JPH07506814A - 有機リン酸エステルの免疫学的検出法 - Google Patents

有機リン酸エステルの免疫学的検出法

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JPH07506814A
JPH07506814A JP5514726A JP51472693A JPH07506814A JP H07506814 A JPH07506814 A JP H07506814A JP 5514726 A JP5514726 A JP 5514726A JP 51472693 A JP51472693 A JP 51472693A JP H07506814 A JPH07506814 A JP H07506814A
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ジョーンズ，ウィリアム　トーマス
ウィンベルグ，ハンズ
テン　ホーベ，ウォルター
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ザ　ホーティカルチャー　アンド　フード　リサーチ　インスティチュート　オブ　ニュージーランド　リミテッド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機リン酸エステルの免疫学的検出性 技術分野 本発明はハブテンとしての使用に適した新規打機リン酸エステル化合物、同化合 物の製造法および新規中間体、特異的な有機リン酸エステルと結合しつる抗体、 このような抗体の製造法、かかる抗体を使用する免疫学的検定法、ならびに抗体 を含む検定キットに関する。
背景となる技術 有機リン酸エステル存置生物防除剤は、農業上および園芸上の産物の生産に殺虫 剤として一般に使われる大きい一群の化合物である。これら化合物の多くに対し 大抵の食用作物および製品において法定の最高残留量限界が一国のそして国際的 な取締り機関により規定されている。これらの水準はますます国際的および国内 の機関により監視されつつある。
従って、これら有機リン酸エステル化合物の存在を決定するための国際的に受け 入れられる、簡単、迅速で、信頼できる、携行可能な、鋭敏な、そして費用効果 の高い検定方式に対する要望がある。免疫検定に基づく試験法はこれら必要条件 のすへてを満している。近代的な免疫検定法は二つの重要な現象に基づいている 。即ち、（ｉ）抗体の異常に高い差別力；　（ｉｉ）定量しようとするノ１ブテ ンと抗体との反応を１反応体（抗体とハブテン）の低濃度で可能にする検出方式 、に基づく。免疫検定法においては検出剤として非常に多数の標識、例えば酵素 、放射性トレーサー、化学発光性および蛍光性標識、金属原子およびゾル、安定 遊離基、ラテックスおよびバタテリオファージ、か適用されて来た。
酵素の使用、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）および固相技術はこれら技術の法尻な使 用をもたらした。酵素免疫検定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ　Ｐ 。
−Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎ ｏａｓｓａｙｓ　”ｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅｃｈ獅奄曹浮■刀@ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅ ｌｓｅｖｉｅｒ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Oｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ　０−７２０４−４２００−１　（１９９０）により提供されている。
抗体は大きい抗原分子および小さい生物学的打機分子や合成有機分子の検出、定 量化および精製に役立つ試薬であることが明らかにされた。前者の群はそれ以上 修飾することなく動物に注射でき、適当な免疫応答をひき起こし、抗原を認識す る抗体を産生することになろう。
小さい分子（ＭＲ＜１．０００）は通常動物に注射したとき免疫応答を引き出す ことができない。従って、これら分子はより大きい免疫原性分子（担体）に接合 しなければならない。そのようにすると、小さい分子は一団のエピトープとして 行動し、担体上のＴ細胞受容体の存在下で免疫応答を起こし、その結果差別され たＢ−リンパ球により抗体を産生ずるようになる。
小さい分子はそれを担体と接合するために利用できる官能基と共にスペーサーア ーム（結合手）を導入することによりしばしば修飾する必要がある。小さい分の 余地があるならば、そして分子に対して特異的な抗体をつくりたいならば、分子 上の独特な構造的特徴から空間的に遠い位置に結合手を置かねばならない。結合 手に関するもう一つの４慮すべき点は、結合手そのものの大きさと可能な抗原性 に関するものである。それはこれら結合手が免疫原そのものとして作用し望まな い抗体を生じつるからである。しばしば出会うもう一つの問題は、分子と結合手 か新しいユニットを形成し、免疫系を刺激して抗体をつくり出すかもしれないこ とである。この抗体は新しいユニットを認識するが、望む分子は認識しないかも しれないし、あるいはごく低い親和性しかもたないかもしれない。このような場 合、その抗体は実際上役立たない。
小さい分子に対する抗体の産生を考える場合、これら問題のすべてと取り組む必 要かある。
ｆｌ’ｌ生害防除剤の有機リン酸エステル群は、小さい分子であるので、免疫原 性でなくまたそれらの普通の化学的状態で抗原性を与えようとする場合、これら の大部分は適当な担体タンパク質に容易には接合することもできない。免疫検定 を基本とする試験法の開発に必要な試薬抗体の生産における一つの特別な欠点は 、有機リン酸エステル有害生物防除剤と構造上に類似しているが、また分子を適 当な抗原性タンパク質に接合するために使用できる官能基をも含む新しい分子を 合成するという必要条件であった。これは国際的な研究にとって大きな障害であ ったし、また多くの有毒なあるいは危険な有機リン酸エステルを検出するための 免疫検定に基づく方法の開発を目指す努力を少なからず阻止して来た。
この問題を解決する一つの試みがＰＣＴ特許明細書ＷＯ第９１１００２９４号に 記載されている。前記明細書は、スペーサーアーム化合物であるベーターアラニ ンの保護エステルまたは酸を用いて、リン原子を経て誘導体形成を行なうことに より、有機リン有害生物防除剤（フェニトロチオンおよび密接に関連する有機リ ン酸エステル）の化学的活性化を開示している。
しかし、この方法は一般的種類、 式中、Ｒは任意に置換された芳香族または複素環基であり、各Ｒ１とＲ３はそれ ぞれメチルかエチルである。
に属する有機リン酸エステルにのみ関連し、他の大きい有機リン酸エステル群と は関連かない。従って、その大きな欠陥はあらゆる有機リン酸エステルに対する 抗体の製造には適用できないことである。
発明の要約 本発明の一つの目的は、先行技術の欠点の克服に向かってしばらく進むことであ り、あるいは少なくとも国民に有用な選択を提供することである。
第一の面において、本発明は式、 式中、ＸはＲ−０、Ｒ−３またはＲ−ＮＨからなる群から選ばれ、Ｒは任意に置 換された芳香族基または複素環基てあり、あるいは任意に置換されたアルキルま たはアルケニル基であり、 Ｙは０またはＳから選ばれ、 Ｒ１はＨまたはアルキルであり、そしてＲ２は式−ＣＣＨＪｎ　Ｃ式中、ｎは０ から１０（なるべ（は０から６）の整数である）を有する基、あるいは分岐鎖ア ルキレン、あるいは式Ｒ’−０−Ｒ’式中、Ｒ３およびＲ４は両者とも直鎖また は分岐鎖アルキレンである）を有する基である、 をイＴする化合物、あるいはその塩またはエステルからなると一般に言うことが できる。
更に他の面において、本発明は式、 式中、Ｒ，Ｒ’およびＲ富は上で定義した通りである、を存する化合物からなる 。
更にもう一つの面において、本発明は式、式中、ＸおよびＹは上で定義した通り であり、Ｒ１は−Ｈ，−ＣＨ，、または−ＣＨ，ＣＩ（、であり、そしてＲ４は 上で定義した通りである。
を有する化合物、あるいはその塩またはエステルからなる。
もう一つの面において、本発明は上に定義された式（１）の化合物および式、式 中、ＸはＲ−０、Ｒ−３およびＲ−ＮＨ（Ｒは任意に置換された芳香族基または 複素環基、あるいは任意に置換されたアルキルまたはアルケニル基である）から なる群から選ばれ、Ｙは０またはＳであり、Ｒ１はアルキルである、を有する有 機リン酸エステル化合物の両方と結合しつる抗体またはその結合性フラグメント からなる。
抗体はモノクローナル抗体であるのか便利である。
別法として、抗体はポリクローナル抗体である。
更にもう一つの面において、本発明は抗原性高分子に接合した式（１）または式 （ＩＶ）の化合物からなる免疫接合体からなる。
更に一つの面において、本発明は動物を上に定義された免疫接合体で免疫化する 工程を含む抗体またはそのフラグメントの製造法からなる。
本発明は更に上に定義された方法により製造された抗体または抗体フラグメント を提供するものである。
もう一つの面において、本発明は上に定義された免疫接合体で免疫化した動物か ら得られる抗体産生性細胞を不死化する工程を含むハイブリドーマ細胞系の製造 法を提供する。
本発明はまたこのような方法によってつくられたハイブリドーマ細胞系ならびに かかる細胞系により分泌されるモノクローナル抗体を提供する。
特に本発明は式、 式中、ＸはＲ−０、Ｒ−３およびＲ−ＮＨ（式中、Ｒは任意に置換された芳香族 基またはｒ！１素環基、あるいは任意に置換されたアルキルまたはアルケニル基 である）からなる群から選ばれ、Ｙは０かＳであり、Ｒ″はアルギルである、を 有する有機リン酸エステル化合物に特異的に結合しつるモノクローナル抗体を提 供する。
更に一つの面において、本発明は組換え宿主細胞中でコード化するＤＮＡを発現 させる工程を含む抗体または結合性フラグメントの製造法を提供する。前記ＤＮ Ａは上で定義した免疫接合体で免疫化した動物の抗体産生細胞から得られ、この 場合前記抗体産生細胞は牌細胞である。
本発明は更にかかる方法によりつくられた抗体または結合性フラグメント、およ びとりわけ式、 を有する有機リン酸エステル化合物と特異的に結合しうる組換え型抗体または結 合性フラグメントを提供する。
更にもう一つの面において、本発明は有機リン酸エステルを含むかもしれない試 料中の有機リン酸エステルの存在を検知する方法からなり、前記方法は前記試料 を上で定義した抗体またはそのフラグメントで検定する工程を含む。
更に一つの面において、本発明は有機リン酸エステルを含むかもしれない試料中 の有機リン酸エステルの存在を検知するための検定キットを提供する。前記キッ トは前記有機リン酸エステルに対する抗体あるいは上て定義した抗体の結合性フ ラグメントを含む。
キットは上に定義された免疫接合体を含むのか便利である。
更にもう一つの面において、本発明は試料から有機リン酸エステル化合物を単離 する方法を提供するものであり、本性は、（ａ）　前記試料を上で定義した抗体 またはそのフラグメントと接触させ、そして （ｂ）　前記抗体またはフラグメントによって拘束された有機リン酸エステルを 回収する の工程からなる。
更にもう一つの面において、本発明は有機リン酸エステル化合物で汚染された環 境媒質を浄化する方法を提供するものであり、前記方法は前記媒質を上で定義し た抗体またはフラグメントと接触させて前記化合物を前記媒質から除去する工程 を含む。
更に他の面において、本発明は本明細書中にこれから記述される式（１）の化合 物の製造法を、かかる製造過程中に生ずる種々な新規中間体化合物と共に提供す る。
発明の詳細な説明 本発明を上で広く定義したが、本発明はこの定義に限定されるのではなく、下記 の記述が例を提供する具体例も包含することは当業者にとって明らかであろう。
とりわけ、本発明の種々な面は下記の一層詳細な説明を参照すればよりよく理解 されるであろう。
Ａ、有機リン酸エステルハブテン 本発明はその第一の面において新規有機リン酸エステル化合物（本明細中で「ハ ブテンＪと呼ぶ）を提供する。
これらハブテンは広く言えば式、 式中、ＸはＲ−０、Ｒ−３またはＲ−ＮＨ（Ｒは任意に置換された芳香族基また はＰｉ素環基、あるいは任意に置換されたアルキルまたはアルケニル基である） であり、ＹはＯまたはＳであり、Ｒ１はアルキルである、を有する有機リン酸エ ステル化合物に基礎をおくものである。
本発明ハブテンは適当な高分子（例えばタンパク質）に接合させることによって 抗体を産生てきる免疫接合体を形成させることに適していることが要求される。
この必要条件を満すため、本発明ハブテンは上で定義した一般式（＋）を有する 。
式（］）中、ＸはＲ−０、Ｒ−ＳまたはＲ−ＮＨでよく；Ｙは０かＳでよい。Ｘ およびＹに対して異なる基を当てはめると、それぞれ式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ ＩＣ）、（ＩＤ）、（ＩＥ）および（ＩＦ）の化合物か得られる。
上記式中、Ｒは特定の「親」有機リン酸エステルを限定するとの構造もとりつる 。従って、Ｒは任意に置換された芳香族基または複素環基、あるいは任意に置換 されたアルキルまたはアルケニル基のいずれかである。Ｒに対する幾つかの典型 的な構造を表１に示す。
ｊ［ｔ 上記式中、Ｒ１は水素またはアルキル基（とりわけＣ１−Ｃ，アルキル）でよい 。
しかし、好ましくは、ハブテンをタンパク質高分子に接合し抗体の製造に使用し ようとする場合、Ｒ１は通常水素、−ＣＨ，または−ＣＨｔＣＨｓから選ばれ、 Ｒ１はＨあるいは−ＣＨ，であるのが現在最も好ましい。
上記式中、Ｒ１は式−（ＣＨ，）ｎ−（式中、ｎは０からＩＯの整数、一層好ま しくは０から６の整数である）を有する基、あるいは分岐鎖アルキレン、あるい は式Ｒ”　−０−Ｒ’　（式中、Ｒ３とＲ′はそれぞれ直鎖または分岐鎖アルキ レンである）を存する基から選ばれる。
特に適当な具体例においては、Ｒ′は式Ｒ″−０−Ｒ’　（式中、Ｒ１は−ＣＨ ，−てあり、Ｒ４は直鎖または分岐鎖アルキレンである）を有する基である。
を有する式（＋）の化合物の亜群を与える。
本発明の最も適当な具体例は式（］■）において、ＸとＹは上で定義した通りで あり、Ｒ１は水素か−Ｃ１，、モしてＲ４は−ＣＨｌ−である化合物である。
Ｂ、　ｆｒ機リン酸エステルハブテンの製造Ｒ２がＲ’−０−Ｒ４である式ＩＡ 、　１８およびＩＤの化合物は、合成経路Ａとして示されＢｌ（ｉ）　、Ｂ２お よびＢ４て一般的に後述される反応スキームを用いて製造できる。
