JPS61100599A - カルシウム特異性けい光指示薬染料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカルシウムイオンに対して特異的である叶い光
指示薬染料に関する。さらに詳しくは、本発明は、染料
が結合したカルシウムを含んでいるかまたはカルシウム
を含んでいないかによって異なる波長でけい光を発する
カルシウム特異性げい光指示薬染料に関する。この波長
のずれは、２つの波長におけるげい光の比を単に測定す
ることによって絶対的なスケールでカルシウム濃度を算
出することを可能にする。

さらに、本発明はα−アシルオキシアルキルブロミド、
特にここに開示する新規なげい光染料のクラスに含まれ
るアセトキシメチルエステルの製造に有効なアセトキシ
メチルプロミドの改良された合成方法に関する。

細胞内伝達物質及び調節物質としてカルシウムが重要で
あるため、細胞内の遊離カルシウム濃度（Ｃａ”）　ｉ
　を測定するために広範囲な方法が開発されている（参
考文献４参照）。これらの方法の中で最も有利な方法は
、Ｃａ　　イオンを結合すると吸光度またはルミネセン
スを変える染料または蛋白質を用いるものである。現在
、これらの方法の中で最も一般的な方法は、「ｑｕｉｎ
　２Ｊと呼ばれる指示薬染料化合物のよ５なりＡＰＴＡ
　（１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ
　、　Ｎ　、　Ｎ’、Ｎ／−テトラ酢酸）様化合物のげ
い光を監視することである（参考文献４〜７参照）。こ
の方法を用いて哺乳動物細胞の細胞内遊離カルシウムを
測定する場合には、ｑｕｉｎ　２を膜浸透性エステル誘
導体として細胞とともにインキュベートすることによっ
て、ｑｕｉｎ２　　を生きた細胞内に負荷させる。次に
細胞質ゾルのエステラーゼが誘導体を分解するため、膜
不浸透性ｑｕｉｎ　２テトラ陰イオンが細胞質ゾル内に
捕捉されて残される。ｑｕｉｎ　２のけい光が細胞質ゾ
ル内の遊離カルシウム濃度の尺度を与える。この濃度は
捕捉された染料をカルシウムの飽和するほどの高レベル
ならびに消失するほどの低レベルに付することによって
得た一定げい光レベルにあてはめることによって計算さ
れる。

ｑｕｉｎ　２は非常に重要な生物学的情報を明らかにし
たが、これは厳しい、一般に認められた限界を有してい
る（参考文献５と７参照）。例えば、ｑｕｉｎ　２の好
ましい励起波長３３９０ｍは紫外線領域に入るので短か
すぎる。ＵＶ照射は監視すべき細胞からの有意な自然け
い光を励起させる。さらに、このようなＵＶ照射は被験
細胞に生物学的副作用を誘発することがある。さらに、
このＵＶ範囲の光線が顕微鏡のレンズをあまり良く通過
しないことも知られている。

ｑｕｉｐ　２に関する第２の問題は、その吸光係数（＜
５０００　）と叶い光量子収量（０，０３〜０．１４）
が水溶液中のダンシル基に匹敵するとしても、低すぎる
という事実である。このような分光学的な性質　　゛は
、細胞の自然げい光を克服するためには１ミリモルのｉ
１０分の１以上のｑｕｉｎ　２負荷が必要であることを
意味する。幾つかのタイプの細胞では、この大きな負荷
が「ｃａ　　Ｊｉ　遷移状態を緩衝する。

ｑｕｉｎ　２に関する第３の問題は、ｑｕｉｎ　２が励
起波長または発光波長をシフトさせるのでなしにＣａ２
＋　のげい光強度を高めることによって、２＋ Ｃａ濃度に関する情報を与えるという事実である。残念
なことに、叶い光強度も光線内の照射強度、発光回収効
率、染料濃度及び有効細胞厚さのような、量的に充分に
限定できな−いかまたは変化しやすい変数に依存する。

従って、カルシウムに反応して強いげい光を維持したま
ま波長をシフトさせるような、指示薬染料を得ることが
望ましいと考えられる。この場合には、適当に選択した
２１′つの波長のけい光の比が、装置の効率と有効染料
量によって生じうる可変性の殆んどまたは全てを排除し
て、カルシウム量を特徴づけることになる。

ｑｕｉｎ　２に関する第４の問題は、ｑｕｉｎ　２がマ
イクロモルレベルではカルシウムを測定できないという
事実である。Ｃａ　　に対するｑｕｉｎ　２の有効な親
和性が高いことは（Ｃａ　　）ｉ　の典型的な静止値す
なわち１０　　Ｍ近くかまたはそれ以下の濃度を測定す
るには理想的であるが、カルシウムのマイクロモル濃度
以上では、残念なことにｑｕｉｎ２は飽和に近づくため
、けい光強度のこれ以上の変化は小さくなる。この結果
、このような上昇したレイルのカルシウムを定量するた
めには親和性の弱い染料が必要になる。

最後に、マグネシウム及び２価の重金属陽イオンに比べ
てカルシウムを選ぶという選択性についてもｑｕｉｎ２
は改良の余地があると考えられる。

ｑｕｉｎ２　　は解離定数１〜２ｍＭでＭｇ　　を結合
する。Ｍｇ　　は３３９　ａｍで励起したｑｕｉｎ２の
叶い尤に殆んど影響しないが、〔Ｍｇ　〕１の変化はＣ
ａ２＋に対する有効親和性及びげい光シグナルに対する
校正スケールに影響すると考えられる。異常に高レベル
の置換可能重金属を含む細胞も、重金属がｑｕｉｎ　２
の叶い光を消失させるので、誤った低い（Ｃａ　　）１
読取り値を与えることになる（参考文献８参照）。逆に
、染料負荷は（Ｍｇ　　）ｉを変動させるかまたは細胞
の機能に重要な重金属をキレート化させるおそれもある
。

このように、カルシウムイオンに対して特異的な新規な
りラスのけい光指示薬染料が必要とされている。このよ
うな染料は水溶液、特に生物学的液体中のカルシウム濃
度の測定及びさらに詳しくは、生活細胞内のカルシウム
濃度の測定のために必要である。絶対的なスケールでの
カルシウム濃度の測定を可能にするために１新規なけい
光指示薬代合物はＣａ　　結合に基づいて波長シフトを
表さなければならない。この新規な化合物は公知のＣａ
％異性指示薬ｑｕｉｎ２　　の使用に伴う特殊な問題の
幾つかも克服すべきである。さらに詳しくは、ｑｕｉｎ
２に比べて、新規な化合物は非常に強力な叶い光を示す
とともｉＣ，Ｃａ　　　に対する幾らか弱い親和性なら
びにマグネシウム及び重金属に対する良好な選択性を示
さなければならない。

