DE69409788T2

DE69409788T2 - Methoden fuer analyse/ trennung

Info

Publication number: DE69409788T2
Application number: DE69409788T
Authority: DE
Inventors: Ying Univ Of Texas M D A Huang; Alastair Macgregor; Adrian Parton; Ronald Pethig; Denise Pollard-Knight; Xiao-Bo Univ Texas M D An Wang
Original assignee: Scientific Generics Ltd
Current assignee: Scientific Generics Ltd
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 1998-11-12
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: DK0680380T3; EP1092477A1; ATE204211T1; JPH08506179A; US5653859A; US5993631A; GB9301122D0; EP0815942A1; DK0815942T3; EP0815942B1; DE69428000T2; WO1994016821A1; EP0680380A1; DE69409788D1; EP0680380B1; DE69428000D1; ATE165255T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf analytische Methoden basierend auf der Beobachtung der Migration von Partikeln in Reaktion auf ein elektrisches Feld.
Zur Hintergrundinformation: Partikel können dadurch manipuliert werden, daß sie elektrischen Wanderfeldem unterworfen werden. Solche Wanderfelder werden durch Anlegen von geeigneten Spannungen an Mikroelektrodenanordnungen von geeignetem Aufpau erzeugt. Die Mikroelektroden haben die geometrische Form von parallelen Stangen, welche durch Zwischenräume unterbrochen sein können, um Kanäle zu bilden, was in Figur 1 gezeigt ist, und können mittels Standard-Metallbedampfungs- und -Photolithographiktechniken, beschrieben beispielsweise von Price, Burt und Pethig, Biochemica et Biophysica, Bd. 964, S. 221-230 hergestellt werden. Elektrische Wanderfelder werden erzeugt, indem Spannungen von geeigneter Frequenz und Phasen an die Elektroden angelegt werden, was in einem Dokument mit dem Titel "Separation of small particles suspended in liquid by nonuniform travelling field" (Trennung von kleinen Partikeln, welche in Flüssigkeit suspendiert sind, durch ungleichmäßiges Wanderfeld) von Masuda, Washizu und Iwadare, WEE Transactions on Industry Applications, Bd. IA-23, S. 474-480 beschrieben ist. Masuda und seine Mitarbeiter beschreiben, wie eine Reihe von parallelen Elektroden (ohne Kanäle), welche ein elektrisches Wanderfeld stützen, im Prinzip verwendet werden können, um Partikel entsprechend ihrer elektrischen Ladung und Größe (Gewicht) zu trennen. Masuda et al haben jedoch kein praktisches Beispiel eines solchen Partikel-Trennverfahrens beschrieben.
Ein Dokument mit dem Titel "Travelling-wave dielectrophoresis of microparticles" (Wanderwellen-Dielektrophorese von Mikropartikeln) von Hagedorn, Fuhr, Müller und Gimsa (Electrophoresis, Bd. 13, S. 49-54) zeigt ein Verfahren zum Bewegen von dielektrischen Partikeln, wie beispielsweise lebende Zellen und künstliche Objekte von mikroskopischen Abmessungen, über Mikroelektrodenstrukturen und in Kanälen, welche durch die Elektroden begrenzt sind. Das Wanderfeld wurde durch Anlegen von Spannungen derselben Frequenz an jede Elektrode mit einer 90º Phasenverschiebung zwischen benachbarten Elektroden erzeugt.
In "Electrokinetic behaviour of colloidal partides in travelling electric fields: Studies using Yeast cells" (Elektrokinetisches Verhalten von kolloidalen Partikeln in elektrischen Wanderfeldern: Untersuchungen mit Hefezellen) von Y.Huang, X-B Wang und R.Pethig J.Phys.D.Appl.Phys. 26 1993 1528-1535 erfolgt eine auf ein Experiment gestützte Analyse der Wirkung des "travelling-wave dielectrophoresis" (Wanderwelle-Dielektrophorese) (TWD)-Effekts, welcher von Hagedorn et al (oben genanntes Dokument) beschrieben wird. Die phänomenologische Gleichung
wurde von Huang et al entwickelt, uni zu zeigen, daß die TWD-Geschwindigkeit eine Funktion des Quadrats des Partikelradius (r), des Quadrats der elektrischen Feldstärke (A(O)), der Periodenlänge des Wanderfeldes (λ), der mittleren Viskosität (η) und des Imaginärteus des Clausius-Mossotti-Faktors f(&epsi;p*,&epsi;m*) ist, welche die dielektrischen Eigenschaften des Partikels und des Suspensionsmediums in bezug auf deren jeweilige komplexe (absolute) Dielektrizitätskonstanten &epsi;p* und &epsi;m* definieren. Diese Gleichung stellt zum ersten mal einen praktischen Leitfaden für den Aufbau des Wanderwellen-Elektrodensystems für die Manipulation und Trennung von Partikeln bereit.
Die Bewegung von Partikeln durch Hochfrequenzfelder mittels Elektrodenanordnungen ist ebenfalls in der WO92/07657 beschrieben.
Obwohl das betreffende Phänomen normalerweise "Wanderwellen-Dielektrophorese" genannt wird, haben wir nun gezeigt, daß dies eine irreführende Bezeichnung ist, da die Kraft, welche auf die Partikel wirkt, um eine Translationsbewegung zu erzeugen, nicht die Dielektrophorese-Kraft ist, sondern eher diejenige, welche bei der Elektrorotation wirkt. Diese Kraft bezieht sich auf die Imaginärkomponente der Polarisierbarkeit des Partikels in seinem umgebenden Medium. Wie jedoch im folgenden detaillierter erläutert wird, findet die Partikelmigration nur bei Wanderwellenfrequenzen statt, welche negative dielektrophoretische Kräfte an dem Partikel erzeugen. (Dielektrophoretische Kräfte stehen im Zusammenhang mit der Realkomponente der Polarisierbarkeit des Partikels in seinem umgebenden Medium). Diese Kräfte sind verantwortlich für ein Heben des Partikels weg von den Elektroden und dem Kanal zwischen den Elektroden. Demgemäß nennen wird das zuvor "Wanderwellen-Dielektrophorese" genannte Phänomen lieber "Wanderwehen-Feld-Migration (travelling wave field migration TWFM). Wir haben festgestellt, daß, um TWFM zu erhalten, zwei separate Kriterien erfüllt werden müssen. Zuerst muß eine Frequenz gewählt werden, bei welcher die Dielektrophoresekraft, die auf die Partikel wirkt, negativ ist, d.h. so daß die Partikel von den Elektroden abgestoßen werden. Wir haben herausgefunden, daß hierzu die reale Komponente des Dipolmoments, welches in den Partikeln induziert wird, negativ sein muß.
Zweitens muß die gewählte Frequenz dergestalt sein, daß die Imaginärkomponente des Dipolmoments, welches in den Partikeln induziert wurde, nicht gleich Null ist (ob positiv oder negativ), um eine Kraft zu erzeugen, welche die Partikel entlang der Elektrodenanordnung verlagert.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Beobachtung, daß die TWFM-Eigenschaften eines Partikels (d.h. die Richtung und Geschwindigkeit, mit welcher es sich unter TWFM bewegt und die Bedingungen, einschließlich Elektrodenanordnung und -beabstandung, Spannung, Frequenz und Suspensionsmedium, unter welchen TWFM möglich ist) durch eine Auswahl an Methoden geändert werden können, welche die dielektrischen Eigenschaften des betreffenden Partikels beeinflussen.
Die vorliegende Erfindung bietet in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Trennen einer ersten Population von Partikeln von einer zweiten Population von Partikeln durch Wanderwellen-Feld-Migration, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren aufweist: Binden eines Liganden an jedes Partikel der ersten Population von Partikeln und Binden einer Markierung an den Liganden, welche dazu dient, die Feld-Migrations-Eigenschaften des dergestalt mit der Markierung durch den Liganden verbundenen Partikels zu ändern, wobei die zweite Population von Partikeln nicht durch den Liganden und die Markierung gebunden ist, und Ausführen einer Wanderwellen-Feld-Migration der Partikel, um eine Translationsbewegung derselben unter solchen Bedingungen herzustellen, daß die markierte erste Population von Partikeln von der zweiten Population getrennt wird.
