JP5906190B2 - レシオメトリックであり、かつ赤色スペクトルで発光する蛍光カルシウム指示薬 - Google Patents
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Description
本出願は、出願人によって2010年10月17日に出願された米国仮特許出願第61/252,654号明細書に関連し、その出願の優先日を主張する。
本出願は、長波長蛍光イオン指示薬の設計および合成に関する。
レシオメトリックである、最も一般的な蛍光カルシウム指示薬としては、Fura−2(励起シフト)およびIndo−1(発光シフト)iが挙げられる。レシオメトリーは、指示薬の濃度、細胞ローディングの程度、光退色、検出器の感度、細胞の厚さ、および光路などのカルシウム測定における可変的影響を排除する、特有の利点を有する。それは本質的に、較正および定量的測定を可能にする理想的な特性である。しかしながら、これらの一般的なレシオメトリック色素は紫外線で機能する。UV光学装置類は高価であり、したがってこれらの色素の一般的な使用が制限されている。高エネルギー紫外線光は細胞に有害でもある。レシオメトリーはこの問題を減らすが、紫外線光で励起した場合、ヌクレオチドおよび一部のアミノ酸による自家蛍光も、測定中に干渉を引き起こす。
a.R2がHであり、かつR3がメチルである場合、デフォルトの高親和性バージョンが得られる。
b.R3がCH2CH2CO2R1として修飾される場合には、蛍光特性を変化させることなく、新規な漏れ抵抗性バージョンが得られる。
c.R2およびR3がFである場合、デフォルトの高親和性バージョンよりもほぼ20倍高いカルシウムに対するKdを有し、蛍光特性も変化させることなく、低親和性バージョンが得られる。
d.R3=
である場合、ミトコンドリアバージョンが得られ、細胞質ゾルよりはむしろミトコンドリアにおけるカルシウム測定が可能となる。
e.R3=
である場合、膜付近バージョンが得られ、蛍光特性に影響することなく、膜付近のカルシウム測定が可能となる。
本明細書で使用される用語の定義
本明細書および特許請求の範囲において、以下のように、本明細書で使用するために明確に定義される、当該技術分野のフレーズおよび用語が参照される:
本発明は、電磁スペクトルの赤色および近赤外領域での発光を有する、カルシウム指示薬の新規なファミリーを説明する。新規な指示薬は、カルシウムキレート化のためにBAPTAまたはBAPTA様主鎖から誘導され、赤色または赤外蛍光は、塩素化およびフッ素化ベンゾ[c]キサンテノンとキレート化部分を連結することによって達成される。キサンテノンがレゾルシノールとナフタレンジオールの組み合わせから誘導される場合、その発光は650nmであり、2つのナフタレンジオールからの誘導体によって、690nmの発光が得られる。それらはカルシウム指示薬として細胞内カルシウムに応答する。波長が長くなると、量子収量がわずかに減少する。
図1は、化合物Iの非レシオメトリックなカルシウム滴定を示す。それぞれが化合物I 5μΜを含有する、適切な体積の10mMカリウム−EGTA、100mM KCl、10mM MOPSバッファー(pH7.20)および10mMカルシウム−EGTA、100mM KCl、10mM MOPSバッファー(pH7.20)を混合し、目的の遊離カルシウム濃度0nM、50nM、150nM、450nM、および39μΜを得た。540nmでの励起を有する、各溶液の発光スペクトルを記録し、カルシウム濃度の増加に伴って、650nmで発光強度が激しく増加した。解離定数を計算し、約400nMが得られた。SPEX Fluoromax−3でスペクトルを記録した。
本発明の一態様は、セミナフトフルオレセイン、ジナフトフルオレセイン、およびセミナフトローダミン様フルオロフォアのpKaを下げる能力である。かかる変化を可能にする前駆物質は、5−フルオロ−7−クロロ−1,6−ナフタレンジオール(図5、化合物9)である。
メチル−5−フルオロ−6−ヒドロキシナフトエート(3)
6−ヒドロキシナフトエ酸(25g)をメタノール(250ml)に溶解し、硫酸(25ml)を添加した。混合物を80℃で一晩加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、次いで重炭酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させ、クリーム色の固形物(24g)としてエステルを得た。そのエステル(10g)をアセトニトリル(500ml)に溶解し、Selectfluor 2当量を添加し、室温で3時間攪拌し、その時点で出発原料は消費されていた。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて、クリーム色の固形物(7g)としてジェミナルに二フッ素化された化合物(2)が得られた。酢酸200mL中の亜鉛粉末2gを使用して、この固形物をモノフルオロ化合物へと還元した。固形物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル6:1)によって、化合物3を6g得た。