新規なりラスのカルシウム特異性げい光指示薬を提供す
ることが本発明の１つの目的である。

水溶液中のカルシウム濃度を測定し得るような、新規な
りラスのカルシウム特異性けい光指示薬代合物を提供す
ることが本発明の他の目的である。

生物学的液体中のカルシウム濃度を測定し得るような、
新規なりラスのカルシウム特異性けい光指示薬代合物を
提供することが本発明の他の目的である。

生活細胞内のカルシウム濃度を測定し得るような、新規
なりラスのカルシウム特異性げい光指示薬代合物を提供
することが本発明の他の目的である。

Ｃａ　　結合状態及びＣａ　　非結合状態の両方で強い
けい光を示すような、新規なりラスのカルシウム特異性
けい光指示薬代合物を提供することが本発明の他の目的
である。

２＋ Ｃａ　　結合に基づいて波長シフトを示すような、新規
なりラスのカルシウム特異性叶い光指示薬代合物を提供
することが本発明の他の目的である。

マイクロモルレベルのカルシウムを測定し得るような、
カルシウム特異性けい光指示薬代合物を提供することが
本発明の他の目的である。

マグネシウム及び重金属に対する良好な選択性を示すよ
うな、カルシウム特異性指示薬化合物を提供することが
本発明の他の目的である。

α−アシルオキシアルキル令プロミド合成の改良方法を
提供することが、本発明のさらに他の目的である。

α−アセトオキシメチル・プロミド合成の改良方法を提
供することが、本発明のさらに他の目的である。

合成されたプロミドがビス（１−ブロモアルキル）エー
テルによって汚染されていないα−アシルオキシアルキ
ル・プロミド合成の改良方法を提供することが、本発明
のさらに他の目的である。

本発明のこの他の目的は、添付図面に関連しながら行う
次の説明から、当業者に明らかＫなると思われる。

図１はｓｔｉ／−１、ａｔｉノー２及び釦ｄｏ−１に導
く合成経路を示す。図面に用いたローマ数字は、下記の
合成方法の項で説明する合成内容に合わせたものである
。

図２はｆｕｒａ−１、ｆｕｒａ−２及びｆｕｒａ−３に
導く合成経路を示す。図面に用いたローマ数字は、この
場合も、下記の合成方法の項で説明する合成内容に合わ
せたものである。

図３は、（１ｍＭから）１０μＭまでの範囲の遊離Ｃａ
　　値を含む緩衝液内の１μＭ　ｆｕｒａ−２の２０℃
における励起スペクトル系列を示す。励起帯幅は１．９
ｄｍであり、発光は５１０　ｎｍにおいて４．５ｍｍの
帯幅で集められ、スペクトルはローダミンＢ量子計測器
を用いて励起ランプとモノクロメータの特性に関して自
動的に補正された。

１００ｍＭ　ＭＣＩ、　１０ｍＭ　ＫＭＯＰＳ　、　１
０ｍＭＫ２Ｈ２ＥＧＴＡと１μＭ　ｆｕｒａ−２から成
る５ｄから出発して％　ｐＨを７．２０に調節し、スペ
クトルを記録し、次にこの溶液の０．５ｄを捨て、１０
０ｍＭＫＣｌ、　１０　ｍＭ　ＫＭＯＰＳ　、　１０　
ｍＭ　Ｋ２ＣａＦｉＧＴＡとｌμＭｆｕｒａ−２から成
る０、　５　ｔｘｔを補充し、ｐｇを７、２０に再調節
し、スペクトルを９　ｍＭ　Ｋ２Ｈ２ＥＧＴＡと１　ｍ
　Ｍ　Ｋ２　ＣａＥＧＴＡの中で記録することによって
滴定を行った。次に、５．０１　（１１−ｏ）ＩＩ１，
１！を捨て、等量の１０　ｍＭ　ＫｚＣａＥＧＴＡ−１
μＭ　ｆｕｒａ−２ストツク液を補充することによって
、　ｎ　ｍＭ　ＣａＥＧＴＡ。

（１０−ｎ）ｍＭＥＧＴＡｌｃ達するまでくり返ｆ、（
但し、ｎ＝２〜１０）。Ｋｌ”１０に達して１０〜１０
　　Ｍの遊離Ｃａ　　か生じた後に、１　ｍＭ　ＣａＣ
ｌ２を添加してもスペクトルに対する影響はもはやなか
った。Ｃａ　　選択性電極で測定して電位差終点に達す
るまでに２Ｈ２ＥＧＴＡをＣａ　Ｃ１２によって滴定す
ることによって、　Ｋ２　ＣａＥＧＴ　Ａ　　溶液中の
ＣａとＥＧＴＡの含量が確実に等しいようにした。ＥＧ
ＴＡはブルカ・ケミカル社の「ｐｕｒｉｓｓＪ等級であ
った。

図４は、遊離Ｃα　の関数としての１ｎｄｏ−１の発光
スペクトルを示す。１１５　ｍＭ　ＫＣＩ、　　２０ｍ
ＭＮａＣ１，ｌｏｍＭＭＯＰｓ、Ｌ１１５ｍＭＭｇＣＡ
！２，１．１１５ｍＭ　Ｋ２Ｈ２ＥＧＴＡから成る液中
の６μＭの染料を、ｐＨ７，０５０±０．００４に達す
るまでＫＯＨを加えて３７℃において滴定し、この溶液
にに２　ＣａＥＧＴ　Ａの小アリコートをマイクロメー
タの注入器から加えて、図中の各曲線に付した。Ｍの単
位の値（特に指定しない限り）にまで遊離Ｃａ　　を高
めた。励起は３５５　ｎｍで生じ、励起と発光の両方を
５　ｏｎの帯幅になるように設定した。これらのスペク
トルはパーキン・エルマーＭＰＩ’−４４の発光感度特
性に関して補正しなかった。特に４６５　ａｍにおける
ノツチは機器の人為結果である。補正した発光スペクト
ルは、励起が３５５〜３５６　ａｍで生じた場合に高Ｃ
ａ４０４Ωｍピークに非常に似た振幅の低Ｃａ４８ｎｍ
ピークを示す。

図５は、同じセットの条件下、すなわち１３０ｍＭ　Ｋ
ＣＩ　、　１０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、　　１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、　　ｐＨ７，２０になるようにＫＯＨを添加、２
０℃の条件下での１　ｍＭ遊＃ＩＣａ　　を生ずるため
の２ｍλ（Ｃａ　Ｃ１２添加の前後の１μＭ　ｆｕｒａ
−２及び３０μＭｑｕｉｎ−２の励起スペクトルを示す
。発光は５００ａｍにおいて、４．６ｄｍの帯幅で回収
され、励起帯幅は０．９３ｎｍであった。Ｑｕｉｏ２　
　遊離酸はランカスター・シンセシス社（イングランド
９、モーキャンプ）から入手した。