Bei einem zweiten Aspekt bietet die Erfindung ein Analyseverfahren, welches aufweist: Binden eines Liganden an jedes Partikel einer Population von Partikeln und Binden einer Markierung an jeden Liganden, welche dazu dient, die Feld-Migrations-Eigenschaften der dergestalt mit der Markierung durch den Liganden verbundenen Partikel zu ändern, und Ausführen einer Wanderwellen-Feld-Migration der Partikel zum Erzeugen einer Translationsbewegung derselben unter solchen Bedingungen, daß sich die Bewegung der markierten Partikel von derjenigen unterscheidet, welche erzeugt worden wäre, wenn die Partikel nicht markiert wären.
Das Partikel kann von einer solchen Größe sein, daß es mittels eines Lichtmikroskops (Mikroskoppartikel) sichtbar ist oder es kann kleiner sein (Submikroskoppartikel) und kann durch Verwendung von Markierungen, wie beispielsweise lumineszierende, fluoreszierende und elektromagnetische Strahlung absorbierende Markierungen detektiert werden.
Beispiele der ersteren Art von Partikel beinhalten Säugetierzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen, Kunststoff-Mikroperlen, Chromosomen, welche einer Meiose und Mitose unterzogen werden, und Oozyten, z.B. von Cryptosporidium.
Beispiele der zweiten Art würden beinhalten: Bakterienzellen, Viren, DNA- oder RNA-Moleküle, Proteine, andere Biomoleküle und Chromosomen.
Der Komplex zwischen dem Partikel und dem Ligand kann einen verknüpfenden Molekülteil beinhalten, welcher das Partikel und den Ligand verbindet. Die mit dem Ligand verbundene Markierung kann auch über einen zweiten verknüpfenden Molekülteil verbunden sein. Der Komplex kann zahlreiche Liganden beinhalten, welche mit dem Partikel verbunden sind.
Die Wahl des verknüpfenden Molekülteils hängt offensichtlich von der Natur des Partikels und des Liganden ab. Wenn man z.B. eine Nukleinsäureart (der Ligand) auf einer Kunststoff-Mikrosphäre (das Partikel) festhalten will, wird als verknüpfender Molekülteil normalerweise eine Nukleinsäure oder ein nukleinsäureanaloges Oligomer mit einer Sequenz gewählt, welche zu dem des Liganden oder einem Teil davon komplementär ist.
Der verknüpfende Molekülteil mag zuerst mit dem Partikel verbunden werden und mag dann eine Art sein, welche eine Affinität für den Ligand hat. Vorzugsweise ist die Affinität ffir den Ligand eine selektive Affinität, so daß die Bildung des Komplexes zwischen dem Partikel und dem Ligand selektiv ist und mindestens ein (gewisses) Maß an Identifikation des Liganden bereitstellt. Vorzugsweise ist diese Affinität höchst spezifisch und demgemäß mag der verknüpfende Molekülteil, welcher mit dem Partikel verbunden ist, welches die selektive Affinität für den Ligand bereitstellt, ein Antikörper oder ein Antikörperfragment, welches Antikörperwirkung hat, ein Antigen, eine Nukleinsäuresonde oder eine Nukleinsäureanalogsonde mit selektiver Affinität für komplementäre Nukleinsäure-Sequenzen, oder Avidin oder ein Avidin-ähnliches Molekül, wie beispielsweise Strept-Avidin sein.
Antikörper und Antikörperfragmente mit Antikörper-Eigenschaften sind besonders bevorzugt. Bekannt sind Techniken, welche zum Beschichten von Antikörpern auf die Oberfläche von Pantikeln, wie beispielsweise unter Fachleuten wohlbekannten Kunststoff-Mikroperlen geeignet sind. Mit Antikörper beschichtete Partikel können entsprechende Antigene, welche an Mikroorganismenzellen oder einem anderen Liganden vorhanden sein können, erkennen und binden.
Es sind auch Verfahren bekannt zum Binden von Oligonukleinsäuresonden an solche Mikroperlen. Geeignete Methoden sind beispielsweise in der PCT-Anmeldung Nr. GB92/01526 beschrieben. Wenn der verknüpfende Molekülteil eine Nukleinsäuresonde ist oder eine Nukleinsäureanalogsonde, ist das resultierende Partikel natürlich geeignet, komplementäre Nukleinsäure-Sequenzen zu erkennen und zu binden.
Der Ligand kann so gewählt werden, daß er die Sichtbarkeit des Partikels erhöht oder in anderer Weise seine Detektierbarkeit verbessert sowie seine TWFM-Eigenschaften verändert. Antikörper z.B. welche Fluorophore oder Chromaphore aufweisen, können mit dem Partikel so verbunden werden, daß der dergestalt gebildete Komplex von dem Startpartikel durch TWFM unterschieden werden kann und durch Fluoreszenz oder Farbe detektiert werden kann.
Die Markierung kann mit dem Ligand entweder vor, gleichzeitig mit oder nach der Bildung des Komplexes zwischen dem Ligand und dem Partikel verbunden werden. Die Markierung kann einen zweiten verknüpfenden Molekülteil aufweisen, der von der Markierung getragen ist. Wiederum ist es bevorzugt, daß die Affinität des zweiten verknüpfenden Molekülteils für den Ligand selektiv ist, vorzugsweise höchst spezifisch, und der zweite verknüpfende Molekülteil kann auch ein Antikörper, ein Antikörperfragment mit Antikörper-Aktivität, ein Antigen, eine Nukleinsäuresonde, eine Nukleinsäureanalogsonde, Avidin oder ein Avidin-ähnliches Molekül sein. Die Verwendung einer Markierung dieser Art kann erwünscht sein, um eine schnelle Detektion des Komplexes zu unterstützen und/oder, wenn ein Komplex zwischen dem Partikel und dem Ligand an sich keine ausreichend unterscheidungskräftige TWFM-Eigenschaften hat, kann somit die TWFM weiter durch Miteinbeziehung in den Komplex der Markierung geändert werden. Hierzu kann die Markierung ein Fluorophor oder Chromaphor oder ein Mikroorganismus, ein Metallpartikel, eine Polymerperle oder ein magnetisches Partikel sein. Bei der Verwendung in Verbindung mit TWFM-Messungen hat die Markierung vorzugsweise dielektrische Eigenschaften und kann eine signifikante Oberflächenladung annehmen. Ein besonders bevorzugtes Material ist kolloidales Gold, welches einfach mit Antikörpern (als die zweite Art) zu verbinden ist, um eine Markierung zu bilden. An kolloidales Gold gebundene Antikörper sind kommerziell erhältlich und Verfahren zum Binden von Antikörper mit kolloidalem Gold sind beispielsweise in Geohegan W.D. et al (1978) Immunol. Comm 7 pl. beschrieben. Andere Metallpartikel können jedoch verwendet werden, beispielsweise Silberpartikel und Eisenpartikel.
Die Verwendung einer Markierung der oben beschriebenen Art kann bevorzugt sein, selbst wenn ein Komplex zwischen dem Ligand und einem Partikel ausreichend unterscheidungskräftige TWFM-Eigenschaften aufweist, um die Bildung eines solchen zu beobachtenden Komplexes zu ermöglichen. Ein höheres Maß an Spezifität kann in bestimmten Fällen durch Verwendung einer Markierung in einem solchen Komplex erhalten werden. So möchte man z.B. vielleicht einen Mikroorganismus, welcher ein Antigen A exprimiert, von einem Mikroorganismus, welcher Antigene A und B exprimiert, unterscheiden. Dies kann durch Verwendung von Mikropartikein, welche als verknüpfender Molekülteil einen Antikörper gegen A haben, und einer Markierung, deren Teil ein Antikörper gegen B ist, erreicht werden. Der Unterschied der Geschwindigkeiten des markierten Komplexes (zwischen dem Mikropartikel, dem Mikroorganismus und der Markierung) und des nicht markierten Komplexes (zwischen dem Mikropartikel und dem Mikroorganismus) kann beobachtet und verwendet werden, um Mikroorganismen, die nur Antigen A exprimieren, von denen, die A und B exprimieren, zu unterscheiden.
