JPH0694444B2 - カルシウム特異性けい光指示薬染料 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカルシウムイオンに対して特異的であるけい光
指示薬染料に関する。さらに詳しくは、本発明は、染料
が結合したカルシウムを含んでいるかまたはカルシウム
を含んでいないかによつて異なる波長でけい光を発する
カルシウム特異性けい光指示薬染料に関する。この波長
のずれは、２つの波長におけるけい光の比を単に測定す
ることによつて絶対的なスケールでカルシウム濃度を算
出することを可能にする。

さらに、本発明はα−アシルオキシアルキルブロミド、
特にここに開示する新規なけい光染料のクラスに含まれ
るアセトキシメチルエステルの製造に有効なアセトキシ
メチルブロミドの改良された合成方法に関する。

細胞内伝達物質及び調節物質としてカルシウムが重要で
あるため、細胞内の遊離カルシウム濃度〔Ca²⁺〕ｉを測
定するために広範囲な方法が開発されている（参考文献
４参照）。これらの方法の中でも有利な方法は、Ca²⁺イ
オンを結合すると吸光度またはルミネセンスを変える染
料または蛋白質を用いるものである。現在、これらの方
法の中で最も一般的な方法は、「quin 2」と呼ばれる指
示薬染料化合物のようなBAPTA（1,2−ビス（２−アミノ
フエノキシ）エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸）様化
合物のけい光を監視することである（参考文献４〜７参
照）。この方法を用いて哺乳動物細胞の細胞内遊離カル
シウムの測定する場合には、quin2を膜浸透性エステル
誘導体として細胞とともにインキュベートすることによ
つて、quin2を生きた細胞内に負荷させる。次に細胞質
ゾルのエステラーゼが誘導体を分解するため、膜不浸透
性quin2テトラ陰イオンが細胞質ゾル内に捕捉されて残
される。quin2のけい光が細胞質ゾル内の遊離のカルシ
ウム濃度の尺度を与える。この濃度は捕捉された染料を
カルシウムの飽和するほどの高レベルならびに消失する
ほどの低レベルに付することによつて得た一定けい光レ
ベルにあてはめることによつて計算される。

quin2は非常に重要な生物学的情報を明らかにしたが、
これは厳しい、一般に認られた限界を有している（参照
文献５と７参照）。例えば、quin2の好ましい励起波長3
39nmは紫外線領域に入るので短かすぎる。UV照射は監視
すべき細胞からの有意な自然けい光を励起させる。さら
に、このようなUV照射は被験細胞に生物学的副作用を誘
発することがある。さらに、このUV範囲の光線が顕微鏡
のレンズをあまり良く通過しないことも知られている。

quin2に関する第２の問題は、その吸光係数（＜5000）
とけい光量子収量（0.03〜0.14）が水溶液中のダンシル
基に匹敵するとしても、低すぎるという事実である。こ
のような分光学的な性質は、細胞の自然けい光を克服す
るためには１ミリモルの数10分の１以上のquin2負荷が
必要であることを意味する。幾つかのタイプの細胞で
は、この大きな負荷が「Ca²⁺」ｉ遷移状態を緩衝する。

quin2に関する第３の問題は、quin2が励起波長または発
光波長をシフトさせるのでなしにCa²⁺のけい光強度を高
めることによつて、Ca²⁺濃度に関する情報を与えるとい
う事実である。残念なことに、けい光強度も光線内の照
射強度、発光回収効率、染料濃度及び有効細胞厚さのよ
うな、量的に充分に限定できないかまたは変化しやすい
変数に依存する。従つて、カルシウムに反応して強いけ
い光を維持したまま波長をシフトさせるような、指示薬
染料を得ることが望ましいと考えられる。この場合に
は、適当に選択した２つの波長のけい光の比が、装置の
効率と有効染料量によつて生じうる可変性の殆んどまた
は全てを排除して、カルシウム量を特徴づけることにな
る。

quin2に関する第４の問題は、quin2がマイクロモルレベ
ルではカルシウムを測定できないという事実である。Ca
²⁺に対するquin2の有効な親和性が高いことは〔Ca²⁺〕
ｉの典型的な静止値すなわち10−⁷M近くかまたはそれ以
下の濃度を測定するには理想的であるが、カルシウムの
マイクロモル濃度以上では、残念なことにquin2は飽和
に近づくため、けい光強度のこれ以上の変化は小さくな
る。この結果、このように上昇したレベルのカルシウム
を定量するためには親和性の弱い染料が必要になる。

最後に、マグネシウム及び２価の重金属陽イオンに比べ
てカルシウムを選ぶという選択性についてもquin2は改
良の余地があると考えられる。quin2は解離定数１〜2mM
でMg²⁺を結合する。Mg²⁺は339nmで励起したquin2のけい
光に殆んど影響しないが、〔Mg²⁺〕ｉの変化はCa²⁺に対
する有効親和性及びけい光シグナルに対する校正スケー
ルに影響すると考えられる。異常に高レベルの置換可能
重金属を含む細胞も、重金属がquin2のけい光を消失さ
せるので、誤つた低い〔Ca²⁺〕ｉ読取り値を与えること
になる（参考文献８参照）。逆に、染料負荷は〔Mg²⁺〕
ｉを変動させるかまたは細胞の機能に重要な重金属をキ
レート化させるおそれもある。

このように、カルシウムイオンに対して特異的な新規な
クラスのけい光指示薬染料が必要とされている。このよ
うな染料は水溶液、特に生物学的液体中のカルシウム濃
度の測定及びさらに詳しくは、生活細胞内のカルシウム
濃度の測定のために必要である。絶対的なスケールでの
カルシウム濃度の測定を可能にするために、新規なけい
光指示薬化合物はCa²⁺結合に基づいて波長シフトを表さ
なければならない。この新規な化合物は公知のCa特異性
指示薬quin2の使用に伴う特殊な問題の幾つかも克服す
べきである。さらに詳しくは、quin2に比べて、新規な
化合物は非常に強力なけい光を示すとともに、Ca²⁺に対
する幾らか弱い親和性ならびにマグネシウム及び重金属
に対する良好な選択性を示さなければならない。

新規なクラスのカルシウム特異性けい光指示薬を提供す
ることが本発明の１つの目的である。

水溶液中のカルシウム濃度を測定し得るような、新規な
クラスのカルシウム特異性けい光指示薬化合物を提供す
ることが本発明の他の目的である。

生物学的液体中のカルシウム濃度を測定し得るような、
新規なクラスのカルシウム特異性けい光指示薬化合物を
提供することが本発明の他の目的である。

生活細胞内のカルシウム濃度を測定し得るような、新規
なクラスのカルシウム特異性けい光指示薬化合物を提供
することが本発明の他の目的である。

Ca²⁺結合状態及びCa²⁺非結合状態の両方で強いけい光を
示すような、新規なクラスのカルシウム特異性けい光指
示薬化合物を提供することが本発明の他の目的である。

Ca²⁺結合に基づいて波長シフトを示すような、新規なク
ラスのカルシウム特異性けい光指示薬化合物を提供する
ことが本発明の他の目的である。

マイクロモルレベルのカルシウムを測定し得るような、
カルシウム特異性けい光指示薬化合物を提供することが
本発明の他の目的である。

マグネシウム及び重金属に対する良好な選択性を示すよ
うな、カルシウム特異性指示薬化合物を提供することが
本発明の他の目的である。

本発明のこの他の目的は、添付図面に関連しながら行う
次の説明から、当業者に明らかになると思われる。

図１はstil−1,stil−２及びindo−１に導く合成経路を
示す。図面に用いたローマ数字は、下記の合成方法の項
で説明する合成内容に合わせたものである。

図２はfura−1,fura−２及びfura−３に導く合成経路を
示す。図面に用いたローマ数字は、この場合も、下記の
合成方法の項で説明する合成内容に合わせたものであ
る。

図３は、＜1nMから＞10μＭまでの範囲の遊離Ca²⁺値を
含む緩衝液内の１μM fura−２の20℃における励起スペ
クトル系列を示す。励起帯幅は1.9nmであり、発光は510
nmにおいて4.6nmの帯幅で集められ、スペクトルはロー
ダミンＢ量子計測器を用いて励起ランプとモノクロメー
タの特性に関して自動的に補正された。

100mM KCl,10mM KMOPS,10mM K₂H₂EGTAと１μM fura−２
から成る5mlから出発して、pHを720に調節し、スペクト
ルを記録し、次にこの溶液の0.5mlを捨て、100mM KCl,1
0mM KMOPS,10mM K₂CaEGTAと１μM fura−２から成る0.5
mlを補充し、pHを7.20に再調節し、スペクトルを9mM K₂
H₂EGTAと1mM K₂CaEGTAの中で記録することによつて滴
定を行つた。次に、5.01（11−ｎ）mlを捨て、等量の10
mM K₂CaEGTA−１μM fura−２ストツク液を補充するこ
とによつて、n mM CaEGTA,（10−ｎ）mM EGTAに達する
までくり返す。（但し、ｎ＝２〜10）。ｎ＝10に達して
10−^４〜10−⁵Mの遊離Ca²⁺が生じた後に、1mM CaCl₂添
加してもスペクトルに対する影響はもはやなかつた。Ca
²⁺選択性電極で測定して電位差終点に達するまでK₂H₂EG
TAをCaCl₂によつて滴定することによつて、K₂CaEGTA溶
液中のCaとEGTAの含量が確実に等しいようにした。EGTA
はフルカ・ケミカル社の「puriss」等級であつた。

図４は、遊離Ca²⁺の関数としてのindo−１の発光スペク
トルを示す。115mM KCl,20mM NaCl,10mM MOPS,1.115mM
MgCl₂,1.115mM K₂H₂EGTAから成る液中の６μＭの染料
を、pH7.050±0.004に達するまでKOH加えて37℃におい
て滴定し、この溶液にK₂CaEGTAの小アリコートをマイク
ロメータの注入器から加えて、図中の各曲線に付したnM
の単位の値（特に指定しない限り）にまで遊離Ca²⁺を高
めた。励起は355nmで生じ、励起と発光の両方を5nmの帯
幅になるように設定した。これらのスペクトルはパーキ
ン・エルマーMPF−44の発光感度特性に関して補正しな
かつた。特に465nmにおけるノツチは機器の人為結果で
ある。補正した発光スペクトルは、励起が355〜366nmで
生じた場合に高Ca 404nmピークに非常に似た振動幅のCa
48nmピークを示す。

図５は、同じセットの条件下、すなわち130mM KCl,10mM
MOPS,1mM EDAT,pH7.20になるようにKOHを添加、20℃の
条件下での1mM遊離Ca²⁺を生ずるための2mM CaCl₂添加の
前後の１μM fura−２及び30μM quin−２の励起スペク
トルを示す。発光は500nmにおいて、4.6nmの帯幅で回収
され、励起帯幅は0.93nmであつた。Quin2遊離酸はラン
カスター・シンセシス社（イングランド、モーキヤン
ブ）から入手した。

図６はfura−２に対するMg²⁺の影響を示す。32mMKCl,1m
M EGTAと10mM MOPSから成り、KOHによつてpH7.18に調節
し、20℃に温度調節した溶液2.5ml中で２μM fura−２
の励起スペクトルを記録した。次に、この溶液25μを
捨て、代りに２μM fura−２、104.8mM MgCl₂、5.8mM E
GTAと10mM MOPSから成り、KOHでpH7.18に調節した25μ
を補充した。両ストツク液は1mM遊離EGTAを有するが
後者は100mM遊離Mgを有するので99:1v/vの組合わせは1.
0mM遊離Mg²⁺を生ずることになる。さらに、この混合物
から25.25,76.53,131.6及び277.8μを連続的に捨て、
当量の高Mgストツク液をそれぞれ補充することによつ
て、この操作をくり返して2,5,10及び20mM遊離Mg²⁺を得
た。発光は510nmにおいて、4.6nm帯域で回収され、励起
は0.9nm帯域であつた。

図７は、0,200nM及び1mM遊離Ca²⁺におけるfura−２に対
する6.75〜7.05の範囲でのpH変化の影響を示す。135mM
KCl,5mM MOPSと2mM EGTAから成り、KOHでpH7.05に調節
した、37℃の溶液中で0.5μM fura−２の励起スペクト
ルを記録した。HClでpH6.75に酸化した後、0.379mM CaC
l₂を添加し、KOHでpH6.75に調節した後；さらに0.655mM
CaCl₂を添加し、KOHでpH7.05に調節した後;2mM CaCl₂
を添加し、KOHでpH6.75に調節した後；及びKOHでpH7.05
に調節した後に連続スペクトルを記録した。添加量を記
録し、図示したスペクトルは若干の希釈効果を補償する
ように調節した。発光は505nmにおいて、18.5nm帯域で
回収され、励起帯域は4.6nmであつた。200nM遊離Caによ
る曲線を含めることは重要である。この場合には、おそ
らく右側環のアミノ基の窒素に重要なプロトン化が生
じ、零Ca²⁺または極度に高いCa²⁺のいずれの場合にもけ
い光に影響することなく、Ca²⁺結合を有意に抑制すると
考えられるからである。200nM Ca²⁺において、pH6.75曲
線がpH7.05曲線よりも「零Ca」曲線に接近しているとい
う観察は、Ca²⁺結合のこのようなH⁺抑制が軽度に生ずる
がその影響は有らかに小さく、一部はCa²⁺を含まない染
料に対するpHの直接影響が小さいことによつて中和され
ることを示唆する。

ここで用いる用語の定義 ここで用いるかぎり、〔Ca²⁺〕ｉは細胞内の遊離カルシ
ウムを意味する。

ここで用いるかぎり、EGTAはエチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,N′−四酢酸
を意味する。

ここで用いるかぎり、BAPTAは1,2−ビス（２−アミノフ
エノキシ）エタンN,N,N′,N′−四酢酸を意味し、BAPTA
の化学構造式は次式である： ここで用いるかぎり、BAPTA様とは２個のビス（カルボ
キシメチル）アミノ置換フエニル環の本質的な特徴を保
持し、該環がアミンに対してオルト位置において、各フ
エニル環に隣接する原子がＮまたはＯであり、２個の中
心原子がそれぞれＣである４原子架橋を通して結合して
いるBAPTAの置換体を意味する。この定義によつて、「B
APTA様」がquin−１とquin−２に似た化合物を含むこと
が明らかである。

ここで用いるかぎり、quin−１は２−〔〔２−〔ビス−
（カルボキシメチル）アミノ〕−５−メチルフエノキ
シ〕−メチル〕−８−〔ビス（カルボキシメチル）アミ
ノ〕−キノリンを意味する。

ここで用いるかぎり、quin2は２−〔〔２−〔ビス（カ
ルボキシメチル）アミノ〕−５−メチルフエノキシ〕−
メチル〕−６−メトキシ−８−〔ビス（カルボキシメチ
ル）アミノ〕−キノリンを意味し、quin2の化合構造式
は次式である： ここで用いるかぎり、MOPSは３−（Ｎ−モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸を意味する。

ここで用いるかぎり、stil−１は１−（２−アミノ−５
−〔（２−（４−カルボキシフエニル）−Ｅ−エテニル
−１〕フエノキシ−２−（２′−アミノ−５′−メチル
フエノキシ）−エタン−N,N,N′,N′−四酢酸を意味す
る。stil−１の化学構造式は化合物Ｘとして図１に示
す。

ここで用いるかぎり、stil−２は１−（２−アミノ−５
−〔（２−（４−N,N−ジメチルアミノスルホニルフエ
ニル）−Ｅ−エテニル−１〕フエノキシ−２−（２′−
アミノ−５′−メチルフエノキシ）−エタン−N,N,N′,
N′−四酢酸を意味する。stil−２の化学構造式は化合
物XIIとして図１に示す。

ここで用いるかぎり、indo−１は１−（２−アミノ−５
−（６−カルボキシインドリル−２〕−フエノキシ）−
２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）エタン
−N,N,N′,N′−四酢酸を意味する。indo−１の化学構
造式は化合物XVIIとして図１に示す。

ここで用いるかぎり、fura−１は１−（２−４−カルボ
キシフエニル）−６−アミノ−ベンゾフラン−５−オキ
シ）−２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）
エタン−N,N,N′,N′−四酢酸を意味する。fura−１の
化学構造式は化合物XXIXとして図２に示す。