図６はｆｕｒａ　−２に対するＭｇ　　の影響を示す。

３２　ｍＭ　ＭＣＩ　、　　１　ｍＭ　ＥＧＴＡと１０
　ｍＭ　ＭＯＰＳから成り、ＫＯＨによってｐＨ７，１
８に調節し、２０℃に温度調節した溶液２−５ｄ中で２
μＭ　ｆｕｒａ−２の励起スペクトルを記録した。次に
、この溶液２５μｌを捨て、代りに２μＭ　ｆｕｒａ−
２，１０４，８ｍ　Ｍ　Ｍｇ　Ｃ１ｚ、５．８　ｍＭ　
ＩＧＴＡとＩ　ＯｍＭ　ＭＯＰＳから成り、ＫＯＨでｐ
Ｈ７，１８に調節した溶液２５μｌを補充した。両スト
ック液は１ｍＭ遊離ＥＧＴＡを有するが後者は１００ｍ
Ｍ遊離Ｍｇを有するので９９二１　ｖ　／　ｖの組合わ
せはＬ　ＯｍＭ遊離Ｍｇ２＋を住することになる。さら
に、この混合物から２５．２５，７６．５３，１３１．
６及び２７７８μｌを連続的に捨て、吟量の高Ｍｇスト
ック液をそれぞれ補充することによって、この操作をく
り返して２，５゜１０及び２０　ｍＭ遊離Ｍｇ　　を得
た。発光は５１０１０ｍにおいてｓ４．６ｍｍ帯域で回
収され、励起は９．９ｏｍ帯域であった。

図７は、０，２００ｎＭ及び１ｍＭ遊離Ｃａ”における
ｆｕｒａ−２に対する６、　７５〜７．０５の範囲での
ｐＨ変化の影響を示す。１３５ｍ１ｖｌＫＣ！、５ｍＭ
　ＭＯＰＳと２　ｍＭ　ＥＧＴＡから成り、ＫＯＨでｐ
Ｈ７，０５に調節した、３７℃の溶液中で０．５μＭｆ
ｕｒａ−２の励起スペクトルを記録した。ＨＣｌでｐＨ
６，７５に酸化した後、０．３７９　ｍＭ　Ｃａ　ＣＡ
！　２を添加し、ＫＯＨでｐＨ６，７５に調節した後：
さらに０．６５５　ｍＭ　Ｃａ　Ｃ１２を添加し、ＫＯ
ＨでｐＨ７，０５に調節した後；２ｒｎＭＣａＣ１２を
添加し、ＫＯＨでｐＨ６，７５に調節した後；及びＫＯ
ＨでｐＨ７０５に調節した後に連続スペクトルを記録し
た。

添加量を記録し、図示したスペクトルは若干の希釈効果
を補償するように調節した。発光は５０５ｎｍにおいて
、ｌ＆５ｎｍ帯域で回収され、励起帯域は４．６ｎｍで
あった。２００　ｎＭ遊離Ｃａによる曲線を含めること
は重要である。この場合には、おそら（右側環のアミノ
基の窒素に重要なプロトン化が生じ、零〇ａ　　または
極度に高いＣａ”のいずれの場合にもけい光に影響する
ことなく、２＋ Ｃａ　　結合を有意に抑制すると考えられるからである
。２００ｏＭＣａ　　において、ｐＨ６，７５曲線がｐ
Ｈ７，０５曲線よりも「零Ｃａ１曲線に接近していると
いう観察は、　Ｃａ　　結合のこのようなＨ＋抑制が軽
度に生ずるがその影響は明らかに小さく、一部はＣａ　
　を含まない染料に対するｐａの直接影響が小さいこと
によって中和されることを示唆する。

ここで用いる用語の定義 ここで用いるかぎり、（Ｃａ　　）ｘ　　は細胞内の遊
離カルシウムを意味する。

ここで用いるかぎり、ＥＧＴＡはエチレングリコールビ
ス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ。

ＨｔＨｔ−四酢酸を意味する。

ここで用いるかぎり、Ｂ、ＡＰＴＡはＬ２−ビス（２−
７ミノフエノキシ）エタンＮ、Ｍ、Ｎ／、Ｍ’−四酢酸
を意味し、ＢＡＰＴＡの化学構造式は次式である： ここで用いるかぎり、ＢＡＰＴＡ様とは２個のビス（カ
ルボキシメチル）アミン置換フェニル環の本質的な特徴
を保持し、該環がアミンに対してオルト位置において、
各フェニル環に隣接する原子がＮまたはＯであり、２個
の中心原子がそれぞれＣである４原子架橋を通して結合
しているＢＡＰＴＡの置換体を意味する。この定義によ
って、「ＢＡＰＴＡ様」がｑｕｉｎ−１とｑｕｉｐ−２
に似た化合物を含むことが明らかである。

ここで用いるかぎり、ｑｕｉｎ１は２−（（２−〔ビス
−（カルボキシメチル）アミノコ−５−メチルフェノキ
シ〕′−メチル）−８−（ビス（カルボキシメチル）ア
ーミノ〕−キノリンを意味する。

ここで用いるかぎり、ｑｕｉｎ２は２−ＣＣ２−〔ビス
（カルボキシメチル）アミンシー５−メチルフェノキシ
〕−メチルクー６−メドキシー８−〔ビス（カルボキシ
メチル）アミノコ−キノリンを意味し、ｑｕｉｎ　２の
化合構造式は次式である：ここで用いるかぎり、ＭＯＰ
Ｓは３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸を意味
スる。

ここで用いるかぎり、９ｔｉｌ−１は１−（２−７ミノ
ー５−　Ｃ（２−（４−カルボキシフェニル）−Ｅ−エ
チニル−１〕フエノキシ）　−２−（２’−アミノ−５
′−メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ、Ｎ。

Ｎ／、　Ｎ／−四酢酸を意味する。θｔｉｌ−１の化学
構造式は化合物Ｘとして図１に示す。

ここで用いるかぎり、８ｔｉＡ！−２は１−（２−アミ
ノ−５−ＣＣ２−Ｃ４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノスルホ
ニルフェニル）−Ｅ−エチニル−１）フェノキシ）　−
２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタン
−Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ／、　Ｎ／−四酢酸を意味する。