Die Markierung kann ein magnetisches Partikel beinhalten, so daß die Markierung von einem Magneten angezogen werden kann, um diese Markierung enthaltende Komplexe zur einfacheren Observation zu konzentrieren. In einigen Fällen mag es möglich sein, markierte Komplexe von einem Magneten anzuziehen und nicht markierte Partikel fortzuspülen, um den Untergrund der Partikel, welche verknüpfende Molekülteile, jedoch keinen normalerweise vorhandenen Ligand/Markierung aufweisen, zu eliminieren. Geeignete magnetische Markierungen fur diesen Zweck beinhalten Eisen-Mikropartikel, die verknüpfende Molekülteile, wie z.B. Antikörper, tragen. Solche mit Antikörpern beschichtete Eisenpartikel sind kommerziell erhältlich.
Markierungen fur sowohl Zellen und kleinere Partikel können fluoreszierende Marker z.B. HTC oder Rhodannin, Chromophore, lumineszierende Marker oder Enzymmoleküle beinhalten, welche ein detektierbares Signal erzeugen können. Beispiele der letzteren beinhalten Luciferasen und alkalische Phosphatase. Diese Marker können mittels spektroskopischer Techniken detektiert werden, welche den Fachleuten wohlbekannt sind. Die Markierung könnte mit dem Ligand entweder vor, gleichzeitig mit oder nach der Bildung des Komplexes zwischen Ligand und Partikel gebunden werden. Im Falle von Transfektion von Zellen können die Zellen einen Marker zusammen mit dem Genprodukt exprimieren. Das Gen z.B. für Glühwürmchen- oder Bakterien-Luciferase mag in die Zellen ko-transfiziert werden, wodurch ermöglicht wird, daß die transfizierten Zellen durch ein Lumineszenz-Signal sichtbar gemacht werden.
Der mit dem Partikel einen Komplex bildende Ligand kann einen physikalischen Effekt auf die TWFM-Eigenschaften ausüben und auch durch Wechselwirkung mit dem Partikel eine Änderung der natürlichen TWFM-Eigenschaften des Partikels herbeiführen.
Die Erfindung beinhaltet Methoden, wie sie oben beschrieben sind, die für analytische Zwecke ausgeführt werden und auch solche Methoden, die für präparative oder andere Zwecke ausgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können in einer weiten Vielzahl von analytischen Anwendungen angewendet werden, einschließlich der Trennung und Analyse von Proben, welche Zellen enthalten, z.B. Bakterien-, Säugetier-, Hefe- und Insektenzellen oder Viruspartikel und biologische Makromoleküle. Aktuelle Verfahren zum Trennen von Zellen, z.B. Durchfluß-Zelien-Zytometrie erfordern eine teure Ausrüstung, Fachleute und wichtige Labor-Hilfsmittel. Die Techniken haben auch Grenzen, wenn viele unterschiedliche Zellpopulationen getrennt werden müssen, und wenn die interessierenden Zellen weniger als ein paar Prozent des Gesamten darstellen. Zum Trennen und zur Analyse von modifizierten biologischen Molekülen oder Komplexen zwischen biologischen Makromolekülen beinhalteten die verwendeten Techniken Elektrophorese und chromatographische Trennung unter Verwendung von Gel-Filtration oder Affinität-Chromatographie. Obwohl diese in einigen Fällen eine angemessene Trennung bieten, können sie bei vielen Anwendungen zeitaufwendig sein und haben eine beschränkte Auflösung. Außerdem kann die Verwendung dieser Verfahren das Gleichgewicht zwischen biologischen Komplexen beeinflussen. Gel-Filtration hat z.B. eine beachtliche Verdünnung der Probe zur Folge.
Die im folgenden beschriebenen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bieten eine Lösung einiger oder aller dieser Nachteile.
Wenn bei einem analytischen Verfahren gemäß der Erfindung ein Komplex zwischen dem Partikel und einem Ligand erzeugt wird, muß der Ligand selbst nicht von der Art sein, welche die Anwesenheit, Natur oder Quantität festlegt, was der elementare Zweck der Analyse ist. Somit kann der Ligand ein Reagens in der Analyse sein und die interessierende Sorte in der Analyse kann eine weitere Komponente des Komplexes sein, z.B. eine Hälfte, welche den Ligand mit den Partikeln verbindet oder das Partikel selbst.
Das zuvor beschriebene TWFM-Verfahren wurde ausgeführt mit einer Anordnung von linearen, parallelen Elektroden, welche bezüglich der Phase festgelegten elektrischen Feldern ausgesetzt smd, normalerweise so, daß jede vierte Elektrode entlang der TWFM-Bahn phasengleich ist. Diese Periodizität definiert die effektive Wellenlänge des erzeugten Wanderwellenfeldes. Wir haben festgestellt, daß diese Wellenlänge optimalerweise ungefähr zehn mal so groß ist wie der Durchschnittsdurchmesser des unter TWFM zu bewegenden Partikels, z.B. zwischen 5 bis 20 mal oder vorzugsweise 8 bis 12 mal so groß wie der genannte Durchschnittsdurchmesser. Bei Partikeln, welche nicht ungefähr kreisförmig sind, ist die Länge quer zur TWFM-Bewegung von Bedeutung.
Die Elektroden können in Abhängigkeit von den erforderlichen Abmessungen unter Verwendung einer beliebigen der Standardtechniken zur Muster-Bildung und Herstellung mikroskopischer Strukturen gebildet werden. Z.B. können die Elektroden auffolgende Weise hergestellt werden:
Siebdruck;
Aufbringen von Elektrodenmaterial (z.B. durch Elektroplattieren oder Zerstäuben) gefolgt von einer der folgenden Muster-Bildungs-Techniken:
Direktes Schreiben mittels eines Elektronenstrahls gefolgt von Ätzen (z.B. chemisches Naßätzen, Plasma-Trockenätzen oder fokussiertes Ionenstrahlätzen);
Schreiben durch Exposition durch eine photolithographisch erzeugte Maske hindurch, gefolgt von Ätzen - die Maske kann z.B. durch sichtbare, ultraviolette, Röntgen- oder Elektronenstrahl-Lithographie erzeugt werden;
Excimer-Laser-Ablation;
Muster-Bildung gefolgt von Aufbringen des Elektrodennnaterials (wie in dem Röntgenstrahl-LIGA-Verfahren).