ここで用いるかぎり、fura−２は１−（２−（５′−カ
ルボキシ−オキサゾル−２′−イル）−６−アミノベン
ゾフラン−５−オキシ）−２−（２′−アミノ−５′−
メチルフエノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢酸を意
味する。fura−２の化学構造式は化合物XXXVとして図２
に示す。

ここで用いるかぎり、fura−３は１−（２−（４−シア
ノフエニル）−６−アミノベンゾフラン−５−オキシ）
−２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）エタ
ン−N,N,N′,N′−四酢酸を意味する。fura−３の化学
構造式は図２に化合物XXXIIとして示す。

ここで用いるかぎり、薬剤学的に受容できるエステルと
は製薬工業で用いられている公知の、容易に加水分解可
能なエステル、特にα−アシルオキシアルキルエステル
を意味する。一般的に参考文献37と38を参照のこと。

ここで用いるかぎり、薬剤学的に受容できる無害な塩と
は、対イオンまたはイオンが全てNa,K,NR₄ ⁺（ＲはH,C₁
〜C₄アルキルまたはこれらの混合物を意味する）、Caま
たはMgであるカルボン酸塩、またはこれらの対イオンの
組合わせもしくはこれらの対イオンのカルボン酸塩の組
合わせプラス遊離酸基を意味する。

ここで用いるかぎり、μＭとはマイクロモルを意味す
る。

ここで用いる温度は全て℃で表される温度である。

ここで用いるかぎり、「染料」と「指示薬」は交換可能
な意味に用いるものである。

図１と２に示す化合物の化学式はローマ数字によつて認
識される。これらのローマ数字は明細書を通して（特
に、下記の合成方法の項参照）図に示した化合物に相当
する化合物を認識するために用いられる。

ここで開示する新規な染料は数字の１と小文字のエルを
区別するために、例えばindo−1,fura−1,fura−2,stil
−1,stil−２等のように、ハイフンをつけて名づけるこ
とにする。

参考文献リスト ここに挙げる科学刊行物は特に参考文献として関係する
ものである。

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有するテトラカルボキシレート Ca²⁺キレート化合物とスチルベン型発けい光団を結合し
た、新規なクラスのカルシウム特異性けい光指示薬染料
に関する。

第一形態で、こ新規な染料は単独のけい光染料に結合し
たBAPTA様Ca²⁺キレート化剤から成る。この形態で、こ
の新規な染料は次の一般式： 〔式中、 R¹は−Ｈ、−CH₃、−Ｆ、−Cl及び−Brから成る群から
選択する； R²は−Ｈ、−CH₃、−Ｆ、−Cl、−Br及びC₁〜C₄アルコ
キシから成る群から選択する； R³またはR³aは互いに関係なくＨ、または−CO₂H,−CO₂R
⁴,−CONR⁵R⁶,−SO₃H,−SO₂NR⁵R⁶,−SO₂CF₃,−COCH₃及び
−CNから成る群から選択された極性電子求引性官能基で
あるか、または R³またはR³aが一緒になつて−（CO）NR⁵（CO）−であ
る； R⁴はα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受容で
きるエステル化基である； R⁵とR⁶は互いに関係なく−H,メチルまたはエチルであ
る； Ｚはトランスエチレン結合を通して、１つの２−アミノ
フエノキシ環の５位置に結合した芳香族またはヘテロ芳
香族系であり、該エチレン結合自体が芳香族またはヘテ
ロ芳香族環系の一部であつてよく； ＷはＨであり、ＸもＨであるか；または ＷとＸは一緒になつてＯまたはNR⁵である； ＹはＨであり、Ｙ′もＨであるか（ＡはNR⁵、Ｏまたは
Ｓでないかぎり）；または ＹとＹ′は一緒となつてNR⁵であり、ＡがＣである； ＡとＡ′は互いに関係なくＣ、Ｎ、ＯまたはＳである； ＤはＯ、Ｎ、NHまたはＮアルキルである； ＱはＤがＮである場合には二重結合であり、他の場合は
単結合である；ならびに R⁷はＨであり、R⁸もＨである；または R⁷とR⁸が、ヘテロ原子Ｄ、R⁷に隣接する炭素及びR⁸に隣
接するフエニル環と共にキノリン環系（Ｄ＝Ｎ、Ｑ＝二
重結合）を形成する〕 で表されるビス（２−アミノフエノキシ）エタン−N,N,
N′,N′−四酢酸ならびにその薬剤学的に受容できる非
毒性塩及びエステルから成る。

第二形態では、この新規な染料は一対のけい光染料に結
合したBAPTA様のCa²⁺キレート化剤から成る。この形態
で、新規な染料は次の一般式： 〔式中、 R³またはR³aは互いに関係なくＨ、または−CO₂H,−CO₂R
⁴,−CONR⁵R⁶,−SO₃H,−SO₂NR⁵R⁶,−SO₂CF³,−COCH₃及び
−CNから成る群から選択した極性電子求引性官能基であ
る、または R³とR³aは一緒になつて−（CO）NR⁵（CO）−である； R⁴はα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受容で
きるエステル化基である； R⁵とR⁶は互いに関係なく−H,メチルまたはエチルであ
る； Ｚは、トランスエチレン結合を通して１つの２−アミノ
フエノキシ環の５−位置に結合した芳香族またはヘテロ
芳香族系であり、該エチレン結合自体が芳香族またはヘ
テロ芳香族環系の一部であつてよく； ＷはＨであり、ＸもＨである；または ＷとＸは一緒になつてＯまたはNR⁵である； ＹはＨであり、Ｙ′もＨである（ＡはNR⁵,OまたはＳで
ないかぎり）；または ＹとＹ′は一緒になつてNR⁵であり、ＡはＣである； ＡとＡ′は互いに関係なくＣ、Ｎ、ＯまたはＳである； ＤはＯ、Ｎ、NHまたはＮアルキルである； ＱはＤがＮである場合には二重結合であり、他の場合に
は単結合である；ならびに R⁷はＨであり、R⁸もＨである；または R⁷とR⁸は、ヘテロ原子Ｄ、R⁷に隣接する炭素及びR⁸に隣
接するフエニル環と共に、キノリン環系を形成する（Ｄ
＝N,Q＝二重結合）〕 で表される化合物ならびにその薬剤学的に受容できる非
毒性塩及びエステルから成る。

第一及び第二形態の両方における好ましい指示薬は、ス
チルベンのエチレン結合をトランス配位に限定し、疎水
性を減ずるヘテロ環架橋を含む。

さらに、本発明はα−アシルオキシアルキルブロミド、
特にここで開示し特許を請求する新規な指示薬のクラス
に含まれるアセトキシメチルエステルの製造に有用なア
セトキシメチルブロミドの改良合成方法を含む。α−ア
シルオキシアルキル・ブロミドは製薬工業において前駆
薬の製造に有用である（参考文献38と39参照）。この改
良方法は約0.1〜0.2当量のルイス酸の存在下で反応が完
成するまで攪拌しながら、反応器内で約１当量の1,1−
ジアシルオキシアルカンと約１〜1.5当量のトリメチル
シリルブロミドを反応させ、このようにして製造された
α−アシルオキシアルキルブロミドを回収することから
成る。

公知の方法で製造されたα−アシルオキシアルキルはビ
ス（１−ブロモアルキル）エーテルによつて汚染されて
いる。本発明の改良された方法によつて製造されたα−
アシルオキシアルキルブロミドはビス（１−ブロモアル
キル）エーテルによる汚染を含まない。また、この新規
な方法は、公知の方法によつて製造することが非常に困
難又は不可能であるだろう特定なα−アシルオキシアル
キルブロミドを製造することが可能である。公知な方法
は、吸水性で、不安定で、重合しやすい純粋な無水アル
デヒドを必要とするからである。

発明の構成 本発明は、スチルベン型発けい光団を８配位テストカル
ボキシレートCa²⁺キレート化化合物、BAPTAの同族体と
結合させる新規なクラスのカルシウム特異性けい光指示
薬染料に関する。第１形態では、この新しい染料は単独
の螢光染料に結合したBAPTA同族体から成る；第２形態
では、BAPTA同族体が１対の螢光染料に結合している。
第１及び第２形態の両方で好ましい化合物は、スチルベ
ンのエチレン結合をトランス配置に限定するヘテロ環橋
を含む。

ここで開示した新規な指示薬染料は、BAPTA様親化合物
の少なくとも１個の芳香族環に付着した少なくとも１個
のスチルベン型官能基を共通して有する。このスチルベ
ン型官能基は、トランス二重結合を有する２個の炭素を
通してBAPTA様の親の芳香族環に結合した芳香族系又は
ヘテロ芳香族系から成る。典型的な最終化物は分子のBA
PTA様キレート化部分（例えば、最大波長＝約254nm、吸
光係数＝約16,000）（参考文献６参照）と発螢光団（例
えば、最大波長＞300nm、吸光係数＞10,000）（下記の
表１参照）の両方からのスペクトル寄与を有する。発螢
光団はキレート化剤に電気的に結合しているので、カル
シウムが分子に結合している場合、分子のキレート化部
分は発螢光団部分に電子密度をもはや供与せず、最大吸
収波長は減少する。発螢光団とBAPTA様キレート化剤の
間の結合に１列になつたわずかに１つのシグマ結合があ
る限り、この電気結合は維持されるだろう。発螢光団と
キレート化部分の間の結合は、錯体ヘテロ環の一部でも
ありえるし、逆に該錯体ヘテロ環は発螢光団の一部又は
キレート化剤の一部でもありえる。

BAPTA誘導体の陽イオンの親和性は、適当な電子供与性
又は電子求引性基によつて増加または減少しうることは
公知である（一般的には参考文献６参照）。例えば、BA
PTAの２個の窒素に対してパラの２個の水素を２個のメ
チル基で置換するとCa²⁺の結合を0.4対数単位だけ強化
し、臭素による同様な二置換はCa²⁺の結合を1.2対数単
位だけ弱める（参考文献６参照）。１置換はカルシウム
親和性に半分の効果をもたらすことが発見された（デー
タ示さず）。当業者にとつては、本化合物の陽イオンの
親和性に対する他の置換基の影響が、ハメツト型（Hamm
ettype）線形自由エネルギー相互関係によつて量的に予
想可能であることは公知である。

染料を特定する特性の最も大きな変化は、特定の染料の
Kdの２対数〔Ca²⁺〕単位内で生じることも公知である。
（参考文献６参照）。従つて、このことは種々範囲のKd
値を有する染料を得ることが重要と考えられる。この目
的のためにR₁とR₂を変化させてKdを上下に調節すること
が可能である。予想通り、分子の染料成分はCa²⁺結合を
０−0.3対数単位だけ弱める（表１のKdとBAPTA Kd＝100
nmを比較せよ、参考文献６参照）。

長波長の発螢光団を一個のみ有する化合物の製造におい
て、R²が水素以外のものであるならば環の５位置はブロ
ツクされ、４−Ｗ−ベンゼン環又は等価なキノリン環の
望ましい５位置でのみホルミル化が生ずるであろう。R²
が水素であるならば、R¹にハロゲンがあると求電子置換
に対して環は不活化され、主に望ましい位置でホルミル
化が生ずると考えられる。R²＝Ｈ及びR¹＝Ｈ又はアルキ
ル基であるとしても、目的の生成物は、制御されたホル
ミル化及び目的生成物の分離又は適当な３−ヒドロキシ
−４−ニトロベンズアルデヒドで合成を始めることによ
つて製造される（下記の合成方法の項、参照）。

２個の発螢光団を含む化合物を製造するために、R²は水
素でなければならず、R¹は水素、アルキル基、又は置換
基Ｗの任意の態様であり得る。この場合、望ましいホル
ミル化は、両方のフエニル環の５位置又はR¹,R²フエニ
ルの両方およびキノリン又はベンゾピランの５位置で生
ずると考えられる。

分子染料成分はトランススチルベンに基づくが、他の多
くの形態もとりうる。スチルベンのエチレン橋は、架橋
を含むヘテロ環を形成することによつてトランス配置で
ロツクされてもよい。従つて、上述の一般式のＹ及び
Ｙ′は一緒になつてNR⁵のようなヘテロ原子であり得、
染料分子はインドールでありうる。インドールのような
ものの合成は下記の合成方法の項で述べられ、このクラ
スの染料成分が説明されている。（indo−１参照）。エ
チレン橋を分子のキレート化部分のフエニル環にブロツ
クするヘテロ環も形成されうる。従つて、ＷとＸ（上記
の一般式参照）が一緒になつてNR⁵,又はＯであるなら
ば、インドール又はベンゾフラン誘導体の分離基が製造
され得る。例示のために、このようなベンゾフランの１
つの合成を下記の合成方法の項で述べる（化合物fura−
1,fura−２及びfura−３参照）。

Ｚ系の本質的な特徴は、その芳香族性と親のキレート化
化合物への結合関係である。。一般式で示すように、結
合は上記で述べたようにトランス−エチレン又はヘテロ
環の一部である。例示のために、下記の合成方法の項で
はＺとしてフエニルまたはオキサゾールの使用を示す化
合物、例えばそれぞれstil−１またはfura−２の化合
物、またはＹとＹ′及びエチレン橋と一緒になつたＺと
してインドールを用いた化合物例えば化合物indo−１を
説明する。

ＺのR³とR³a置換基は、最終分子の芳香族の一般的に疎
水性の染料化合物の親水性を高めるのに役立つ。R³とR³
aは染料の最大吸収または発光波長を若干調節するのに
も用いられる。本発明で開示し、特許を請求する染料に
は、R³とR³aが一緒になつて−（CO）NR⁵（CO）−である
場合に形成される環状イミドを含めて、広範囲なR³とR³
a置換基を用いることができる。カルボキシ、シアノ及
びアミノスルホニルのR³としての使用は、実施例によつ
て説明する（それぞれ、fura−1,fura−３及びstil−２
化合物の合成、参照）。

ここに開示する新規な染料の合成方法は、下記の合成方
法の項で概要を述べる。好ましい形態のindo−1,stil−
1,stil−2,fura−1,fura−２及びfura−３によつて例示
するような、新規な染料の特有の性質及び実施態様は下
記の実施例Ｉ〜VIIに開示して考察する。さらに詳しく
説明すると、実施例ＩはCa²⁺の存在下及び不在下での新
規な指示薬の吸光度性状について考察し、実施例IIはけ
い光性状について考察する。実施例IIIはCa²⁺結合定数
について考察する。スチルベン型染料の光異性化につい
ては実施例IVで考察し、陽イオン選択性については実施
例Ｖで考察する。実施例VIは膜結合について考察し、実
施例VIIは２波長でのけい光強度値を用いた染料の校正
式について考察する。

種々な実施例において開示し考察したデータから、けい
光輝度の増加が、quin2のようなこれらの直線の先行技
術試薬と比べた場合に、この新規な染料の最も明白に認
められる利点であることがわかる。この新規な染料は一
部は５〜６倍高い吸光係数を有するため、また一部はそ
れらのけい光量子率が高い（quin2の0.1に比べて0.5ま
で）ために、10〜30倍強いけい光を有する。このけい光
の増強は、適当なシグナルを与えるために一定量の細胞
に導入する染料が非常に少なくてよいことを意味する。
細胞内部の染料が少なければ少ないほど、測定すべきカ
ルシウムレベルを有意に緩衝したりまたは他の点で細胞
を混乱させる可能性は少なくなる。この代りに、輝度が
高くなれば、より短い観察時間においてまたはより小体
積の組織からCa²⁺の測定が可能となる。後者の例は、直
径約６ミクロンの単独胸腺細胞の分裂促進剤レクチンに
よつて誘発された〔Ca²⁺〕ｉ上昇のfura−２による観察
（データ示さず）である。これはquin2によつては不可
能であることがわかつている成果であつた（参考文献28
参照）。

新規な染料の非常に重要な第二の特徴はCa²⁺によつてけ
い光スペクトルの形状と波長分布が有意に変化するが、
強度は変化しないことである。この波長シフトによつ
て、２つの波長におけるけい光の比のみから、染料濃
度、光道の長さまたは絶対的な検出感度を考慮せずに、
絶対的なスケールでカルシウム濃度を測定することが可
能になる（実施例VII、参照）。本発明の実施例とし
て、ここに開示した６種類の好ましい染料（stil−1,st
il−2,indo−1,fura−1,fura−２とfura−３）の全てが
それらの励起スペクトルにこのような特徴を有してい
る。（６種類の中、indo−１はカルシウムを結合すると
発光波長に大きな変化を示すという点で、非常にユニー
クである）。

quin2のような既存の染料はカルシウムを結合したとき
に、強度を変えるがピーク波長を変えないので、そのシ
グナルを校正することがかなり困難である。その結果、
このような染料は波長比法によつて絶対的スケールでカ
ルシウム濃度を測定するために、ここに開示する新規な
染料ほどには有用でないことになる。