５ｔｉＡ−２の化学構造式は化合物■とじて図１に示す
。

ここで用いるかぎり、１ｎｄｏ−１は１−〔２−アミノ
−５−（６−カルポキシイント９リルー２〕−フェノキ
シ）　−２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノキシ
）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ／、Ｎ’−四酢酸を意味する。１
ｏｄｏ−１の化学構造式は化合物Ｘ■として図１に示す
。

ここで用いるかぎり、ｆｕｒａ−１は１−（２−（４−
カルボキシフェニル）−６−アミツーベ／シフラン−５
−オキシ）−２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノ
キシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ／、Ｎ／−四酢酸を意味する
。ｆｕｒａ−１の化学構造式は化合物ＸＸ■　として図
２に示す。

ここで用いるかぎり、ｆｕｒａ−２は１−（２−（５′
−カルボキシ−オキサシル−２′−イル）−６−アミノ
ベンゾフラン−５−オキシ）　−２−（２’−アミノ−
５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ。

Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎ／−四酢酸を意味する。ｆｕｒａ−
２Ｆ）化学構造式は化合物ＸＸＸＶとして図２に示す。

ここで用いるかぎり、ｆｕｒａ−３は１−（２−（４−
シアノフェニル）−６−アミノベンゾフラン−５−オキ
シ）−２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノキシ）
エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　−四酢［ヲ意味する。ｆ
ｕｒａ−３の化学構造式は図２に化合物ｘｘｘｎ　　と
して示す。

ここで用いろかぎり、薬剤学的に受容できるエステルと
は製薬工業で用いられている公知の、容易に加水分解可
能なエステル、特にα−アシルオキシアルキルエステル
を意味する。一般的に参考文献３７と３８を参照のこと
。

ここで用いるかぎり、薬剤学的に受容できる無害な塩と
は、対イオンまたはイオンが全てＮａ、Ｋ。

ＮＲ４”（ＲはＨ・、Ｃ□〜Ｃ４アルキルまたはこれら
の混合物を意味する）、ＣａまたはＭｇであるカルボン
酸塩、またはこれらの対イオンの組合わせもしくはこれ
らの対イオンのカルボン酸塩の組合わせプラス遊離酸基
を意味する。

ここで用いるかぎり、μＭとはマイクロモルを意味する
。

ここで用いる温度は全て℃で表される温度である。

ここで用いるかぎり、「染料」と「指示薬」は交換可能
な意味に用いるものである。

図１と２に示す化合物の化学式はローマ数字によって認
識される。これらのローマ数字は明細書を通して（特に
、下記の合成方法の項参照）図に示した化合物に相当す
る化合物を認識するために用いられる。

ここで開示する新規な染料は数字の１と小文字のエルを
区別するために、例えば１わｄｏ−１，ｆｕｒａ−１、
ｆｕｒａ−２，ａｔｉｌ−１，ｇｔｉ６−２等のように
、ハイフンをつげて名づけることにする。

参考文献リスト ここに挙げる科学刊行物は特に参考文献として関係する
ものである。

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）、ジビルジリオ、エフ、　（ａｉＶｌｒｇｔｎｏ、ｆ
’、）、　ライエン。

チーに、ｒ）イ、　（Ｔｇｉｅｎ、Ｒ，Ｙ、）とポザン
。

ティー、　（Ｐｏｚｚａｎ、Ｔ・）、ジェイ・パイオー
ル・ケＡ　、　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、）　　に発
表するために提出中の論文 （９）　　リツベルト、イー、　（Ｌｉｐｐｅｒｔ、Ｅ
、）、ネジニレ。

ダプリュ＊　（Ｎａｅｇａ　１　ｅ　Ｔ　Ｗ　−）　＃
　　セイボルドープランケンシュタイン、アイ、　（Ｓ
ｅｉ’ｂＯ１ｄ　−Ｂｌａｏｋｅｏ日ｔｅｉｎ　、工、
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ａｌｌ）　、　ａンドン ａｌ）　　−ｒルｆｓｐ、　　ｘ−、イー　、　（Ｍａ
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フ。

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であるへ配位結合基を有するテトラカルボキシレート２
＋ Ｃａ　　　キレート化合物とスチルベン型光叶い先回を
結合した、新規なりラスのカルシウム特異性げい光指示
薬染料に関する。

第一形態で、この新規な染料は単独の叶い光染料に結合
したＢＡＰＴＡ様Ｃａ　　キレート化剤から成る。この
形態で、この新規な染料は次の一般式：〔式中、 Ｒは−Ｈ、−ＣＨ３，−Ｆ’　、　−ＩＪ及び−Ｂｒか
ら成る群から選択する； Ｒは−Ｈ、−ＣＨ３，−Ｆ　、　−ＣＩ　、　−Ｂｒ及
びｃ。−ｃ４アルコキシから成る群から選択する； ＲまたはＲ−は互いに関係な（Ｈ，または−Ｃｏ□Ｈ，
−Ｃｏ□Ｒ’　、　−ＣＯＮＲ５Ｒ’　　−３ｏ　Ｈｓ
　　　　　　３９ 一３ｏ２ＮＲ５Ｒ’　、−８ｏ２ＣＦ３．−ＣＯＣＨ３
及ヒ−ＣＮから成る群から選択された極性電子求引性官
能基であるか、または Ｒ３ｔ　？、：ハＲ３ａカー緒にナラＣ−（Ｃｏ）ＮＲ
５（ＣＯ）−である； Ｒはα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受容で
きるエステル化基である； ＲとＲは互いに関係な（−Ｈ，メチルまたはエチルであ
る： ２はトランスエチレン結合を通して、１つの２−アミノ
フェノキシ環の５位置に結合した芳香族またはへテロ芳
香族系であり、該エチレン結合自体が芳香族またはへテ
ロ芳香族環系の一部であってよく； ＷはＨであり、ＸもＨであるか；またはＷとＸは一緒に
なってＯまたはＮＲである；Ｙは五であり、Ｙ′もＨで
あるか（Ａ′ｂ″−ＮＲ。

０またはＳでないかぎり）；または ＹとＹ′は一緒になってＮＲであり、ＡがＣである； ＡとＡ′は互いに関係なくＣ，Ｎ、ＯまたはＳである； Ｄは０１Ｎ１ＷＢまたはＮアルキルである；ＱはＤがＮ
である場合には二重結合であり、他の場合は単結合であ
る：ならびに ＲはＨであり、ＲもＨである；または ＲとＲが、ヘテロ原・子Ｄ％Ｒに隣接する炭素及びＲＫ
隣接するフェニル環と共にキノリン環系（Ｄ、、Ｎ、Ｑ
−二重結合）を形成する〕 で表されるビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、
Ｎ、Ｎ’、Ｎ′−四酢酸ならびにその薬剤学的に受容で
きる非毒性塩及びエステルから成る。