Die Erfindung wird in der folgenden Beschreibung einer Vorrichtung und einer Methodik in bezug auf die beiliegenden Zeichnungen weiter beschrieben und dargestellt. Es zeigen:
Fig. 1 eine Elektrodenanordnung und Spannungs-Phasen-Verhältnisse zur TWFM-Erzeugung;
Fig. 2 die möglichen Muster der Bewegung von Partikeln über die in Fig. 1 gezeigten Elektrodenanordnung;
Fig. 3 eine modifizierte Elektrodenanordnung, bei welcher sich der Abstand zwischen den Elektroden entlang der Anordnung ändert;
Fig. 4 eine weitere modifizierte Elektrodenanordnung, bei welcher sich der Abstand zwischen den Elektroden quer zur Anordnung ändert;
Fig. 5 eine weitere modifizierte Elektrodenanordnung, bei welcher sich der Abstand zwischen den Elektroden sowohl quer zur als auch entlang der Anordnung ändert;
Fig. 6 eine Elektrodenanordnung, bei welcher der mittlere Kanal, der in den in den vorherigen Figuren gezeigten Anordnungen vorhanden ist, fehlt;
Fig. 7 in schematischer Weise die Komponenten der Vorrichtung zum Ausführen von Verfahren gemäß der Erfindung und Erhalten von Daten daraus;
Fig. 8 in schematischer Weise einen Komplex, welcher ein geändertes Partikel darstellt, welches in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet wird;
Fig. 9 in schematischer Weise einen ternären Komplex, welcher ein geändertes Partikel darstellt, welches in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet wird;
Fig. 10 einen weiteren ternären Komplex, welcher ein geändertes Partikel darstellt, welches in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet wird;
Fig. 11 einen weiteren Komplex, welcher ein geändertes Partikel darstellt, welches in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet wird
Fig. 12 einen Komplex, bei welchem das Partikel ein Chromosom ist, welcher ein geändertes Partikel zur Verwendung bei der Erfindung darstellt;
Fig. 13 eine Elektrodenanordnung, welche zum Feststellen von Frequenzen und Suspensionsmedien geeignet ist, welche wahrscheinlich zufriedenstellende TWFM-Eigenschaften für ein Partikel erzeugen;
Fig. 14 graphische Darstellungen, welche die dielektrischen Eigenschaften von lebenden Zellen in einem Medium von einer Leitfähigkeit von 5 x 10&supmin;&sup4; 5m&supmin;¹ zeigen;
Fig. 15 graphische Darstellungen, welche die dielektrischen Eigenschaften von lebenden Hefezellen zeigen;
Fig. 16 graphische Darstellungen, welche die dielektrischen Eigenschaften von toten Hefezellen in einem ahnlichen Medium zeigen.
Beispiele von Elektrodengestaltungen zur Erzielung von Trennungswirkungen sind in Figuren 1 bis 6 gezeigt.
In Figur 1 ist die Elektrodenanordnung gebildet durch zwei parallele Reihen von Elektroden, wobei jede Elektrode rechteckig ist und ihre Längsrichtung quer zur Erstreckungsrichtung der Reihen verläuft. Die zwei Reihen sind durch einen Spalt von konstanter Breite getrennt und der Abstand zwischen jedem Elektrodenpaar in jeder Reihe ist derselbe. Die Elektroden sind dünne Metallfilm-Elektroden auf einem isolierenden Substrat, in geeigneter Weise Goldelektroden, welche auf einen Objektträger aus Glas gedruckt sind. Der Abstand zwischen den Reihen beträgt 30um und die Teilung von Gruppen von vier Elektroden in jeder Reihe beträgt 80um. Eine nützliche Regel ist, daß im allgemeinen die die Wellenlänge der Wanderwelle definierende genannte Teilung von 5 bis 20 mal so groß sein sollte wie das Partikel, z.B. 8 bis 12, vorzugsweise 10 mal so groß.
Wie in Fig. 2 gezeigt ist, kann die Reaktion der Partikel, die einem Wanderwellenfeld der unten beschriebenen Art ausgesetzt sind, variiert werden. Partikel können an den Elektroden gesammelt werden, sie können induziert werden, so daß sie rotieren, und es kann bewirkt werden, daß sie entlang des Spalts zwischen den Reihen oder über die Elektrodenreihen wandern. Diese letztgenannte Art von Bewegung ist TWFM. Die Art der erzeugten Bewegung hängt von der Natur des Partikels, dem Suspensionsmedium, dem Elektrodenabstand und der Feldfrequenz ab.
In Fig. 3 variiert die periodische Länge zwischen Elektroden, um den Parameter λ in der obigen Gleichung zur Wirkung zu bringen. Eine Wanderwelle z.B., die sich von den oberen zu den unteren Elektroden bewegt, beschleunigt ein unter TWFM nach oben wanderndes Partikel. Dies kann z.B. verwendet werden, um eine gleichmäßigere Auflösung entlang der TWFM-Bahn zu erzeugen, wodurch einer natürlichen Tendenz entgegengewirkt wird, daß die Auflösung mit der zurückgelegten Entfernung steigt. In Fig. 4 ändert sich auch die Kanalbreite und dies bringt die Änderung des Feldes A(O) der obigen Gleichung zur Anwendung. Ein sich unter TWFM bewegendes Partikel wird als Folge davon, daß mit abnehmender Kanalbreite das Feld zunimmt, beschleunigt. Somit werden zwei Partikel von unterschiedlicher Größe, ansonsten jedoch ähnlichen physikalischchemischen Eigenschaften räumlich getrennt, während sie sich entlang des Kanals bewegen. Partikel von unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften könnten in einem geeigneten Medium suspendiert sein, so daß der Faktor Im[f(&epsi;p*,&epsi;m*)] in der obigen Gleichung ein unterschiedliches Vorzeichen für jedes Partikel hat. Die Partikel würden sich dann physikalisch trennen, indem sie sich unter TWFM in entgegengesetzte Richtungen bewegen.
Fig. 5 ist ein Elektrodenaufbau, welcher den Einfluß von λ und A(O) kombiniert. Partikel können auch so induziert werden, daß sie sich über parallele Elektroden unter dem Einfluß von Wanderfeldern bewegen, und ein Beispiel einer Elektrodengeometrie, bei welcher eine Trennung unter Verwendung von Differential-Teilchenbeschleunigung erzielt werden kann, ist in Fig. 6 gezeigt.
Die Partikel bewegen sich unter TWFM, es sei denn sie sind von positiven Dielektrophorese-Kräften (wie in der Arbeit von Huang et al beschrieben) gefangen. Somit wird eine extra Einrichtung zum selektiven Fangen und Trennen von Partikeln gemäß ihren dielektrischen Eigenschaften und ihrer Größe bereitgestellt.
Wie in Fig. 7 gezeigt ist, weist die Vorrichtung zur Verwendung gemäß der Erfindung ein Lichtmikroskop auf, welches schematisch durch eine Linse 100 angedeutet ist, welches mit einem CCD-Kamera-Zusatzgerät 102 sowie mit einer herkömmlichen, das Feld beleuchteten Lichtquelle 103 und Objektträger (nicht gezeigt) ausgerüstet ist.
Die CCD-Kamera 102 ist mit einer Signalprozessoreinheit 104 und einem Anzeigebildschirm 106 verbunden. Die Vorrichtung weist weiterhin einen Frequenzgenerator 108 auf, welcher bei Betrieb mit Anschlüssen verbunden ist, welche an einem Mikroskopobjektträger 110 vorgesehen sind, welcher ein Muster von Elektroden trägt, was in Fig. 1 detaillierter gezeigt ist.
Die Elektroden können z.B. in Gold gedruckt oder auf dem Mikroskopobjektträger 110 aufgeschichtet und geätzt werden, zusammen mit Bahnen, die zu Anschlüssen führen zur Verbindung mit dem Frequenzgenerator 108. Der Frequenzgenerator stellt das Ausgangssignal für das elektrische Feld bereit. Der Frequenzgenerator kann variable Ausgangssignale liefern, um es dem Bediener zu ermöglichen, die Frequenz der Sinuswellenausgangssignale und deren Spitze-Spitze-Spannung einzustellen.
Bei Betrieb zeigt die auf der Anzeige der Vorrichtung erscheinende Abbildung eine Anzahl an Perlen in dem Feld des Mikroskops, welche mit einer ausreichend niedrigen Geschwindigkeit wandern, so daß die Migrationsrate in einer Zeitspanne, wie beispielsweise 30 Sekunden, direkt von einem Beobachter festgestellt werden kann, welcher jede Perle der Reihe nach betrachtet. Während die oben beschriebene Vorrichtung ausreicht, um nützliche Ergebnisse zu erzielen, was durch die unten aufgeführten spezifischen Beispiele gezeigt ist, ist es im allgemeinen bevorzugt, daß Migrations-Geschwindigkeitsmessungen bei mehr Perlen ausgeführt werden als ein menschlicher Beobachter realistisch direkt bewältigen könnte. Zu diesem Zweck ist es wünschenswert, Bildverarbeitungstechniken zu verwenden, um die Migration der Perlen in der Vorrichtung zu detektieren und messen. Von dem CCD-Kamera-Zusatzgerät kann man Abbildungen eines Betrachtungsfeldes erhalten, die eine Anzahl an Migrationsperlen enthalten. Eine Reihe solcher Abbildungen oder Rahmen kann durch eine Rahmen-Greif-Schaltung (Grabber) in einem Computer aufgenommen werden und die Reihe der Abbildungen kann durch Bildverarbeitungssoftware analysiert werden.