励起及び発光波長を高め、Ca²⁺結合を弱めてさらに高い
〔Ca²⁺〕ｉレベルの検出を可能にすることが目的である
場合には、残念ながら、新規な染料はquin2のような既
存の染料に比べてごくわずかにすぐれているにすぎな
い。それにも拘らず、新規な染料の励起波長が従来の染
料に比べてわずかに長いことによつても（例えば、fura
−２とquin−２の比較）、典型的に340と350nmの間で波
長が急激に遮断されるガラス光学の従来のへい光顕微鏡
によつて研究することが非常に容易になる。quin2に比
べて大体２倍高いindo−１及びfura−２の解離定数が、
約10−⁶M以上の〔Ca²⁺〕ｉレベルの分解能を改良するも
のと期待される。

本発明の新規な染料では、カルボキシ系の基よりも強い
電子求引性基が発色団の末端にある場合の法が波長とCa
²⁺解離定数の双方は増加する筈である（fura−１とfura
−２を比較）。しかし、末端カルボキシレートは、長い
発色団端部の疎水性結合の抑制手段として、少なくとも
理論的には魅力的である。

新規な染料の吸光係数が大きいことは発色団の長さ及び
より単純な同族体に関するデータから予想された通りで
ある。量子効率が確実に予想できないとしても、固定環
構造を有する拡大した発色団が効果的なけい光発生を助
成することは良く知られている。Ca²⁺結合時の吸収及び
励起スペクトルの浅色シフトは充分に理解される（参考
文献６参照）:Ca²⁺はおそらく窒素と環の間の結合をね
じることによつて、主要窒素の孤立電子対を独占する。
このために、発色団の孤立電子対と残りの部分との間の
結合は破壊される。励起状態では、Ca²⁺が窒素から離れ
るために、低〔Ca²⁺〕と高〔Ca²⁺〕の間で発光スペクト
ルが殆んど変化しないと考えられる。indo−１が例外的
である理由は不明である。

quin2のような公知の染料を凌駕する新規な染料の第五
の利点は、例えばMg²⁺,Mn²⁺,Zn²⁺及びFe²⁺のような２価
陽イオンに対する良好なCa²⁺選択性である。quin2に比
べたfurra−２の改良はMg²⁺,Mn²⁺及びZn²⁺に対するそれ
ぞれ約３倍、12倍及び40倍の選択性である。quin2を用
いる大多数の研究者は、細胞質ゾルの遊離Mg²⁺がリンパ
球で測定した場合に1mMであると一律に想定している
（参考文献７参照）。実際の遊離〔Mg²⁺〕がそれぞれ０
または2mMであるならば、真の〔Ca²⁺〕値は1mM〔Mg²⁺〕
と想定して算出した場合に比べて0.5または1.5倍高くな
るであろう。これに対して、新規な本発明の染料は〔Mg
²⁺〕の不確実性に対して敏感ではない。重金属によるqu
in2妨害の唯一の明確な例は特定の腫瘍細胞ラインにお
けるものである（参考文献８、参照）。しかし、新規な
染料は重金属親和性が低いために、本質的な重金属のキ
レート化による他の発生ならびに有害性を阻止すること
になる。これらの染料とquin2は、異なるCa²⁺曲線の全
てが互いに交差するような波長において使用することに
よつて、重金属指示薬としても用いることができる。

新規な染料の２価陽イオン選択性の改良は、不都合な環
窒素を含むキノリン構造を除去したことによると思われ
る（参考文献６参照）。

Mg結合はCa²⁺結合に比べてスペクトルに影響することが
非常に少ないが、これはMg²⁺が両アミノ窒素に一度に結
合するには小さすぎ（参考文献６参照）、前記の構造の
右側の窒素を該窒素が弱電子求引性発色団骨格と共役し
ていないという理由から、選択する傾向があるからであ
ると考えられる。fura−２とEGTAの両方は温度上昇に対
して、Ca²⁺親和性を弱め、Mg²⁺親和性を高めることによ
つて反応する（参考文献11,参照）。このことはこれら
のCa²⁺:Mg²⁺選択性の熱力学的根拠が同じであることを
示唆している。

本発明の新規な指示薬を例示するために、ここに開示し
た６種類の好ましい染料の中で、fura−２は最も広く用
いられうる好ましい染料であるが、indo−１は流動細胞
測定学にとつて最も適する染料である。スチルベン類は
他の染料に比べて若干合成されやすいが、他の染料ほど
明るく、けい光を発生しない。さらに、スチルベン類は
光異性化と光分解の複雑な問題を有しており、溶解性が
不充分であるためにアセトキシメチルエステル（データ
示さず）として負荷することが比較的困難である。fura
−３の若干長い波長がその低い輝度と発色団の親水性の
低さを補償し得るかどうかは検討の余地がある。この新
規な染料は多くの今まで処理しにくかつた系において
〔Ca²⁺〕ｉの測定をすでに可能にしている。個々の細胞
または組織塊の研究を展望すると、〔Ca²⁺〕ｉならびに
その遍在的なメツセンジヤー機能の光学測定の範囲と容
易さが膨大に拡大することが予想される。

合成方法 ここに開示する新規な染料の合成方法を以下に述べる： 本発明は新規なクラスのカルシウム特異性のけい光指示
薬染料に関する。これらの新規な染料の好ましい例はst
il−1,stil−2,fura−1,fura−2,fura−３およびindo−
１である。図１と２はこれらの化合物の製造に用いた合
成経路の概要を示す。反応条件の完全な説明を以下に述
べる。以下の図面と明細書の記載の両方において、ロー
マ数字を用いて種々な化学化合物を区別する。

ここで特許を請求する化合物の合成は、下記のstil−１
（化合物Ｘ）、stil−２（化合物XIII）、indo−１（化
合物XXII）、fura−１（化合物XXIX）、fura−２（化合
物XXXII）、fura−３（化合物XXXV）及び５−ホルミル
−quin−１、エチルエステルの詳細な合成のところで説
明する。当業者は、これらの染料の新しい形態が関連す
る合成方法及び出発物質を用いて製造可能であることを
理解できるであろう。

このために、１個の発けい光団を含む化合物の合成の重
要な中間体が化合物Iaまたは、化合物VIIとXXVIを含め
たその同族体として下記に示すアルデヒドであることを
指摘する（図１と２参照；以下の考察も参照）： ホルミル化段階中に、R²ラジカルとしてのメチル、ハロ
ゲンまたはアルコキシ基の存在はその位置における求電
子置換を阻止し、R¹−R²−フエニル環のホルミル化を限
定する。R²が水素であるとしても、R¹位置のハロゲンは
化合物Iaの右手ベンゼン環を求電子置換に対して不活化
するので、この環にはホルミル化は殆んどまたは全く生
じない。R¹のメチル基はR²位置のホルミル化をわずかに
促進させるが、二重にホルミル化された不純物は容易に
除去される。

R²がＨであり、ＷがＯまたはNR⁵前駆体である場合に
は、これらのＷ基が求電子置換を促進させる能力はＷに
対してオルトの５位置で直接的にホルミル化を行わせる
のに充分である。８−アミノキノリン系はフエニル系よ
りもはるかに容易にホルミル化されるので、特許を請求
するR¹とR²の組合わせはキノリンまたはベンゾピラン系
を含む化合物の容易なホルミル化を妨げない。

R²とＷが両方ともＨであり、R⁷とR⁸が閉じた環の一部で
ない場合には、R²＝Ｈである５−ホルミル化合物Iaを一
定量のヴイルスマイヤー（Vilsmeier）試薬によつてホ
ルミル化し、生成物を未反応出発物質と二重ホルミル化
生成物から分離することによつて、製造することができ
る。また、同じ５−ホルミル化合物の製造は、化合物II
Iの代りに３−ヒドロキシ−４−ニトロベンズアルデヒ
ドのアセタール、化合物Ｉの代りに２−ニトロ−４−R¹
−５−R²−フエノキシドを用い、化合物VIの製造に対し
て下記に説明するような工程（1,2−ジブロモ−エタン
との縮合、還元、及びアルキルブロモアセテートによる
アルキル化）に従つて、行なうこともできる。この化合
物VIの同族体を緩和な酸加水分解に付すことによつて、
アルデヒドが生じ、モノアルデヒドIaになる。

Ｗ＝H,D＝O,R⁷＝R⁸＝Ｈ及び種々なR¹とR²の置換基を有
するアルデヒド（下記の構造式Ib、参照）の製造は、適
当に置換した２個の２−ニトロフエノールを出発物質と
することに基づいている。各ニトロフエノールのカリウ
ム塩を製造し、次に１当量の1,2−ジブロモ−エタンと
縮合させる。ニトロ基の還元、アルキルブロモアセテー
トによる処理、及びヴイルスマイヤーホルミル化によつ
て、化合物Ibとして説明される重要なアルデヒドが得ら
れる。当業者は下記に説明する化合物VIIの合成を容易
に変更して、このような化合物を製造することができ
る。

ＷがOHであるサリチルアルデヒドの誘導体であるアルデ
ヒドIbは、ｐ−ヒドロキノンから８段階で合成される。
サリチルアルデヒドの製造の重要な段階は、ニトロ基に
対してメタ位のフエノール基より先に、ニトロ基に対し
てオルト位のフエノール基の酸触媒による選択的脱ベン
ジル化（参考文献20参照）を起すことを含む。生成する
２−ニトロ−４−ベンジルオキシフエノールは次に、重
要なアルデヒドIbの製造の上述の方法に出発物質として
用いることができる。化合物XXIVをベンジルオキシドの
ヒドロオキシド転位によつて化合物XXVに転化させる試
みは成功しなかつた。残留するベンジル保護基は白金触
媒による水素化（参考文献21、参照）及びヴイルスマイ
ヤーホルミル化にも耐えるが、パラジウムによる水素化
によつて最終的に除去される。４−ベンジルオキシ置換
基は隣接５−位置のホルミル化速度を促進させるから、
R¹とR²の如何なる選択もモノホルミル化に干渉しないと
考えられる。

Ｗ＝NR⁵H（R⁵＝Ｈ、メチルまたはエチル）であるアルデ
ヒドIbの製造は、４−（R⁵−アミノ）フエノールをベン
ジルオキシカルボニルによつて保護することから開始さ
れる。ニトロ化、ニトロソ化または適当なジアゾニウム
塩との結合によつて、下記の化合物XXIの置換フエノー
ル同族体が得られる。このようなフエノールは１−ブロ
モ−２−（２−ニトロ−４−R¹−５−R²−フエノキシ）
エタンと縮合させてから、還元することができる（H₂/
白金）。これによつて、ニトロ、ニトロソまたはジアゾ
ニウム塩基のいずれも還元され、ベンジルオキシカルボ
ニル基に影響することなく、NH₂になる。アルキルブロ
モアセテートによるアルキル化及びホルミル化の後に、
炭素上のパラジウムによる水素化によつてベンジルオキ
シカルボニル基を除去して、Ｗ＝NR⁵Hを有するアルデヒ
ドIbを得る。

R⁷とR⁸がキノリン環の一部であるアルデヒドIaの直接前
駆物質の製造は、参考文献６に述べられている。例え
ば、２−メチル−６−Ｗ−８−ニトロキノリンから出発
して、２−メチル基をヨードメチルにヨウ素化し、次に
カリウム２−ニトロ−４−R¹−５−R²−ニトロフエノキ
シドと縮合させ、還元し（H₂/白金）、メチルまたはエ
チルブロモアセテートによつてアルキル化する（参考文
献６、参照）。次にこの化合物をホルミル化して、アル
デヒドIcを得ることができる。

この合成は、５−ホルミル−quin−1,エチルエステル
（Ic,W＝H,R¹＝H,R²＝CH₃）の製造によつて下記で説明
する。当業者はこれらのヒントを利用して種々な基の
R¹,R²,R⁷及びR⁸を含む化合物を合成できるであろう。

R⁷とR⁸がキノリンまたはベンゾピラン環の一部であり、
Ｗ＝OHであるアルデヒドIaの製造は、例えば２−メチル
−６−メトキシ−８−ニトロキノリンから開始される。
メトキシ基をBBr₃または熱HIによつて開裂することによ
つて、６−ヒドロキシ基が得られる。次にこの基を酸触
媒下でのジメトキシメタンとの反応によつて保護するこ
とによつて、２−メチル−６−メトキシメチルオキシ−
８−ニトロキノリンが得られる。これをアルデヒドIcの
上述の合成法の出発物質として用いて、Ｗ＝OCH₂OCH₃の
化合物Icを得ることができる。この化合物の緩和な酸加
水分解によつて、Ｗ＝OHのアルデヒドIcが得られる。

R⁷とR⁸がキノリンまたはベンゾピラン環の一部であり、
Ｗ＝NR⁵であるアルデヒドIaは、例えば２−メチル−６
−（R⁵−アミノ）キノリンから、アミノをベンジルオキ
シカルボニルとして保護し、ニトロ化もしくはニトロソ
化し、またはジアゾニウム塩とカツプリングさせ、次に
ヨウ素化し、２−ニトロ−４−R¹−５−R²−ニトロフエ
ノキシドと縮合させ、還元し、アルキルブロモアセテー
トによつてアルキル化することによつて製造することが
できる（参考文献６、参照）。このような化合物を炭素
担体付きパラジウムで水素化すると、Ｗ＝NR⁵のアルデ
ヒドが得られる。

２個の発けい光団を含む化合物の合成における重要な中
間体は、化合物Idとして下記に示すジアルデヒドまたは
その同族体である。

５−置換基を有さず、４−置換基として水素、アルキル
またはベンジルオキシを含む一種類または二種類の２−
ニトロフエノールを用いて、アルデヒドIbについて述べ
た合成法に従うことによつて、ヴイルスマイヤーホルミ
ル化段階がジアルデヒドIdをもたらす。次にこのジアル
デヒドを化合物Iaに関して用いたウイツチヒ試薬のいず
れかと縮合させて、２つの長波長発けい光団を含有する
最終化合物を得る。R⁷とR⁸がキノリン環系の一部であ
り、R²＝Ｈ、R¹＝Ｈ、アルキルまたはベンジルオキシで
あるジアルデヒドIdを製造するためには、ヘテロ環が容
易にホルミル化するので、フエニル環ホルミル化に適し
たヴイルスマイヤーホルミル化条件によつて、目的のジ
アルデヒドが得られる。

適当なアルデヒドIaまたはIdから出発して、このアルデ
ヒドを例えばR³−R³a−Ｚ−メチル−トリフエニルホス
ホランのような、R³とR³a置換芳香族基Ｚから成るウイ
ツチヒ試薬と縮合させることによつて、Ｗ＝Ｈの化合物
の合成が進行する。例を挙げると、（４−エトキシカル
ボニル）メチル−トリフエニルホスホニウムブロミドVI
IIをアルデヒドVIIと縮合させると、究極的に化合物sti
l−１（IX）が得られる。（図１と以下の化合物VIII、V
II及びＸの合成を参照）。これに関連する例として（４
−N,N−ジメチルアミノスルホニルフエニル）メチルト
リフエニルホスホニウムブロミド、XI、をアルデヒドVI
Iと縮合させると、究極的に化合物stil−２（XII）が得
られる。（図１及び以下の化合物XI、VII及びXIIの合成
参照）。

これと同様に、分子（Ｙ′＝Ｙ＝NR⁵）の染料部分の残
基にエチレンを結合させることによつて、トランス配置
でエチレン橋をロツクするようにヘテロ環を含む化合物
も得られる。例として、indo−1,XVIIの合成を下記に述
べる。選択したアルデヒドをオルト−ニトロ基含有のウ
イツチヒ試薬と縮合させ、次に亜リン酸トリエチルによ
つて還元すると、ニトレン（nitrene）が得られる、こ
れは直ちに環化してインドールになる（参考文献19、参
照）。