第二形態では、この新規な染料は一対のげい光染料に結
合したＢＡＰＴＡ様のＣａ　　　キレート化剤から成る
。この形態で、新規な染料は次の一般式：〔式中、 ＲとＲは互いに関係なくＨｌまたは一〇０２Ｈ。

−Ｃｏ２Ｒ’　、　−ＣＯＮＲ５Ｒ６，−８ｏ３Ｈ、−
８ｏ２Ｒ５Ｒ’。

−８ｏ　ＯＦ”　、　−ｃｏｃａ３及び−〇Ｎから成る
群から選択した極性電子求引性官能基である、または ＲとＲは−緒になって−（Ｃｏ）ＮＲ（Ｃｏ）−である
； Ｒ４はα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受容
できるエステル化基である； ＲとＲは互いに関係なく−Ｈ，メチルまたはエチルであ
る； Ｚは、トランスエチレン結合を通して１つの２−アミノ
フェノキシ環の５−位置に結合した芳香族またはへテロ
芳香族系であり、該エチレン結合自体が芳香族またはへ
テロ芳香族環系の一部であってよく； ＷはＨであり、ＸもＨである；または ＷとＸが一緒になって０またはＮＲである：ＹはＨであ
り、Ｙ′もＨである（Ａが皿、ＯまたはＳでないかぎＦ
））；または ＹとＹ′は一緒になってＮＲであり、ＡはＣである： ＡとＡ′は互いに関係なくＣ，Ｎ、ＯまたはＳである； ＤはＯ，Ｎ％ＮＨまたはＮアルキルである；ＱはＤがＮ
である場合には二重結合であり、他の場合には単結合で
ある：ならびに ＲはＨであり、ＲもＨである、または ＲとＲは、ヘテロ原子り、Ｒに隣接する炭素及びＲに隣
接するフェニル環と共に、キノリン環系を形成する（Ｄ
＝Ｎ、Ｑ−二重結合）〕 で表される化合物ならびにその薬剤学的に受容できる非
毒性塩及びエステルから成る。

第−及び第二形態の両方における好ましい指示薬は、ス
チルインのエチレン結合をトランス配位に限定し、疎水
性を減するペテロ環架橋を含む。

さらに、本発明はα−アシルオキシアルキルブロミド、
特にここで開示し特許を諸求する新規な指示薬のクラス
に含まれるアセトキシメチルエステルの製造に有用なア
セトキシメチルプロミドの改良合成方法を含む。α−ア
シルオキシアルキル・プロミドは製薬工業におい【前駆
薬の製造に有用である（参考文献３８と３９参照）。こ
の改良方法は約０．１〜０．２当量のルイス酸の存在下
で反応が完成するまで撹拌しながら、反応器内で約１当
量の１，１−ジアシルオキシアルカンと約１〜１．５当
量のトリメチルシリルプロミドを反応させ、このように
して製造されたα−アシルオキシアルキルブーワミドを
回収することから成る。

公知の方法で製造されたα−アシルオキシアルキルはビ
ス（１−７’ロモアルキル）エーテルによって汚染され
ている。本発明の改良された方法によって製造されたα
−アシルオキシアルキルブロミドはビス（１−ブロモア
ルキル）エーテルによる汚染を含まない。また、この新
規な方法は、公　　　　知の方法によって製造すること
が非常に困難又は不可能であるだろう特定なα−アシル
オキシアルキルブロミドを製造することが可能である。

公知な方法は、吸水性で、不安定で、重合しやすい純粋
な無水アルデヒドを必要とするからである。

発明の構成 本発明は、スチルベン型光叶い元口を８配位テストカル
ボキシレートＣａ　　キレート化化合物、ＢＡＰＴＡの
同族体と結合させる新規なりラスのカルシウム特異性叶
い光指示薬染料に関する。第１形態では、この新しい染
料は単独゛の螢光染料に結合したＢＡＰＴＡ同族体から
成る；第２形態では、ＢＡ　ＰＴ　Ａ同族体が１対の螢
光染料に結合している。　　　　　、。

第１及び第２形態の両方で好ましい化合物は、スチルベ
ンのエチレン結合をトランス配置に限定するヘテロ環橋
を含む。

ここで開示した新規な指示薬染料は、ＢＡＰＴＡ様親化
合物の少なくとも１個の芳香族環に付着した少なくとも
１個のスチルはン型官能基を共通して有する。このメチ
ルイン型官能基は、トランス二重結合を有する２個の炭
素を通してＢＡＰ’Ｉ’Ａ様の親の芳香族環に結合した
芳香族系又はへテロ芳香族系から成る。典型的な最終化
合物は分子のＢＡＰＴＡ様キレート化部分（例えば、最
大波長−約２５４ａｍ、　　吸光係数−約１６０００）
（参考文献６参照）と発螢光団（例えば、最大波長〉３
００ｎｍ、　　吸光係数’＞ＩＱＯＯＯ）（下記の表１
参照）の両方からのスペクトル寄与を有する。発螢光団
はキレート化剤に電気的に結合しているので、カルシウ
ムが分子に結合している場合、分子のキレート化部分は
発螢光団部分に電子密度をもはや供与せず、最大吸収波
長は減少する。発螢光団とＢＡＰＴＡ様キレート化剤の
間の結合に１列になったわずかに１つのシグマ結合があ
る限り、この電気結合は維持されるだろう。発螢光団と
キレート化部分の間の結合は、錯体ヘテロ環の一部でも
ありえるし、逆に該錯体ヘテロ環は発螢光団の一部又は
キレート化剤の一部でもありえる。

ＢＡＰＴＡ誘導体の陽イオンの親和性は、適当な電子供
与性又は電子求引性基によって増加または減少しうろこ
とは公知である（一般的には参考文献６参照）。例えば
、ＢＡＰＴλの２個の窒素に対してパラの２個の水素を
２個のメチル基で置換するとＣａ　　の結合を０．４対
数単位だけ強化し、臭素による同様な二置換はＣａ　　
結合を１．２対数単位だけ弱める（参考文献６参照）。

１置換はカルシウム親和性に半分の効果をもたらすこと
が発見された（データ示さず）。当業者にとっては、本
化合物の陽イオンの親和性に対する他の置換基の影響が
、ハメット型（Ｈａａｎｅｔｔｙｐｅ　）線形自由エネ
ルギー相互関係によって量的に予想可能であることは公
知である。

染料を特定する特性の最も大きな変化は、特定の染料の
Ｋａの２対数（Ｃａ　　）単位内で生じることも公知で
ある。（参考文献６参照）。従って、このことは種々範
囲のＫａ値を有する染料を得ることが重要と考えられる
。この目的のためにＲ１とＲ２を変化させてＫａを上下
に調節することが可能である。予想通り、分子の染料成
分はＣａ”結合を０−０．３対数単位だけ弱める（表１
のＫａとＢＡＰＴＡＫｄ−１００ｎｍを比較せよ、参考
文献６参照）。