Somit kann z.B. ein Schwellenwertverfahren verwendet werden, um die von der Kamera erzeugte Graustufen- Abbildung in eine binäre Abbildung zu konvertieren. Eine separate Schwellenwertoperation wird durchgeführt, um jegliche Bereiche der Abbildung zu identifizieren, welche als zu dunkel erachtet werden, wobei diese Bereiche von der binären Abbildung der Perlen entfernt werden. Die restlichen Formen in der Abbildung können von dem Rest der Abbildung getrennt werden und auf eine oder mehrere charakteristische Eigenschaften, wie beispielsweise Fläche, getestet werden, um diejenigen auszuwählen, welche wahrscheinlich Perlen darstellen. Das Massezentrum kann dann für jede qualifizierte Form festgestellt werden. Die Positionen der Zentren können zwischen den aufeinander folgenden Rahmen verglichen werden, so daß jede Perle in einem Rahmen in dem nächsten lokalisiert werden kann. Wenn eine Perle in zwei Rahmen lokalisiert wurde, gibt die Differenz der Positionen der Perle direkt die Migrationsentfernung, aus welcher ihre Migrationsrate berechnet und über mehrere Rahmenpaare gemittelt werden kann. Durch solche automatisierten Techniken können die Migrationsgeschwindigkeiten aller Perlen in dem Blickfeld zu jedem Zeitpunkt gemessen werden und ein statistisches Bild der Migrationseigenschaften der Perlen kann entwickelt werden, wahlweise durch Verwendung einer Anzahl an Feld-Migrations-Frequenzen.
Andere abbildungsverarbeitende Techniken können auch verwendet werden, um die Position von Partikeln zu identifizieren und ihre Bewegung zu bestimmen, z.B. Wechselbeziehung, Randdetektion oder morphologische Techniken oder Abbildungssubtraktion. Neuronale Netze können auch dazu verwendet werden, um Partikel zu identifizieren.
Es ist nicht immer erforderlich, einen Abbildungsdetektor der oben beschriebenen Art zu verwenden, um Partikelgeschwindigkeiten festzustellen. Alternative Detektionsanordnungen beinhalten:
Lichtzerstreuungs-Detektoren, wie in einem Durchfluß-Zytometer;
Standard-Fluoreszenz-Detektionsanordnungen;
Lumineszenz-Detektion unter Verwendung von CCDs oder anderen Detektoren;
optische Einfach- oder Multi-Element-Spektroskopmessungen;
Brechzahl-Modulationsdetektion (z.B. durch Phasenkontrast-Techniken)
Detektion durch akustische Impedanzmessung (welche sich auf Partikelmasse bezieht) unter Verwendung von akustischen Oberflächen- oder Masse-Sensoren;
elektrische Impedanz, Kapazität oder Induktivität
Die Vorrichtung kann weiter durch Hinzufügen eines Magneten modifiziert werden, in geeigneter Weise eines Elektromagneten, welcher so angeordnet ist, daß er jegliche Magnetperlen in der Probe in das Blickfeld des Mikroskops zieht. Der Magnet würde dann entfernt oder abgeschaltet werden, während die Migrationseigenschaften der Perlen gemessen werden. Alternativ dazu können die Partikel durch Dielektrophorese oder Elektrophorese in Position manipuliert werden.
Wie in Fig. 8 gezeigt ist, kann ein Mikropartikel eine Kunststoffperle 12 aufweisen, an welche als verknüpfender Molekültell ein oder mehrere Antikörper-Moleküle 14 gebunden ist/sind. Es ist zu beachten, daß die Zeichnung nicht maßstabsgetreu ist und daß normalerweise in der Realität die Kunststoffperlen mit einer Vielzahl an Antikörpermolekülen beschichtet sind. Die Mikropartikel können Mikroorganismus-Zellen 16 ausgesetzt werden, welche Oberflächen-Antigene tragen, die reaktionsfähig mit dem gebundenen Antikörper sind, um einen Komplex 10 zwischen dem Mikropartikel und der Zelle zu bilden. Die Mikroorganismus-Zellen können z.B. E.coli oder andere Coli-Bakterien sein, die im Wasser vorkommen, oder pathogene Mikroorganismen, welche in Nahrungsmitteln vorkommen, wie beispielsweise Listeria oder Salmonellen. Es hat sich herausgestellt, daß die Migrationsrate solcher Mikropartikel/Mikroorganismus-Zellkomplexe unter richtig gewählten Bedingungen von den Migrationsraten unterschieden werden kann, welche durch Verwendung der Mikropartikel allein erhalten wurden, und weiterhin, daß die Migrationsraten, welche für Komplexe zwischen Mikropartikeln und lebensfähigen Mikroorganismus-Zellen erhalten wurden, von denjenigen unterschieden werden können, welche zwischen Mikropartikeln und ähnlichen nicht lebensfähigen Zellen erhalten wurden.
Wie in Fig. 9 gezeigt ist, kann ein ternärer Komplex 10 zwischen einem Mikropartikel 12 der in Figur 8 gezeigten, oben beschriebenen Art, einem Antigen 18 und einer Markierung 20, welche ein markierendes Molekülteil 22 und einen zweiten Antikörper 24 aufweist, welcher gleich wie der Antikörper 14 oder anders sein kann, erzeugt werden. Ein ternärer Komplex dieser Art kann verwendet werden, wenn das Antigen 18 zu klein ist oder nicht ausreichend dielektrische Eigenschaften aufweist, um die TWFM-Eigenschaften des Mikropartikels 10 zu beeinflussen, oder wenn gewünscht wird, ein höheres Maß an Spezifizität durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen Antikörpern in einer einzigen Analyse zu erhalten. Das Antigen kann z.B. ein Toxin sein, welches in einem Nahrungsmittel als Verseuchungsstoff (contaminant) enthalten ist.
Figuren 10 und 11 zeigen Verfahren zum Detektieren von Nukleinsäuren und insbesondere Nukleinsäure Sequenzen, welche als Produkte von Vermehrungsverfahren, wie beispielsweise PCR (Polymerase-Kettenreaktion), LCR (Ligase-Kettenreaktion) und 3SR-Techniken, erzeugt werden. Bekannte Verfahren zum Detektieren von Nukleinsäure-Vermehrungsverfahrensprodukten stützen sich darauf, daß sie einer Art von Reinigungs und/oder Trennungsverfahren unterzogen werden, bevor sie analysiert werden. Ein weitgehend verwendetes, bekanntes Verfahren beinhaltet die Analyse der Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Diese trennt die vermehrten DNA-Fragmente und jegliche verbleibende Oligonukleotid-Primer aufgrund der Größe. Trennen von Produkten auf der Basis der Größe allein ermöglicht es nicht, zwischen PCR-Produkten der erforderlichen Basissequenz und einem vermehrten Verseuchungsstoff von ungefähr derselben Länge zu unterscheiden. Um PCR-Produkte weiter zu identifizieren, kann die Gel-Elektrophorese einen Schritt weiter gebracht werden, indem ihr Produkt der Southern-Blot-Technik unterzogen wird, bei welcher die getrennten Fragmente von dem Gel zu einer Membran in direkter Entsprechung zu ihren relativen Positionen an dem Gel übertragen werden. Sie werden dann mit einer markierten einsträngigen DNA-Sonde mit einer Basissequenz, die komplementär zu der interessierenden Sequenz ist, getestet. Die für die Sonde verwendete Markierung ist normalerweise Biotin oder ein Radio-Isotop, wie beispielsweise ³²P. Southern-Blot ist relativ aufwendig und erfordert ein moderates Maß an Laborfähigkeiten sowie auch Laborausrüstung und -einrichtungen. Es ist nicht zur Verwendung beim schnellen Austesten einer großen Anzahl an Proben oder beim Austesten von Proben außerhalb des Labors geeignet. Das "Dot-Blotting"-Verfahren, bei welchem der Schritt der Agarose-Gel-Trennung des Southern-Blot weggelassen wird, ist etwas schneller, hat jedoch im wesentlichen dieselben Nachteile wie Southern-Blot.