エチレン橋を分子のキレート化部分に結合させることに
よつて、エチレン橋をトランス配置でロツクする化合物
を製造することもできる。例として、ＷとＸが一緒にな
つて酸素であるベンゾフラン誘導体の製造を、fura−１
（XXXIX）,fura−２（XXXII）及びfura−３（XXXV）の
合成として、下記で説明する。Ｗ＝OHのアルデヒドから
出発して、フエノールのヒドロキシルを電気陰性的に置
換したアリールメチル基によつてエーテルに再転化させ
る；この基は最終生成物のＺになる。次に塩基触媒によ
るクネベナゲル反応がベンゾフラン環を完成する。この
縮合のためには、アルミナ担体上のフツ化カリウムが特
に良好な触媒である（参考文献22、参照）。この理由は
この塩基が他の塩基に比べて、エステル基の存在に作用
する傾向が小さいからであると考えられる。

インドール環を含む同様な化合物（Ｗ＝Ｘ＝NR⁵）はＷ
＝Ｘ＝NR⁵のアルデヒドIaまたはIdから製造される。こ
のアルデヒドを例えばXXVII,XXXまたはXXXIII化合物の
ような、適当なハロメチル芳香族化合物と縮合させる
（図2,参照）。アルミナ担体上のフツ化カリウムのよう
な塩基によつて閉環させると、XXVII,XXXI及びXXXIVと
同様に、目的インドールが得られる。

疎水性発けい光団「端部」を親水性にすることが必要で
ある場合には、R³とR³a基が存在する。R³とR³aも長波長
発色団のけい光性を幾らか変えるこ考えられる。当業者
は、最終化合物がR³及び（または）R³a＝−CO₂H,−CO₂R
⁴,−CONR⁵R⁶,−SO₃H,−SO₂NR⁵R⁶,−SO₂CF₃,−COCH₃,も
しくは−CN,またはR³及びR³aが一緒になつて−（CO）NR
⁵（CO）−であるように、適当な前駆置換基を用いて、
ウイツチ試薬またはＺ基を含む置換アリールメチル化合
物を容易に合成できる。他の可能なＺ基は、ピリジニウ
ムのような第四窒素を有するヘテロ環である。このタイ
プのＺ基は、R³またはR³a置換基が発けい光団のけい光
波長を変えるためには有効であるか、これらのR³または
R³aによつて発けい光団の疎水性を低下させる必要はな
い。R³＝−CO₂H（stil−1,indo−1,fura−1,fura−
２），−CN（fura−３）及び−SO₂NMe₂（stil−２）を
含む化合物の合成を、実例によつて下記に示す。

これらの合成において、キレート化剤のアセトキシメチ
ルエステルを製造する方法は従来の方法（参考文献23,
参照）を変更したものであり、この従来方法は乾燥固体
の遊離酸形キレート化剤の製造及び立体障害塩基のエチ
ルジイソプロピルアミン存在下でのアセトキシメチルブ
ロミドとの反応を必要としている。この方法は単純なBA
PTA系列のキレート化剤に対しては受容できる結果を与
えたが、ここに述べる新規な染料のような複雑な誘導体
に適用する場合には、収率及び純度が不定であることが
わかつた。１つの問題は、乾燥固体の遊離酸としてのキ
レート化剤の単離が、部分的な分解を（おそらく脱カル
ボキシルによつて）生ずると考えられることが問題であ
るように思われた。

さらに、今までアセチルブロミドとパラホルムアルデヒ
ドから製造され、殆んど分離不能な副生成物としての数
モル％のビス（ブロモメチル）エーテルによつて汚染さ
れているアセトキシメチルブロミドの純度が有意な問題
であることがわかつた（参考文献24、参照）。このエー
テルはアセトキシメチルブロミドよりも迅速にカルボン
酸と反応するため、細胞によつて加水分解されにくいエ
ステルが生じることになる。多量に過剰な粗ブロミドを
用いるならば、もちろんこのようなエステルの割合は増
大するが、ブロミドをスピニングバンド・カラムに通し
て真空蒸留によつて部分的に精製するならば、減少す
る。しかし、最良の解決は、ビス（ブロモエチル）エー
テルを生じないような代替ルートによつてアセトキシメ
チルブロミドを製造することである。

本発明の以前に、トリメチルシリルブロミドがエステル
を開裂して、遊離酸（TMSエステル）とエステル化剤の
ブロミドにすることが知られていた（参考文献39,参
照）。しかし、トリメチルシリルブロミドを用いて、1,
1−ビスアシルオキシアルカンを開裂できることは、本
発明まで知られていなかつた。我々の問題は、エステル
開裂の標準条件を用いてアセトキシメチルブロミドを得
ようと試みたときに、密封管に入れて110℃で一晩加熱
してもトリメチルシリルブロミドとメチレンジアセテー
トの間に反応が生じなかつたことであつた。非常に意外
にも、約10モル％のルイス酸を加えることによつて、目
的の反応が室温において48時間内に完成することが発見
された。さらに意外であつたのは、ジブロモエタンを生
じることになるアセトキシへのブロミドの分子内転位が
起らなかつたことであつた。アセトキシメチルブロミド
の蒸留後に、生成物中にビス（ブロモメチル）エーテル
の痕跡もNMRによつて検出されなかつた。

これと同様に、トリフルオロアセトキシメチルプロミド
CF₃COOCH₂Brがメチレンビス（トリフルオロアセテー
ト）,CF₃COOCH₂OCOCF₃から製造され；ベンゾイルオキシ
メチルブロミド,C₆H₅COOCH₂Brはメチレンジベンゾエー
トC₆H₅COOCH₂OCOC₆H₅から製造され、また１−アセトキ
シ−１−ブロモアセトンは1,1−ジアセトキシアセトン
から製造された、1,1−ジアセトキシアセトン自体は1,1
−ジクロルアセトンへの酢酸ナトリウムの作用によつて
製造された。

１−アセトキシ−１−ブロモアセトンは１−アシルオキ
シアルキルブロミド化合物の標準製造法によつては製造
が非常に困難または不可能であつた。これはこの標準ル
ートが純粋な無水ピルブアルデヒドCH₃COCHOを製造して
アセチルブロミドと反応させることを必要としたからで
ある。無水ピルブアルデヒドは特に吸湿性で不安定であ
り、重合しやすい。１−アシルオキシアルキルハライド
の上記製造は全て、トリメチルシリルブロミドと触媒量
の無水塩化亜鉛を用いて室温において一晩行つたもので
ある。出発物質の1,1−ジエステルが固体である場合に
は、塩素化溶媒（CH₂Cl₂,CHCl₃またはCCl₄）を加えて、
均質な反応混合物を形成した。生成物は沸点、NMR及び
ハロゲン化物滴定によつて特徴づけた。メチレンジベン
ゾエートに対しては種々なルイス酸をテストした。ZnCl
₂,ZnI₂,ZrCl₄及びSnCl₄は全て有効であることがわかつ
たが、AlCl₃はあまり有効ではなかつた。BF₃Et₂OとCu₂B
r₂は有効ではなかつた。１−アシルオキシアルキルクロ
リドもこの一般方法によつて得られるが、やや強度な条
件が必要であり、収率はやや低い。すなわち、C₆H₅COOC
H₂OCOC₆H₅とMe₃SiClをCCl₄中でAlCl₃触媒を用いて、100
℃において（密封管）60時間反応させると、35％収率で
C₆H₅COOCH₂Clが得られた。

上記方法によつて製造したα−アシルオキシアルキルブ
ロミドは本発明のけい光染料のエステルの製造に有用で
ある。例を挙げると、ここに特許を請求する化合物のア
シルオキシメチルエステルは次の方法によつて最も良く
製造された：目的キレート化剤（例えば、下記及び図１
と２における化合物IX,XII,XVI,XXVIII,XXXIまたはXXXI
V）のメチルまたはエチルエステルをKOHでケン化し、４
〜６当量のテトラブチルアンモニウム塩（好ましくはヒ
ドロキシド）を加え、真空下で蒸発乾固させる。次に残
渣を、テトラブチルアンモニウム塩として染料を溶解す
るジクロロメタンによつて抽出する。この有機溶液を真
空下で完全に乾燥させ、残渣をジクロロメタンに加え、
約５〜10当量（染料に対して）のアセトキシメチルブロ
ミド（ここに開示する新しい方法によつて製造したも
の、下記のアセトキシブロミドの製造方法参照）と約２
当量（染料に対して）エチルジイソプロピルアミンと混
合し、一晩攪拌した。次に溶媒を蒸発させ、残渣をベン
ゼンまたはトルエンに加え、重炭酸塩水溶液と水で洗浄
し、乾燥させ、蒸発させた。生成物は使用に対して充分
に純粋であつたが、必要に応じて、シリカゲル上で再度
精製することも可能であつた。

化合物の合成 この合成に使用される試薬および溶媒はほとんど、ACS
またはHPLCグレードであつて、アルドリツチ（Aldric
h），マリンクロツト（Mallinc−krodt）、フイツシヤ
ー（Fisher）、またはジエイ・テイー・ベイカー（J.T.
Baker）から受けとつたまま使用した。乾燥ジメチルホ
ルムアミドおよび乾燥ピリジンはアルドリツチ（Aldric
h）、ゴールドラベル（Gold Label）から得て4A分子篩
上に貯蔵し、受けとつたままで使用した。ジエイ・テイ
ー・ベイカー（J.T.Baker）からのNaH₂PO₄は110゜の炉
内で乾燥させてから真空デシケーター内で冷却した。ジ
メチルアミンは、NaOHペレツト上のジメチルアミン塩酸
塩から蒸留した。ジアゾピルビン酸エチルは、標準法に
よつてジアゾメタンおよび塩化エチルオキサリルから製
造した。２−ニトロフエノキシドのカリウム塩は、メタ
ノール中のニトロフエノールに化学量論量の濃KOH水溶
液を加え、次に化学量論量に達するまで溶媒を真空で蒸
発させることにより、製造した。

種々の反応生成物を試験する際に、プロトンNMRスペク
トルは、バリアン（Varian）計測器で、60MHz（EM−36
0）、80MHz（CFT−20）、90MHz（EM−390）、および100
MHz（HA−100）で記録した。ピークは、以下に、次の形
式で報告している:NMR（溶媒、操作周波数）：テトラメ
チルシランからのppm化学シフト、多重度（ｓ＝一重
線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重
線、br＝ブロード）、適宜スピン−スピン結合定数、プ
ロトンの積算数、時には、いくつかの隣接ピークがあま
りに近すぎてその積分を分離することができず、この場
合はその一群について全体の積分のみを記述する。

化合物ＩII １−ブロム−２−（２′−ニトロ−５′−メチルフエノ
キシ）エタン（II）は次のようにして製造した： カリウム２−ニトロ−５−メチルフエノキシド（Ｉ）5
7.6g（0.30モル）、1,2−ジブロムエタン187.4g（1.0モ
ル）、およびジメチルホルムアミド151gを一緒にして12
0゜に加熱した。反応混合物の明かるい橙色がまもなく
あせて淡黄色となり、白色の沈殿が沈着した。冷却した
後、この沈殿を濾去し、水およびジクロルメタンで洗浄
した。不溶性残留物は、1,2−ビス（２−ニトロ−５−
メチルフエノキシ）−エタン、5.87g（0.018モル）であ
つた。濾液の有機相を合わせて、抽出物中に橙色があら
われなくなるまで希NaOHでくり返し洗浄した後、少量の
NaH₂PO₄を含有する飽和NaCl水溶液で１回洗浄した。MgS
O₄上で乾燥させた後、有機相を蒸発乾固し、残留物を、
石油エーテル（沸点60−80゜）またはメタノール−水か
ら再結晶させた。IIの収量は、34g（44％）、融点44−4
5゜であつた。NMR（CDCl₃,60MHz）:7.75,d,8Hz,1H:6.9
−6.75,2H;4.36,t,7Hz,2H:3.6,t,7Hz,2H;2.36,s,3H 化合物II＋IIIIV １−（２−ニトロフエノキシ）−２−（２′−ニトロ−
５′−メチルフエノキシ）エタン（IV）は、次のように
して製造した： IIを5.32g（20.5ミリモル）およびカリウム２−ニトロ
フエノキシド（III）3.98g（22.5ミリモル）を、ジメチ
ルホルムアミド10ml中でかくはんし、80分間、130゜に
加熱した。混合物を冷却し、水で希釈して100mlとして
濾過した；沈殿物をNa₂CO₃水溶液でくり返し洗浄した
後、水で洗浄した。乾燥後、これを5mlの酢酸を含有す
る沸騰95％エタノール1.25から再結晶させ、冷却後こ
れに少量の水を加えた。IVの収量は5.55g,85％，融点15
0−152゜であつた。NMR（CDCl₃,80MHz）:7.7−6.6,m,7
H;4.34,s,4H;2.26,s,3H 化合物IVＶ １−（２−アミノフエノキシ）−２−（２′−アミノ−
５′−メチルフエノキシ）エタン（Ｖ）は、次のように
して製造した： 5.55gのIVを、95％エタノール中の0.46gパラジウム（木
炭上５％）触媒を用いて、室温、大気圧で水素化した。
十分な水素が吸収された後（13時間）、混合物をあたた
めて熱いうちに濾過し、少量のNaBH₄で脱色し、−10゜
まで冷やした；白色結晶としてのＶの収量は4.03g、89
％、融点118−119゜であつた、NMR（CDCl₃,80MHz）:6.8
−6.5,m,7H;4.28,s,4H;3.5−3.7,br s,4H;2.24,s,3H 化合物ＶVIaまたはVIb １−（２−アミノフエノキシ）−２−（２′−アミノ−
５′−メチルフエノキシ）エタン−N,N,N′,N′−テト
ラ酢酸、テトラエチルエステル（VIa）またはテトラメ
チルエステル（VIb）は、次のように２つの方法のどち
らか一方により製造した： Ｖを2.58g（10ミリモル）,1.8−ビス（ジメチルアミ
ノ）ナフタレン11.3g（53ミリモル）、沃化ナトリウム
0.79g（5.3ミリモル）、ブロム酢酸エチル8.91g（53m
M）およびアセトニトリル9.5gを、窒素下で18時間かく
はんし還流させた。冷却した混合物をトルエンで希釈
し、濾過した。濾液を1,8−ビス（ジメチルアミノ）−
ナフタレンが除去されるまでpH2で燐酸塩緩衝剤を用い
て抽出した。トルエン溶液を乾燥させ、蒸発させて、残
留物を50mlのエタノールから再結晶させた。テトラエチ
ルエステル,VIa,の収量は5.27g、87％、融点110−110.5
゜，であつた。NMR（CDCl₃,100MHz）:6.88−6.6,m,7H;
4.30,s,4H;重なつた 4.18,s,4.14,s,4.08,q,7Hz,全体で16H;2.28,s,3H;1.18,
t,7Hz,12H もつと大きな規模のくり返しでは、ブロム酢酸エチルを
ブロム酢酸メチルで置き換え、1,8−ビス（ジメチルア
ミノ）ナフタレンを、150゜で乾燥させたNa₂HPO₄で置き
換えた。こうして、V25.83g（100ミリモル）、乾燥Na₂H
PO₄71g（500ミリモル）、NaI5.9g（39ミリモル）、BrCH
₂CO₂Me84.7g（554ミリモル）およびCH₃CN104gを、三日
月形の櫂で激しくかくはんしながら18時間、窒素下で還
流させた。冷却した反応混合物を水とトルエンとの間に
分配させた。有機相を蒸発乾固して、メタノールから再
結晶させた。テトラメチルエステル、VIbの収量は、40.
2g（71％）であつた。もう一度メタノールから結晶させ
ると、融点は95−95.50゜であつた。NMR（CDCl₃,90MH
z）:6.83,s,6.67,m,全体で7H;4.24,s,4.13,s,4.09,s,全
体で12H;3.56,s,3.54,s,全体で12H;2.23,s,3H 化合物VIbVIIb １−（２−アミノ−５−ホルミルフエノキシ）−２−
（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）エタン−N,
N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラメチルエステル（VII
b）は、次のようにして製造した： 2.186g（4.0ミリモル）のVIbを、乾燥ピリジン0.4mlを
含む4.0mlの乾燥ジメチルホルムアミド中にかくはんし
ながら溶解させた。混合物を氷浴中で冷却し、オキシ塩
化燐（3.0ml）を滴加した。この反応混合物はすぐに黒
色に変わつた。TLC（石油エーテル−酢酸エチル1:1）は
0.5時間後にはほんの痕跡量の生成物を示した。この反
応混合物を60゜で１時間かくはんした後、室温に一夜放
置した。反応混合物を50mlのCH₂Cl₂に溶解させて、NaOH
水溶液と混合した砕氷上に注いだ。水性層を、10mlづつ
のCH₂Cl₂5部で抽出した。合わせた有機抽出物をMgSO₄で
乾燥させ、濾過し蒸発させた。一部結晶性の残留物（1.
75g）を5mlのイソプロピルアルコールで研和し、濾過
し、エーテル−石油エーテル混合物で洗浄して、乾燥さ
せた。黄色がかつたVIIbの結晶を得たが、このものはTL
Cに関して均質であつて126〜７゜で融解し、重量は1.50
g（65.3％）であつた。第二収穫物の結晶は重量0.126g
であり合わせた収率は72％となつた。アセトン−ヘキサ
ンからの再結晶により淡黄色の結晶が得られた、融点13
1−132゜ 化合物VIIb＋VIIIIX １−（２−アミノ−５−〔（２−（４−エトキシカルボ
ニルフエニル）−Ｅ−エテン−１−イル〕−フエノキ
シ）−２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）
エタン,N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラメチルエステ
ル（IX）は、次のようにして製造した： VIIb574mg（１ミリモル）、臭化４−エトキシカルボニ
ルベンジルトリフエニルホスホニウム（800mg,1.58ミリ
モル）、および無水K₂CO₃0.4gを、乾燥ジメチルホルム
アミド4ml中で100゜で2.5時間かくはんした。冷却した
反応混合物を水とトルエンとの間に分配させた後、水性
層をさらにトルエンで抽出した。溶媒を蒸発させた後の
残留物を、石油エーテル−酢酸エチル9:1（v/v）中のシ
リカ上のクロマトグラフにかけた。スチルベン類の混合
物を単離すると0.380g（53％）の収量であつた。酢酸エ
チル−石油エーテルから４回再結晶させて、純粋なIXの
トランス−異性体、融点131−132゜を得た。単離および
精製段階はうす暗い橙色の安全光の照明下で実施した。
NMR（CDCl₃,90MHz）:7.99,d,8Hz,2H;8.48,d,8Hz,2H;7.1
−6.85,m,6.8−6.5,m,全体で７−8H;4.4−3.9,m,14H;3.
58,s,3.55,s,全体で12H;2.22,s,3−4H;1.37,t,7Hz,3−5
H ホスホニウム塩（VIII）は、ｐ−ブロムメチル安息香酸
エチル、XXVII（参考文献30を参照）12.16g（50mM）
を、還流トルエン中でトリフエニルホスフイン14.48g
（55mM）と一夜反応させることによつて、92％収率で製
造した。冷却した反応混合物から沈殿を濾去した。洗浄
ならびに乾燥後に、このものは融点241−243゜を有し重
量は23.3g、92％収率であり、その後の使用には十分に
純粋であつた。