長波長の発螢光団を一個のみ有する化合物の製造におい
て、Ｒ２が水素以外のものであるならば環の５位置はブ
ロックされ、４−Ｗ−ベンゼン環又は等価なキノリン環
の望ましい５位置でのみホルミル化が生ずるであろう。

Ｒが水素であるならば、Ｒにハロゲンがあると求電子置
換に対して環は不活化され、主に望ましい位置でホルミ
ル化が生ずると考えられる。Ｒ−Ｈ及びＲ−Ｈ又はアル
キル基であるとしても、目的の生成物は、制御されたホ
ルミル化及び目的生成物の分離又は適当な３−ヒト１０
キシ−４−ニトロベンズアルデヒｒで合成を始めること
によって製造される（下記の合成方法の項、参照）。

２個の発螢光団を含む化合物を製造するために、Ｒ２は
水素でなければならず、Ｒ１は水素、アル　　　　′キ
ル基、又は置換基Ｗの任意の態様であり得る。

この場合、望ましいホルミル化は、両方のフェニル環の
５位置又はＲ、Ｒフェニルの両方およびキノリン又はイ
ンゾピランの５位置で生ずると考えられる。

分子染料成分はトランススチルベンに基づくが、他の多
（の形態もとりうる。スチルベンのエチレ、ン橋は、架
橋を含むヘテロ環を形成することによってトランス配置
でロックされてもよい。従って、上述の一般式のＹ及び
Ｙ′は一緒になってＮＲのようなヘテロ原子であり得、
染料分子はインドールでありうる。インドールのような
ものの合成は下記の合成方法の項で述べられ、このクラ
スの染料成分が説明されている。（１ｎｄｏ−１参照）
。エチレン橋を分子のキレート化部分のフェニル環にブ
ロックするヘテロ環も形成されうる。従って。

ＷとＸ（上記の一般式参照）が−緒になってＮＲ。

又は０であるならば、インドール又はベンゾフラン誘導
体の分離基が製造され得る。例示のために、このような
ベンゾフランの１つの合成を下記の合成方法の項で述べ
る（化合物ｆｕｒａ−１、ｆｕｒａ−２及びｆｕｒａ−
３参照）。

Ｚ系の本質的な特徴は、その芳香族性と親のキレート化
化合物への結合関係である。一般式で示すように、結合
は上記で述べたよ５Ｋ）ランス−エチレン又はへテロ環
の一部である。例示のために、下記の合成方法の項では
Ｚとしてフェニルまたはオキサゾールの使用を示す化合
物、例えばそれぞれ５ｔｉｘ−ｘまたはｆｕｒａ−２の
化合物、または、ＹとＹ′及びエチビン橋と一緒になっ
た２としてインドールを用いた化合物例えば化合物１ｎ
ｄｏ−１を説明する。

ＺのＲとＲ置換基は、最終分子の芳香族の一般的に疎水
性の染料化合物の親水性を高めるのに役立つ。ＲとＲは
染料の最大吸収または発光波長を若干調節するのにも用
いられる。本発明で開示し、特許を請求する染料には、
ＲとＲが一緒になって−（Ｃｏ）ＮＲ（Ｃｏ）−である
場合に形成される環状イミドを含めて、広範囲なＲとＲ
置換基を用いることができる。カルボキシ、シアノ及び
アミノスルホニルのＲとしての使用は、実施例によって
説明する（それぞれ、ｆｕｒａ−１。

ｆｕｒａ−３及びａｔｉＡ！−２化合物の合成、参照）
。

ここに開示する新規な染料の合成方法は、下記の合成方
法の項で概要を述べる。好ましい形態の１ｎｄｏ−１、
５ｔｉｌ−１、ａｔｉｌ−２、ｆｕｒａ−１、ｆｕｒａ
−２及びｆｕｒａ−３によって例示するような、新規な
染料の特有の性質及び実施態様は下記の実施例Ｉ〜■に
開示して考察する。さらに詳しく説明すると、実施例Ｉ
はＣａ　　の存在下及び不在下での新規な指示薬の吸光
度性状について考察し、実施例■はけい光性状について
考察する。実施例■はＣａ”結合定数について考察する
。スチルベン型染料の光異性化については実施例■で考
察し、陽イオン選択性については実施例Ｖで考察する。

実施例■は膜結合について考察し、実施例■は２波長で
のげい光強度値を用いた染料の校正式について考察する
。

種々な実施例において開示し考察したデータから、げい
光輝度の増加が、ｑｕｉｎ２のようなこれらの直接の先
行技術試薬と比べた場合に、この新規な染料の最も明白
に認められる利点であることがわかる。この新規な染料
は一部は５〜６倍高い吸光係数を有するため、また一部
はそれらの叶い光量子効率が高い（ｑｕｉｎ２００．１
に比べて０．５まで）ために、１０〜３０倍強い叶い光
を有する。

このけい光の増強は、適当なシグナルを与えるために一
定量の細胞に導入する染料が非常に少なくてよいことを
意味する。細胞内部の染料が少なければ少ないほど、測
定すべきカルシウムレイルを有意に緩衝したりまたは他
の点で細胞を混乱させる可能性は少なくなる。この代り
に、輝度が高くなれば、より短い観察時間においてまた
はより小体積の組織からＣａ　　の測定が可能となる。

後者の例は、直径約６ミクロンの単独胸腺細胞の分裂促
進剤レクチンによって誘発された（Ｃａ　　）ｉ上昇の
ｆｕｒａ−２による観察（データ示さず）である。

これはｑｕｉΩ２　によっては不可能であることがわか
っている成果であった（参考文献２８参照）。

新規な染料の非常ｌＣ重要な第二の特徴はＣａ”Ｋよっ
てけい光スイクトルの形状と波長分布が有意に変化する
が、強度は変化しないことである。

この波長シフトによって、２つの波長におけるけい光の
比のみから、染料濃度、光道の長さまたは絶対的な検出
感度を考慮せずに、絶対的なスケールでカルシウム濃度
を測定することが可能になる（実施例■、参照）０本発
明の実施例として、ここに開示した６種類の好ましい染
料（５ｔｉＪ−１。

ａｔｉＪ−２、１ｏｄｏ−１、ｆｕｒａ−１、ｆｕｒａ
−２とｆｕｒａ−３）の全てがそれらの励起スペクトル
にこのような特徴を有している。（６程類の中、　１ｎ
ｄｏ−１はカルシウムを結合すると発光波長に大きな変
化を示すという点で、非常にユニークである）。