この反応スキームは一般式、 式中、Ｒ１はＨまたはアルキルであり、Ｒ３はアルキルである。
を有するトリオールの使用に基づいている。このトリオール、２−ヒドロキシメ チル−２−メチル−１，３−プロパンジオールは低価格で商業的に入手容易であ り、便利な出発原料を提供する。
式ＩＡにおいてＲ２がＲ″−０−Ｒ４である化合物の別の一般的製造法を８．１ （ｉ　ｉ）て述へる。
式ＩＣにおいてＲ１かＲ’−０−Ｒ’である化合物は、下記８．３に一般的に説 明されているように製造できる。
Ｒ２が−（ＣＨ２）ｎ−または分岐鎖アルキレンである式Ｉの化合物は合成経路 ＢおよびＣとして示され下記８．６に説明された反応スキームを用いることによ り製造できる。
Ｒ”ｆ）＜Ｒ”−０−Ｒ’である式ＩＢおよびＩＦの化合物は下記８．５で一般 的に説明されているようにして製造できる。
合成経路Ａ 工＾　ＩＩＩ　ｘＤ 合成経路口 川　ｎ 毅　社 ｕ　ｕ　ｎ ｕ　２ｆＩ 合成経ｍｃ 合成径１１ＲＡ、ＢおよびＣで述べられた中間体化合物は、全部ではないにして も殆どは新規であることは明らかてあろう。このような中間体化合物は本発明に 更に一つの面を提供するものである。
セトンケタールとして保護し、弐Ｃの化合物を得ることによりつくられる３、　 アセタール部分を温和な条件下で（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸ビリジ体混 合物として）に変換する。
５、　弐１［ＩＡ（エステルとして、このときもまた異性体の混合物として）の ハブテンへの変換は、適当な溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中水 めるアルコール（典型的に芳香族アルコール）の陰イオンとの反応により達成で きる。
６、式［Ａのハブテンを得るには、カルボン酸部分を選択的に加水分解する（リ ン酸エステルを加水分解することなく）。この選択的加水分解を行なうのに特に 適した試薬は炭酸カリウムである。
リメチルホスファイトおよびトリエチルアミンと反応させて式、の化合物を得る ことによりつくられる。
このようにして得られた式Ｖｌの化合物を式、式中、Ｘはハロゲン（例えば、ク ロラール）である、を有する化合物と反応させて式Ｖｌｌ のメチルエステルを得る。
このメチルエステルを次に選択的に加水分解して式（ＶＩ［Ｉ）　（式ＩＡの化 合物の亜群）、 式中、Ｒ’　、Ｒ”およびＲ１は特異的な［親Ｊ有機リン酸エステルを限定する 基のとれかをとりつる、 を有する化合物を得る。従って、各Ｒ７、ＲｔおよびＲｏはそれぞれ水素か、ま たは任意に置換された芳香族基または複素環基、あるいは任意に置換されたアル キルまたはアルケニル基である。
式ＩＡの化合物についてバラグラフＢ、１（ｉ）で概略を述べた工程ｌから６を たどることにするが、ただし、塩化チオホスホリル（塩化ホスホリルの代り）を ジオール旦と反応させて式１１Ｂ　（工程４′）の化合物を得、次にこのものを 、同様にして、即ちめるアルコールＲＯＭの陰イオンとの反応により（工程５′ ）、式１１１Ｂのハブテンエステルに変換する。そのようにして得られるカルボ ン酸エステルを、例えば水酸化リチウムあるいは、より好ましくは炭酸カリウム 、のいずれかを用いて選択的に加水分解し式ＩＢの化合物を得る。
式ＩＢの特に適当な化合物は、Ｒが任意に置換された芳香族基、複素環基または アルケニル基であるものである。Ｒがアルキル基の場合、式ＩＢの化合物は不安 定であり、部分的に転位して式ＩＣの化合物になることがある。
Ｂ　３　式１ｃの化合物（例えば、デメトンに対するハブテン）の製造１、　式 Ｒ”−ＯＨＣ式中、Ｒ”は任意に置換されたアルキル基である）のアルコール（ 例えば、エチルチオエタノールとｒＢｕ−Ｌｉ）を式ＪＩＢ　（このものはパラ グラフ８．２に記載のようにして調製できる）の化合物と反応させて式（ＩＸ） 、を有する化合物を得る。
２　このようにして得た式（ＩＸ）の化合物を選択的に加水分解しく例えば、に ＊ＣＯ＊を使用）、酸性にする（例えば、ＩＣｌを使用）。
３、　工程２の生成物は徐々に異性化してより安定な式ＩＣ（上で定義した通り 、Ｒ２はＲ’−０−Ｒ’）のチオリン酸ｏ、　Ｏ，Ｓ−トリエステルを生ずる。
こて式！１Ｄの塩をつくる（工程４′）。なるへくはメタノール中水酸化カリウ ムを用いてヒスカリウム塩（Ｑ°゛はに゛である）をつくるのがよい。次にこの 塩１１０を強酸で処理してカルホギシレートをプロトン化し、続いて式Ｒ＠−Ｃ Ｈ，Ｙ　（式中、Ｙはハロゲンであり、Ｒ１はＲに対して定義した通り）の化合 物と反応させてめるハブテンを得る（工程５″）。例えば、アジンホスに対する ハブテンを得るには、塩１１Ｄをｌ当量の塩酸で処理し、続いてクロロメチルベ ンゾトリアジニオンと反応させる。
８、　５　式ＩＥおよびＩＦの化合物の製造合成経路Ａの工程ｌから４または４ ′を先ず実施することにより式［ＩＡの化合物（もし式ＩＨの化合物を望むなら ば）または式１１Ｂの化合物（もし弐［Ｆの化合物を望むならば）のいずれかを つくる。
そのようにして得られる式＋１ＡまたはＩＩＢの化合物を次に式Ｒ−聞、（式中 、Ｒは式ＩＡについて定義した通りである）のアミンの陰イオンで処理して式＋ ［Ａの化合物からは また式ＪＩＢの化合物からは の化合物を得る。
次に式（Ｘ）または（ＸＩ）の化合物を、例えば炭酸カリウムを用いて選択的に 加水分解し、それぞれ式ＩＥまたはＩＦの化合物を得る。
Ｂ、６　Ｒ”か−（ＣＨｚ）ｎ−または分岐鎖アルキレンである式Ｉの化合物の 製造Ｒ１かＨてＲ２か−（ＣＨりｎである式（Ｄの化合物は合成経路Ｂを用いる ことにより製造できる。合成経路Ｂに示した特定の反応スキームは有機リン酸エ ステルパラチオンに対するハブテンの製造である。各工程で用いる試薬は例に詳 しく述べられており、それに従って化合物２６の製造が説明されている。
もしバラチオン以外の有機リン酸エステル化合物に対するハブテンをつくりたい ならば、合成手順の最終工程（化合物並からの）を、合成経路への最終工程（化 合物旦からの）と類似の適当な工程で置き換えることができるか、それは製造し ようとする式（＋）の化合物によって左右される。
また出発原料として１．　４−ジブロモブタンより長い、あるいは短がい、ジハ ロアルカンを用いることにより、Ｒ１が反応スキームに示された−（ＣＨｓ）− 一基よりも長いか短かい式（＋）の化合物を製造することも可能である。
Ｒｔが分岐鎖アルキレンである化合物も、なるべくは合成経路Ｂにより、出発原 料として例えば の置換ジハロアルカンを用いて製造できる。
別法として、分枝鎖化合物は合成経路Ｃを用いて製造できる。先ず合成経路Ｂび 合成経路Ａの工程と同様である。
もしＲ１が−（ＣＨｔ）ｎ−で、Ｒ１かアルキルである式（１）の化合物をつく りたいならば、合成経路Ｂを相応に修飾すればよい。例えば、Ｒ１が−ＣＨ，で 、Ｒ８がよびＣＨ，Ｉと反応させて式、 ！！ の化合物を得ることにより製造される。
次に合成経路Ｂの残りの工程を実施すれば、化合物＋９ａを式Ｉの化合物に変換 できる。
８、　７　実施例 −０−ＣＨ２−である式（［Ｂ）の化合物であり、合成経路Ａを用いてつくられ た。化合物上スは式（ＩＡ）　（Ｒ１が−ＣＨ，、Ｒ”は−ＣＨ，−０−ＣＨ， −）の化合物であり、これも合成経路へを用いてつくられた。化合物１３および １６は式（［０）　（Ｒ’は−ＣＨ３、Ｒ２は−ＣＨ２−０−Ｃ１１，−）の化 合物であり、合成経路Ａを用いてつくあり、上記８．１（ｉｉ）に一般的に述べ られた反応スキームを用いてつくられた。化合物上ヱは式（ＩＣ）　（Ｒ’は− ＣＨ，、Ｒ１は−ＣＨ−ＯＣＨ２）の化合物であり、上記８．３に一般的に述べ られた反応スキームを用いてつくられた。
化合物並は式（１０）　（Ｒ’はＨ，Ｒ”は−（ＣＨ２）４−）の化合物であり 、８．６に一般的に述べられた合成経路Ｂを用いてつくられた。
すべての場合に、例中に記載の製造手順において出発原料として示された化合物 番号は、その製造法かすぐ前の例に述べられた特定の化合物に相当する。
２−ヒト七キシメチルー２−メチル−１，３−プロパンジオール（２４０ｇ。
２モル）、アセトン（１２０ｇ、２モル）、ｐ−トルエンスルホン酸結晶数個、 およびベンゼン８００ｍｌからなる混合物を、水の共沸除去下、２４時間還流加 熱した。反応混合物を回転蒸発により濃縮し、残留物をクーゲル−ロール蒸留法 により精製した。これにより沸点８０°Ｃ１０，２ｍｍＨｇを有するめるアルコ ール２８８．８ｇ（１，８０５モル、９０９６）を得た。
２−　（２，２，５−）リフチル−１，３−ジオキサン−５−イル）メトキシ酢 酸、水素化ナトリウム分散液１８８ｇ（鉱油中５０−５５％、ヘキサンで一回洗 浄、２．４６モル）へ、トルエン２０００ｍｌを加え、続いてトルエン約１００ ｍ１に溶かしたアルコール±　１７８ｇ（１，１１モル）を加えた。この混合物 を窒素下に６０−７０°Ｃて１．５時間撹拌加熱した。灰色を帯びた懸濁系を冷 却し、トルエン２００ｍｌに溶かしたブロモ酢酸（ブロモ酢酸を初めに融解する ことによりトルエン中に溶かす’）１８７ｇ（１，３６モル）を氷冷しっつ４５ 分て加えた（発泡する、反応混合物のｆ！Ａ度は２０から３０°Ｃ）。反応混合 物を加温し、トルエン５００ｍ１を加えてよくかきまぜられるようにし、次に機 械かきまぜを行ないつつ２日間還流加熱した。この時間後懸濁系を生じたか、大 部分の固体物質はガラス壁に付着していた。回転蒸発によりトルエンをできるだ けよく除去し、残留物へＤＭＦ　３０００ｍｌを加えた。混合物を約２時間、即 ち固体がＤＭＦ中にかなりよく懸濁するまて、かきまぜた。この懸濁液を氷て約 ＩＯ°Ｃに冷却しくもっと低温にすると凝固を起こす）　、ＤＭＦ　２００ｍｌ ｍｌ中ヨークメタン００ｇ、１．４０８モル）を撹拌、冷却しつつ加えた。
室温で３日間かきまぜた後、撹拌容易な懸濁系を回転蒸発させた。残留物にトル エン（２Ｅ）と１０％重炭酸ナトリウム溶液（ｉＩりをかきまぜながら加えた。
次に混合物を真空下に濾過し、固体を水５００ｍ１およびトルエン５００ｍ１で 洗浄した。存機層を分離し、水１！て洗浄し、次に硫酸ナトリウムと若干の炭酸 カリウムとの混合物で乾燥し、濾過し、蒸発させた。０．　２ｎｍ１ｇでのクー ゲル−ロール蒸留法によりめる生成物１７５ｇ（０，７５４モル、６８％）を得 た。＋Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：δ０．８５（ｓ、　３Ｈ）、　１．３５（ｓ 、　３Ｈ）、　１．４０（ｓ、　３Ｎ）、　３．５−３．７（ＡＢ、　SＨ）。
３．５（ｓ、　２１（）、　３．７（ｓ、　３Ｈ）、　４．１（ｓ、　２Ｈ）。
”Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：δ１７．９．２０．７．２６D６゜ ３４．３．５１．６．６６．２．６８．７．７４．５．９７．８．１７０．９゜ 水素化ナトリウム分散液１５７ｇ（鉱油中５５−６５％、３．６０〜４．２５モ ル、３００ｍ１のへキサンで２回洗浄）へ、ＤＭＦ　８００ｍｌを加え、続いて ＤＭＦ　２００ｍｌ中アルコール±　２８５ｇ（１，７８モル）を約１時間で加 えた（反応混合物の温度が２０〜３０°Ｃに留まるように氷水浴で冷却）。混合 物を室温で３時間かきまぜ、次にＤＭＦ　５００ｍｌ中ブロモ酢酸２４９ｇ（１ ，７９モル）を２時間にわたり水冷および機械撹拌しつつ加えたく反応混合物の 温度は１６〜２２°Ｃに留まる）。すべての酸を加え終って間もな（固体塊を生 じたので、撹拌可能な物質を得るためＤＭＦ　Ｉ！！を加えた。この懸濁系を室 温で一晩かきまぜて部分凝固した混合物を得、次に３０℃まで加温してかきまぜ られる懸濁系を得た。３０°Ｃて２時間かきまぜ後、硫酸ジメチル２１０＋＋＋ １（２，２２モル）を３０〜３５°Ｃにおいて２時間で加えた（若干の冷却を必 要とする）。このうすい懸濁系を室温で５時間かきまぜ、次に部分的に回転蒸発 させてＤＭＦの大部分を除去した。この残留物へ水１１およびトルエン１１を加 え、混合物を振盪し、層を分けた。水層をトルエン７５０ｍ１で抽出し、合わせ たトルエン層を水２Ｘ１ｆて洗浄した。トルエン層の乾燥、蒸発後、残留物をク ーゲル−ロール蒸留法により精製した。これによりめる生成物２４０．２ｇ（１ ，０３５モル、５８％）４５０ｍ１中の溶液へ、ｐ−）ルエンスルホン酸ピリジ ニウム６．９ｇ（２７，５ミリモル）続いて水１２０ｍ１を加えた。溶液を４時 間かきまぜた。このかきまぜ時間中に合計４００ｍ１の水を１００ｍ１ずつ加え た。得られた溶液を回転蒸発させ、残留物にトルエン１００ｍ１を加え、溶液を 回転蒸発させ、再びトルエンｌｏＯ＋ｎｌを加え、溶液を回転蒸発させた。これ により９０ｇの残留物が得られ、これをそのまま後の反応に使用した（クーゲル −ロール蒸留法による精製を試みたところラクトン化を起こした）　。’ＩＩ− ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｍ）：　δ０．８（ｓ、　３Ｈ）、　３．４（ｓ、　２Ｈ）、 　３．５（Ｓ、４Ｈ）、　３．６（Ｓ、　２Ｈ）、　３．７（Ｓ、　３Ｈ）、　 ４．１（Ｓ、　２Ｈ）。
２−（２−クロロ−５−メチル−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル 。
２−スルフィド）メトキシ酢酸、メチルエステル　４上で得た粗製ジオール３２ ７．３ｇ（即ち、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム３，１ｇを含む）をトル エン１００ｍ１に溶かし、次にピリジン（２５ｍｌ。
０．３１６モル）を加えた。混合物を１０〜１５°Ｃに冷却し、次いて塩化チオ ホスホリル（蒸留したもの、２６ｇ、０．１５３モル）を３分間にわたり加えた （混合物の温度は２５〜３０°Ｃに上昇）。この懸濁系を室温で一晩かきまぜ、 水２５０ｍ１中に注入した。トルエン（１００ｍ１）を加え、混合物を振盪し、 層を分けた。有機層を水２５０ｍ１で洗浄し、水層をトルエン１００ｍ１で抽出 した。合わせたトルエン層を硫酸ナトリウム上て乾燥し、次いて回転蒸発させた 。残留物を若干のトルエンに溶かし、酸化アルミニウムのカラム（５Ｘ３ｃｍ） 上で濾過し、生成物をｌ−ルエンて溶離した。濾液を蒸発させ、残留物をエーテ ル３０ｍ１およびリグロイン（沸点４０〜６０°Ｃ）３０ｍｌの混合物と一晩か きまぜた。−１０°Ｃに２時間冷却後、懸濁系を吸引濾過し、団体をエーテルと りグロビンの２／３混合物で洗浄した。これにより１２．９５ｇの生成物か得ら れ、このものはＮＭＲにより主として一異性体であると思われる。結晶化の濾液 を蒸発させ、それにより１２．７２ｇの残留物を得た。このものはＮＭＲにより 結晶性異性体と液体異性体との１／２混合物であると思われる。合計収率は２５ ．６７ｇ　（８８，０ミリモル、アセタールエステル２に基づき収率７１％）。