Wie in Fig. 11 gezeigt ist, kann in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Mikropartikel ein Oligonukleotid oder ein synthetisches Oligonukleotid-Analogon als eine Festhalte-Sonde 26 (verknüpfender Molekülteil) beinhalten, welcher mit der Fläche einer Polymerperle verbunden ist und eine Sequenz hat, die zu der eines erwarteten Vermehrungsverfahrenprodukts 28 komplementär ist. Es wird eine Markierung 30 mit einem TWFM-Markierungsteil 32, wie oben beschrieben, die mit einer zweiten Oligonukleotid- oder Oligonukleotid-Analog-Sequenz 34 verbunden ist, welche komplementär zu einem zweiten Bereich der Ligand-Nukleinsäure-Sequenz ist. Die Mikropartikel und die Markierung können dem Produkt der Vermehrungsreaktion vor oder nach einem jeglichen Verarbeiten des Reaktionsgemisches hinzugefügt werden, um die Vermehrungsprodukte zu trennen. Die TWFM-Eigenschaften des ternären Mikropartikel/Vermehrungsprodukt/Markierungs- Komplexes können dann beobachtet und von denen der Mikropartikel allein unterschieden werden. Eine Variante dieses Verfahrens ist in Fig. 8 gezeigt, in welcher einer der in dem Vermehrungsverfahren verwendeten Primer mit einer geeigneten TWFM-Markierungshälfte 32 markiert ist, welche dadurch kovalent in das Nukleinsäureprodukt des Vermehrungsverfahrens aufgenommen wird. Ein binärer Komplex wird dann zwischen einem Mikropartikel mit einer Festhalte-Sonde 26 und dem Vermehrungsprodukt erzeugt und die TWFM-Eigenschaften des Komplexes werden beobachtet.
In einer Variante der Fig. 11, gezeigt in Fig. 12, kann der Ligand Nukleinsäure ein Chromosom (komplexe Nukleinsäure) sein und das Mikropartikel kann gesonderte dielektrische Eigenschaften haben, z.B. Metall (Gold) etc. sein. Dies ist besonders nützlich für die Trennung von menschlichen (und anderer Arten von) Chromosomen, wenn unterschiedliche Chromosomen ähnliche Größen und dielektrische Eigenschaften haben können. Technologien, wie beispielsweise Durchfluß-Zytometrie werden momentan verwendet, um Chromosomen auf Größenbasis zu sortieren, und können somit Chromosomen ähnlicher Größe nicht unterscheiden. Bei Menschen können die Chromosomen 9-12 einschließlich nicht einfach durch Durchfluß-Zytometrie getrennt werden aufgrund ihrer ähnlichen Größe. Gemäß unserem Lösungsweg können diese Chromosomen, wenn sie mit einem "dielektn.schen" Marker zuvor markiert wurden, auf Basis ihrer dielektrischen Eigenschaften getrennt werden.
In der Praxis wird dies erreicht, indem die Chromosomen-DNA teilweise denaturiert wird, (z.B. Hitze, chemische Behandlung oder elektrische Behandlung) und nachfolgend eine (zu einer definierten Nukleinsäuresequenz) komplementäre Nukleinsäuresonde hybridisiert wird. Die Nukleinsäuresonde kann vorzugsweise aus mindestens 15 Nukleotiden bestehen, und kann selbst mit einer Größe vormarkiert sein, welche eine Affinität für ein Bindemittel hat. Beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, kann die Markierung "Biotin" sein, welches in einem Nukleotid aufgenommen sein kann oder dem Endbereich der Sondensequenz hinzugefügt werden kann. Das Bindemittel kann beispielsweise ein Antikörper sein, welcher eine Spezifität für die Markierung hat oder alternativ ein Protein/Enzym etc., welches eine Affinität für die gewahlte Markierung hat. Das Bindemittel kann wiederum mit einem Mikropartikel verbunden sein, welches wiederum sowohl ein dielektrischer Vermehrer (durch Vermehren zusätzlicher dielektrischer Eigenschaften) und/oder eine Hilfe zur Detektierung der gewählten Chromosomen sein kann. Somit könnte man sich einen Komplex, wie in Fig. 9 beschrieben, vorstellen. Nach der "dielektrischen Markierung" des Ligandenchromosoms kann er dann von den anderen Chromosomen auf der Basis von unterschiedlichen dielektrischen Eigenschaften getrennt werden. Dies kann praktisch durch Verwendung von unterschiedlichen Migrationsfrequenzen oder selektiven Elektrodenanordnungen erzielt werden - siehe Figuren 1 bis 3.
Somit ist es möglich, zu sehen, daß die selektive Trennung und Identifikation von Chromosomen unter Verwendung der oben beschriebenen Methode erzielt werden könnte. Dies findet praktische Anwendung in klinischer Diagnostik, wo Identifikation und Charakterisierung von Chromosomenänderungen, z.B. Neuanordnungen/Verdünnungen, Einführung von fremder DNA z.B. viraler DNA wichtig ist.
Alternativ dazu kann das Chromosom das Partikel sein und es kann behandelt werden, indem zu ihm eine Nukleinsäuresonde mit einer Markierung (der Ligand) hybridisiert wird, welche die TWFM-Eigenschaften des Chromosoms ändert und optimalerweise auch seine Detektion unterstützt, z.B. ein fluoreszierender Marker.
Um TWFM für ein geändertes Partikel zu beobachten, welches sich von dem Verhalten des nicht geänderten Partikels unter identischen Bedingungen unterscheidet, muß man die Bedingungen sorgfältig auswählen. Es hat sich gezeigt, daß, damit TWFM stattfindet, die Partikel von den Elektroden abgestoßen werden müssen, so daß sie über den Elektroden schweben und nicht auf die Elektroden gezogen zu werden. Gleichzeitig müssen die Partikel entlang der Elektrodenanordnung durch die elektrische Feld-Wanderwelle vorwärtsgetrieben werden. Die Dielektrophorese-Kraft, die für die Abstoßung oder Anziehung der Partikel von der/zu der Elektrode verantwortlich ist, wird durch die Realkomponente des induzierten Dipolmoments in dem Partikel bestimmt. Der Antrieb des Partikels entlang der Elektrodenanordnung wird durch die Größe der Imaginärkomponente des induzierten Dipolmoments und die Bewegungsrichtung durch ihr Vorzeichen bestimmt. Sowohl die Real- als auch Imaginär-Komponente variiert mit der Feldfrequenz und hängt auch von der Natur des Partikels und dem Suspensionsmedium ab. Um eine sichtbare Differenz in dem Verhalten zwischen den geänderten und nicht geänderten Partikeln zu erzeugen, muß man Feldbedingungen und Suspensionsmedium-Eigenschaften finden, bei welchen das Verhältnis zwischen den Real- und Imaginär-Komponenten des Dipolmoments adäquat unterschiedlich für die zwei Formen des Partikels sind. Dies kann wie folgt bewerkstelligt werden.