ｑｕｉ口２のような既存の染料はカルシウムを結合した
ときに、強度を変えるがピーク波長を変えないので、そ
のシグナルを校正することがかなり困難である。その結
果、このような染料は波長比法によって絶対的スケール
でカルシウム濃度を測定するために、ここに開示する新
規な染料はどには有用ではないことになる。

励起及び発光波長を高め、Ｃａ　　結合を弱めてさらに
高い（Ｃａ　　）ｉ　　レベルの検出を可能にすること
が目的である場合には、残念ながら、新規な染料はｑｕ
ｉｎ２のような既存の染料に比べてごくわずかにすぐれ
ているにすぎない。それにも拘らず、新規な染料の励起
波長が従来の染料に比べてわずかに長いことによっても
（例えば、　ｆｕｒａ−２とｑｕｉｎ−２の比較）、典
型的に３４０と３５０　ｏｎの間で波長が急激に遮断さ
れるガラス光学の従来のげい光顕微鏡によって研究する
ことが非常に容易になる。ｑｕｉｐ　２に比べて大体２
倍高い１ｏｄＯ−１及びｆｕｒａ−２の解離定数が、約
１０　　Ｍ以上の（Ｃａ”）ｉ　　レベルの分解能を改
良するものと期待される。

本発明の新規な染料では、カルボキシ系の基よりも強い
電子求引性基が発色団の末端にある場合の方が波長とＣ
ａ”＋解忌定数の双方は増加する筈である（ｆｕｒａ−
１とｆｕｒａ−２を比較）。しかし、末端カルボキシレ
ートは、長い発色団端部の疎水性結合の抑制手段として
、少なくとも理論的には魅力的である。

新規な染料の吸光係数が大きいことは発色団の長さ及び
より単純な同族体に関するデータから予想された通りで
ある。量子効率が確実に予想できないとしても、固定環
構造を有する拡大した発色団が効果的なげい光発生を助
成することは良く知られている。Ｃａ　　結合時の吸収
及び励起スペクトルの浅色シフトは充分に理解される（
参考文献６参照）　：　Ｃａ”＋はおそらく窒素と環の
間の結合をねじることによって、主要窒素の孤立電子対
を独占する。このために、発色団の孤立電子対と残りの
部分との間の結合は破壊される。励起状態で＆ｔ、Ｃａ
　　が窒素から離れるために、低〔Ｃａ〕と高（Ｃａ　
　）の間で発光スペクトルが殆んど変化しないと考えら
れる。１Ωｄｏ−１が例外的である理由は不明である。

ｑｕｉｎ　２　　のような公知の染料を凌駕する新規な
染料の第五の利点は、例えばＭｇ　　、Ｍｏ　　、Ｚｎ
及びＦｅ　　のような２価陽イオンに対する良好なＣａ
”＋選択性である。ｑｕｉｎ　２に比べたｆｕｒａ−２
の改良はＭｇ　　、Ｍｏ　　及びＺｏ　　に対する゛そ
れぞれ約３倍、１２倍及び４０倍の選択性である。

ｑｕｉｎ２　　を用いる大多数の研究者は、細胞質ゾル
の遊離Ｍｇ　　がリンノ球で測定した場合にｌ　ｍＭで
あると一律に想定している（参考文献７参照）。

実際の遊離（Ｍｇ　　）がそれぞれＯまたは２ｍＭであ
るならば、真の（Ｃａ　　）値はｌ　ｍＭ　Ｉ”Ｍｇ　
　）と想定して算出した場合に比べて０．５または１．
５倍高くなるであろう。これに対して、新規な本発明Ω
染料はＣＭｇ）の不確実性に対して敏感ではない。重金
属によるｑｕｉｎ　２妨害の唯一の明確な例は特定の腫
瘍細胞ラインにおけるものである（参考文献８、参照）
。しかし、新規な染料は重金属親和性が低いために、本
質的な重金属のキレート化による他の発生ならびに有害
性を阻止することになる。これらの染料とｑｕｉｐ　２
は、異なるＣａ２１曲線の全てが互いに交差するような
波長において使用することによって、重金属指示薬とし
ても用いることができる。

新規な染料の２価陽イオン選択性の改良は、不都合な環
窒素を含むキノリン構造を除去したことによると思われ
る（参考文献６参照）。

Ｍｇ結合はＣａ　　結合に比べてスペクトルに影響する
ことが非常に少ないが、これはＭｇ　　が両アミン窒素
に一度に結合するには小さすぎ（参考文献６参照）、前
記の構造の右側の窒素を該窒素が弱電子求引性発色団骨
格と共役していないという理由から、選択する傾向があ
るからであると考えられる。ｆｕｒａ−２とＥＧＴＡの
両方は温度上昇に対して、Ｃａ　　親和性を弱め、Ｍｇ
　　親和性を高めることによって反応する（参考文献１
１．参照）。

このことはこれらのＣａ２＋二Ｍｇ２＋選択性の熱力学
的根拠が同じであることを示唆している。。

本発明の新規な指示薬を例示するために、ここに開示し
た６種類の好ましい染料の中で、ｆｕｒａ−２は最も広
く用いられうる好ましい染料であるが、１ｎｄｏ−１は
流動細胞測定学にとって最も適する染料である。スチル
ベン類は他の染料に比べて若干合成されやすいが、他の
染料はど明るく、げい光を発生しない。さらに、スチル
ベン類は光異性化と光分解の複雑な問題を有しており、
溶解性が不充分であるためにアセトキシメチルエステル
（データ示さす）として負荷することが比較的困難であ
る。ｆｕｒａ−３の若干長い波長がその低い輝度と発色
団の親水性の低さを補償し得るかどうかは検討の余地が
ある。この新規な染料は多くの今まで処理しにくかった
系において（Ｃａ　　）ｉの測定をすでに可能にしてい
る。個々の細胞または組織塊の研究を展望すると、（Ｃ
ａ　　）ｉならびにその遍在的なメツセンジャー機能の
光学測定の範囲と容易さが膨大に拡大することが予想さ
れる。

合成方法 ここに開示する新規な染料の合成方法を以下に述べる： 本発明は新規なりラスのカルシウム特異性のげい光指示
薬染料に関する。これらの新規な染料の好ましい例はａ
ｔｉＪｔ’−１、５ｔｉＪ−２、ｆｕｒａ−１。