結晶性異性体はδ０，９．３．７および４．ｌｐｐｍに単一線を有する。両異性 体は６３．８〜４．　８ｐｐ＠領域に多重線を有する。
２−（２−クロロ−５−メチル−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル 。
４の製造と同一の方法で、塩化チオホスホリルの代りに塩化ホスホリルを使用す ることにより酸素類縁体５をつくった。粗製生成物を酸化アルミニウム上で濾過 後、トルエン溶離液を蒸発させ、生成物（２１，８ｇ、８０ミリモル、アセター ルエステル２に基づき収率６３９６）を二異性体の油状混合物として得た。真空 蒸留による精製を試みたところ殆ど完全に分解した。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｍ ）：　δ１．０（ｓ）。
１．３（ｓ）　（比的２／１）、３．　３−４．　７　（ｍ）、３．４．３．７ および４．　１に単一線を有する。
イル、２−スルフィト）メトキシ酢酸、ビスカリウム塩　６に溶かした。三硫化 リン（３５，４ｇ、０．１４４モル）を加え、懸濁液を６０〜７０°Ｃで１時間 、次に室温で一晩、次に８０〜９０°Ｃで３時間かきまぜた（三硫化リンの大部 分はこの加熱の過程で溶解する）。混合物を真空下で濾過し、固体を若干のトル エンて洗浄した。濾液を蒸発させ、残留物にメタノール２００ｍ１を加え、続い てメタノール１００ｍ１中水酸化カリウム３０ｇを１５分にわたり加えた（冷却 しつつ加える、温度は約３５°Ｃに上昇）。得られた懸濁系を真空で瀘だ。この ものはエタノールと水との混合物から再結晶できる。　’Ｈ−ＮＭＲ（ＤｔＯ） ：１．０（ｓ、　３ｔｌ）、　３．５（ｓ、　２ｔ（）、　３．９．４．０．（ ｓ、　４Ｈ）、　４．２５（ｓ、　２１１）。
鉱油中水素化ナトリウム（５０〜５５９６．１．９４ｇ、４４．４ミリモル、４ ０ｍ１のりグロビンで２回洗浄）へ、ＤＭＦ　５　Ｏｍｌ、続いてトリクロロビ リジノール（９２ｇ、４６．３ミリモル、少量ずつ１０分間にわたり添加）を加 えた。
３０分かきませた後、上で得た結晶性異性体４（１０，１５ｇ、３５．１８ミリ モル）次にＤＭＦＩ　Ｏｍｌを加えた。室温で３日間かきまぜた後、混合物を水 ５００ｍ１に注いだ（この水は重炭酸ナトリウムｌＯｇを含む）。生成物をクロ ロホルム５００ｍ１および２５０ｍ１で抽出し、合わせた有機層を水５００ｍ１ で洗浄し、次いて乾燥し、蒸発させた。残留物（放置すると固化）の重量は１５ ．０ｇであった。このものはエーテルとりグロビンのＩ／Ｉ混合物とかきまぜる ことにより精製でき、それにより一異性体として生成物を得ることかできる。− ’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：６１．０（ｓ、　３Ｈ，３，８（ｓ、５Ｈ）、　 ４．２（ｓ、　２Ｈ）、　４．２−４．４（亀４１（）、　７．９（ｓ、@ＩＨ ）。
”Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１，二　δ１６．１．　３６．２．　５１．７．　６Ｂ、 ５．　７１．８．　７３，９．　７４．０．　１２＋、０゜３．７．３．９およ び７．　９ｐｐｍに単一線を、またδ３．　７−４．　８ｐｐｍに単重線を有す る。
２−（５−メチル−２−（３，５，６−）リクロロビリジンー２−オキシ）−１ ゜上で得た粗製？　（１５，０ｇ）にＴＨＦ　７５ｍｌ、次いでメタノール７５ ｍ１を加えた。水３５ｍ１中炭酸カリウム（５，２８ｇ、３８．３ｇリモル）の 溶液を１０分間にわたって加え、続いて水５０ｍ１を１５分間にわたり加えた。
２時間かきませた後、５００ｍ１の水を加えた。混合物をトルエンとエタノール との３／１混合物４００ｍ１でまたトルエン３００ｍ１で抽出した。合わせた有 機層を水２５０ｍ１で洗浄し、次いて乾燥し、蒸発させて未反応エステル７を得 た。合わせた水層を１０ｍ１のｆＱ酸て酸性にし、次にトルエン４ｘ２５０ｍｌ で抽出した。合わせたトルエン層を乾燥し、回転蒸発させることにより残留物を 得、これを温メタノール１００ｍ１に溶かした。水（約６０ｍ１）を加え、続い て若干の種結晶を加えた。室温で若干時間かきまぜた後、沈殿を真空濾過により 集めた。このものは６．　５０ｇの目方かあり、ＮＭＲにより一異性体であると 思われた。同じ手順を用いて濾液から更に１．７８ｇの８が得られ、これはＮＭ Ｒによるとより可溶性の異性体と難溶性異性体との３／２混合物からなっていた 。合計収量は８．　２８ｇ（１８，９７ミリモル）で、塩化物４に基づく収率は ５４％である。同様に、上で得た塩化物４の油状混合物から酸８が（メタノール −水精製後）より可溶性の異性体と難溶性異性体との５／２混合物として得られ た。難溶性異性体に対する’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ□）：δ１．０（３Ｈ）、　 ３．７（２Ｈ）、　４．８（２Ｈ）、　７．８（ＩＨ）および８．９（ＩＨ，ブ ロード）に単一線、そして６３．　８−４．　９に多重線を存する。溶は易い異 性体はδＩ　３．３．４（ブロード）、および７．８に単一線、そして６３．７ −４９に多重線を有する。
２−〔５−メチル−２−（４−ニトロフェノキシ）−１，３，２−ジオキサホス ホリナン−５−イル、２−スルフィド〕メトキシ酢酸、メチルエステル　９水素 化ナトリウム（＋、ｌｏｇ、５０−５５％、２２．９ミリモル、３０ｍ１のりグ ロインで１回洗浄）とＤＭＦ　（３０＋ａｌ）との混合物へ、４−二トロフェノ ール３．ＯＯｇ　（２１，６ミリモル）を０．５ｇずつ加えた。１時間かきまぜ た後、５．１５ｇ（２０ミリモル）の結晶性塩化物４を加え、混合物を室温で３ 日間かきまぜた。反応混合物２５０ｍ１の４％重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ、 生成物を２５０ｍ１のトルエンで抽出した。水２Ｘ２５０ｍｌで洗浄後、乾燥し 蒸発させることにより粗製生成物を３／２異性体混合物（ＮＭＲによる）として 得た。５０ｍ１のエーテルを加えて固体を得、濾過し、エーテルで洗浄した後の 目方は２．０７ｇであった（ＮＭＲによれば一異性体であり、これは粗製生成物 中の主要異性体である）。同様にして、塩化物工の油状混合物５．１５ｇから粗 製生成物を得たが、そのＮＭＲは結晶性の４から得た粗製生成物のＮＭＲと殆ど 同一であった。
エーテルでの処理で１．５９ｇの一異性体を得た。両生酸物のエーテル濾液を合 わせて蒸発させ、５０ｍ１のエーテルおよび若干のりグロインて処理し、次いで 一１５°Ｃて貯蔵することにより３．４５ｇの生成物（より可溶性の異性体と難 溶性異性体との３／２混合物）を得た。合計収量７．３１ｇ（１８，７ミリモル 、収率４７９６）。難溶性異性体の’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：　１．０（ｓ 、　３Ｈ）、　３．７（ｓ、　５Ｈ）、　４．１（ｓ、４Ｈ）、　４．３５（Ａ Ｂ、　２Ｈ）、　７．１−８．２（ＡＢ、　４Ｈ）。より可溶性の異性体は１． ３ｐｐｍに単一線をもち、３．　４−４．　９ｐｐｍの範囲に３．４．３．７お よび４．０ｐ四の単一線を含む複雑な様相を示した。
２−〔５−メチル−２−（４−ニトロフェノキシ）−１，３，２−ジオキサホス ホリナン−５−イル、２−スルフィド〕メトキシ酢酸　１０（バラチオンハブテ メタノール７０ｍ１中難溶性エステル９　３．６６ｇ（９，３６ミリモル）へ、 溶液を生ずるまでＴＨＦを加えた（ＴＨＦ約２０ｍ１）。水／メタノール１／３ ２０ｍ１中水酸化リチウム（２３２ｍｇ、９．６５ミリモル）をかきまぜなから ３０分て加えた。混合物を１時間かきまぜ、次に水５００ｍ１中に注いだ。この 溶液をトルエン２５０ｍ１で抽出し、これを水５０＋ａｌで洗浄した。合わせた 水層を１．　５ｍｌの濃塩酸で酸性にし、次にトルエン２Ｘ２５０ｍｌで抽出し た。トルエン層を乾燥し、蒸発させて固体残留物を得、これをエーテルとかきま ぜた。エーテルを濾過し、洗浄して１．２６ｇの難溶性異性体を得た。
同様にして、上で得たエステル１の混合物３．４５ｇから、エーテル処理の後に 、より可溶性の異性体（異性体比２／ｌ）１．Ｏｌｇを得た。これら両方の反応 の合わせた濾液から、エーテル処理後に、異性体のほぼｌ／１混合物を更に０． ７９ｇ得た。合計収量：３．０６ｇ（８，１２ミリモル、４３％）。難溶性異性 体の’）ｌ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１，：δ１．０（ｓ、　３Ｈ）、　３．６−４．６ （ｎ＋）、　３．８（ｓ）、　４．２（ｓＸ８Ｈ）、　V．５−８．６ （ＡＢ、　４Ｈ）。
より可溶性の異性体はδ１．　３．３．４５および４．ｌｐｐｍに単一線を示し た。
２−〔５−メチル−２−（４−ニトロフェノキシ）−１，３，２−ジオキサホス ホリナン−５−イル、２−オキサイド）メトキシ酢酸、メチルエステルｌ！水素 化ナトリウム（３，１４ｇ、５０−５５％、７２ミリモル、４０１１１１のりグ ロインで１回洗浄）とＤＭＦ７５ｍｌとの混合物へ、４−ニトロフェノール１０ ゜２ｇ（７３，４ミリモル）を１０分間にわたり加えた。更に３０分間かきまぜ た後、ＤＭＦ２０ｍｌ中塩化物５　（１６，９ｇ、６２．　０ミリモル）を加え た。混合物を室温で３０間かきまぜ、次に２９６重炭酸ナトリウム溶液５００ｍ １中に注いだ。
生成物をトルエン５００ｍ１て抽出し、トルエン層を水２ｘ５００ｍｌで洗浄し 、次に乾燥し蒸発させた。この残留物（３／２比の二異性体からなる）にエーテ ル１００ミリを加え、混合物を２時間かきまぜた。固体を濾別し、エーテルで洗 浄して主に主異性体からなる１２．６ｇを得た。濾液を蒸発させると主に池の異 性体からなる７、９４ｇが残った。合計収量：１９．５４ｇ（５２，Ｉミリモル 。
８４９６）、ｉｌ溶性異性体の’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：　δ１．０（ｓ、 　３Ｈ＞、　３．７（ｓ、　５Ｈ）、　３．９−４．８（ｍj および４．１５（ｓＸ６Ｈ）、　７．２−８．３（ＡＢ、　４Ｈ）。
より可溶性の異性体の’ｌ（−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ□・δ１．３（ｓ、　３１（） 、　３．４（ｓ、　２）り、　３．７（ｓ、　３Ｈ）、　３D９− ４、９（ｍ）および４．０（ｓＸ６Ｈ）、　７．２−８．３（ＡＢ、　４）１） 。
２−〔５−メチル−２−（４−ニトロフェノキシ）−１，３，２−ジオキサホス ホリナン−５−イル、２−オキサイド）メトキシ酢酸！２（パラオキソン　ハブ 体）の溶液へメタノール１００ミリを加え、続いて水５０ｍ１中炭酸カリウム（ ４，２０ｇ、３０．４ミリモル）の溶液を滴加した。（滴加時間は１５分）。
その後更に１００ｍ１の水を５分間にわたり加えた。室温で９０分かきまぜた後 、反応混合物を水７５０ｍ１の中に注いだ。トルエン２Ｘ３００ｍｌで抽出し、 続いてトルエン層を水１５０ｍ１で洗浄し、乾燥し、蒸発させることにより出発 エステル±±　２．９６ｇを得た。合わせた水１を約６ｍｌの濃塩酸で酸性にし 、次にトルエン３Ｘ３００ｍｌで抽出した。これらトルエン層を乾燥し、回転蒸 発させて固体残留物を得、これを若干のエーテルとかきませた。
濾過し、エーテルで洗浄して酸１２　４．７０ｇ（１３，０ミリモル、収率４８ ９６）を得た。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１＊／ＤＭＳＯ−ｄａ）：δ０．９５（ｓ 、　３Ｈ）、　３．７（ｓ、　２Ｈ）、　３．９−４．U （ｍ）および４．０５（ｓＸ６Ｈ）、　７．２−８．２ＣＡ＆　４Ｈ）。
上で得たＩＩのより可溶性の異性体を水酸化リチウムを用いて加水分解する試み は、リン酸エステルの完全加水分解という結果になった。
２−（（５−メチル−２−（（４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３ （４Ｈ）−イル）メチル−チオ）−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イ ル、２−スルフィド〕〕メトキシ酢酸１３（アジンホス　ハブテン）メタノール １００ｍ１中ビスカリウム塩６　（８，７１ｇ、２５．０３ミリモル）の懸濁液 へ、ａ＠酸（２，９３ｇ、ｄ　１．１？２，２７．７ミ’Ｊモル）、続いて水２ ０ｍ１を加えた。生じた透明な溶液を完全に蒸発させた。その残留物へ無水エタ ノール７５ｍ１を加え、混合物をかきまぜ、溶液が得られるまで加温し、次にト ルエン７５ｍ１を加え、混合物を完全に蒸発させた。この残留物にトルエン１０ ０ｍ１を加え、混合物を再び回転蒸発させた。固体残留物へ、アセトン７５ｍ１ を加え、続いて３−クロロメチル−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ） −オン（４，３４ｇ、２２．２ミリモル、　Ｃｈｅａ　Ａｂｓｔｒ　５土　２８ ８８１に従い調製）を加えた。混合物を室温で５日間かきまぜ（反応は２日後に 殆ど完了する）、次に真空濾過し、固体の塩を若干のアセトンで洗浄した。濾液 を蒸発させ、残留物を炭酸カリウム（４，４４ｇ、３２．１７ミリモル）、水４ ００ｍ１およびトルエン４００ｍ１からなる混合物と１５分かきまぜた。水（２ ５０ｍ１）を加え、層を分けた。水層をトルエン２５０ｍ１で抽出し、合わせた 水層を約９，５ｍｌの濃塩酸で酸性にし、生成物をトルエン３Ｘ２５０ｍｌで抽 出し、水１５０ミリで洗浄し、次物をトルエン５０ｍ１、水中４０％ジメチルア ミン２゜４ｇ（２１，３ミリモル）、および透明溶液を得るのに必要なだけのメ タノールとかきまぜた。この溶液を完全に蒸発させ、残留物をトルエン７５ｍ１ と３日間かきまぜた。懸濁系を真空濾過し、固体を若干のトルエンで洗浄するこ とにより±王のジメチルアミン塩５．６５ｇ（１１，９ミリモル、且に基づき収 率４７％）を得た。この塩の少量をクロロホルムに溶かし、この溶液を若干の希 塩酸でまた水で洗浄し、乾燥し、蒸発させると、１３が粘稠油として得られた。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　ｏｆ　１３　（１／１異性体混合物）：δ０．９ （ｓ）と１．２５（ｓＸ３Ｈ）、　３．５（ｓ）と３．７（ｓＸ２Ｈ）、　３． ８−４．６（ａ　６８）、　５．７（ｓ）とU．０ （ｓＸ２Ｈ）、　７．５−８．５（ａ　４）１）。
２−（（５−メチル−２−（２−（メチルアミノ）−２−オキソエチルチオ〕− １、３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、２−スルフィド〕〕メトキシ酢 メタノール２００ｍ１中ビスカリウム塩且（１４，６７ｇ、４２．１６ミリモル ）の懸濁液へ、濃塩酸４．２１ｇ（ｄ　１．１７５，４０．５ミリモル）続いて 水３０ｍ１を加えた。生した溶液を完全に蒸発させた。無水エタノール（１００ ｍｌ）を加え、懸濁液を均一になるまで加温し、次に完全に蒸発させた。トルエ ン（１００ｍ１）を加え、懸濁液を再び蒸発させた。この後者の工程を繰り返し た。