Partikel, für welche Eigenschaften festgestellt werden sollen, werden in einem gewählten Medium suspendiert und werden in eine Kammer pipettiert, die an ihrer Basis eine Elektrodenanordnung, wie in Fig. 13 gezeigt, aufweist. Ein rotierendes elektrisches Feld wird an die Elektrodenanordnung angelegt und die Frequenz des rotierenden Felds wird schrittweise über einen gewünschten Bereich, z.B. von 10 bis 10¹&sup0; Hz abgetastet. Bei jeder Frequenz wird die Winkelgeschwindigkeit und Richtung der elektrischen Rotation, die in den Partikeln erzeugt wird, als ein Maß der Imaginärkomponente des induzierten Dipolmoments betrachtet. Diese ist als Linie TRANS in Fig. 14 eingezeichnet. Die Linie DEP, welche die dielektrophoretische Kraft darstellt, welche die Partikel erfahren, kann entweder aus der Linie TRANS unter Berücksichtigung der komplexen Polarisierbarkeit der Partikel berechnet werden oder experimentell in derselben Vorrichtung festgestellt werden. Im letzteren Fall werden die Elektroden einem Feld unterworfen, so daß benachbarte Elektroden eine sinusförmige um 180º phasenverschobene Spannung haben. Die Geschwindigkeit, mit welcher sich die Partikel von dem mittleren Bereich zwischen den Elektroden (positiver DEP-Effekt) oder in Richtung zu dem mittleren Bereich (negativer DEP-Effekt) bewegen, ist über der Frequenz eingezeichnet.
Ein typisches Ergebnis für eine lebende Zelle, wie beispielsweise eine Erythrozyte oder Hefezelle ist in Fig. 14 gezeigt. Die Kurvenform ist typisch für lebende Zellen, die Frequenzen varlieren mit dem Zellentyp. TWFM ist in den zwei Bereichen f&sub1;-f&sub2; und f&sub3;-f&sub4; gezeigt, wo die Dielektrophorese (DEP) negativ ist, so daß die Partikel von den Elektroden abgestoßen werden, und die Zusammenwirkung mit der Wanderwelle erzeugt eine Nettokraft entlang der Elektrodenanordnung (non-zero TRANS). Die Richtung, in welche sich die Partikel bewegen, hängt davon ab, ob TRANS positiv oder negativ ist.
Tatsächliche Kurven für lebende und tote Hefezellen sind in Figuren 15 und 16 gezeigt. Es ist ersichthch, daß der TWFM-Bereich zwischen f&sub1; und f&sub2; nur für lebende Zellen vorhanden ist.
Dementsprechend bleiben die toten (d.h. geänderten) Zellen stationär, wohingegen die ursprünglichen Zellen unter diesen Frequenzbedingungen wandern.
Die Leitfähigkeit des Suspensionsmediums beeinflußt die Form der in Figuren 14 bis 16 eingezeichneten Kurven. Die Leitfähigkeit kann empirisch eingestellt werden, um passend geformte Kurven zu erhalten.
Der gezeigte Frequenzbereich wird oft höchst praktisch sein, es können jedoch andere TWFM-Bereiche jenseits dieses Bereichs in einer oder beiden Richtungen, die verwendet werden können, vorhanden sein.
Die folgende Beschreibung der Auswahl der TWFM-Bedingungen im Zusammenhang mit der selektiven Manipulation und Trennung von nicht behandelten und wärmebehandelten Hefezellen illustriert diese Betrachtungen.
Backhefe-Zellen (Saccharomyces cerevisiae, Stamm RXII, erhalten von der Biophysikalischen Abteilung der Freien Universität Berlin) wurden bei 30ºC in einem wässrigen Medium, bestehend aus Sucrose (50g/l), Hefeextrakt (5 g/l) und Pepton (5 g/l) gezüchtet. Wachstumskurven für die Hefekultur wurden durch Messen der Änderung der optischen Absorptionsfähigkeit der Hefesuspension während ihrer Massenkultur unter Verwendung eines Doppelstrahlspektrophotometers erhalten. Wenn die Zellen die stationäre Wachstumsphase erreicht hatten, wurden sie geerntet und vier mal in 280 mM Mannitol gewaschen. Die Zellen wurden durch Erhitzen auf 90ºC in einem Wasserbad über 20 Minuten lebensunfähig gemacht, wonach sie, wie zuvor, in 280 mM Mannitol gewaschen wurden.
Die Zellen-Lebensfähigkeit wurde durch Verwendung eines Methylenblau-Beizmittels festgestellt. Das Beizmittel wurde aus drei Stammlösungen hergestellt, mit: [1] Methylenblau (0,250 g/l) in 20 ml destilliertem Wasser, [2] KH&sub2;PO&sub4; (2,722 g) in 100 ml destilliertem Wasser, [3] Na&sub2;HPO&sub4; (0,248 g) in 10 ml destilliertem Wasser. Eine Arbeitslösung wurde durch Mischen von 2 ml von [1], 99,7 ml von [2] und 0,25 ml von [3] hergestellt. Nicht weniger als 0,02 ml Hefe aus Suspension wurde mit 0,8 ml Suspensionsmedium plus 0,08 ml Methylenblau gemischt. Nicht lebensfähige Zellen nahmen den blauen Farbstoff im Zytoplasma auf und konnten von den lebenden Zellen unterschieden werden, welche den Farbstoff nicht in ihr Inneres ließen. Suspensionen mit unterschiedlichen relativen Mengen an lebensfähigen und nicht lebensfahigen Zellen wurden hergestellt durch Mischen in 280 mM Mannitol mit elektrischen Leitfähigkeiten (eingestellt durch Hinzugabe von NaCl) von 1, 10 und 50 mS/m, wie festgestellt bei 50 kHz unter Verwendung von Platinschwarz-Elektroden und einem HP 4192A Impedanz-Analysator.
50 Mikroliter-Proben von solchen Suspensionen wurden auf eine Mikroelektrodenanordnung mit derselben Form wie Fig. 1, welche mittels Standard-Photolithographie hergestellt wurde, und mit einer Form und elektrischen Verbindungen, wie von Huang, Wang, Tame und Pethig in ihrem Dokument "Electrokinetic behaviour of colloidal particles in travelling electric fields: studies using yeast cells" J.Phys. D:Appl.Phys.26 (1993) 1528- 1535 beschrieben ist, pipettiert, um die Zellen den Kräften, die durch elektrische Wanderfelder ausgeübt werden, auszusetzen. Die Elektrodenbreiten hatten eine nominale Abmessung von 14 Mikrometern, der Spalt zwischen benachbarten Elektroden war in der Größenordnung von 6 Mikrometern und der Abstand über dem Kanal zwischen gegenüberliegenden Elektrodenspitzen betrug 30 Mikrometer. Die Spannungsphasen-Verhältnisse waren wie in Fig. 1 gezeigt, so daß die effektive Periodenlänge λ des Wanderfeldes 80 Mikrometer betrug. Diese Abmessungen wurden so gewählt, daß sie die selektivsten TWFM-Effekte für Partikel bereitstellen, wie beispielsweise Hefezellen, welche einen Durchschnittsdurchmesser im Bereich von 6 bis 8 Mikrometern haben. Die elektrischen Wanderfelder wurden durch sequentielles Adressieren der Elektroden mit sinusförmigen Spannungen mit einem Phasenunterschied, wie in Fig. 1 gezeigt, hergestellt, und die Amplitude der angelegten Spannungen betrug 5 V (Spitze-Spitze). Ein Deckglas wurde über die Suspension gegeben und die resultierenden Bewegungen der Zellen wurden durch ein Mikroskop beobachtet.