この化合物け混合されたメチルおよびエチルエステルを
含有しているけれども、適当なVIIIおよびVIIのエステ
ルの使用によりこのささいな差異が解決されるであろう
ということがわかるであろう。エステル化基は混じつて
いないので混合エステルの存在は問題ではなく、この化
合物はキレート剤として使用する前にけん化しなくては
ならない。

化合物VII＋XIXII １−（２−アミノ−５−〔（２−（４−N,N−ジメチル
アミノスルホニルフエニル）−Ｅ−エテン−１−イル〕
フエノキシ）−２−（２′−アミノ−５′−メチルフエ
ノキシ）エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラメ
チルエステル（XIII）は、次のようにして製造した： 0.486g（0.84ミリモル）のVIIbを、CH₂Cl₂中のホスホニ
ウム塩XI0.42g（0.84ミリモル）およびナトリウムメト
キシド（54mg,1ミリモル）とともに一夜還流させた。冷
却した反応混合物を水とクロロホルムとの間に分配させ
た。粗生成物をトルエン−酢酸エチル4:1（v/v）中でシ
リカ上のクロマトグラフにかけ、濃厚なシロツプ（112m
g,17％収率）として単離した。NMR（CDCl₃,90MHz）:7.6
5,d,9Hz,2H;7.4,d,9Hz,2H;7.3−7.0,m,トルエン汚染に
より積分は不明確になつている;6.9−6.5,m,7H;4.25,s,
4.20,s,4.16,s,全体で12H;3.54,s,12H;2.77,s,2.75,s,
全体で6H;2.25,s,3H. スルホンアミドホスホニウム塩XIは、還流トルエン中で
トリフエニルホスフインをN,N−ジメチル４−（クロル
メチル）ベンゼンスルホンアミドと反応させることによ
り、VIIIと同様にして製造した。その融点は275−280゜
であつた。スルホンアミドは、塩化４−クロルメチルベ
ンゼンスルホニル（参考文献31参照）を、エーテル中の
ジメチルアミンの冷溶液と反応させることにより製造し
た。

化合物VIIb＋XIVXV １−（２−アミノ−５−〔２−（４−エトキシカルボニ
ル−２−ニトロフエニル）−Ｅ−エテン−１−イル−フ
エノキシ）、２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノ
キシ）エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラメチ
ルエステル（XV）は、次のようにして製造した： 0.14gのVIIbおよび0.20gのXIV、および0.6gのK₂CO₃を1m
lの乾燥ジメチルホルムアミド中、90゜で３時間かくは
んした。反応混合物をトルエンと水との間に分配させ、
有機相を蒸発させて、トルエン−酢酸エチル6:1を用い
るシリカ上のクロマトグラフにかけた。プールしたカラ
ムからの分画を蒸発させて赤味がかつた油135mg、69
％、を得た。

1.5gのトリフエニルホスフインを還流トルエン中の1.2g
の４−ブロムメチル−３−ニトロ安息香酸エチルと一夜
反応させることにより、ホスホニウム塩XIV（融点165−
168）を、76％収率で製造した。後者のエステルは、濃H
₂SO₄10ml中のｐ−ブロムメチル安息香酸エチル、XXVII,
2.43g、を５℃でかくはんし、その間に濃HNO₃（ｄ 1.
4）1mlを滴加することにより、製造した。このニトロ化
混合物を砕氷上に注ぎ、CH₂Cl₂で抽出した。抽出物を希
NaOHで洗浄して乾燥させ、蒸発させて油を得たが、この
油は結局結晶化した、融点41−43゜、収量2.32g、80
％。NMR（CCL₄,90MHz）:7.8,d,9Hz,7.67,d,2Hz,7.58,d
d,9Hz＋2Hz,全体で3H;4.45,s,2H;3.9,s,3−4H 化合物XVXVI １−（２−アミノ−５−〔６−エトキシカルボニルイン
ドリル−２−〕フエノキシ）−２−（２′−アミノ−
５′−メチルフエノキシ）エタン−N,N,N′,N′−テト
ラ酢酸、テトラメチルエステル（XVI）は次のようにし
て製造した： 300mg（0.392ミリモル）のXVを、2mlの亜燐酸トリエチ
ルに溶解させて窒素下で一夜還流させた。この反応混合
物を真空で蒸発乾固して、残留物をトルエン−酢酸エチ
ル4:1中のシリカ上のクロマトグラフにかけた。環化生
成物XVIを黒つぽい油（160mg,55.6％）として得たが、
このものは0.1トルで乾燥後に結晶化した。メタノール
からの再結晶によつて96−97゜で融解する結晶が得られ
た。NMR（CDCl₃,90MHz）:8.80,s,1H;7.73,d,8Hz,7.5,d,
8Hz,全体で2H;7.21,m,2H;6.9−6.5,m,5H;4.35,q,7Hz,4.
21,s,4.14,s,4.09,s,全体で12−14H;3.58,s,3.54,s,11
−12H;2.17,s,3H;1.8,br s,約2H（H₂Oピークを含んでい
るであろう）;1.33,t,7Hz,3H 化合物XVIIIXIX 1,4−ジ（ベンジルオキシ）ベンゼン（XIX）は次のよう
にして製造した： かくはんした、エタノール100ml中のヒドロキノン（XVI
II）55g（0.5モル）および塩化ベンジル143.1g（1.1モ
ル）の懸濁液に、エタノール中の水酸化カリウム60.2g
（0.91モル）の溶液を加えた。１時間後に、混合物を水
中に注いだ、数時間後に沈殿を濾去して、70゜で乾燥さ
せ、3.5リツトルの沸騰エタノールから再結晶させた。X
IXの収量は105g、73％、融点128−130゜〔文献値（32）
は126.5から130゜までにわたつている〕であつた。NMR
（CDCl₃,100MHz）:7.35,s,10H;6.87,s,4H;4.98,s,4H 化合物XIXXX ２−ニトロ−1,4−ジ（ベンジルオキシ）ベンゼン（X
X）は、次のようにして製造した： 70％硝酸水溶液18.3g（0.203モル）を氷酢酸で50mlまで
希釈して、酢酸200ml中のXIX58g（.200モル）の懸濁液
に加えた。混合物をかくはんして、静かに50゜まであた
ためると出発物質が溶解し、生成物が晶出しはじめた。
この混合物を冷却して第一収穫物を濾去した後、水を滴
加して第二収穫物を沈殿させた。XXの全収量は65.6g、9
8％、融点81−82.5゜（参考文献33には83゜と報告され
ている）であつた。NMR（CDCl₃,100MHz）:7.5−6.9,M,1
3H;5.15,s,5.03,s,全体で4H 化合物XXXXI ２−ニトロ−４−ベンジンルオキシフエノール（XXI）
は次のようにして製造した： エタノールを含まないクロロホルム100ml中のXX50.4g
（0.15モル）の溶液を、トリフルオル酢酸15.0ml（0.2
モル）で処理して、室温に48時間保持すると、この時、
NMRスペクトルは、4.92でのピークの大きさにより判定
したとき出発物質の約90％が変換されていることを示し
た。過剰の酸を5Mの水酸化カリウム水溶液で中和した。
水性層が最初のような暗褐色でなく淡橙色になるまで、
有機相を希炭酸カリウム水溶液でくり返し抽出した。次
にクロロホルム溶液を1.5容量のジエチルエーテルで希
釈し、5M水酸化カリウム60mlで処理した。カリウム４−
ベンジルオキシ−２−ニトロフエノキシドの暗赤色沈殿
を濾去して、希HClで酸性化し、600mlづつの石油エーテ
ル（沸点60−80゜）６部で抽出した。抽出物を合わせて
石油エーテルを蒸発させた後、残留物を沸騰メタノール
から再結晶させた。冷却後これに水を滴加した。XXIの
収量は31−32g、84−87％、融点67−70゜であつた。

NMR（CCl₄,100MHz）:10.24,s,1H;7.52,d,3Hz,1H;7.32,
s,5H;7.19,dd,3Hz,および9Hz,1H;7.00,d,J＝9Hz,1H;5.0
1,s,2H 化合物XXI＋IIXXII １−（２−ニトロ−４−ベンジルオキシフエノキシ）−
２−（２′−ニトロ−５′−メチルフエノキシ）エタン
（XXII）は、次のようにして製造した： XXI2.45g（10ミリモル）、II2.8g（108ミリモル）、無
水K₂CO₃0.76g（5.5mM）、およびジメチルホルムアミド5
ml、の混合物を150゜に加熱し、15分間かくはんした。
まだかなり温かい間に、このかくはんした混合物を、最
初のKBrの沈着物が溶解して生成物が結晶し始めるま
で、水を滴加することにより処理した。このものを濾去
して乾燥させ（粗収率90％）最小限の量の熱アセトンに
溶解させ、その２倍の容量の石油エーテルで沈殿させる
ことによつて再結晶させた。XXIIの淡黄色結晶は、融点
143−144゜であつた。

化合物XXIIXXIII １−（２−アミノ−４−ベンジルオキシフエノキシ）−
２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）エタン
（XXIII）は次のようにして製造した： XXII5g（11.8ミリモル）および木炭上の５％白金0.5gを
無水エタノール100ml中に懸濁させ、水素下でかくはん
した。理論容量から５時間で吸収されたが、混合物は一
夜水素下に放置した。その後で累積吸収量は理論量より
19％高かつた。同じ水素化混合物に別に5gのXXIIを加え
たところこれもまた一夜で理論量より同じだけ高い量の
水素を吸収した。生成物XXIIIをアセトンから再結晶さ
せると、融点は129−132゜であつた。NMRスペクトル
は、ベンジル基が失われていないことを示した。（CDCl
₃＋CD₃SOCD₃,90MHz）:7.29,s,5H;6.75−6.45,m,4H;6.3
2,d,3Hz,1H;6.12,dd,3Hz＋7Hz,1H;4.93,s,2H;4.3,brs,
4.26,s,全体で4H;2.27,s,3H. 化合物XXIIIXXIV １−（２−アミノ−４−ベンジルオキシフエノキシ）−
２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）エタン
−N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラエチルエステル（X
XIV）は、次のようにして製造した： XXIII3.64g（10ミリモル）、1.8−ビス（ジメチルアミ
ノ）ナフタレン10.72g（50ミリモル）、乾燥NaI2.0g（1
3ミリモル）、ブロム酢酸エチル8.35g（50ミリモル）、
およびアセトニトリル15mlを、窒素下で40時間、かくは
んし還流させたが、この間に、最初の24時間の後、さら
にブロム酢酸エチル1.5mlおよび1,8−ビス（ジメチルア
ミノ）ナフタレン2gを添加した。冷却した反応混合物を
蒸発させて乾燥させ、トルエンで希釈し、濾過した；灰
色の沈殿を別の少量づつのトルエンでくり返し洗浄し
た。プールしたトルエン溶液を、洗液が新しい緩衝剤と
同じpH2となるまで、燐酸塩緩衝剤でくり返し抽出し
た。次にこのトルエン溶液を水で洗浄して、MgSO₄上で
乾燥させた。減圧下でトルエンを蒸発させた後、残留物
を石油エーテル−酢酸エチル9:1v/vで洗浄して、痕跡量
のブロム酢酸エチルを除去した。XXIVの収量は、6.4g
（90％）であり、融点は95−96゜であつた。

化合物XXIVXXV １−（２−アミノ−４−ベンジルオキシ−５−ホルミル
フエノキシ）−２−（２′−アミノ−５′−メチルフエ
ノキシ）−エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラ
エチルエステル（XXV）は次のようにして製造した： XXIV0.35g（0.5ミリモル）を2mlの乾燥ジメチルホルム
アミドおよび0.4mlのピリジンに溶解させた。０゜でPOC
l₃（0.4ml,4ミリモル）を加えた。0.5時間後に、反応混
合物をあたためて、一夜室温に放置した。この反応混合
物を、氷冷NaOH水溶液で中和し、20mlづつのトルエン３
部で抽出した。トルエン相の蒸発により結晶性のXXV,融
点114−115゜（256mg、73％収率）を得た。NMR（CDCl₃,
90MHz）:10.33,s,1H;7.35,s,5−7H;6.8−6.6,m,4H;6.3,
s,1H;5.08,s,2H;4.25−3.9,m,20H;2.21,s,3−4H;1.14,
t,7Hz,12−14H. 化合物XXVXXVI １−（２−アミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルミルフエ
ノキシ）−２−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキ
シ）−エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラエチ
ルエステル（XXV）は、次のようにして製造した： XXVを、大気圧で木炭上の５％Pd触媒を用いた氷酢酸中
での水素化により脱ベンジル化した。XXVIは融点109−1
11゜であつた。

化合物XXVI＋XXVIIXXVIII １−（２−（４−エトキシカルボニルフエニル）−６−
アミノベンゾフラン−５−オキシ）−２−（２′−アミ
ノ−５′−メチルフエノキシ）エタン−N,N,N′,N′−
テトラ酢酸、テトラエチルエステル（XXVIII）は、次の
ようにして製造した： 低収率の不純なXXVIIIはDMF中のXXVIおよびXXVIIを70時
間、100゜に加熱することによつて直接得ることができ
るけれども、エステム化とフラン環の閉環を別々の段階
で行なう方がよい。65mgのXXVI（0.1ミリモル）、50mg
の４−ブロムメチル安息香酸エチル（XXVII）、0.2gのK
₂CO₃,および10mgの硫酸水素テトラブチルアンモニウム
を、アセトニトリル中で一夜かくはんしながら還流させ
た。生成物であるXXVIの４−エトキシカルボニルベンジ
ルエーテルを、石油エーテル−酢酸エチル1:1を用いる
分取層クロマトグラフイーによつて単離すると、57mg、
71％収率、融点109−110゜が得られた。