次に残留物ヘアセトン（Ｉ　Ｏ０ｍ１）を加え、続いてＮ−メチル−クロロアセ トアミド（５，０５ｇ、４６．９８ミリモル）を加えた。混合物を室温で３日間 かきまぜ、次いて蒸発させた。この残留物へ水（２５０ｍｌ）中炭酸カリウム（ ８，８０ｇ）を加え、続いてトルエン２５０ｍ１を加えた。１５分がきまぜた後 層を分離し、水層をトルエン２５０ｍ１で抽出し、合わせた有機層を水１００ｍ １で洗浄した。
合わせた水層へ濃塩酸１７ｍｌを加え、生じた混合物をクロロホルム３Ｘ２００ ｍｌて抽出した。クロロホルム層を乾燥し、蒸発させて８．２ｇの残留物を得た 。この残留物へ濃アンモニア（５ｍｌ）を加え、溶液を完全に蒸発させた。残留 物ヘアセトンを加え、混合物をかきまぜ、生じた固体（１見のアンモニウム塩） を濾別し、アセトンで洗浄した。これにより２．７７ｇ　（ＮＭＲによると一興 性体）が得られ、これを水１００ｍ１に溶かした。濃塩酸（２ｍｌ）を加え、混 合物をクロロホルム３Ｘ１００ｍｌで抽出した。乾燥し、蒸発させることにより 残留物を得、こ（ＣＤＣｌ２）：δ１．０（ｓ、　３）１）、　２．８（ｓ）と ２．９（ＳＸ３Ｈ）、　３．４（ｓ）　と３．７（ｓ）（２Ｈ）、　３．６iｓ 、　２）１）、　３．８ −４．６（ｍ）と４．１（ｓＸ６Ｈ）、　６．５（ブロードｓ、　ＩＨ）、　９ ．３（ｓ、　ＩＨ）。
（２−月・キシ−５−メチル−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル） メタノール２００ｍ１、ｐ−１−ルエンスルホン酸ピリジニウム２．１ｇおよび 水２４０ｍ１を用いる通常の方法で、アセターノはステ／Ｌ＝２　４２ｇ（０， １８１モル）をジオール且に変えた。生じたジオールを、トルエン４００ａ＋１ 、トリメチルホスファイト３３ｇ　（０，２６６モル）およびトリエチルアミン １６滴と３日間かきまぜた（同様な手順についてはＥｄｍｕｎｄｓｏｎ、　Ｒ， Ｓ、　；　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｏ；　Ｊｏｎｅｓ、　Ｄ、Ｗ；Ｋｉｎｇ、　Ｔ、 Ｊ、　Ｊ、Ｃｈｅａ　Ｓｏｃ、、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、　２．　＋　９ ８５．　６９参照）。
３００ｍ引ｇ、４０℃で回転蒸発後、残留物を水２Ｘ１００ｍｌで洗浄し、次に 乾燥し、蒸発させた。残留物をクーゲル−ロール蒸留法により０．　ｌｍｍＨｇ で精製し純粋な生成物２８．２１ｇ　（０，１１２モル、６２％）を得た。’Ｈ −ＮＭＲ（ＣＣ１，）：δ０．７５および１．２（比２／１）、３．　１〜４． 　７　（ｍ）、３．３．３．５．３．６および４，０に単一線を含む。
２−　（２−（２，２−ジクロロエチニルオキシ）−５−メチル−１，３，２− ジオキサホスホリナン−５−イル、２−オキシド〕メトキシ酢酸１５（ジクロル ポクロラール２０．０ｇ　（０，１３６モル）を氷冷しつつ１５分で加えた。こ の溶液を０〜１０°Ｃで１時間、次に室温で３時間かきまぜた。溶液を完全に蒸 発させ、旦の粗製メチルエステルを残留物として得た。’Ｈ−ＮＭＲ（Ｃｅｌｔ ）：　δ１．　０および１、　３　（ｓ、３Ｈ，比ｌ／２）、３．２〜４．７　 （ｍ）　、および３．３．３．７．４０および４　ｌに単一線（ＩＩＨ）、７． 　０　（ｄ、Ｊ＝６．　ＩＨ）。この粗製エステルをＴＨＦ　Ｉ　ＯＯｍｌおよ びメタノール１５０ｍ１の混合物に溶かし、次に水１００ｍ１中炭酸カリウム１ ５．Ｏｇ（０，１０９モル）の溶液を１０分て加え、更にｌ００ｍ１の水を１５ 分て加え、混合物を室温で３時間かきまぜた。水（５００ｍｌ）を加え、混合物 をクロロホルム２Ｘ２５０ｍｌで抽出した。有機層を水２５０ｍ１で洗浄した。
クロロホルム層は不純物と出発エステルを含有した。合わせた水層ヘクロロホル ム２５０ｍ１を加え、続いて濃塩酸２５ｍ１をかきまぜながら加えた。層を分離 し、水層をクロロホルム２Ｘ２５０ｍｌで抽出した。乾燥し蒸発させた後、粗製 生成物１１．６ｇを得、これをエーテル１００ｍ１とかきまぜて無色固体を得た 。濾過し、エーテルで洗浄することにより、ＮＭＲでビニルプロトンを／メタノ ールにはるかに溶は易い）。濾過し、水／メタノール（３／Ｉ）で洗浄−異性体 ）を得た。後者の手順を繰り返し、旦の一異性体を得た。’ｌ−ＮＭＲ（ＣＤＣ Ｉｓ）：δ１．３（ｓ、　３Ｎ）、　３．４（ｓ、　２Ｈ）、　３．８−４．８ （ｍ）と４．０（ｓＸ８Ｈ）、　７．０（ｄ、　Ｊ≠T．　ＩＨ）、　９．５ （ブロードｓ、ＩＨ） ２−　（（２−（２−（エチルチオ）−エチルチオ〕−５−メチル−１，３，２ −ジオキサホスホリナン−５−イル、２−オキシト〕〕メトキシ酢酸＋７（デメ トＴＨＦ５０ｍｌ中エチルチオエタノール（４，２６ｇ、４０ミリモル）の氷冷 した溶液にｎ　−ＢｕＬｉ　１　Ｂｍｌ　（ヘキサン巾約２．２５Ｍ、４０．５ ミリモル）を５分て加えた。懸濁系を室温で１時間かきまぜ、次いで氷冷した。
ＴＨＦ　１５０１１に溶かした酸塩化物工（異性体混合物）　（ｌ　１．　６０ ｇ、４０．　２ミリモル）を１０分て加えた。混合物を室温で一晩かきまぜ、水 ２５０ｍ１中に注ぎ、生成物をトルエン２Ｘ２００ｍｌで抽出した。合わせたト ルエン層を水３Ｘ１００ｍｌで洗浄し、次に乾燥し、蒸発させた。残留物（この ものは室温でスルフィドからオキシドへ徐々に異性化する。この異性化はまたト リフルオロ酢酸によっても行なわれ、生じたスルフィドは本発明者等の加水分解 条件下で分解する）をメタノールｌｏ。
ｍｌとＴＨＦ　１００ｍｌとの混合物に溶かした。水５０ｍ１中炭酸カリウム５ ．５０ｇ（３９，９ミリモル）の溶液を１０分で加え、続いて水１００ｍ１を３ ０分て加えた。溶液を室温で３時間かきまぜ、水５００ｍ１中に注ぎ、クロロホ ルム２×２５０ｍ１で抽出した（若干の塩化すトリウムを加える）。合わせたク ロロホルム層を水２Ｘ１００ｍｌで洗浄した（若干のエタノールを加える）。合 わせた水層を１０ｍ１の濃塩酸で酸性にし、次にクロロホルム３Ｘ２５０ａ＋１ で抽出した。乾燥し蒸発させた後、残留物を得、これをトルエン５０ｍ１中で室 温で１０日間かきまぜた（これによりスルフィドから酸化物へゆっくり異性化す る）。溶液を蒸発させ、（−異性体か沈殿する）。濾過しエーテルで洗浄して３ ５０■の１７　（１，０２ミリモル、酸塩化物４に基づき２．５％）を得た。’ ）ｌ−Ｎ＆１Ｒ（ＣＤＣＩｓ）＋δ１．　Ｏ（ｓ、　３Ｈ）。
１、３　ｃ＋、　３Ｈ）、　２．３−３．４（ａ　６Ｈ）、　３．７（ｓ、　２ Ｈ）、　３．９−４．６（ｍ）と４．０および４．１（ｓＸUＨ）、　９．６ （ＩＨ）。
４−ベンジルオキシ−１−ブロモブタ水１５０ｍ１中水酸化ナトリウムリウム（ ２４０ｇ、６モル）の温混合物へ、ベンジルアルコール（１７４ｇ、１．　ｆ＋ １モル）、１．４−ジブロモブタン（６２４ｇ。
２．８８モル）　、ａｌｉｑｕａｔ　−３３６１０ｇ、およびトルエン１５０ｍ １をよくかきまぜながら加えた。反応混合物の温度は徐々に約６０゛Ｃに上昇し た。幾分冷却することによりこの温度以下に保った。混合物の温度が下がったと き冷却浴を除き、反応混合物を更に１時間かきまぜ、次に水５００ｍ１中に注い だ。生成物をトルエン７５０ｍｌで抽出し、有機層を水３Ｘ５００ｍｌで洗浄し た。次に乾燥し、蒸発させ、０．　２ａｍＨｇにおけるクーゲル−ロール蒸留法 により精製した。この蒸留で最初１．　４−′）ブロモブタンが、次に中間留分 が、そして次に生成物が得られた。中間留分の再蒸留後に合計２６０ｇの生成物 （１，０７モル、収率６６？６、多分若干の１．４−ジベンジルオキシ化合物か 混入している）、沸点！３０°Ｃ１０、２ｍｍＨｇ、を得た。この生成物はその まま次の工程で使用した。’　）ｌ−Ｍ（ト）（ＣＣｌａ）：　δｌ、４−ｍｌ 　（ａ　４８）、　３．３（２ｔ、　４Ｎ）、　４．３（ｓ、　２）１）、　７ ．２（ｓ、　５Ｈ）。
２−（４−ペンノルオキシ）ブチルーブロバンニ酸、ジエチルエステル１９無水 エタノール１リツトル中ナトリウム（４９，５ｇ、２．１５モル）の温溶液にマ ロン酸ジエチル（３２５ｍ１．　２．　１１モル）を加えた。溶液を５０℃まで 加温し、粗製臭化物＋８　（４１０ｇ、１．６８モル）を３０分にわたり加えた 。
混合物を６５°Ｃまで上昇した。次にこれを１時間還流加熱した。溶媒の大部分 を蒸発させ、残留物にトルエン１リツトルと水５００ｍ１を加えた。層を分離し 、有機層を水２Ｘ７５０ｍｌで洗浄し、次いて乾燥し蒸発させた。残留物をクロ ーゲル−ロール蒸留法により精製し、沸点１７０″Ｃ（０，２ｎ＋ｎｔ１ｇ）を 有する±且　４１０ｇ（１，２７３モル、７６％）を得た。この生成物はそのま ま次の工程で使用した。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＣ１，）：　δ１．０−２．０（ｍ） および１．２（ｔＸ１２Ｈ）、　３．２（ｔ、　ＩＨ）、　３．４（ｔ、　２g ）。
４、０（ｑ、　４Ｈ）、　４．３（ｓ、　２Ｈ）、　７．２（ｓ、　５）１）。
２−（４−ベンジルオキシ）ブチル−１，３−プロパンジオール２０ウム（６６ ，７ｇ、１．７５５モル）とエーテル１リツトルとの混合物に３時間にわたり加 えた（反応混合物の温度を外部冷却により３０°Ｃ以下に保つ）。混合物を室温 で一晩かきまぜ、次に１時間還流加熱した。酢酸エチル２０ｍ１を徐々に加え、 続いてメタノール２０ｍ１および濃塩酸１００ｍ１を加えることにより過剰の水 素化物を分解した（すべて冷却しながら）。次に塩酸（５Ｎ、１リツトル）を加 え、透明な２層ができるまで混合物をかきまぜた。層を分離し、水層をエーテル ２Ｘ５００ｍｌで抽出した。合わせたエーテル層を水５００ｍ１で洗浄し、次に 乾燥し、蒸発させた。この残留物はそのまま次の工程で使用した。’Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣＩ　ｓ）　：δ１．　Ｏ−２，Ｏ侃７Ｈ）、　３．２−３．８（亀８Ｈ ）、　４．４（ｓ、四）、　７．２（ｓ、　５Ｈ）。
上で得た粗製ジオール２０に、２，２−ジメトキシプロパン５００ｍ１とｐ−＋ −ルエンスルホン酸５ｇを加えた。混合物を室温で一晩かきまぜ、次に炭酸カリ ウムＩＯｇを加え、混合物を蒸発させた。残留物にトルエン５００ｍ１を加え、 溶液を５００ｍ１の金型炭酸ナトリウム溶液また水５００ｍ１で洗浄した。水層 をトルエン５００ｍ１て抽出した。合わせたトルエン層を乾燥し、蒸発させた。
残留物をりのものはそのまま次の工程で使用した。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＣ［４）： 　δ１．０−１．９（ｍ）および１．３（ｓＸ　１３）１）、　３．１−３．９ （ａ　６Ｈ）、　４．３（ｓ、　２Ｈ）、　７．２（ｓ、　５Ｈ）。
ｌＯ％パラジウムＩＯｇからなる混合物を、試料のＮＭＲがベンジル基の消失を 示すまで１気圧で水素化した。次に混合物を濾過し、酢酸て洗浄し、蒸発させた 。
残留物のＮＭＲはこの物質か相当な脱保護を受けたことを示した。それ故に、こ の粗製生成物を２．２−ジメトキシプロパン２５０ｍ１、アセトン５０ｍ１およ びｐ−トルエンスルホン酸３ｇと一晩かきまぜた。炭酸カリウム（１０ｇ）を加 え、混合物を１時間かきまぜ、次に濾過し、蒸発させた。残留物をクーゲル−ロ ール蒸留法により精製し、８５．Ｏｇ　（０，４５２モル、７８９６＞の２２、 沸点１１Ｏ°Ｃ（０，２ａｍＨｇ）　、を得た。’Ｈ−ＮＩＪＲ（ＣＤＣＩｓ） 　：６０．９−２．０（ｍ）および１．４（ｓ）（＋３１４）、２−７（ｂｓ、 　１８）、　３．３−４．１（ｗ　６Ｈ）。
に溶かし、次に水１５０ｍ１中水酸化ナトリウム１２０ｇの溶液に加えた。相間 移動触媒（ａｌｉｑｕａｔ　−３３６，５，５ｇ）を加え、続いてｐ−トルエン スルホニルクロリド（Ｉ　ＩＯｇ、０．５７７モル）をよくかきまぜながら（温 度は水冷により２５°Ｃ以下に保った）３０分間にわたり加えた。−晩かきまぜ た後、混合物を水５００ｍ１とトルエン２００ｍｌの中に注いだ。有機層を分離 し、水層をトルエン２５０ｍ１て抽出した。有機層を水５００ｍｌで洗浄し、次 に乾燥し、蒸発させて粗製トシレートを得た。トシレートの’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＣ １ａ）：　６０．９−１．９（ｍ）および１．２（ｓ）（１３８）、　′２．． ４（Ｓ、　３Ｈ）、　３．１−４．１（Ｉｌｌ、　６Ｈ）、　７．０−７．７（ 八Ｂ、　４８）。
このトシレートをＤＭＳ０２５０ｍｌに溶かし、シアン化ナトリウム（２９，４ ｇ、ｏ、６０モル）を加え、混合物を９０〜１００℃で２．５時間加熱した。冷 却後、混合物を水５００ｍｌ中に注ぎ、生成物をトルエン２ｘ２５０ｍｌで抽出 した。
トルエン層を水３００ｍｌて洗浄し、次いて乾燥し、蒸発させた。残留物をクー ゲル−ロール蒸留法により精製し、沸点１２０°　（０，２ａｍＨｇ）を有する ニトリル２３　（７９ｇ、０．４０１モル、アルコール且且に基づき収率８２％ ）を得た。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＣ１，）：δ０．９−１．９（ｍ）および１．３（ｓＸ１３Ｈ ）、　ｌ　２（ｔ、　２Ｈ）、　３．１−３．９（ａ　４８j。
（３１ｇ、０．４７モル）、エタノール２５０ｍ１および水１００ｍ１と共に２ ４時間還流加熱した。水３００ｍ１を加え、エタノールの大部分を留去した。ｎ −プロパツール２００ｍ１を加え、混合物を２日間還流加熱した。冷却後、水３ ００ｍ１を加え、混合物をトルエン２Ｘ２５０ｍｌで抽出した。トルエン層を水 ２５０ｍ１で洗浄した。水層を蒸発させ、最後の痕跡の水は１００”Ｃ（０，２ ａｗｎＨｇ）て除いた。
固体残留物をＤＭＦ　３００ｍｌおよび硫酸ジメチル６２ｍｌ　（０，６６モル ）と２４時間かきまぜた。混合物を蒸発させ、残留物にトルエン５００＋ｎｌお よび水３００ｍ１を加えた。層を分離し、トルエン層を水３００ｍ１て洗浄した 。水層をトルエン２５０ｍ１て抽出した。合わせた有機層を乾燥し、蒸発させ、 残留物をクーゲル−ロール蒸留法により精製して沸点１２０°Ｃ（０，２ａｗｎ Ｈｇ）を有するエステル２４（４７，７ｇ、０．２０７モル、５２％）を得た。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＣ１，）、δ１．Ｏ−１、９（ｍ）、　１．２５（ｓ）および １．３０（ｓ）（１３Ｈ）、　２．２（ｂｔ、　２Ｈ）、　３．２−３．９（Ｉ ｌｌ）および３．６iｓＸ７Ｈ）。