Beim Untersuchen der TWFM der lebensfähigen Hefezellen bei einer Leitfähigkeit des Suspensionsmediums von 1 mS/m zeigten die lebensfähigen Zellen keine TWFM bei keiner der untersuchten Frequenzen von 1 kHz bis 10MHz und blieben an den Elektrodenrändern und -spitzen gefangen. Bei einer Medium-Leitfahigkeit von 10 mS/m zeigten die lebensfähigen Zellen TWFM im Frequenzbereich von zwischen 8 kHz und 60 kHz und dabei bewegten sie sich entlang des Kanals zwischen den Elektrodenspitzen in eine Richtung entgegengesetzt zu der des auferlegten Wanderfeldes. Bei einer Medium-Leitfähigkeit von 50 mS/m zeigten die lebensfähigen Zellen eine TWFM zwischen 3 kHz und 300 kHz und bewegten sich wiederum entlang des Kanals in die zu der des auferlegten Wanderfelds entgegengesetzte Richtung. Das Verhalten der nicht lebensfahigen Zellen, gekennzeichnet durch ihre Blaufärbung, war jedoch deutlich anders. Bei einer Suspensionsmedium-Leitfähigkeit von 1 msim blieben die nicht lebensfähigen Zellen an den Elektroden bei allen Frequenzen von 1 kHz bis 2 MHz gefangen, zwischen 3 MHz und 10 MHz zeigten sie jedoch eine TWFM und bewegten sich entlang des Kanals in derselben Richtung wie das Wanderfeld. Somit konnten die nicht lebensfahigen Zellen bei einer Medium-Leitfahigkeit von 1 mS/m selektiv von den lebensfähigen Zellen in dem Zellgemisch durch Anlegen eines Wanderfelds von einer Frequenz von 3 MHz entfernt werden. Bei einer Medium-Leitfahigkeit von 10 mS/m zeigten die nicht lebensfähigen Zellen TWFM nur bei Frequenzen oberhalb von 3 MHz und wanderten dabei entlang des Kanals in eine Richtung entgegengesetzt zu der des Wanderfeldes. Somit wurden die lebensfähigen Zellen bei 10 mS/m Leitfähigkeit des Suspensionsmediums durch Anlegen einer Signalfrequenz von 30 kHz selektiv den Kanal hinunter in eine Richtung entgegengesetzt zu dem Wanderfeld bewegt, wohingegen bei einer Frequenz von 5 MHz die nicht lebensfähigen Zellen selektiv entlang des Kanals in dieselbe Richtung wie das Wanderfeld bewegt wurden. Durch Anlegen eines 30 kHz Wanderfeldes an die Elektroden gleichzeitig und in derselben Richtung wie ein 5 MHz Wanderfeld, wurde der Beweis erhalten, daß sowohl die lebensfähigen als auch die nicht lebensfähigen Zellen den Kanal hinab und über die Elektroden gleichzeitig und in entgegengesetzte Richtungen bewegt werden können, so daß ihre vollständige Trennung voneinander vereinfacht wird. Bei einer Medium-Leitfähigkeit von 50 mS/m zeigten die nicht lebensfähigen Hefezellen eine relativ schwache TWFM im Frequenzbereich zwischen 70 kHz und 700 kHz und sie wanderten entlang des Kanals in die entgegengesetzte Richtung zu der des Wanderfeldes. Somit blieben die nicht lebensfahigen Zellen bei einer Medium-Leitfähigkeit von 50 mS/m durch Anlegen einer Wanderfeldfrequenz von 50 kHz an der Elektrode gefangen, wohingegen die lebensfahigen den Kanal hinab in eine Richtung entgegengesetzt zu dem Wanderfeld wanderten. Durch Überlagern eines weiteren Wanderfeldes bei 500 kHz und in die entgegengesetzte Richtung zu dem des 50 kHz Wanderfeldes wurde ein Zeichen der nicht lebensfahigen Zellen, die sich in die entgegengesetzte Richtung zu der der lebensfahigen Zellen bewegen beobachtet, diese Trennungswirkung war jedoch nicht so groß wie die, die bei einer Medium-Leitfahigkeit von 10 mS/m für überlagerte Felder von 30 kHz und 5 MHz beobachtet wurde.
Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit, "behandelte" Partikel und "unbehandelte" Partikel selektiv zu identifizieren und zu trennen und eine Richtlinie der Prinzipien bereitzustellen, die mit der Auswahl der effektivsten Leitfähigkeit des Suspensionsmediums (Flüssigkeit oder Gel) und der Frequenz oder Frequenzen und Richtung des angelegten Wanderfeldes oder Wanderfelder verbunden sind.
Beispiele der möglichen Analysen und Trennungen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Techniken sind wie folgt.
Ein doppelsträngiges DNA-Molekül, an welches ein Protein, wie beispielsweise ein Transskriptionsfaktor (geändertes Partikel) gebunden ist, kann von DNA, welche das Protein nicht aufweist, getrennt werden durch Wahlen von Bedingungen, unter welchen nur das geänderte Partikel wandert und das Protein kann dann abgespalten, isoliert, sequenziert und untersucht werden.
Bei einer Variante des obengenannten kann der Protein-DNA-Komplex von ahnlichen Protein-DNA-Komplexen, an welche ein zusätzliches Protein gebunden wurde (geändertes Partikel), getrennt werden.
Eine Zelle, welche auf ihrer Oberfläche einen Rezeptor für einen Liganden, wie beispielsweise einen Antikörper, Wachstumsfaktor, Neurotransmitter oder anderen biochemischen Boten aufweist, kann von ähnlichen Zellen, an welche der entsprechende Ligand gebunden ist, getrennt werden.
Zellen, welche erfolgreich transfiziert wurden, so daß sie ein neues Genprodukt exprimieren, welches möglicherweise in der Zellmembran lokalisiert ist, können von der ursprünghchen Zellenform unterschieden werden.
Zellen, an welche ein Phage gebunden ist, können von nicht infizierten Zellen unterschieden werden.
Zellen können eine oligonukleotide Sonde haben, die an eine Markierung gebunden ist, wie beispielsweise ein Goldpartikel, welche in sie eingeführt ist, um während der Zellteilung eine komplementäre genomische DNA zu binden, um sich teilende Zellen von sich nicht teilenden Zellen zu unterscheiden.
Die verwendeten Detektionsverfahren sind nicht auf Mikroskopie beschränkt. Wo die geänderten Partikel z.B. einen Farbstoff- oder fluoreszierende Marker aufweisen, kann die Anwesenheit von geänderten Partikeln durch ein entsprechendes Spektrophotometer überwacht werden.
Die Elektroden müssen nicht als eine lineare "Leiter" angeordnet werden. Stattdessen kann die "Leiter" der Elektroden gekrümmt oder in anderer Form nicht linear sein. Sie kann eine Spirale oder Serpentinenbahn bilden oder eine geschlossene Bahn sein, um welche die Partikel sich bewegen.

Claims

1. Verfahren zum Trennen einer ersten Population von Partikeln (12) von einer zweiten Population von Partikeln (12) durch Wanderwellen-Feld-Migration, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren aufweist: Binden eines Liganden (14) an jedes Partikel der ersten Population von Partikeln und Binden einer Markierung (16) an den Liganden, welche dazu dient, die Feld-Migrations-Eigenschaften des dergestalt mit der Markierung durch den Liganden verbundenen Partikels zu ändern, wobei die zweite Population von Partikeln nicht durch den Liganden und die Markierung gebunden ist, und Ausfahren einer Wanderwellen-Feld-Migration der Partikel, um eine Translationsbewegung derselben unter solchen Bedingungen herzustellen, daß die markierte erste Population von Partikeln (12) von der zweiten Population getrennt wird.

2. Analyseverfahren, welches aufweist: Binden eines Liganden (14) an jedes Partikel einer Population von Partikeln (12) und Binden einer Markierung (16) an jeden Liganden, welche dazu dient, die Feld-Migrations-Eigenschaften der dergestalt mit der Markierung (16) durch den Liganden (14) verbundenen Partikel (12) zu ändern, und Ausführen einer Wanderwellen-Feld-Migration der Partikel zum Erzeugen einer Translationsbewegung derselben unter solchen Bedingungen, daß sich die Bewegung der markierten Partikel (12) von derjenigen unterscheidet, welche erzeugt worden wäre, wenn die Partikel nicht markiert wären.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Partikel durch Verwendung eines Lichtmikroskops beobachtbar sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Partikel zu klein sind, um durch Verwendung eines Lichtmikroskops beobachtet werden zu können.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die effektive Wellenlänge des Wanderfeldes 8 bis 12 mal so groß ist wie die Größe des veränderten Partikels, gemessen quer zur Bewegungsrichtung unter Wanderwellen-Feld-Migration.