NMR（CDCl₃,90MHz）:10.34,s,1H;8.06,d,8Hz,2H;7.47,
d,8Hz,2H;7.3,s,一部CHCl₃により不明確となつている;
m,6.8−6.55,3H;6.3,s,1H;5.16,s,2H;4.37,q,7Hz,4.21,
s,4.14,s,4.05,q,7Hz,4.02,q,7Hz全体で22H;2.23,s,3H;
1.38,t,7Hz,1.17,t,7Hz,1.15,t,7Hz,全体で15H. このエーテル39mg（0.05ミリモル）を、ジメチルホルム
アミド1ml中の弗化カリウム／アルミナ試薬（参考文献2
2を参照のこと）とともに150゜で２時間かくはんした。
螢光性生成物を、トルエン−酢酸エチル1:1を用いるシ
リカ上の分取層クロマトグラフイーにより21mg（54％）
収量で単離した。DMF中での反応時間をもつと長くする
とエステルの加水分解が増大する。NMR（CDCl₃,90MH
z）:8.15,d,9Hz,7.89,d,9Hz,全体で４−5H;7.15−7.05,
m,6.78,m,全体で６−7H;m,3.9−4.5,20−22H;2.23,s,3
H;1.0−1.4,m,13−17H 化合物XXVI＋XXXXXXI １−（２−（５−エトキシカルボニルオキサゾール−２
−イル）−６−アミノベンゾフラン−５−オキシ）−２
−（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）エタン−
N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テトラエチルエステル（XXV
I）は、次のようにして製造した： この場合には、エーテルの形成とフラン環閉環を一段階
で行なうことができる。XXVI0.5（ｇ）（0.77ミリモ
ル）、２−クロルメチルオキサゾール−５−カルボン酸
エチル（XXX）0.2g、およびK₂CO₃0.5gを、乾燥ジメチル
ホルムアミド2ml中、100゜で1.5時間かくはんした。こ
の反応混合物を冷却し、水で希釈して、HClで酸性化
し、CHCl₃で抽出した。合わせた抽出物を、MgSO₄で乾燥
させ、蒸発させて、黒つぽい半結晶性残留物を得た。シ
リカゲルの短いカラムを通して濾過し、1:1トルエン−
酢酸エチルで洗浄して蒸発させると、黄色の結晶が得ら
れた。このものは、ヘキサン−酢酸エチル9:1で研和
し、濾過した後では138゜ではつきりと融解した。収量
は420mg、68％であつた。NMR（CDCl₃,90MHz）:8.11,s,1
H;7.69,s,1H;7.34,s,7.29,s,全体で2H;6.97−6.87,m,3
H;4.57,q,7Hz,4.45,s,4.35,s,4.25,s,4.35,s,4.25,s,4.
18,q,7Hz,4.22,q,7Hz,全体で22H;2.31,s,3H;1.44,t,7H
z,3H;1.21,t,7Hz,1.19,t,7Hz,全体で12H。

２−メチルオキサゾール−５−カルボン酸エチルの合成
（参考文献34を参照のこと）と同様にして、クロル−ア
セトニトリルをジアゾピルビン酸エチルと反応させるこ
とにより、２−クロルメチル−オキサゾール−５−カル
ボン酸エチル（XXX）を製造した。ジアゾピルビン酸エ
チル0.1g、アセチルアセトン酸第二銅数mg、およびクロ
ルアセトニトリル0.4mlを、ベンゼン溶液にして一夜60
゜に保つた。冷却した反応混合物をNaHCO₃水溶液および
エーテルの間に分配させた。有機層を乾燥させ、蒸発さ
せて、シリカ上のクロマトグラフにかけ、石油エーテル
−酢酸エチル9:1v/vで溶離した。単離した生成物を、12
トル、90゜空気浴温度でのバルブ−トウ−バルブ（bulb
−to−bulb）蒸留によつて精製した。NMRスペクトルは
まだかなりの不純物を示したけれども、GC−MS分析は、
ずばぬけて優勢な分画が正確な親M/e＝189と、161（−C
₂H₄または−CO）、154（−Cl）、144（−OC₂H₅）に断片
（fragment）を、そして116（−COOC₂H₅）に基礎ピーク
を有するXXXに対して期待される等方性パターン、とを
有していることを示した。

化合物XXVI＋XXXIIIXXXIV １−（２−（４−シアノフエニル）−６−アミノベンゾ
フラノキシ−５−）−２−（２′−アミノ−５′−メチ
ルフエノキシ）エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸、テ
トラエチルエステル（XXXIV）は、次のようにして製造
した： XXVI140mg（0.22ミリモル）、塩化ｐ−シアノベンジル8
8mg（10.58ミリモル）、K₂CO₃350mg、および硫酸水素テ
トラブチルアンモニウム30mgを、ジメチルホルムアミド
3ml中で、125゜で４時間かくはんした。黒つぽい反応混
合物を水で希釈し、トルエン中に抽出した。蒸発させた
トルエン相を、トルエン−酢酸エチル混合物を用いるシ
リカ上のクロマトグラフにかけた。速行性の螢光帯を捨
てた；それに続く主ピークを蒸発させると82mgの油が得
られ、これは結晶化した。おそらくもつとよい溶媒が見
い出されたであろうが、石油エーテル−酢酸エチルから
さらに再結晶させると、融点は120−121゜であつた。収
率は51％であつた。NMRは大ざつぱに予想通りであつた
が、厳密には指定できなかつた。NMR（CDCl₃,90MHz）:
7.9−7.1,m,7.03,m,6.70,m,4.1−4.3,m,225,s,0.8−1.
4,m. 遊離酸の製造 臭化アセトキシメチルを合成する方法 その十分にイオン化された塩はこれよりかなり安定であ
るけれども、固体の遊離酸は2.3日しか安定でない。最
終生成物はNMRによつては特性を決定されなかつたが、U
V、螢光、およびCa²⁺滴定により注意深く研究された
（表１を参照のこと）、Ca²⁺滴定は、どの製造例でも10
％より多いジ−またはトリ−カルボン酸エステル化合物
は含んでいないことを示した（データは示されていな
い）。

化合物IXＸ １−（２−アミノ−５−〔（２−（４−カルボキシフエ
ニル）−Ｅ−エステル−１〕−フエノキシ）−２−
（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）−エタン−
N,N,N′,N′−テトラ酢酸（Ｘ）はIXのけん化によつて
製造した。

化合物XIIXIII １−（２−アミノ−５−〔（２−（４−N,N−ジメチル
アミノスルホニルフエニル）−Ｅ−エテニル−１−〕−
フエノキシ）−２−（２′−アミノ−５′−メチルフエ
ノキシ）−エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸（XIII）
は、XIIのけん化によって製造した。

化合物XVIXVII １−（２−アミノ−５−〔６−カルボキシインドリル−
２−〕フエノキシ）−２−（２′−アミノ−５′−メチ
ル−フエノキシ−）−エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢
酸（XVII）は、XVIのけん化により製造した。

化合物XXVIIXXIX １−（２−（４−カルボキシフエニル）−６−アミノ−
ベンゾフラノキシ−５−）−２−（２′−アミノ−５′
−メチルフエノキシ）−エタン−N,N,N′,N′−テトラ
酢酸（XXVIII）はXXVIIのけん化により製造した。

化合物XXXI→XXXII １−（２−（５′−カルボキシオキサゾール−２′−イ
ル）−６−アミノ−ベンゾフラノキシ−５−）−２−
（２′−アミノ−５′−メチルフエノキシ）エタン−N,
N,N′,N′−テトラ酢酸（XXXII）は、XXXIのけん化によ
り製造した。

化合物XXXIVXXXV １−（２−（４−シアノフエニル）−６−アミノ−ベン
ゾフラノキシ−５−）−２−（２′−アミノ−５′−メ
チルフエノキシ）エタン−N,N,N′,N′−テトラ酢酸（X
XXV）は、XXXIVのけん化により製造した。

遊離酸へのけん化 本合成反応においては、エチルまたはメチルエステル
は、そのエステルをメタノール、エタノール、またはジ
オキサンのような水と混和性の溶媒に溶解させて、過剰
の水酸化ナトリウム、カリウム、またはテトラブチルア
ンモニウム水溶液を加えることによつてけん化されて遊
離のキレート化剤ポリ陰イオンとなる。我々は、時には
短時間あたためることにより、水溶液の添加により沈殿
するエステルの加水分解が始まりやすくなることを見出
した。しかしながら、このキレート化剤が少なくとも0.
1M過剰のNaOHまたはKOHを含有する均質な溶液中に2,3時
間存在する限り、ブタノール−酢酸−水4:1:1または4:
1:5v/vを用いるシリカ上の薄層クロマトグラフイーまた
はCa²⁺滴定により判定したとき加水分解は完全であつ
た。水酸化テトラブチルアンモニウムはより遅いように
思われたが、これはおそらくこの陽イオンがK⁺またはNa
⁺よりも、加水分解の中間段階の電荷と対になつてこれ
を部分中和する力が弱く、そのため水酸化物の静電斤力
がそれ以上の加水分解を遅くするためであろう。

Quin1,テトラエチルエステル quin1/Et,2−（〔２−（ビス〔エトキシカルボニル）メ
チル〕アミノ）−５−メチルフエノキシ〕−メチル）−
８−（ビス〔（エトキシカルボニル）メチル〕アミノ）
ミノリンの合成は参考文献６に記載されている。

５−ホルミル−quin1,テトラエチルエステル ２−（〔２−（ビス〔（エトキシカルボニル）メチル〕
アミノ）−５−メチルフエノキシ〕−メチル）−５−ホ
ルミル−キノリン−８−（ビス〔（エトキシカルボニ
ル）メチル〕アミノ）,2aは次のようにして製造した： 64.1mgのquin1/Et（103マイクロモル）を、０゜の、42.
3mgのPOCl₃（276マイクロモル）および50マイクロリツ
トルのジメチルホルムアミドの混合物に加えた。次にさ
らに50マイクロリツトルのDMFを使つてquin1/Et粉末を
フラスコの側面からすすぎ落とした。最終的に透明な暗
橙色のシロツプが形成されたので、これを室温に２時間
放置すると、この時薄層クロマトグラフイー（シリカ、
49:1v/vクロロホルム−メタノール）は、反応が完了し
ていることを示した。この反応混合物を水で希釈し、ト
ルエンで洗浄した。水性相をNaHCO₃で部分中和してpH2
としてトルエンで再抽出した。プールしたトルエン相を
NaHCO₃水溶液で一回洗浄した後、Na₂SO₄上で一夜乾燥さ
せた。トルエンを蒸発させると、黄橙色のゴム、63.4mg
が残つた；これをジ−イソプロピルエーテルを用いて研
和すると、はじめにこのゴムが溶解するがまもなく非常
に淡い黄色の粉末が結晶して出て来た。これを濾過して
乾燥させたとき、2aの結晶は重さ43.8mg、67マイクロモ
ル、65％収率、であつた。

NMR（80MHz,CDCl₃＋CCl₄）:9.96,s,1H;9.61,d,1H,9Hz;
7.75,d,9Hz,7.71,d,8Hz全体で2H;6.8−6.6,m,4H;5.12,
s,2H;4.45,s,4.23,q,7Hz,4.08,s,4.03,q,7.Hz全体で16
H;2.14,s,3H;1.24,t,7Hz,1.13,t,7Hz,全体で12H 臭化アセトキシメチルの製造方法 臭化アセトキシメチル、CH₃COOCH₂Br,は、メチレンジア
セテート4.0g（30mM）および臭化トリメチルシリル5.0g
（33mM）を、無水ZnCl₂60mgを存在させるが溶媒は加え
ないで室温で48時間かくはんすることにより製造した。
生成物を、10トル、40−60゜でざつと蒸留した後、10ト
ル、55−57゜でビグロー（Vigreaux）カラムを通して再
精留すると、4.04g、87gが得られ、BrCH₂OCH₂BrはNMRに
より検知できなかつた。ルイス酸触媒作用は必須であ
り、これがなければ封管中110゜に一夜おいても反応は
起こらない。メチレンジアセテートはパラホルムアルデ
ヒドおよび無水酢酸から製造され（参考文献35を参照）
注意深く蒸留してCH₃COOCH₂OCH₂OCOCH₃を除去した。

第1A図に示す合成ルートにより、１つの螢光団を有する
化合物を合成した。出発化合物であるキノリン構造体XX
XVIは、明細書の参考文献リストに掲げられている文献
６に従つて得た。

化合物XXXVIXXXVII 第1A図に示すこの転換は、前記した「５−ホルミル−qu
in1,テトラエチルエステル」の項で述べた方法により良
好な収率で行なつた。

化合物XXXVIIXXXVIII 化合物XXXVIIへのこの転換は、化合物VIIおよびXIからX
IIへの前記合成法に従い、化合物VIIを化学量論的に等
しい量のXXXVIIを置き換えることにより、良好な収率で
もつて行つた。

化合物XXXVIIIXXXIX 遊離酸としての化合物XXXIXは、化合物XXXVIIIを水酸化
カリウムなどの塩基でケン化条件下で処理することによ
り得た。

化合物XXXVIIXL 化合物XLは、化合物VIIbおよびVIIIからIXへの前記合成
法に従い、化合物VIIを化学量論的に等しい量のXXXVII
と置換することにより得た。

化合物XLXLI 化合物XLIは、XLを水酸化カリウムなどの塩基でケン化
条件下で処理することにより得た。

化合物XXXVIIXLII 化合物XLIIは、化合物VIIbおよびXIVからXVへの前記合
成法に従い、化合物VIIb化学量論的に等しい量のXXXVII
と置き換えることにより得た。

化合物XLIIXLIII 化合物XLIIIは、化合物XVからXVIへの前記合成法に従
い、化合物XVを化学量論的に等しい量のXLIIと置き換え
ることにより得た。

化合物XLIIIXLIV 化合物XLIVは、化合物XVIからXVIIへの前記合成法に従
い、化合物XIVを化学量論的に等しい量のXLIIIと置き換
えることにより得た。

第1B図に示す合成ルートにより、２つの螢光団を有する
キノリン誘導体を合成した。

出発原料であるキノリン構造体Ｌは、前記した文献
（６）に記載されている合成法を適用し、４−メチルフ
エノールをフエノールと置換して、得た。

化合物ＬLI 第1B図に示すこの転換は、前記した「５−ホルミル−qu
in1,テトラエチルエステル」の項で述べた方法により良
好な収率で行なつた。

２当量以上のジメチルホルムアミドを使用した。

化合物LILII 化合物LIIを得るこの転換は、化合物VIIおよびXIから化
合物XIIの前記合成法に従い、化合物VIIを化学量論的に
等しい量の化合物LIと置き換えそして２当量以上の化合
物XIを使用して、良好な収率でもつて行つた。

化合物LIILIII 遊離酸としての化合物LIIIは、化合物LIIを水酸化カリ
ウムなどの塩基でケン化条件下で処理することにより得
た。

化合物LILIV 化合物LIVは、化合物VIIbおよびVIIIからIXへの前記合
成法に従い、化合物VIIbを化学量論的に等しい量のLIと
置換しそして２当量以上のVIIIを使用することにより得
た。

化合物LIVLV 化合物LVは、LIVを水酸化カリウムなどの塩基でケン化
条件下で処理することにより得た。

化合物LILVI 化合物LVIは、化合物VIIbおよびXIVからXVへの前記合成
法に従い、化合物VIIbを化学量論的に等しい量のLIと置
き換えそして２当量以上のXIVを使用することにより得
た。

化合物LVILVII 化合物LVIIは、化合物XVからXVIへの前記合成法に従
い、化合物XVを化学量論的に等しい量のLVIと置き換え
そして２当量以上のトリエチルホスフエートを使用する
ことにより得た。