−トルエンスルホン酸ピリジニウム０．５２ｇを加え、続いて水６０ｍ１を加え た（１時間で加えた）。溶液を３時間かきまぜ、次に完全に蒸発させた。トルエ ン５０ｍ１を加え、混合物を完全に蒸発させた。この残留物はそのまま次の工程 で使用した。’Ｈ−ｔａＪＲ（ＣＤＣＩｓ）：６１．　Ｏ−１，９（ａ、　７Ｈ ）、　’１．３（ｂｔ、　２）１）、　３．３−３．８（ｍ）お謔■R．６（ｓ ） （９Ｈ）。
２４モル）ヲ加え、続いて０−（４−ニトロフェニル）ホスホロジクロリドチオ エート（９，４ｇ、３４．６ミリモル）　（Ｈ，Ｔｏｌ）ｕｎｉｔｈ、　Ｊ　Ｏ ｒｇ　Ｃｈｅ＋ｓ　２３＝１６８５　（１９５８）に従い調製〕を加えると、幾 分か発熱反応を起こした。懸濁液を４０時間かきまぜ、次に水２５０ｍ１とトル エン２００ｍ１の中に注いだ。層を分離し、有機層を若干の塩化ナトリウムを含 む水２Ｘ２００＋ａｌで洗浄し、次に乾燥し、蒸発させて１２．８ｇの旦の粗製 メチルエステルを得た。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｚ）：δ１．０−１．９（ａ　 ７Ｈ）、　′２．３（ｔ、■）、　３．６（ｓ、　３Ｈ）、　３．９−４．７（ 亀４８）、　７．P−８．２（ＡＢ、　４１（）。
このエステルをＴＨＦ　１５０ｍｌに溶かし、メタノール１００ｍ１を加え、続 いて水５０ｍ１中炭酸カリウム（５，ＯＯｇ、３６．２ミリモル）を５分間にわ たり加えた。更に水１００ｍ１を５分間て加え、次に溶液を６４時間かきまぜた 。水３００ｍ１を加え、混合物をクロロホルム２Ｘ２５０１１１１で抽出した。
クロロホルム層を水１５０ｍｌで洗浄し、次に乾燥し、蒸発させた。ＮＭＲによ るとこの残留物は殆ど純粋な出発エステルであった。水層を合わせ、濃塩酸９ｍ ｌで酸性にし、次にクロロホルム３Ｘ１００ｎｌで抽出した。乾燥し蒸発させる と固体残留物が残り、これをエーテルとかきまぜ、次いで濾過した。この固体を トルエンから再結晶することにより１．６１ｇの２６を二異性体の混合物として 得た。
エーテルおよびトルエン濾液を合わせ、蒸発させ、残留物を上記の回収エステル と一緒にした。この物質をＴＨＦ、メタノール、および水中炭酸カリウム（１０ ，０ｇ、７２．５ミリモル）からなる混合物と２４時間がきまぜた。上記のよう に仕上げ処理をしたところ再び若干の出発エステルが得られたが、水層からはそ れを酸性にし抽出した後に、粗製の酸旦が得られた。エーテルとがきまぜて１． ５７ｇの純粋な並を得たので、合計収量は３．２４ｇ（８，６４ミリモル、　エ ステル２４１：基づき収率２５％）となる。ＩＨ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１，）：６１ ．１−１０（ａ７Ｈ）、２−３５（２ｔ、　２）１）、　４．０−４．４（ｍ、 　２Ｈ）、　４．３−４．７（ＡＢ、　２１（）７．２−８．３（ＡＢ、　SＨ ）、　１０．０（ｂｓ、　１１（）。
Ｃ０免疫接合体の調製 ｎｉＩ述したように、仔機リン酸エステル有害生物防除剤のような小さい分子は 、これを動物に注射したときそれ自身免疫反応を誘発することはできない。しか し適当な結合手を存する官能基を含むハブテンを免疫学上活性なタンパク質に結 合させることにより、ハプテン分子を識別しカリ反応することのできる抗体を産 生しうる。
従って、もう一つの面において本発明は抗体産生に使用するのに適した免疫接合 体を提供するものである。このような免疫接合体は、タンパク質といった適当な 高分子にカップリングさせた式（１）または式（ＩＶ）の化合物からなる。この 目的に対してこの分野で常用されるとのタンパク質高分子も使用することができ るが、牛血清アルブミン、マウスアルブミン、ポリリジンおよびオボアルブミン が有用な例である。
本発明に係る免疫接合体をつくるには適当な方法のどれでも使用できる。例えば 、この分野でよく知られていて、カルボキシル基を含むハブテンをタンパク質に 接合するために常用される三つの方法は次の通りである：（ｉ）混合無水物法（ ｌｉｌａｒｋｓ等、ｒＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｎｎｕｎｏａｓｓａｙ　 ｏｆ　ｌ（ｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄＤｒｕｇｓＪ　（Ｓ　Ｂ　Ｐａ１編）、４１ ９頁、Ｗａｌｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ　、ベルリン（＋９７８））： （ｉｉ）カルボジイミド（ＣＤ　Ｉ）　（Ｅｒｌａｎｇｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｎｏｌｏｇｙ　７０８５　（１９８０））；および ＦｌｕｉｄｓＰｒｏｃＣｏｌｌ　２４　７６３　（１９７６）〕、これはＣＤＩ 法の変形である。
本発明の実施の際は方法（ｉｉｉ）が本出願者に好まれている。それは効率力塙 い上、反応の調節が容易だからである。その手順は一般に次のようである二式（ １）のハブテンをＣＤＩＣ例えば、Ｎ−エチル−Ｎ’　−（３’−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド（ＮＨ３）と反応させてハブテンのスクシンイミジルエステルをつくる。次 にこのエステルをタンパク賃上のアミノ基と反応させて免疫接合体を形成させる 。
ＲＣｏｔ　ＨＮＨ３，ＥＤＣ−＋　ＲＣｏｔ　Ｎ接合法の一例を下に述へるが、 これに制限されない。
Ｃ，１手順： １、　ハブテン（０，２繭）をジエチルアミド（ＤＭＦ）１ｍｌに溶かす。ＮＨ ３３０ｍｇとＥＤＣ４０ｍｇを加え、室温で２時間がきまぜる。
２　かきまぜられる反応びん（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中で、牛血 清アルブミンまたはオボアルブミン（２０ｍｇ）を蒸留水０．６ｍｌに溶かし、 ＤＭＦ　０．４ｍｌを加える。
３、　ハブテン−ＮＨＳエステル０．０５０ｍ１をタンパク質溶液に加え、−晩 インキユベーションする。
４、　蒸留水に対し十分よく透析する。
５、　タンパク質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ　７２　２４８　（１９７６）〕およびリジン原子吸光分析 ）を測定し、ハブテンのモル数／タンパク質１モルを決定する。
この手順を用いてクロルビリフォス　ハブテン８、パラチオン　ハブテンＩＯ、 バラオキソン　ハブテン１２、アジンホス　ハブテン１３およびデメトン　ハブ テン１７とオボアルブミンとからなる免疫接合体を、カップリング度がオボアル ブミン１モル当りハブテン８から５０モルであるように調製できる。これら免疫 接合体は後述するように抗血清の製造に使われた。
免疫接合体はまたオボアルブミンの代りにＢＳＡを用いた同じ手順を使用しても 調製でき、これら接合体は捕獲抗原（ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　）とし てあらゆる免疫検定法に使用された。
タンパク質高分子とカップリングさせた式（１）の化合物からなる免疫接合体が 形成されたので、本発明のもう一つの面はかかる免疫接合体に対する抗体の製造 法を提供することである。抗体はポリクローナル抗体を含む抗血清の形にあって もよく、あるいはハイブリドーマ技術を用いることによりモノクローナル抗体を 得ることもてきる。更にまた、組換えＤＮＡ技術を用いて抗体あるいはフラグメ ントをつくることもできる。
ポリクローナル抗体あるいはこのような抗体の結合性フラグメントを得たい場合 に、従来からの免疫化プロトコールを使用できる。このような実施要綱の一例を 、０節で特定的に前述したようにして調製されたクロルビリフォス、パラチオン 、バラオキソン、デメトンおよびアジンホス免疫接合体に関して下に述べる。
他方、モノクローナル抗体あるいはこのような抗体の結合性フラグメントを得た い場合には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの手順（Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ　 ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ。
−Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｆｕｓｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　 Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　Ｐｒｅｄｅ■奄獅■■ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−、Ｎａｔｕｒｅ　２５６　４９５−４９７　（１９７ ５））を使用できる。
一般にこの手順は、動物を免疫接合体で免疫化し、動物から抗体産生細胞を得、 この抗体産生細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマをつくるものであ る。これらハイブリトーマを発育あるいは培養して免疫接合体の有機リン酸エス テル部分に特異的なモノクローナル抗体をつくる。
適当な特異性を存するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを得るため に使用できる手順の一例を、前述したパラチオンおよびアジンホス免疫接合体に 関して下に述べる。
最後に、抗体あるいは結合性フラグメントを組換え的につくる手順を次のＤ３節 で詳述する。
Ｄ、Ｉ　ポリクローナル抗血清の製造 Ｂａ１ｂ　ｃＸＤＢＡマウス（ハブテン当り４頭）を、５０９６不完全フロイン ドアジユバント中オボアルブミン接合体２００μｇで、皮下および腹腔内部位で 免疫化し、４週間休ませた。３回の追加免疫注射（５０％不完全フロインドアジ ュバント中接合体１００μｇ）を３週間隔で与えた。免疫化前に、また免疫化後 ８−１Ｏ日で採った血液から血清を単離した。
血清を一２０°Ｃて貯蔵した。
Ｄ、２　モノクローナル抗体（ＭＡｂ　）の産生ＭＡＩＩ調製のため、マウス（ Ｂａｌｂ／ｃ　ＰＮｘＤＢＡ）に前記のようにオボアルブミン／ハプテン免疫接 合体を注射した。融合に先立ちマウスを最低４週間休ませた。
融合の４日前に、マウスを免疫接合体５００μｇで腹腔内投与により免疫化した 。牌細胞を調製し、ネズミの骨髄腫細胞系（なるべくはＰａ−ＮＳ−１−Ａｇ４ −１）とポリエチレングリコールを使用して融合させた。融合の実施計画、培養 およびクローン化の手順はＪｏｎｅｓ　Ｗ　Ｔ、　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　Ｐ　ＨＳ 、　Ｊｏｎｅｓ　Ｓ　Ｄ、　ＬｉｄｄａｎｅＣＰＬａｎｄ　Ｒｏｄｂｕｒ　ＫＡ 、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　９４　：１３５８−１３６４　（１９ ９０）記載の通りとした。ハイブリドーマのモノクローナル培養（牌臓／骨髄腫 融合細胞）は液体窒素中に貯えた。
ハイブリドーマを発育させた培養液から■量で、あるいは腹水癌かまたはインハ ウス（ｉｎ　ｈｏｕｓｅ）容器内中空繊維培養系のいずれかからｇ量でモノクロ ーナル抗体を調製した。
Ｄ、３　抗体フラグメントの製造 Ｔｊｉｓｓｅｎ　Ｐ、　−Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｅ ｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏｓａｙｓ”　ｉｎ　Ｌａｂｏｒａ狽盾窒■ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　ＡＩＩＩ唐狽■窒р≠■ ＮｅｗＹｏｒｋ、　０ｘｆｏｒｄ、１１７−１２１　（１９９０）に記載のよう にして、完全免疫グロブリン分子の制御下でのプロテアーゼ消化によって抗体フ ラグメントを調製できる。
別法として、抗体フラグメントは分子生物学的技術を用いて、モノクローナル抗 体のＨ鎖、Ｌ鎖または両方の不定の領域をコード化する遺伝物質をハイブリドー マ細胞から取り出し、それらをモノクローナル抗体の組換え型抗原結合性フラグ メント（Ｆｖ、　５ｃＦｖ、　Ｆａｂなど）の産生に適した生物に発現させるこ とにより調Ｅ、　上に示したように、本発明免疫接合体は免疫学的に活性なタン パク質高分子にカップリングした結合手をもつ有機リン酸エステル官能基からな る。
有機リン酸エステルハブテン分子上の結合手の性質と位置は抗体の特異性と抗体 と反応する遊離ハブテンの能力に影響を及ぼすであろうが、ハブテン−タンパク 質免疫接合体は常に抗体と反応しない。従って、ハブテン−タンパク質免疫接合 体に対して発生させた抗体は、これらが遊離ハブテン、親の有機リン酸エステル ならびに免疫接合体と反応するかどうか、また特異性に対して、即ちそれらが免 疫化に用いたハブテンに見出される共通の構造的特徴の若干を有する小さい分子 とも反応するかどうかを調へるために試験しなければならない。
接合体の溶液〔リン酸塩−食塩水緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７，０）中４μｇ／ｍｌ ）中３７°Ｃで２時間インキュベーションすることにより９６−ウェルポリスチ レンプレートをＢＳＡ−接合体で被覆した。プレートをＰＢＳ中２％ＢＳＡで４ ℃で一晩ｉｔ鎖した。
血清（ＰＩ対照＋最終放血）を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０ で連続希釈しく＋／＋００から始めてＩ／２希釈）、続いてペルオキシダーゼで 標識したヒッノ抗マウスＩｇ（γ鎖特異的）とインキュベーション（３７℃、１ 時間）した。結合したペルオキシダーゼを基質溶液〔過酸化水素０．００３％を 含むクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（ｐＨ６，Ｏ）　ｌ　００＋ｎｌ当りオルトフ ェニレンジアミン、ＯＰＤ、４０ｍｇ）とウェルをインキュベーションすること により測定した。
３０分後、４Ｍ硫酸の添加により反応を停止させ、４９２ｎｍにおける吸光度を Ｆｌｏｗ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣミクロウェル　プレート　リーダーで演鴫 定した。
（ｂ）　競合検定 ＥＬＩＳＡの条件はＥ、Ｉ（ａ）で前述した通りである。各血清に対して抗血清 およびハブテン−ＢＳＡのチェッカーボード滴定を行なった。第一に最低血清濃 度そして第二に最低抗原濃度（非飽和条件）として、最適抗原および血清の塗布 希釈度をとり、０，８〜１．２００単位の範囲で４９２ｎｍにおける最終信号を 得るようにした。ミクロウェル　プレートはこの最適ＢＳＡハブテン濃度で被覆 した。