化合物(3)5gをトルエン(50ml)に溶解し、s−ブチルアミン(500μl)を添加し、反応混合物を油浴で66℃に維持し、塩化スルフリル(1.2当量)を3時間にわたって添加した。混合物を酢酸エチルで希釈し、ブライン、5%チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、(4)を得た。残留物をアセトニトリル(10ml)に溶解し、炭酸カリウム(4g)に続いて臭化ベンジル(3ml)を添加した。すべての出発原料が消費されたことがTLCで分かった時に、混合物を還流下にて2時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、油状残留物を得て、それをヘキサン:酢酸エチル(9:1)のカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固形物(3g)として(5)を得た。
化合物(5)(5.8g)をジエチルエーテル(100ml)に溶解し、無水エーテル75mL中の水素化アルミニウムリチウム(2当量)に一滴ずつ添加した。添加が完了した時、攪拌をさらに30分間続け、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、希硫酸と共に攪拌した。有機抽出物を乾燥させ、蒸発させて、クリーム色の残留物を得た。その残留物を無水塩化メチレン(75ml)に溶解し、CH2Cl2(75ml)中のクロロクロム酸ピリジニウム(1.5当量)に添加し、室温で2時間攪拌した。酢酸エチルを反応混合物に添加し、次いで300cm3のシリカに通してそれを濾過した。有機濾液を蒸発させて、淡褐色の固形物4gとして(6)を得た。
化合物6(3g)をベンゼン(30ml)に溶解し、m−クロロ過安息香酸(2当量)を添加し、混合物を70℃で24時間加熱した。混合物を攪拌しながら、1M KOH10mlを添加し、ギ酸エステルを加水分解した。反応混合物を1M HClで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、ゴム状残留物が得られ、ヘキサン:酢酸エチル4:1のカラムクロマトグラフィーによって精製して、クリーム色の固形物2gとして(8)を得た。
化合物8(2g)を塩化メチレン(20ml)に溶解し、三臭化ホウ素(CH2Cl2中で1M、3当量)を添加し、溶液を3時間攪拌した。氷水を反応に添加し、塩化メチレン、続いて酢酸エチルで抽出することによって、洗浄および蒸発後に淡褐色の固形物(1g)として(9)を得た。色素の合成に直接使用できる状態であった。
化合物I、エチルエステル:
Grynkewiczら1からのBAPTAアルデヒド(1mmol)、4−フルオロレゾルシノール(1mmol)、および5−フルオロ−7−クロロ−1,6−ナフタレンジオール(1mmol)をメタンスルホン酸10mLに室温で1時間溶解させた。氷中の3M酢酸ナトリウム200mLに反応を注ぎ、紫色の沈殿物を濾過した。真空下にて五酸化リンで乾燥させた後、固形物をクロロホルム/メタノール(1:1)20mLに溶解し、p−クロラニル(2当量)を添加した。溶液を一晩還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、次いで紫色の固形物をメタノールに溶解した。不溶性p−クロラニルを濾過除去した。濾液を蒸発させ、メタノール/クロロホルム勾配5〜15%を用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物I、エチルエステルを得た。
純粋な化合物I、メチルエステル(0.5mmol)をメタノール4mL中の2M KOH水溶液(4.0mmol)で室温にて30分間加水分解した。水2mLを添加し、メタノールを減圧下で除去した。完全に水性の反応を室温で1時間攪拌し、その時点でC18TLC(メタノール/ブライン3:2)によって加水分解が完了したことが分かった。氷を反応混合物に添加し、pHが7.5〜8.5になるまで、2M HClを添加した。水中で充填されたLH−20カラム30g上に弱い塩基性の溶液をローディングし、水で溶出した。純粋な生成物画分を真空下にて45℃で溶媒から取り除き、化合物I、五カリウム塩を得た。