化合物LVIILVIII 化合物LVIIIは、化合物XVIからXVIIへの前記合成法に従
い、化合物XVIを化学量論的に等しい量のLVIIと置き換
えることにより、ケン化条件下で得た。

quin2（遊離酸）のNMRデータを第８図および第９図に、
quin2−AM（テトラアセトキシメチルエステル）のNMRデ
ータを第10図および第11図に、fura−２（ペンタカリウ
ム塩）のNMRデータを第12図および第13図に、fura−２
（テトアセトキシメチルエステル）のNMRデータを第14
図および第15図に、indo−１（テトラアセトキシメチル
エステル）のNMRデータを第16図および第17図に、そし
てindo−１（ペンタカリウム塩）のNMRデータを第18図
および第19図に示す。

実験法 本新規染料の合成および試験に使用した実験法は次のよ
うなものが含まれる： UV吸収スペクトルを22±２℃でキヤリー（Cary）210分
光光度計で記録した。螢光スペクトルはパーキン−エル
マー（Perkin−Elmer）MPF−44A螢光分光光度計または
スペツクスフルオログ（Spex Fluorolog）111のどちら
かで記録したが、これはどちらもモーダミンＢ量子計数
装置を用いた比率型である。発光モノクロメーターおよ
び光電子増倍管に対する補正率は基準化合物のスペクト
ルをそれらの公知の量子分布（参考文献９を参照）と比
較することにより得られた。量子収率は、補正した試験
試料の発光スペクトルの積分を1N硫酸中のキニン重硫酸
塩の溶液のそれと比較することにより決定された。キニ
ンの濃度を、励起波長でこの試料と同じ吸光度を与える
ように調整した。キニンの量子効率は0.55とした（参考
文献10参照）。

高いイオン強度でのEGTAのカルシウムおよびマグネシウ
ム親和力は125マイクロモルづつのEGTA〔フルカ・ケミ
カル（Fluka Chemical）,purissグレード〕を1.00M KOH
〔ジエイ・テイー・ベイカー（J.T.ベイカー）、低炭酸
塩〕で滴定することにより測定した。EGTAは、225mM KC
l,25mM NaCl、およびある場合には10mM CaCl₂または21m
M MgCl₂を含有する25mlの媒質中に溶解させた。この溶
液を、放射計（Radiometer）TTA80滴定器中でかくはん
し、連続的に窒素を通して泡立て、そして18℃に温度調
節しながら、KOHをABU80自動ビユレツトから.005また
は.01mlのアリコートとして添加した。pHをPHM84計器で
測定し、G2040C電極およびAg/AgCl基準電極を、3M KCl
で満たした.01インチのカテーテル管材料１本によつて
滴定溶液につなぎ、この電極鎖は、米国標準局処方書
（National Bureau of Standards recipes）に従つて製
造したフタル酸塩（4.001）、燐酸塩（6.889）、および
硼砂（9.245）緩衝剤を使つて検定した。各滴定におけ
る50ないし80のpHの読みを、セイス（Sayce）のフオー
トラン（FORTRAN）プログラムSCOGSにより分析した（参
考文献36を参照）。

こうして得られるEGTAに対するプロトンイオン化定数は
9.537および8.961であり、これらは各々計算された不確
定性±0.12および±.008をともなつていた。これらのpK
a値は“混合された”定数、すなわちa_H＋〔EGTA^4-〕／
〔Ｈ^．EGTA^3-〕＝10^−9.54（ここでa_H＋＝10^-p^H）であ
る。

Ca^．EGTAおよびMg^．EGTAに対するlog絶対安定度定数
は、10.777±.011および4.567±.021であると計算され
た;Ca^．EGTAおよびMg^．EGTAに対するプロタンpKa′は各
々3.51±.49および7.885±.05で得られた。このイオン
強度およびすべてのpH＞４で、有効安定度定数Ｋ′caは
（antilog10.77）・〔１＋antilog（3.51−pH）〕／
〔１＋antilog（9.537−pH）＋antilog（9.537＋8.961
−２・pH〕（単位リツトル／モル）として計算すること
ができる。同様にＫ′_Mg＝（antilog4.567）・〔１＋an
tilog（7.885−pH）〕／〔１＋antilog（9.537−pH）＋
antilog（9.537＋8.961−２・pH〕。

遊離の〔Ca²⁺〕水準は、0.1M KCl中pH7.00,20℃で380n
M;0.1M KCl中pH7.20、20℃で151nM;131mM KCl,NaCl20mM
中pH7.05,37℃で214nM;および225mM KCl,25mM NaCl中pH
7.02,18℃で490nM;のCa−EGTAに対する見かけの解離定
数を仮定してCa−EGTA緩衝液により調節した。最初の３
つの見かけの解離定数を参考文献１および12で論議した
ようにマーテル（Martell）およびスミス（Smith）の表
（参考文献11を参照）から計算した。最後の値は、比較
的高いイオン強度では適当な絶対定数が得られず、生物
学的文献（参考文献13−17参照）中にある推定値は受け
入れられないほど大きな領域、すなわち＞0.5log単位で
変わるので、この研究で新しく決定した。この決定のた
めに我々は過剰の金属イオンの存在および不在における
pH滴定という典型的な信頼できる方法を選んだ（参考文
献18参照）。詳細は上記の合成法の項に示されている。

遊離の〔Ca²⁺〕は同様に、130mM KCl中pH7.18,20゜で21
mM;130mM KCl,20mM NaCl中pH7.05,37゜で8.96mM,および
225mM KCl,25mM NaCl中pH7.02,18゜で19mM;のMg^-EGTAに
対する見かけの解離定数を仮定して、Mg^-EGTA緩衝剤に
よつて調節した。ここでも、最後の値は、この研究で新
しく決定した。

重金属結合定数は、次にようにして測定した。Zn²⁺に対
するstil−１およびfura−２の親和力は、120mM KCl,5m
M K₂H₂EGTA,10mM MOPS,5mM Tris中の１−２マイクロＭ
の染料をマイクロメーターシリンジから小出しにした1M
ZnCl₂で滴定することにより測定した。この滴定の各段
階（添加した全ZnCl₂0から7mMまで13段階）で、塩基を
用いてpHが7.12の単位内にあるように調節し、実際のpH
値をpZnの計算のために記録し、室温で励起スペクトル
を記録した。そのスペクトル群は図３とほぼ同様の外観
を有しており、340および380nmでの螢光のヒル（Hill）
プロツトにより、すなわち、log〔（Ｆ−Fmin）／（Fma
x−Ｆ）対log〔遊離Zn²⁺〕（ここでFminおよびFmaxは各
々ゼロZn²⁺および過剰Zn²⁺での螢光である）をプロツト
することにより、同様に分析した。遊離Zn²⁺の計算に
は、Zn²⁺に対するEGTAの有効解離定数を、pH7.11で4.27
nMでありpHの.01増加あたり.02log単位減少するように
とつた（参考文献11参照）。

Mn²⁺およびFe²⁺はfura−２を消すので、Ca²⁺と比較した
これらのイオンに対する親和力は、各々化学量論的に過
剰な金属イオンの間の直接競争によつて評価することが
できた。ヘスケス（Hesketh）外の方法（参考文献26参
照）に類似のこの方法にはEGTAまたはその他の緩衝剤は
含まれない。室温で0.5マイクロＭのfura−２の螢光
は、100mM KCl,10mM KMOPS,pH7.2を含有する溶液中で記
録した。一つのシリーズではまた0,0.1または1mMのMnSO
₄と0,1.1,2.2,4.4または8.8mMのCaCl₂とを含有してお
り；別のシリーズでは2mMのCaCl₂と0,0.1,0.2,0.5,1.,2
mMのFe（NH₄）_２（SO₄）_２とを有し；そして第三のシリ
ーズでは、0.2mMのFe（NH₄）_２（SO₄）_２と0,0.2,0.4,
0.8,2,4および8mMのCaCl₂とを含んでいた。Fe（II）に
ついての測定は、隔壁により密封し絶えず窒素で泡立て
ているクヴエツト中で行ない、溶液は実験の終了後に隔
壁をとり除くまで透明でほぼ無色のままであり、隔壁の
除去により黄色のFe（OH）_３が迅速に析出した。

膜への結合は、145mM NaCl,5mM KCl,10mM MOPS,1mM Na₂
HPO₄,1mM MgCl₂および1mM EGTAまたは1mM CaCl₂のどち
らかを含有する媒質中の、1.5mlの容量の２マイクロM f
ura−2,fura−3,またはindo−１に、十分に洗浄してか
ら沈殿させたヒトの赤血球0.3mlづつを加えることによ
つて評価した。数分間平衡させた後、懸濁液を遠心分離
し、上澄みの螢光を前面形状寸法により測定した。赤血
球を加えた平衡の前のその水準からの螢光のわずかな損
失は、赤血球の残留細胞の外の水による希釈またはもれ
た痕跡量のヘモグロビンから内部フイルター効果もまた
螢光を減らす傾向があるであろうから、膜への染料の結
合に関しての上限であるとした。

実 施 例 本発明の特性と具体化は、下記の実施例にその概略が示
される。このような実施例は詳しい説明を目的としてい
るだけで、決して特許請求の範囲の趣旨を制限しようと
するものではない。

実施例 Ｉ 吸収スペクトル Ca²⁺の存在下または不在での、stil−1,stil−2,indo−
1,fura−1,fura−２およびfura−３により例示したよう
にここに示した新規指示薬についての吸光度および螢光
特性を、下記の表Ｉに示す。この表中のデータが示すよ
うに、新規指示薬に対する吸収スペクトルはスチルベン
発色団に対して期待される範囲内にある。吸光最大値は
近紫外の中にあり、吸光係数は２−３×10^-4M^-1cm^-1の
領域内である。表Ｉ中のデータはまたCa²⁺の結合がすべ
ての吸収スペクトルを短波長側にシフトさせることをも
示している。

実施例 II 螢光特性 この中に示す新規指示薬に対する螢光励起スペクトルは
吸収スペクトルと同様に〔Ca²⁺〕が増大するにつれて短
波長にシフトする。一つの例が図３に示されているが、
これには〔Ca²⁺〕を変化させた検定緩衝液中のfura−２
に対する一組の励起スペクトルが表わされている。この
ような検定データが与えられると、本染料を含有する未
知溶液中の〔Ca²⁺〕をその励起スペクトルの形から演繹
することができる。この検定のために解明された式は、
実施例VIIで誘導される。螢光励起スペクトルと比べ、
それが発光波長シフトについては各本指示薬の間には大
きな変化がある。本化合物はすべて多少のシフトを示す
けれども、インドール型の化合物（indo−１によつて例
示したような）だけはかなりのシフトを示す。

スチルベン型（stil−１およびstil−２により例示）お
よびベンゾフラン型（fura−1,fura−２およびfura−３
により例示）指示薬は、Ca²⁺を結合させたときその発光
波長をほとんど変えないので、異なる〔Ca²⁺〕でのそれ
らの発光スペクトル群は、すべての曲線がお互いに交わ
る点を示さない。このことはインドール型指示薬につい
てはあてはまらないことであるが、それはこれらのCa²⁺
−錯体がそのCa²⁺を含まないものよりもはるかに短い発
光波長を有しているからである。したがつて、indo−１
によつて例示したようなインドール型の発光スペクトル
は、それが、Ca²⁺を含まない形およびCa²⁺−結合した形
を励起させる相対効率に影響を及ぼすため、その位置が
励起波長に依存している明らかな交錯点を示す。これ
は、図４に具体的に示されている。この図はまた、励起
波長355−356nm（クリプトンレーザーにより得られるで
あろう）でindo−１が、長波長および短波長のピークが
匹敵する大きさを有している発光スペクトル群を与える
ことをも示している。

全新規指示薬に対する螢光の量子収率は非常に注目すべ
きものであり、Ca²⁺をともなうindo−１およびfura−２
に対しては約0.5までに上る。すべての場合にCa²⁺−錯
体はCa²⁺を含まない染料より1.3倍から2.1倍高い量子効
率を有している。比較すると、Ca²⁺を含む場合と含まな
い場合のquin2の量子効率は各々0.14および0.029である
（参考文献６を参照）。半飽和のfura−２は、半飽和の
quin−２より４ないし５倍高い量子効率を有しており、
fura−２はquin2よりも約６倍高い吸光係数を有してい
るので、fura−２はquin−２よりも約30倍明かるいはず
だと予測されるであろう。この判断は図５によつて確証
される。すなわち図５は、高Ca²⁺および低Ca²⁺での１マ
イクロＭのfura−２の螢光は、全く同じ条件下での3,0
マイクロＭのquin2のそれよりはさまれていることを示
している。

実施例 III Ca²⁺−結合定数 ここに示した、キレート化剤stil−1,stil−2,indo−1,
fur−1,fura−２およびfura−３により例示されるよう
な新規指示薬に対する解離定数（下記の表Ｉ参照）は、
イオン強度0.1位から0.5で100−300nMの範囲内である。
このような値は、親化合物BAPTA（参考文献６参照）の
解離定数（110nM）に近く、残りの発色団を形成してい
る置換基はわずかに電子をひきつけるだけであることを
示す。fura−２はもつと高いイオン強度、約250mM（225
mM KCL,25mM NaCl）でも検査した。Ca²⁺結合強度にかな
りの減少が観察され、見かけの解離定数は760nMとなつ
た。このように強いイオン強度への依存性は４価陰イオ
ンの２価陽イオンとの反応に関しては驚くべきことでは
ない。

実施例 IV スチルベン類の光異性化 ここに示した、stil−１およびstil−２により例示した
ようなスチルベン型の指示薬、シスおよびトランス異性
体として存在することができる。両異性体はウイツテイ
ヒ反応の生成物（例えばIX,XIIおよびXV）に含まれてい
る。これらの異性体の分離はstil−1/MeおよびEtについ
てのみ試みられた。AgNO₃を含ませたシリカ上の薄層ク
ロマトグラフイー（クロロホルム：メタノール9:1また
は19:1v/v）はかろうじてstil−1/Etの２つの異性体を
分割することができ、シス異性体の方がゆつくり移行す
る。オクタデシル逆相カラム〔スペルコシル（Supelcos
il）LC−18 25cm×4.6mm,ペンシルバニア州、ベルフオ
ンテ、スペルコ社（Supelco,Inc.）〕上の高圧液体クロ
マトグラフイーおよび92:8v/vメタノール−水による溶
離によつても両異性体を分離できた。各々の場合にシス
−異性体はその非螢光により識別された。所望のトラン
ス異性体の予備単離は、エステル、stil/Meをくり返し
再結晶させることにより最良の結果が得られた暗所での
純粋なトランスエステルのけん化はトランス−ペンタ−
陰イオンを与えるために行なわれた。水溶液中のこの陰
イオンに365nmの光を照射すると、長波長の吸光度と螢
光の両方が減少した。トランス異性体のみが螢光性であ
ると仮定すると（参考文献25を参照のこと）、Ca²⁺の不
在での光定常状態は約75％のトランス体、25％のシス体
を含有している。このシス体に対するトランス体の比率
は、スチルベンの光定常状態に対して異常に高い。も
し、もとのシスおよびトランス異性体の混合物を含有す
る粗製のstil−1/Meを加水分解するならば、この陰イオ
ン混合物の照射が吸光度と螢光とを増大させる。光異性
化は、トランスstil−１の螢光指示薬としての使用をか
なり錯雑させる。Ca²⁺測定が始まる前に光定常平衡に達
するためにstil−１を強く光照射すること、およびその
時でさえ励起ビームの強度を最小にして、ある１つの励
起波長での絶対螢光強度からよりもむしろ２つの波長で
の励起効率の比からCa²⁺を読むことが必要となつてく
る。不幸にして、stil−１はまた、シス−トランス異性
の上にもう一つ遅いとはいえ、光化学反応をも受ける。
この遅い反応により長い（＞300nm）励起波長での螢光
が徐々に起こつてくる。これは、stil−１の試料を非常
に低い〔Ca²⁺〕で光照射してからその励起スペクトルの
測定の間高いCa²⁺に暴露するとき最も顕著である。もつ
ともらしいが証明されていない説明は、非螢光性のシス
異性体が光環化して、比較的長い励起波長で極めて螢光
性に富むフエナンスレン（参考文献25参照）となるとい
うことである。こうしたスチルベン類の複雑さすべて
が、示されたindo−型およびベンゾフラン−型の染料の
合成（これらの染料ではこのような光化学反応は複素環
の形成により妨げられる）を好ましいものとする。