有機リン酸エステル存置生物防除剤およびハブテンをメタノールに２ｍｇ／ａ＋ を濃度で溶かした。メタノールで２０００→０．３μｇ／ｍｌに連続希釈を行な った。
ａ機すン酸エステルとメタノール（０対照）の十分の一希釈を２％ＢＳＡ／ＰＢ ＳＴ中で行なった（２００μｇ−３，Ｏｎｇ／ａ＋Ｉ）。２％ＢＳＡ、ＰＢＳＴ 中２×至適濃度で各有機リン酸エステルおよび血清の同体積ずつを混合し、３７ °Ｃて２時間インキュベージコンした。一部分（１００μｌ）をミクロウェル　 プレートに加え、１時間インキュベーションし、続いて前述したようにペルオキ シダーゼ抗マウスおよび基質を加えた。
結果を計算するため、転化率： 式中、Ｂ、＝競合種（即ち、メタノール）欠如下のＯＤ４＠＠ａｍＢ　＝競合種 存在下のＯＤ’口１ を競合種濃度のｌｏｇに対しプロットした。■１．（結合を５０％阻止する競合 種の濃度）、および■、。およびＩｓ’（２０％および８ｏ９６阻止を与える濃 度）を各プロットからグラフ上で決定した。
ＢＳＡ／ハブテン接合体で被覆し、ＢＳＡで封鎖した９６ウエルプレート（Ｍａ ｘｉｓｏｒｂ、　Ｎｕｎｃ）を使用してＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行な った。希釈緩衝液（ＰＢＳＴ、０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０および２９６　Ｂ　Ｓ 　Ａを含む２％ＢＳＡリン酸塩緩衝食塩水）中３０００倍まで希釈した培養液を 、３７°Ｃで２時間被覆プレートに加えた。プレートをＰＢＳＴて６回洗浄し、 指先ではじいて乾かし、マウスに対してヤギて産生したペルオキシダーゼ標識抗 体１　ｇＧ’　（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌｓＡ３６７３．　γ鎖特異的） と１時間インキュベーションした。
ペルオキシダーゼ基質〔オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ））の添加後４９２ ｎｍにおける吸光度の測定により陽性の培養を検出した。
ハブテン免疫接合体を認識する抗体を分泌する培養ＥＬＩＳＡ法によって更に試 験を行ない、「本来の」有機リン酸エステル有害生物防除剤を認識する培養を同 定しｌこ。
最適ＢＳＡ／ハブテン免疫接合体塗布濃度および培養液の希釈度は、各培養液に ついてチェッカーボード滴定することにより決定した。接合体の最適塗布濃度は 、非飽和条件を達成するための免疫接合体の最高希釈度とみなした。最適抗体濃 度は、前述したように、ペルオキシダーゼ抗マウ７１ｇＧおよび基質濃度を用い て、最適免疫接合体塗布濃度において４９２ｒ＋ｎ＋て約１．　０の最終吸光度 を与える培養液の希釈度である。
９６ウエルＥＬＩＳＡをＢＳＡ／ハブテン免疫接合体の最適濃度で処理し、ウェ ル上に残存するタンパク質結合部位は２％ＢＳＡて封鎖した。
培養液を決定された最適希釈度の２倍にうすめた。有機リン酸エステル有害生物 防除剤を、１０％ＭｅＯＨを含むＰＢＳＴ中２９６　Ｂ　Ｓ　Ａに溶かして、血 清（ハイブリドーマの調製にマウスの血液からつくる）を抗体として使用したと き５０％阻止を与える２倍の濃度（２ｘ　ｌｓ。）に相当する濃度とした。
有機リン酸エステル有害生物防除剤あるいはＩ　０９ｃｉＭｅＯＨ（負の対照） および希釈培養液の同体積ずつを混合し、３７°Ｃで２時間インキュベーション し、この混合物の０．１ｍｌを被覆ＥＬＩＳ＾ウェルに加え、３７°Ｃで更に２ 時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、前記のようにしてペルオキシ ダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと反応させ、基質て発色させた。４９２ｎｍにお ける吸光度をＭｅＯＨ中培養液および有機リン酸エステル有害生物防除剤混合物 と比較した。本来の有機リン酸エステル有害生物防除剤を認識する抗体を含む培 養に対して、有機リン酸エステル有害生物防除剤の存在下でＡ４Ｈｍ＋″の減少 が観察された。
（Ｃ）　モノクローナル抗体の亜群の決定抗原捕ｌ１ＥＬＩＳＡを製造業者の勧 告に従って使用したＢｉｏｒａｄ同基準標本キット（標準）と併用することによ り、本来の有機リン酸エステル有害生物防除剤を認識する各抗体について亜群お よびＩＪＩ　（ｋまたはλ）を決定した。
パラチオンおよびアジノホス有害生物防除剤を認識するペルオキシダーゼ標識Ｍ Ａｂを用いて、前述したように競合ＥＬ■ＳＡに対する最適条件を決定した。こ の検定はＢＳＡ−ハブテンで被覆した固体表面および検出分子としてのペルオキ シダーゼを標識抗体を使用する。当業者は他の競合検定法の形式も可能であるこ とを認識するであろう。
競合検定法を３００ｐｇから０．　２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で試験した。三つの 異なるクローンから得た抗体をパラチオン（４Ｄ４．８Ｂ１．ｌ０Ｈ１２）およ びアジノホス（７Ｅ１０．８Ｇ８．９ＤＩ　＋）に対する検定法で試験した。
Ｅ、３　モノクローナル抗体の精製と標識化モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を硫 酸アンモニウム分別およびプロティンＡセファロース上のアフィニティークロマ トグラフィーにより精製した。抗体は数種の手順の一つを用い幾つかの異なる酵 素の何れかで標識できる。（Ｐ　Ｔｉｊｓｓｅｎ。
−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　”　B ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅｌｎｖｎｕｎｏａｓｓａ ｙｓ　１５１−２７８．ｌ５ＢＮＯ−７２０４−４２００−１，Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ、Ａａｓｔｅｒｄａａ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｌｏｎｄｏｎ（！９９０））。− 例として、モノクローナル抗体を以前に発表された方法（Ｐ　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、 　Ｎ　ＲＢｅｒｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｍ　Ｓ　Ｇｒｕｎｄｙ、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ@４１　。
８＋（＋９８１））から修飾されたヘテロ三官能性試薬Ｎ−スクシンイミジル− ３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオネ−）　（ＳＰＤＰ）を使用して、セイ ヨウワサビペルオキシダーゼで標識した。
ペルオキシダーゼおよびＭＡｂを５ＰＤＰで２３℃において４０分処理した。過 剰の５ＰＤＰをゲル濾過により除去し、修飾されたペルオキシダーゼをジチオト レイトール（ＤＴＴ）で処理することにより還元した。このペルオキシダーゼと 修飾ＭＡｂを２３°Ｃで一晩反応させた。ペルオキシダーゼ標識ＭＡｂを硫酸ア ンモニウム分別（５０９６飽和硫酸アンモニウム）およびゲル濾過により過剰の ペルオキシダーゼから精製し、小分けして一２０°Ｃで貯蔵した。
有機リン酸エステル有害生物防除剤およびそれらのハブテンを、存置生物防除剤 バイオセンサーデテクターキットを使用してコリンエステラーゼ活性を阻害する 能力について試験した（Ｅｎｚｙｔｅｃ　Ｉｎｃ、カンサス市、ミズーリ州、Ｕ ＳＡ、陽性反応を阻害する最低濃度を各試験分子について製造業者の実施要綱を 用いて測定クロルピリホス、パラチオン、バラオキソン、デメトンおよびアジン ホスハブテンのすボアルブミン免疫接合体をマウスに注射すると、ＢＳＡに結合 したハブテンを認識する抗血清を生ずる結果となる。免疫前血清をＢＳＡ−ハブ テンと反応させたとき、あるいは免疫化したマウスをＢＳＡに対して試験したと きには反応が見られなかった。従って、ハブテンに対する特異的な反応であるこ とは明白である。
クロルビリフォス免疫接合体で免疫化したマウスに対する血清タイターはｌ／２ ０、０００から１／１６０，０００　；パラチオン免疫接合体では１／６４０， ０００−１／１，２００，０００　。
バラチオン免疫接合体では１／３２０．０００−１／１，２００，０００　；ア ジンホス免疫接合体ではｌ／６４０．０００−１／２．４００．０００　；また デメトン免疫接合体ではｌ／２５６，０００−１／２、４００．０００にわたる 。
ＢＳＡ−ハブテンに対する最適塗布濃度および吸光度０．８〜１．２を与える血 清希釈度は次の通りである： （ａ）クロルビリフすスハブテン：　ＢＳＡ−ハブテンＩ／１６０．０００　ｔ ｏ　ｌ／６４０，０００；血清希釈度１／１６．０００−１／６４．０００　； （ｂ）パラチオン：ＢＳＡ−ハブテン１／３２０．０００−１／６４０．０００ 血清希釈度１／３２．０００−１／６４．０００　： （ｃ）バラオギソン＝ＢＳＡ−ハブテン１／８０．０００−１／６４０，０００ 　；血清希釈度！／８、０００−１／３Ｚ　０００　； （ｄ）７ジンホス：ＢＳＡ−ハブテンｌ／６４０．０００−１／１．２００．０ ００　；血清希釈度！／６４、０００　。
（ｅ）デトメン：ＢＳΔ−ハブテンｌ／８０，０００−１／６４０．０００　； 血清希釈度１／３２．０ＱＯ−１／１２８．０００゜ 競合は、有機リン酸エステル有害生物防除剤あるいはハブテンとのインキュベー ションの結果として、ミクロウェル　プレートへの抗体の結合抑制として定義さ れ、すべてのマウスに対しまたすべての存寄生物防除剤に対して観察された。
一つの特定の検定内で、有機リン酸エステルの測定に対しマウス間でＩ１．にま た有用範囲（Ｌ。〜１１゜）に変動が観察された。特定の結果は次の通りである 。
（ａ）クロルビリフォス免疫接合体 上に示した最適条件を用いると、マウスから得た血清は競合を生じた。クロルピ リフォスに関して、マウス１および２に対するパラメーター１ｓｓ＝３００ｎｇ ／ｍｌ、　’　Ｉｚｏ＝６０μｇ／ｍｌ、Ｉ　ｓａ＝　ｌ　５００μｇ／ｍｌ。
マウス３と４ではＩＩ＃＝１５０ｎｇ／ｍｌ、１．ｏ＝２５ｎｇ／ｍｌ、１＊＠ ＝８６０μｇ／ｎ＋１゜バラオキソン、パラチオンおよびアジンホスメチルの１ ００μｇ／ｍｌまでの濃度では競合を測定できなかった。
クロルビリフすス　ハブテンは２０口ｇ／＋ａｌのＩ１．を有した。すべてのマ ウスに対しては１１０＝　ｌｏｇ／ｎ＋ｌ、Ｉ　ｔｏ＝　Ｉ　００μｇ／ｍｌで あった。
（ｂ）パラチオン免疫接合体。
マウスｌ血清を用いたパラチオンに対する■、。、Ｉ　ｔａおよびＩ８．は、そ れぞれ１．２μｇ／ｍ１．８０ｎｇ／ｎ１．１６μｇ／ｉｔ；マウス２血清では ８００　ｎｇ／ｍｌ。
６０μｇ／ｍｌ、１１　ｕ　ｇ／ｍｌ；マウス３血清では４　ｕ　ｇ／ｍ１．　 ３１　ｕ　ｇ／＋１およびマウス４血清に対しては２．１μｇ／＠１．３５０ｎ ｇ／ｍ１．３３μｇ／ｉｔであった。
すへてのマウス血清に対しクロルビリフォスとアジンホスでは競合か観察されず 、バラオキソンはマウスｌおよびマウス２に対しそれぞれ０．６％および０．４ ％の交差反応性を示し、マウス３およびマウス４血清に対しては交差反応を示さ なかった。パラチオン　ハブテンとの競合はＩ、。・、２２０−２５ｎ／畦　Ｉ ２゜　ｌ−２μｇ／ｍｌ、Ｉ　ｍ。８０−１００μｇ／ｍｌを与えた。
（Ｃ）パラチオン免疫接合体 マウス１血清を用いたパラオキソンに対するＩｓｅ＋　１ｘ＊およびＩ　ｔｏは 、それぞれ８．　ｌμｇ／ｍｌ、１．　２μｇ／ｍｌおよび４６μｇ／ｍｌ；マ ウス２に対しては２、　２μｇ／ｍｌ、７１０μｇ／ｍ！、およびＩ　０５．ｃ ｚｇ／＋ｏｌ　；７ウス３血清に対しては８μｇ＋　ｔ、２μｇ／ｍｌおよび４ ３μｇ／ｍｌ、そしてマウス４に対しては２μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌおよ び２３μｇ／ｍｌであった。バラオキソンーハプテン免疫接合体を注射したマウ スから得たどの血清に対しても交差反応は観察されなかった。バラオキソンーハ ブテン免疫接合体を注射したマウスからのどの血清に対してもパラチオン、クロ ルビリフすス、またはアジンホスメチルまたはアジンホスエチルとの交差反応が 観察されなかった。
パラオキソンハブテンは２０　ｎｇ／ｍｌのＩｓｏ、２μｇ／ｍｌの１．。およ び１００　ｎｇ／ｍｌの１．。を与えた。
（ｄ）アジンホス免疫接合体 マウス１およびマウス３血清を用いたアジンホスメチルに対するＩ、。＋　Ｉ！ 。および■、。は、それぞれ、４μｇ／ｍ１．　４００μｇ／ｍｌおよび３０μ ｇ／ｍｌ：マウス２血清に対しては２０　ｕ　ｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌおよ び１２０．ｃＺｇ／ｍｌ；マウス４血清に対しては８００μｇ／ｍｌ、２０μｇ ／ｍｌおよび３４μｇ／ｍｌであった。クロルピリフォスとバラオキ゛ノンは交 差反応を示さなかった。パラチオンはアジンホスメチル１〜２Ｑ６で交差反応を 示した。アジンホスエチルはアジンホスメチルよりも幾分競合的であった。アジ ンホス　ハブテンに対しＩｓｏは６〜Ｉ　Ｏｎｇ／ｍ！。
１２６は１〜２　ｎｇ／ｍｌそしてＩ　ｓｏは６０−１００　ｎｇ／ｍｌにわた った。
（ｅ）デメトン免疫接合体 マウス１およびマウス４血清を用いたデメトンに対するＩｓｏ＋　Ｉｓ。および Ｉ　ＩＩは、それぞれ、２０　ｕ　ｇ／ｍ１．　８００μｇ／ｍｌおよび１２０ μｇ／ｍｌであり：マウス３に対しては６６．７および４００μｇ／ｍｌであり ：マウス２に対しては２００、Ｉ８および８００μｇ／ｍｌであった。
Ｅ、５．　２　モノクローナル （ａ）パラチオン、（ｂ）アジンホスメチルを認識する１Ｍｂを得るために融合 を行なった。
アジンホスに対し、ハブテン免疫接合体を認識する抗体を分泌するハイブリドー マを含んだ１２０個の培養（培養ウェルの１２９ｆｉ）を得た。これらのうち１ ２培養はまた遊離アジンホスメチルも認識した。これら培養のうち２個は８０％ より大きい抑制を与え、８個はおよそ５０％の抑制を与え（融合に用いたマウス 血清中に存在するポリクローナル抗体と等１ｉ１ｉｉ）、２ｇＡは３０％抑制を 与えた。すべてのＭＡｂはマウスＩｇＧＩ　ＫＬｊｎである。
パラチオンに対し、２２５個の培養（ウェルの１９９６）がハブテン免疫接合体 を認識するハイブリドーマ細胞を含み、そのうちの１３個は遊離パラチオンも認 識した。これら培養の７個は５０９６抑制（血清ポリクローナル抗体と等価）を 与え、残り６個の培養は３０％抑制を与えた。これより先の研究のため、パラチ オンおよびアジンホスの各々に対しＭＡｂを分泌する３紬胞系を選んだ。