化合物I、五カリウム塩(0.1mmol)を氷水1mLに溶解した。2M HClを添加してpHを1.5とし、沈殿した遊離酸を濾過した。紫色の固形物を真空下にて五酸化リンで乾燥させた。次いで、無水ジメチルホルムアミド1mLにそれを溶解し、ジイソプロピルエチルアミン1.5mmolを添加した。室温で5分間攪拌した後、酢酸ブロモメチル1mmolを添加し、反応を室温で2時間攪拌した。混合物を酢酸エチル50mLで希釈し、0.1Mクエン酸50mLで2回洗浄し、ブライン50mLで1回洗浄した。有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下にて溶媒から取り除いた。カラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル1:1)によって純粋な化合物I、AMエステルが得られた。
Grynkewiczら1からのBAPTAアルデヒド(1mmol)および5−フルオロ−7−クロロ−l,6−ナフタレンジオール(2.2mmol)をメタンスルホン酸10mLに室温にて1時間溶解した。氷中の3M酢酸ナトリウム200mLに反応を注ぎ、青紫色の沈殿物を濾過した。真空下にて五酸化リンで乾燥させた後、固形物をクロロホルム/メタノール(1:1)20mLに溶解し、p−クロラニル(2当量)を添加した。溶液を一晩還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、次いで青紫色の固形物をメタノールに再び溶解した。不溶性p−クロラニルを濾過除去した。濾液を蒸発させ、メタノール/クロロホルム勾配5〜10%を用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物II、エチルエステルを得た。
メタノール4ml中の2M KOH水溶液(4.0mmol)で、純粋な化合物II、エチルエステル(0.5mmol)を室温にて30分間加水分解した。水2mLを添加し、減圧下にてメタノールを除去した。完全に水性の反応を室温で1時間攪拌し、その時点でC18TLC(メタノール/ブライン3:2)によって加水分解が完了したことが分かった。氷を反応混合物に添加し、pHが7.5〜8.5になるまで、2M HC1を添加した。水中で充填されたLH−20カラム30g上に弱い塩基性の溶液をローディングし、水で溶出した。純粋な生成物画分を真空下にて45℃で溶媒から取り除き、化合物II、五カリウム塩を得た。
化合物II、五カリウム塩(0.1mmol)を氷水1mLに溶解した。2M HClを添加して、pHを1.5とし、沈殿した遊離酸を濾過した。青紫色の固形物を真空下にて五酸化リンで乾燥させた。次いで、無水ジメチルホルムアミド1mLにそれを溶解し、ジイソプロピルエチルアミン1.5mmolを添加した。室温で5分間攪拌した後、酢酸ブロモメチル1mmolを添加し、反応を室温で2時間攪拌し、時間が経つにつれて無色になった。混合物を酢酸エチル50mLで希釈し、0.1Mクエン酸50mLで2回洗浄し、ブライン50mLで1回洗浄した。有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下にて溶媒から取り除いた。カラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル2:1)によって純粋な化合物II、AMエステルが得られた。
特許文献
米国特許第4,849,362号明細書;DeMarinisら、1989年7月
米国特許第5,049,673号明細書;Tsienら、1989年9月
米国特許第4,603,209号明細書;Tsienら、1986年7月
非特許文献
i Grynkiewicz, G.,Poenie,M.,Tsien,R.Y.,J.Biol.Chem.(1985)260,3440−3450.
ii Minta,A.,Kao,J.,Tsien,R.Y.,J.Biol.Chem.(1989)264,8171−8178.
iii latridou,H.,Foukaraki,I.,Kuhn,M.A.,Marcus,E.M.,Haugland,R.P.,Katerinopoulos,H.E.Cell Calcium,(1994)15,190−198.
iv DeMarinis,R.M.,Katerinopoulos,H.E.,Muirhead,K.A.Biochem.Methods(1990)112,381
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