実施例 Ｖ 競争する陽イオンに対する結合定数は、fura−２につい
て最も完全に調査された。Mg²⁺を用いた滴定（図６参
照）は、0.1−0.15Mイオン強度で、37℃で約5.6mMそし
て20゜で9.8mMという解離定数を示した。それ故に、fur
a−２はquin2〔このMg²⁺解離定数は37゜およびほぼ22゜
で各々約1mMおよび2mMである（参考文献６および７参
照）〕ほど強くMg²⁺を結びつけない。その上、図６を図
３と比較することにより分かるように、fura−２スペク
トルに関するMg²⁺結合の効果は、Ca²⁺の効果と比較して
非常に小さい。さらに、極端に高い水準（100mMかそれ
以上）までMg²⁺を増大させると、励起スペクトルはそれ
以上に上がるどころかむしろ下がつたしまうことにな
る。この挙動は2Mg²⁺−１染料錯体が部分形成されてい
ることを反映しているであろう。

fura−２の、生理学的により重要な２価重金属のあるも
のへの結合もまた、簡単に検査された。stil−１および
fura−２は両方とも解離定数約1.6−2nM（pK_Zn8.6−8.
8.）で亜鉛と結合する。これらの値はZn²⁺:Ca²⁺優先の
大きさの程度が２であることを示すけれども、これら
は、大きさの程度3.5でZn²⁺がCa²⁺に対して優先するqui
n2に対する値よりも良好である（参考文献26参照）。不
思議なことにZn²⁺はCa²⁺と同じようにfura−２スペクト
ルをシフトさせるが、一方Zn²⁺はquin2を消減させ、そ
のためCa²⁺と反対に作用をする。Mg²⁺をしりぞける点で
fura−２もまたquin2よりも優れており、Mg²⁺:Ca²⁺優先
は各々42倍および510倍である（参考文献26参照）。不
安定な細胞内の鉄の主酸化状態は＋２であり（参考文献
27参照）;Fe²⁺はCa²⁺より３ないし10倍強くfura−２を
結合させる。もつと正確な推定値は実験上のばらつきに
よつて妨げられたが、このことは1:1よりもさらに複雑
な化学量論または不完全な無気条件を反映しているであ
ろう。Mn²⁺およびFe²⁺は多くの不対電子をもつ金属につ
いて期待される通り、fura−２を消滅させる。これに比
べて、EGTAは各々約50、約20、および約８−倍の率でCa
²⁺に対してZn²⁺,Mg²⁺およびFe²⁺を優先する（参考文献1
1参照）。

生理学的領域内でのpHの変化のfura−２に関する効果
は、非常に小さいように思われる。図７は、合理的な細
胞内値領域にわたるpH変化がCa²⁺を含まないかまたはCa
²⁺結合したもののスペクトルまたは有効Ca²⁺解離定数に
ほとんど影響を及ぼさないことを示す。

実施例 VI 膜への結合 添加および除去が容易であるため、赤血球を結合の試験
のためのモデルの膜として使用した。溶液中17％のfura
−2,fura−３またはindo−１を含むヘマトリツト管に加
えた後、遠心分離した赤血球は上澄みの螢光を５％未満
減少させた。この螢光のわずかな低下は、充てん赤血球
とともに加えられた避けることのできない少量の細胞外
液体による希釈そのものであり得た。たとえそれが完全
に結合のせいであるとしても膜に結合した染料の量は厚
さ0.2ミクロンの隣接水溶液の層に含有されるものより
は少ないであろう。このような無視できる結合は、媒質
が1mMのCa²⁺を含有していようとCa²⁺なしのEGTAを含有
していようと、見出された。

実施例 VII ２つの波長での強度値を用いる染料用検定方程式 ここに記載した新規染料の重要な特徴は、Ca²⁺が強度で
はなく、螢光スペクトルの形および波長分布を変化させ
る能力である。quin−２もCa²⁺によりそのピーク励起波
長をシフトさせるけれども（図５参照）、実際にはその
励起スペクトルの長−波長末端はあまりに低い強度をも
ち、Mg²⁺に対してあまりに敏感である。そのためquin−
２はほとんどいつでも339nmに中心をおく励起に使用さ
れてきた。これらの条件下ではその染料を高Ca²⁺飽和と
低Ca²⁺飽和という２つの公知の状態に無理にもつていく
実験の終りの破壊検定と比較するまで、与えられた細胞
内quin−２からの螢光の読みは定量的な意味をもたな
い。どんな間に入る染料の損失または計器の感度の変化
も検定を危くし、〔Ca²⁺〕ｉにおける変化と間違えられ
るかもしれない。これと対照的にもし染料がCa²⁺を結合
したとき波長をシフトするならば、ちようど２つの励起
波長ラムダ_１およびラムダ_２でその染料の螢光の強度I₁
およびI₂の比Ｒは、全染料濃度、D_T、路長、または計器
の絶対感度と無関係に一般原則として〔Ca²⁺〕を計算す
るのに十分である。この終りまで、単位濃度および励起
波長ラムダ_１およびラムダ_２での全くCa²⁺−を含まない
染料の螢光をF_A1およびF_A2であると定義しよう。完全に
Ca²⁺で飽和された染料に対する類似のパラメータはF_B1
およびF_B2である。各濃度D_AおよびD_Bで遊離指示薬とCa
²⁺結合した指示薬との混合物については、総螢光強度
は： I₁＝D_AF_A1＋D_BF_B1 （Ia） I₂＝D_AF_A2＋D_BF_B2 （Ib） によつて与えられるであろう。しかしながら、D_Aおよび
D_Bは、1:1錯化に対する方程式、 D_B＝D_A〔Ca²⁺〕/Kd （２） によつて〔Ca²⁺〕に関係づけられる。ここでKdは、有効
解離定数である。螢光比Ｒは、比 I₁/I₂＝（D_AF_A1＋D_BF_B1）／（D_AF_A2＋D_BF_B2） ＝（F_A1＋F_B1〔Ca²⁺〕/Kd）／（F_A2＋F_B2 〔Ca²⁺〕/Kd）＝Ｒ （３） である。〔Ca²⁺〕について解くと、検定方程式： が得られる。F_A1/F_A2は単にＲがゼロ〔Ca²⁺〕でもつこ
とのできる極限値であり、そのためRminと考えることが
でき、一方F_B1/F_B2は、その比が飽和〔Ca²⁺〕でもつ同
様の極限値Rmaxであることに注意されたい。それ故に、
上記の方程式は： と書くことができるが、これは唯一つの波長での強度値
を用いる染料についての検定方程式： よく似た形である。両方程式（５）および（６）は、こ
の染料がCa²⁺と単純な1:1錯体を形成すること（方程式
２）、それが検定媒質中と同じように細胞内で行動する
こと、およびそれが十分に希薄であつて螢光の強度は螢
光性物質の濃度に比例すること（方程式１）を仮定して
いる。しかしながら方程式（６）は、Ｆ、Fmin、および
Fmaxがすべて同一の計器感度、光路長、および染料の有
効総濃度、で限定されることを必要とする。Fmaxおよび
Fminを測定するための唯一のほんとうに確実な方法は、
細胞を溶解し、解放された染料を滴定することを必要と
するので、これの要求は、単一層に限定された細胞を観
察するかまたは顕微鏡下または流動血球計算器中で細胞
を観察するときは満足するのがむずかしい。クヴエツト
中に懸濁させた離解細胞を用いたときだけ、光路中の染
料濃度は溶解にもかかわらず変化しないままであること
を期待することができる。これらの方法は、例えば染料
をCa²⁺で飽和させた後それをMn²⁺で消滅させるためにイ
オン泳動を用いることによつて、溶解をともなわないで
検定するために提案されたけれども（参考文献26参
照）、イオン泳動がこの仕事を完全に行なう証拠は溶解
との比較に基づく。このような方法も主記録期間中の漂
白または漏れによる染料の損失を補償しない。比および
方程式５を用いると、染料含有量および計器感度は、そ
れが各比中で消えるので、自由に１つの比ともう１つの
比との間で変わることができる。もちろん、各々の単一
定量の測定の範囲内で安定性が必要とされ、また、Ｒ、
Rmin、Rmaxも、どの波長の偏りもそれらのすべてに等し
く影響を及ぼすように、すべて同一の手段で測定されな
くてはならない。図３からの励起ラムダ_１＝340nmおよ
びラムダ_２＝380nmでのデータは、Rmin＝0.768,Rmax＝3
5.1、F_A2/F_B2＝15.3、およびKd＝135nMで方程式５によ
く一致する。明らかにこれらの方程式はindo−１の発光
比にちようど当てはめられる。発光ラムダ_１＝400nmお
よびラムダ_２＝490nmでの図４のデータに対しては、Rmi
n＝0.121,Rmax＝2.60,F_A2/F_B2＝2.01およびKd＝250nMで
ある。

比演算が２つの主たる不利を有することは特に注目され
ねばならない。もしも組織の自己螢光が有意なものであ
るならば、比を形成する前にこれを引かなくてはなら
ず、一方それがカルシウムに依存していない限り、これ
は方程式６においては自動的に消える。幸いにして、本
新規染料の明かるさのため自己螢光を圧倒することは容
易である。励起波長をすばやく交代させ、螢光の強度の
比を計算する手段もまだ標準通りには得られない。カリ
フオルニア大学の我々の実験室では、我々は、２つの光
源と２つのモノクロメーターとが、10−30Hzで回転して
いる蝶の形をした扇形鏡によつて交代で選択されるシス
テムを作成した。強度の大きな変動の相殺は単一層およ
び単一小細胞を研究するには全く価値がない。しかしな
がら、流動血球計算において安定な相対強度の逐次励起
波長を与えることは比較的困難であり、そのためindo−
１の発光シフトにより、それがこの出願で特に人目をひ
くものとなつている。

【図面の簡単な説明】

第１図はstil−1,stil−２及びindo−１に導く合成経路
を説明する化学的フローチヤートである。 第1A図は、１つの螢光団を有する化合物の合成経路を説
明するフローチヤート図である。 第1B図は、２つの螢光団を有するキノリン誘導体の合成
経路を示すフローチヤート図である。 第２図はfura−1,fura−２及びfura−３に導く合成経路
を説明する化学的フローチヤートである。 第３図は、＜nMから＞10μＭまでの範囲の遊離Ca²⁺値を
含む緩衝液中のfura−２の20℃における励起スペクトル
系列を示すグラフである。 第４図は、遊離Ca²⁺の関数としてindo−１の発光スペク
トルを示すグラフである。 第５図は、同じセツトの条件下における１μMfura−２
と30μM quin2の励起スペクトルを示すグラフである。 第６図は、fura−２に対するMg²⁺の影響を示すグラフで
ある。 第７図は、零、200nM及び1mMの遊離Ca²⁺におけるfura−
２に対する6.75〜7.05のpH変化の影響を示すグラフであ
る。 第８図および第９図は、quin2（遊離酸）のNMRデータで
ある。 第10図および第11図は、quin2−AM（テトラアセトキシ
メチルエステル）のNMRデータである。 第12図および第13図は、fura−２（ペンタカリウム塩）
のNMRデータである。 第14図および第15図は、fura−２（テトラアセトキシメ
チルエステル）のNMRデータである。 第16図および第17図は、indo−１（テトラアセトキシメ
チルエステル）のNMRデータである。 第18図および第19図は、indo−１（ペンタカリウム塩）
のNMRデータである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｃ 311/39 7419−4Ｈ 317/32 7419−4Ｈ Ｃ０７Ｄ 209/14 9284−4Ｃ 307/82 413/04 7602−4Ｃ // Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ 7906−2Ｊ 33/84 Ｚ 7055−2Ｊ (72)発明者 グルゼゴルツ・グリンキーウイツツ ポーランド国01―864 ワルシヤワ，ウ ル・コチヤノウスキーゴ 42 エム 27

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の一般式： ｛式中、R¹は−Ｈ、CH₃、−Ｆ、−Cl又は−Brであり;R²
   は−Ｈ、−CH₃、−Ｆ、−Cl、−Br又はC₁−C₄アルコキ
   シであり;R⁹及びR¹⁰は互いに関係なく水素又はアセトキ
   シメチルであり;W及びＸは共に−Ｈであるか、又はＷ及
   びＸは一緒になって−Ｏ−を構成し、 ここで、（ｉ）Ｗ及びＸが共に−Ｈである場合、 Ｂは であり、〔ここで、R³及びR³aは互いに関係なく−Ｈ、
   −COOH、−COOR⁴（ここで、R⁴はα−アシルオキシアル
   キル又は薬学的に許容できるエステル化基である。）、
   −CONR⁵R⁶（ここで、R⁵及びR⁶は互いに関係なく−Ｈ、
   −CH₃又は−C₂H₅である。）、−SO₃H、−SO₂NR⁵R⁶（こ
   こで、R⁵とR⁶とは上記定義と同一である。）、−SO₂C
   F₃、−COCH₃又は−CNであり、Ｙ及びＹ′は共に−Ｈで
   あるか、又はＹ及びＹ′は一緒になって （ここで、R⁵は上記定義と同一である。）を構成す
   る。〕 （ii）Ｗ及びＸが一緒になって−Ｏ−を構成する場合
   は、 Ｂは であり〔ここで、R³及びR³aは互いに関係なく−Ｈ、−C
   OOH、−COOR⁴（ここで、R⁴はα−アシルオキシアルキル
   又は薬学的に許容できるエステル化基である。）、−CO
   NR⁵R⁶（ここで、R⁵及びR⁶は互いに関係なく−Ｈ、−CH₃
   又は−C₂H₅である。）、−SO₃H、−SO₂NR⁵R⁶（ここで、
   R⁵及びR⁶は上記定義と同一である。）、−SO₂CF₃、−CO
   CH₃又は−CNである。〕、Ｙは−Ｈである。｝ を有するビス（２−アミノフェノキシ）エタン−N,N,
   N′,N′−四酢酸又はそのアセトキシメチルエステル若
   しくは薬剤学的に許容できるその非毒性塩。
2. 【請求項２】１−（２−アミノ−５−〔２−（４−カル
   ボキシフェニル）−Ｅ−エテニル−１）フェノキシ〕−
   ２−（２′−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタン
   −N,N,N′,N′−四酢酸又はアセトキシメチルエステル
   若しくは薬剤学的に許容できる非毒性塩である、特許請
   求の範囲第１項記載の化合物。
3. 【請求項３】１−（２−アミノ−５−〔２−（４−N,N
   −ジメチルスルホンアミドフェニル）−Ｅ−エテニル−
   １〕フェノキシ）−２−（２′−アミノ−５′−メチル
   フェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢酸又はアセト
   キシメチルエステル若しくは薬剤学的に許容できる非毒
   性塩である、特許請求の範囲第１項記載の化合物。
4. 【請求項４】１−（２−アミノ−５−〔６−カルボキシ
   インドリル−２〕フェノキシ）−２−（２′−アミノ−
   ５′−メチルフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢
   酸又はアセトキシメチルエステル若しくは薬剤学的に許
   容できる非毒性塩である、特許請求の範囲第１項記載の
   化合物。
5. 【請求項５】１−（２−４−カルボキシフェニル）−６
   −アミノベンゾフランオキシ−５）−２−（２′−アミ
   ノ−５′−メチルフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−
   四酢酸又はアセトキシメチルエステル若しくは薬剤学的
   に許容できる非毒性塩である、特許請求の範囲第１項記
   載の化合物。
6. 【請求項６】１−（２−４−シアノフェニル）−６−ア
   ミノ−ベンゾフランオキシ−５）−２−（２′−アミノ
   −５′−メチルフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四
   酢酸又はアセトキシメチルエステル若しくは薬剤学的に
   許容できる非毒性塩である、特許請求の範囲第１項記載
   の化合物。
7. 【請求項７】１−（２−（５′−カルボキシオキサゾー
   ル−２′−イル）−６−アミノ−ベンゾフランオキシ−
   ５）−２−（２′−アミノ−５′−メチルフェノキシ）
   エタン−N,N,N′,N′−四酢酸又はアセトキシメチルエ
   ステル若しくは薬剤学的に許容できる非毒性塩である、
   特許請求の範囲第１項記載の化合物。
8. 【請求項８】テトラカリウム塩又は四遊離酸である、特
   許請求の範囲第１項ないし第７項記載の化合物。