固体用をＢＳＡに結合したハブテンで被覆した。標識した抗体を競合する被検物 質（３００ｐｇ　−０、２ｍｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、０．１〜Ｉを 被覆ウェルに加えた。固体用に固定されたペルオキシダーゼ−標識抗体をＤｙｎ ａｔｅｃｈ　ＭＲ５０００プレートリーダーで分光光度法により定量したく基質 として、クエン酸塩／リン酸塩緩衝液、ｐＨ５，０、中オルトフェニレンジアミ ン（ＯＰＤ）を使用）。他の適当な基質をＯＰＤの代りに使用できるであろう。
バラチオン免疫接合体に対して産生じた３種のＭＡｂおよびアジンホス免疫接合 体に対して産生した３種のＭＡｂに対する結果をそれぞれ表２および表３に示す 。
パラチオンおよびアジンホス免疫接合体に対して調製されたＭＡｂを用いると、 ここに示した検定条件下でパラチオンおよびアジンホスメチルをそれぞれｎｇか ら低μｇ／ｍｌおよびピコグラムから低重ｇの範囲で定量できる。検定条件およ び検出標識の性質を変えることにより感度を増すことができる。
パラチオン免疫接合体に対して産生したＭＡｂを用いたとき、パラチオンおよび 密接に関連する有害生物防除剤のみ検出できる。ＭＡｂ４Ｄ４および８Ｂｌは特 異性あるいは感度の点から識別できなかった。従って、両者はパラチオンを、そ してより低い程度で、フェニトロチオン（３０％）およびパラオキソン（２％） の両方を検出したが、４−二トロフェノールあるいは試験した池の有機リン酸エ ステルとの検知しうる反応は示さなかった。＆［ＡｂｌＯＨ１２はフェニトロチ オン（８０９６）およびバラオキソン（１００％）を検知したが、他の点では４ Ｄ４および８Ｂ＋と同様の特異性を有した。
ＭＡｂ７Ｅ１０．８０８および９Ｄ１１はすべて同様な特異性を示し、アジンホ スメチルと反応し、より低い程度に、関連アジンホスエチル（３０％）およびア ジンホスハブテンの製造に用いた合成中間体（＜Ｏ，０１％）と反応する。他の 有機リン酸エステルは検出しうる程の反応を示さなかった（＜０．００３％）。
表２．バラチオン免疫接合体に対して産生されたモノクローナル抗体と有害生物 防除剤および関連化合物との反応。
・　示したデータは、標識ＭＡｂの被覆抗原への結合を５０％抑制するのに必要 な化合物濃度対対照存置生物防除剤パラチオンの比である。
１　反応を５０％抑制するバラチオンの濃度は４Ｄ４．８Ｂｌおよび１ＯＨ１２ に対し、それぞれ１．２５．１．２５および０．４マイクログラム／ｍｌであっ た。
ゞ　バラチオンハブテンは２−（５−メチル−２−（４−ニトロフェノキシ）− １、３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、２−スルフィド）メトキシ酢酸 である。
表３．アジンホス免疫接合体に対して産生されたモノクローナル抗体と有害生物 防除剤および関連化合物との反応。
０　示したデータは、標ａＡｂの被覆抗原への結合を５０％抑制するのに必要な 化合物の濃度対対照有害生物防除剤アジンホスメチルの比である。
ゝ　反応を５０％抑制するアジンホスメチルの濃度は、７Ｅ１０．８Ｇ８および ９Ｄ１１に対し、それぞれ１．　５．０．３および２．０ナノグラム／ｍｌであ った。
ゞ　アジンホスハブテンは２−　（（５〜メチル−２−＋（４−オキソ−１，２ ゜３−ベンゾトリアジン−３（４Ｈ）−イル）メチル−チオール）−１，３゜２ −ジオキサホスホリナン−５−イル、２−スルフィド）〕メトキシ酢酸である。
Ｅ、５．　４　ハブテンおよび有害生物防除剤の抗コリンエステラーゼ活性アジ ンホスメチルおよびパラチオンは、それぞれ０．　３および２ｐ陣より大きい濃 度てコリンエステラーゼの抑制を示した。それらの対応するハブテンに対しては ２００ｐｐｍ（εｎｚｙｔｅｃキットを用いて試験した最高濃度）において抑制 がみられなかった。
Ｅ、６　考察 すべての有機リン酸エステルハブテンは、オボアルブミンと接合させそしてＢａ １ｂ　ｃ／ＤＢＡマウスに注射したとき、強い免疫応答を誘発し、対応するＢＳ Ａ−ハブテン免疫接合体に対する高タイターの抗体を生じた。更にまた、その血 清は、ある割合の抗体混合物が親の有機リン酸エステル有害生物防除剤ならびに 接合および非接合ハブテンを認識することを示した。すべての場合、用いた条件 下で、非接合ハブテンは、親の有害生物防除剤が、抗体により認識されるエピト ープの構造において結合手のノオキサン環がある役割を演することを示したより も競合において効果的であった。
親の有機リン酸エステル有害生物防除剤に対する個々の抗体の高度の特異性も、 分子の非特異的部分（複素環または芳香環）ならびにＳ＝ＰまたはＯ＝Ｐもエピ トープ形成に大きい役割を果していることを示している。従って、クロルビリフ ォスの場合、パラチオン、パラオキソン、アジンホスメチルもまたアジンホスエ チルも１００μｇ／ｍｌで競合できない。パラオキソンに対する抗体はパラチオ ンを認識せず、バラチオン免疫接合体で免疫化したマウスから得た血清との低い 交差反応性（（１％）かバラオキソンに対して観察された。これら有害生物防除 剤の構造は一原子、即ちリン原子に付く２価の硫黄あるいは２価の酸素に関して のみ異なる。アジンホス−メチルはパラチオンに対しＩｌｌ、５％の交差反応性 を示したが、バラオキソンに対しては交差反応かなかった。従って、硫黄はバラ チオン免疫接合体に対して産生された抗体により認識されるエピトープの主要な 面である。
クロルビリフォスもＳ＝Ｐ結合を含むが、バラチオン免疫接合体でもアジンホス 免疫接合体でも、これらに対して発生させた抗体と交差反応性を示さなかった。
アジンホス免疫接合体に対して産生された抗体は、パラオキソンに対してもりロ ルビリホスに対しても交差反応を示さなかった。しかし、競合種としてのパラチ オンとは１１１〜２％の交差反応がみられた。アジンホスメチルはアジンホスエ チルよりもアジンホス免疫接合体に対して産生された抗体と反応するその能力に おいてごく僅かしか有効でない。
従って、上記の結果は、有機リン酸エステル存寄生物防除剤を検出するための免 疫検定法を基本どする検出方式に使用する血清の好適性を示すものである。
またこれらの結果は、より良い感度の検定法が得られるようまた対応するポリク ローナル血清とは異なる特異性をもつ検定法か得られるようにモノクローナル抗 体を選択できることも示している。
このことは、検出用抗体としてアジンホス免疫接合体に対するＭＡｂを含む検Ｏ Ｏ倍の増加をもたらしたという事実から理解できる。また、これらのＭＡｂを基 本どする検定法は、血清を基本どする検定法が示したようなバラチオンとの交差 反応性を示さなかった。
パラチオン免疫接合体に対して産生されたＭＡｂの間に特異性の差が見られた。
１０Ｈ１２はバラチオンおよびバラオキソンと等しく反応するのに対し、他のＭ Ａｂ　４Ｄ４および８Ｂｌならびにポリクローナル血清は、バラオキソンに対し ごく低レベルの交差反応性しか示さなかった。
従って、これらの結果は、記載のようにしてつくり出されたＭＡｂが、有機リン 酸エステル有害生物防除剤を検出するための免疫検定法に基づく検出方式への使 用によく適していることをはっきり示すものである。
アジンホスおよびパラチオン免疫接合体は、親の有機リン酸エステルに対して見 出された抑制レベルを越えた２００倍の濃度においてコリンエステラーゼ活性の 抑制を示さないことに注目すべきである。
Ｆ、を機リン酸エステルの検出 更にもう一つの面において、本発明は環境試料あるいは生物学的産物、例えば園 芸用製品または食品中に存在する有機リン酸エステルの量を定量する方法を提供 する。この定量化は、この分野で公知の免疫学に基づいた検定手順のいずれかを 用いて行なうことができる（Ｐ　Ｔｉｊｓｓｅｎ、　−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　＆ＩｏＬｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏ ｆ　Ｅｎ嘯凵{ｅｅ Ｉｎｗｎｕｎｏａｓｓａｙｓ　Ｉ　５１−２７８．　ｌ５ＢＮ　Ｏ−７２０４− ４２００−１，Ｅ！１ｓｅｖｉｅｒ。
ＡｍｓｔｅｒｄａＩＴＬＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｌｏｎｄｏｎ　（１９９０）　） 。
例えば、その手順は目標の有機リン酸エステルを含むと考えられる試料を、適当 な支持体へ、該目標の有機リン酸エステル（支持体に固定されている）と特異的 に結合しうる抗体または抗体フラグメントと共に適用し、そして結合した有機リ ン酸エステル／抗体複合体を検出するという工程からなる。
このような複合体を検出するには、適当な検出法のいずれかを使用できる。例と して、適当な酵素を抗体とカップリングさせ、その後基質を加える酵素免疫検定 工程、あるいは放射線免疫検定法、蛍光免疫検定法、化学発光検出工程または凝 集検出工程があげられる。
検定法への使用に適した支持体の例としてチューブ、ウェルプレート、ミクロプ レート、長い棒、または薄い小片あるいはビーズがあげられる。これら支持体は プラスチック材ｔ）、ニトロセルロース、ナイロン、ガラスまたはシリカからつ くることができる。
Ｇ、検定キット 更に一つの面において、本発明は試料中の有機リン酸エステルを検出し定量する ためのキットを提供する。このようなキットの特に重要な成分は、目標とする特 定の有機リン酸エステルに対して特異的な抗体または抗体フラグメントの給源で ある。
通常は、当業者にとって公知の検定キットの他の成分も本発明キットに含めるこ とになろう。追加成分の種類は、含まれる検定法の堅そして特に目標の有機リン 酸エステルの存在を検出しようと望む手順により大きく左右されるであろう。
このような成分には目標の有機リン酸エステルの給源、抗体成分または目標の有 機リン酸エステルのいずれかを固定する、あるいは固定できる、支持体、酵素結 合免疫検定検出方式の成分、および適当な洗浄液および封鎖用溶液が含まれる。
しかし、検定キットに対しては、検出すべき有機リン酸エステルに対応する免疫 接合体の給源を含めるのが普通であろう。
もう一つの面において、本発明は試料から有機リン酸エステル化合物を単離する 方法を提供するものである。このような試料として環境媒質（例えば、水または 土）がある。
この方法において、前記媒質を抗体と接触させるという必須工程は、有機リン酸 エステルの検出および定量のために記述されている工程と殆ど違わない。しかし この方法の目的は媒質からの有機リン酸エステル汚染化合物の単離あるいは除去 であるので、結合過程の後で、媒質および結合した抗体／有機リン酸エステル複 合体の分離が必要である。この分離は、抗体を固定した支持体を取除くことによ り、媒質からの抗体／有機リン酸エステル複合体の物理的な除去により行ないう る。別法として、例えば環境媒質が水である場合には、抗体を固定した支持体に 汚染水を流すことにより、分離を自動的に行ないつる。
産業上の応用性 少なくとも本発明の特に適当な形式においては、有機リン酸エステル有害生物防 除剤と構造的に類似はしているが、有機リン酸エステル有害生物防除剤とは著る しく異なって、抗原性高分子に接合されている式（１）の化合物（「ハブテン」 ）か提供される。
従って、本発明は「親」有機リン酸エステル化合物に結合することのできる抗体 またはそのフラグメントの調製に使用するための免疫接合体ならびにこのように してつくられた抗体（あるいはフラグメント）を提供するものである。このよう な抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよいが、モノクローナル抗体か 特によい。
試料中の有機リン酸エステルの存在を検出する方法およびそのための検定キラ１ 〜も提供され、拳法は本発明によって提供される抗体またはそのフラグメントを 用いて試料を検定する工程からなる。このような方法に対して、抗体を標識する かまたは支持体に固定するか、あるいはその両方を行なうかは任意である。
本発明方法はあらゆる種類の有機リン酸エステルに適用できる。本発明に係る一 般的なハブテンを用いてあらゆる有機リン酸エステルに対する抗体を産生できる この能力は、この分野における公知の技術を越えた非常に偉人な進歩といえるも のであり、そこに含まれる意味は当業者によってよく理解されるであろう。
上記説明は単に例示のために提出したのであり、本発明の範囲から離れることな く多くの変更および修飾をなしうることは当業者にとって明らかであろう。
、　、、　＋−ＰＣＴ／ＮＺ　９３１０００１０フロントページの続き （５１）　ｒｎｔ、　Ｃ１，８識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｊ　７０５５− ２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０２ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。
ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ。
ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。
、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、　ＳＫ。
ＵＡ、　ＵＳ （７２）発明者　テン　ホーベ、ウォルターオランダ国エールデ、　９７６１　 ニーエッチ。
ワターモレンデイユク　２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．式、 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）式中、ＸはＲ−Ｏ−、Ｒ−Ｓ−および Ｒ−ＮＨ−からなる群から選ばれ、Ｒは任意に置換された芳香族基または複素環 基、あるいは任意に置換されたアルキルまたはアルケニル基であり； ＹはＯまたはＳであり； Ｒ１はＨまたはアルキルであり；そしてＲ２は式−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは ０から１０の整数である）を有する基、あるいは分枝鎖アルキレン、あるいは式 Ｒ２−Ｏ−Ｒ４（式中、Ｒ３とＲ４は両者とも直鎖または分枝鎖アルキレンであ る）を有する基である、を有する化合物、あるいはその塩またはエステル。 ２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＡ）式中、Ｒ，Ｒ１およびＲ２は請求項 １で定義した通りである。 を有する化合物。 ３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＢ）式中、Ｒ，Ｒ１およびＲ２は請求項 １で定義した通りである、を有する化合物。 ４．式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＣ）式中、Ｒ，Ｒ１およびＲ２は請求項 １に定義された通りである、を有する化合物。 ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＤ）式中、Ｒ，Ｒ１およびＲ２は請求項 １に定義された通りである、を有する化合物。 ６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＥ）式中、Ｒ，Ｒ１およびＲ２は請求項 １に定義された通りである、を有する化合物。 ７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＦ）式中、Ｒ，Ｒ１およびＲ２は請求項 １に定義された通りである、を有する化合物。 ８．Ｒ２は式Ｒ３−Ｏ−Ｒ４（式中、Ｒ３とＲ４は両方とも−ＣＨ２−である） を有する基である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の化合物。 ９．Ｒ１はＨまたはＣ１−６アルキルで、Ｒ２は式−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎ は０から６の整数である）を有する基である、請求項１から請求項７のいずれか １項に記載の化合物。 １０．式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＶ）式中、ＸおよびＹは請求項１に定義 された通りであり、Ｒ１はＨ、−ＣＨ２または−ＣＨ２ＣＨ２であり、そしてＲ ４は請求項１に定義された通りである、を有する請求項１記載の化合物、あるい はその塩またはエステル。 ｌｌ．Ｒ４は−ＣＨ２である、請求項１０記載の化合物。 １２．Ｒ１は−Ｈまたは−ＣＨ２であり、Ｒ４は−ＣＨ２−である、請求項１か ら請求項９のいずれか１項に記載の化合物。 １３．化合物は２−〔５−メチル−２−（３，５，６−トリクロロピリジン−２ −オキシ）−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、２−スルフィド〕 メトキシ酢酸、あるいはその塩またはエステルである、請求項１記載の化合物。 １４．化合物は２−〔５−メチル−２−（４−ニトロフェノキシ）−１，３，２ −ジオキサホスホリナン−５−イル、２−スルフィド〕メトキシ酢酸、あるいは その塩またはエステルである、請求項１記載の化合物。 １５．化合物は２−〔５−メチル−２−（４−ニトロフェノキシ）−１，３，２ −ジオキサホスホリナン−５−イル、２−オキシド〕メトキシ酢酸、あるいはそ の塩またはエステルである、請求項１記載の化合物。 １６．化合物は２−〔〔５−メチル−２−〔（４−オキソ−１，２，３−ベンゾ トリアジン−３（４Ｈ）−イル）メチル−チオ〕−１，３，２−ジオキサホスホ リナン−５−イル、２−スルフィド〕〕メトキシ酢酸、あるいはその塩またはエ ステルである、請求項１記載の化合物。 １７．化合物は２−〔〔５−メチル−２−〔２−（メチルアミノ）−２−オキソ エチルチオ〕−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、２−スルフィド 〕〕メトキシ酢酸、あるいはその塩またはエステルである、請求項１記載の化合 物。 １８．化合物は２−〔２−（２，２−ジクロロエテニルォキシ）−５−メチル− １，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、２−オキシド〕メトキシ酢酸、 あるいはその塩またはエステルである、請求項１記載の化合物。 １９．化合物は２−〔〔２−〔２−（エチルチオ）−エチルチオ〕−５−メチル −１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、２−オキシド〕〕メトキシ酢 酸、あるいはその塩またはエステルである、請求項１記載の化合物。 ２０．化合物は５〔２−（４−ニトロフェノキシ）−１，３，２−ジオキサホス ホリナニル、２−スルフィド〕ペンタン酸、あるいはその塩またはエステルであ る、請求項１記載の化合物。 ２１．請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の化合物と式：▲数式、化 学式、表等があります▼ 式中、ＸはＲ−Ｏ、Ｒ−ＳおよびＲ−ＮＨ（Ｒは任意に置換された芳香族基また は複素環基、あるいは任意に置換されたアルキルまたはアルケニル基である）か らなる群から選ばれ、ＹはＯまたはＳであり、Ｒ５はアルキルである、を有する 化合物との両方に結合しうる抗体またはその結合性フラグメント。 ２２．ポリクローナル抗体である、請求項２１記載の抗体。 ２３．請求項２２記載の抗体のフラグメントである、請求項２１記載の結合性フ ラグメント。 ２４．モノクローナル抗体である、請求項２１記載の抗体または結合性フラグメ ント。 ２５．請求項２４，２８に記載された抗体のフラグメントである、請求項２１記 載の結合性フラグメント。 ２６．組換え型宿主細胞中でコード化するＤＮＡの発現生成物である、請求項２ １記載の抗体または結合性フラグメント。 ２７．抗原性高分子に接合した請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の 化合物からなる免疫接合体。 ２８．高分子がタンパク質である、請求項２７記載の免疫接合体。 ２９．タンパク質はオボアルブミン、牛血清アルブミン、マウスアルブミンまた はポリリジンである、請求項２８記載の免疫接合体。 ３０．請求項２７から請求項２９のいずれか１項に記載の免疫接合体で動物を免 疫化する工程を含む、抗体またはその結合性フラグメントの製造法。 ３１．免疫化工程から生じた抗体またはフラグメントを回収するという更に一つ の工程を含む、請求項３０記載の方法。 ３２．請求項３１記載の方法により製造された抗体またはフラグメント。 ３３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ＸはＲ−Ｏ、Ｒ−ＳおよびＲ−ＮＨ（Ｒは任意に置換された芳香族基また は複素環基、あるいは任意に置換されたアルキルまたはアルケニル基である）か らなる群から選ばれ、ＹはＯかＳであり、そしてＲ６はアルキルである、を有す る化合物に特異的に結合しうる、請求項３２記載の抗体またはフラグメント。 ３４．請求項２７から請求項２９のいずれか１項に記載の免疫接合体で免疫化さ れた動物から得られる抗体産生細胞を不死化する工程を含む、ハイプリドーマ細 胞系の製造法。 ３５．抗体産生細胞を骨髄腫細胞系との融合により不死化する、請求項３４記載 の方法。 ３６．抗体産生細胞は脾細胞である、請求項３４または請求項３５に記載の方法 。 ３７．請求項３４から請求項３６のいずれか１項に記載の方法の生成物であるハ イブリドーマ細胞系。 ３８．請求項３７記載のハイブリドーマ細胞系により分泌されたモノクローナル 抗体。 ３９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、ＸはＲ−Ｏ、Ｒ−ＳおよびＲ−ＮＨ（Ｒは任意に置換された芳香族基また は複素環基、あるいは任意に置換されたアルキルまたはアルケニル基である）か らなる群から選ばれ、ＹはＯまたはＳであり、Ｒ５はアルキルである、を有する 有機リン酸エステル化合物に特異的に結合しうる、請求項３８記載のモノクロー ナル抗体またはその結合性フラグメント。 ４０．組換え型宿主細胞中でコード化するＤＮＡを発現させる工程を含む抗体ま たは結合性フラグメントの製造法において、前記ＤＮＡは請求項２７から請求項 ２９のいずれか１項に記載の免疫接合体で免疫化された動物の抗体産生細胞から 得られたものである上記方法。 ４１．抗体産生細胞は脾細胞である、請求項４０記載の方法。 ４２．請求項４０または請求項４１記載の方法の生成物である、抗体または結合 性フラグメント。 ４３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する有機リン酸エステル化合物に特異的に結合しうる抗体または結合性フラ グメント。 ４４．請求項２１から２６、請求項３２、請求項３３、請求項３８、請求項３９ 、請求項４２および請求項４３のいずれか１項に記載された、検出しうる標識を もつ抗体またはその結合性フラグメント。 ４５．請求項２１から２６、請求項３２、請求項３３、請求項３８、請求項３９ 、請求項４２および請求項４３のいずれか１項に記載の、支持体に固定された抗 体またはその結合性フラグメント。 ４６．有機リン酸エステル化合物を含むかもしれない試料中の有機リン酸エステ ル化合物の存在を検知する方法において、（ａ）前記試料を請求項２１から２６ 、請求項３２、請求項３３、請求項３８、請求項３９および請求項４２から４５ のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントで検定し、（ｂ）もしあれ ば前記抗体またはフラグメントにより拘束された有機リン酸エステル化合物を検 出する工程を含む上記方法。 ４７．抗体またはフラグメントは請求項２１から２６のいずれか１項に記載され たものである、請求項４６記載の方法。 ４８．抗体またはフラグメントは請求項３２または請求項３３記載のものである 、請求項４６記載の方法。 ４９．抗体またはフラグメントは請求項３８または請求項３９記載のものである 、請求項４６記載の方法。 ５０．抗体またはフラグメントは請求項４２または請求項４３記載のものである 、請求項４６記載の方法。 ５１．抗体またはフラグメントは請求項４４または請求項４５記載のものである 、請求項４６記載の方法。 ５２．有機リン酸エステル化合物を含むかもしれない試料中の有機リン酸エステ ル化合物の存在を検知するための検定キットにおいて、前記有機リン酸エステル に対する抗体または抗体の結合性フラグメントを含み、前記抗体は請求項２１か ら２６、請求項３２、請求項３３、請求項３８、請求項３９および請求項４２か ら４５のいずれか１項に記載のものである上記キット。 ５３．抗体または結合性フラグメントは請求項２１から２６のいずれか１項に記 載のものである、請求項５２記載の検定キット。 ５４．抗体または結合性フラグメントは請求項３２または請求項３３記載のもの である、請求項５２記載の検定キット。 ５５．抗体または結合性フラグメントは請求項３８または請求項３９記載のもの である、請求項５２記載の検定キット。 ５６．抗体または結合性フラグメントは請求項４２または請求項４３記載のもの である、請求項５２記載の検定キット。 ５７．抗体または結合性フラグメントは請求項４４または請求項４５記載のもの である、請求項５２記載の検定キット。 ５８．請求項２７から２９のいずれか１項に記載の免疫接合体を更に含む、請求 項５２から５７のいずれか１項に記載の検定キット。 ５９．試料から有機リン酸エステル化合物を単離する方法において、（ａ）前記 試料を請求項２１から２６、請求項３２、請求項３３、請求項３８、請求項３９ および請求項４２から４５のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント と接触させ、 （ｂ）前記抗体またはフラグメントにより拘束された有機リン酸エステル化合物 を回収する という工程を含む上記方法。 ６０．有機リン酸エステル化合物で汚染された環境培質の浄化法において、前記 媒質を請求項２１から２６、請求項３２、請求項３３、請求項３８、請求項３９ および請求項４２から４５のいずれか１項に記載の抗体と接触させて前記化合物 を前記媒質から除去するという工程を含む上記方法。 ６１．本明細書中にいずれかの例に関して実質的に記載され請求項１に定義され た式（Ｉ）の化合物あるいはその塩またはエステル。 ６２．本明細書中にいずれかの例に関して実質的に記載され請求項２１に定義さ れた抗体またはその結合性フラグメント。 ６３．本明細書中にいずれかの例に関して実質的に記載され請求項２７に定義さ れた免疫接合体。 ６４．本明細書中にいずれかの例に関して実質的に記載され請求項３０に定義さ れた抗体または結合性フラグメントの製造法。 ６５．本明細書中にいずれかの例に関して実質的に記載され請求項３４に定義さ れたハイブリドーマ細胞系の製造法。 ６６．本明細書中にいずれかの例に関して実費的に記載され請求項３７に定義さ れたハイブリドーマ細胞系。 ６７．本明細書中にいずれかの例に関して実質的に記載され請求項１に定義され た式（Ｉ）の化合物あるいはその塩またはエステルの製造法。 ６８．請求項１に定義された式Ｉの化合物の製造に使用するための化合物におい て、式： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｄ，▲数式、化学式、表等があります▼Ｅ， ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＡ，▲数式、化学式、表等があります▼ ＩＩＢ，▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＤ，および▲数式、化学式、表 等があります▼（ＶＩ）上記式中、Ｒ１はＨまたはアルキルであり、Ｒ３とＲ４ は両方とも直鎖または分枝鎖アルキレンであり、Ｑｎ＋はｎの正電荷をもつ陽イ オンである、を有する化合物群から選ばれる上記化合物。 ６９．化合物は ２（２，２，５−トリメチル−１，３−ジオキサン−５−イル）メトキシ酢酸、 メチルエステル、 ２（３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−２−メチル）プロポキシ酢酸、メ チルエステル、 ２（２−クロロ−５−メチル−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、 ２−スルフィド）メトキシ酢酸、メチルエステル、２（２−クロロ−５−メチル −１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イル、２−オキシド）メトキシ酢酸 、メチルエステル、２−（２−メルカプト−５−メチル−１，３，２−ジオキサ ホスホリナン−５−イル、２−スルフィド）メトキシ酢酸、ビスカリウム塩、お よび（２−メトキシ−５−メチル−１，３，２−ジオキサホスホリナン−５−イ ル）メトキシ酢酸、メチルエステル からなる群から選ばれる、請求項６８記載の化合物。
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