ｆｕｒａ−２、ｆｕｒａ−３及び１ｎｄｏ−１である。

図１と２はこれらの化合物の製造に用いた合成経路の概
要を示す。反応条件の完全な説明を以下に述べる。

以下の図面と明細書の記載の両方において、ローマ数字
を用いて種々な化学化合物を区別する。

ここで特許を請求する化合物の合成は、下記の５ｔｉＡ
！−１（化合物Ｘ）、ａｔｉｌ−２（化合物ＸＩＴＩ）
、１ｏｄｏ−１（化合物ＸＸＩＩ）、ｆｕｒａ−１（化
合物ＸＸＫ）、ｆｕｒａ−２（化合物ＸＸＸ［）、ｆｕ
ｒａ−３（化合物ＸＸＸＶ）及び５−ホルミル−ｑｕｉ
ｎ−１、エチルエステルの詳細な合成のところで説明す
る。当業者は、これらの染料の新しい形態が関連する合
成方法及び出発物質を用いて製造可能であることを理解
できるであろう。

このために、１個の発げい元図を含む化合物の合成の重
要な中間体が化合物）ａまたは、化合物■とＸＸ■を含
めたその同族体として下記に示すアルデヒドであること
を指摘する（図１と２参照；以下の考察も参照）： Ｒ’　−ＭｅまたはＥｔ ホルミル化段階中に　Ｒ２ラジカルとしてのメチル、ハ
ロゲンまたはアルコキシ基の存在はその位置における求
電子置換を阻止し、Ｒ１−Ｒ２−フェニル環のホルミル
化を限定する。Ｒが水素であるとしても、Ｒ位置のハロ
ゲンは化合物■ａの右手ベンゼン環を求電子置換に対し
て不活化するので、この環にはホルミル化は殆んどまた
は全（生じない。Ｒのメチル基はＲ位置のホルミル化を
わずかに促進させるが、二ＭＫホルミル化された不純物
は容易に除去される。

ＲがＨであり、Ｗが０またはＮＲ前駆体である場合には
、これらのＷ基が求電子置換を促進させる能力はＷに対
してオルトの５位置で直接的にホルミル化を行わせるの
に充分である。８−アミノキノリン系はフェニル系より
もはるかに容易にホルミル化されるので、特許を請求す
るＲ　とＲの組合わせはキノリンまたはベンゾピラン系
を含む化合物の容易なホルミル化を妨げない。

ＲとＷが両方ともＨであり、ＲとＲが閉じた環の一部で
ない場合には、Ｒ＝、Ｈである５−ホルミル化合物（ａ
を一定量のヴイルスマイヤー（Ｖｉｌｓｍｅｉθｒ）試
薬によってホルミル化し、生成物を未反応出発物質と二
重ホルミル化生成物から分離することによって、製造す
ることができる。また、同じ５−ホルミル化合物の製造
は、化合物■の代りに３−ヒドロキシ−４−ニトロベン
ズアルデヒドのアセタール、化合ウニの代りに２−ニト
ロ−４−Ｒ１−５−Ｒ２−フェノキシトを用い、化合物
■の製造に対して下記に説明するような工程（Ｌ２−ジ
ブロモ−エタンとの縮合、還元、及びアルキルブロモア
セテートによるアルキル化）に従って、行なうこともで
きる。この化合物■の同族体を緩和な酸加水分解に付す
ことによって、ア　　　　　　トルデヒト９が生じ、モ
ノアルデヒドｉａになる。

Ｗ＝Ｈ，Ｄ＝Ｏ，Ｒ＝Ｒ＝Ｈ及び種々なＲとＲの置換基
を有するアルデヒｒ（下記の構造式（ｂ。

参照）の製造は、適当に置換した２個の２−二トロフェ
ノールを出発物質とすることに基づいている。各ニトロ
フェノールのカリウム塩を製造し、次に１当量のＬ２−
：）プロモーエタンと縮合させる。ニトロ基の還元、ア
ルキルブロモアセテートによる処理、及びヴイルスマイ
ヤーホルミル化によって、化合物■ｂとして説明される
重要なアルデヒド９が得られる。当業者は下記に説明す
る化合物■の合成を容易に変更して、このような化合物
を製造することができる。

Ｒ′■ＭｅまたはＩｔ ＷがＯＨであるサリチルアルデヒｒの誘導体であるアル
デヒ）”Ｉｂは、ｐ−ヒドロキノンから８段階で合成さ
れる。サリチルアルデヒド９の製造の重要な段階は、ニ
トロ基に対してメタ位のフェノール基より先に、ニトロ
基に対してオルト位のフェノール基の酸触媒による選択
的脱ベンジル化（参考文献２０参照）を起すことを含む
。生成する２−ニトロ−４−ベンジルオキシフェノール
は次に、重要なアルデヒドＩｂの製造の上述の方法に出
発物質として用いることができる。化合物ＸＸ■をベン
ジルオキシｒのヒト９０オキシド転位によって化合物Ｘ
ＸＶ　Ｋ転化させる試みは成功しなかった。残留するベ
ンジル保獲基は白金触媒による水素化（参考文献２１、
参照）及びヴイルスマイヤーホルミル化にも耐えるが、
パラジウムによる水素化によって最終的に除去される。

４−ベンジルオキシ置換基は隣接５−位置のホルミル化
速度を促進させるから　Ｒ１とＲ２の如何なる選択も七
ノホルミル化に干渉しないと考えられる。

Ｗ−皿’Ｈ（Ｒ’−Ｈ，メチルまたはエチル）であるア
ルデヒドＩｂの製造は、４−（Ｒ−ア夷））フェノール
をベンジルオキシカルボニルによって保護することから
開始される。ニトロ化、ニトロソ化または適当なジアゾ
ニウム塩との結合によって、下記の化合物ＸＭの置換フ
ェノール同族体が得られる。このようなフェノールは１
−ブロモー２−（２−ニトロ−４−Ｒ−５−Ｒ−フェノ
キシ）エタンと縮合させてから、還元することができる
（Ｈ２／白金）。これによって、ニトロ、ニトロンまた
はジアゾニウム塩基のいずれも還元され、ベンジルオキ
シカルボニル基に影響することなく、ＮＨ２になる。ア
ルキルブロモアセテートによるアルキル化及びホルミル
化の後に、炭素上のパラジウムによる水素化によってベ
ンジルオキシカルボニル基を除去して、Ｗ−ＮＲ’Ｈを
有するアルデヒドＩｔ）を得る。

ＲとＲがキノリン環の一部であるアルデヒドｉａの直接
前駆物質の製造は、参考文献６に述べられている。例え
ば、２−メチル−６−Ｗ−８−二トロキノリンから出発
して、２−メチル基をヨードメチルにヨウ素化し、次に
カリウム２−ニトロ−４−Ｒ−５−Ｒ−ニトロフェノキ
シト１と縮合させ、還元しくＨ２／白金）、メチルまた
はエチルプロそアセテートによってアルキル化する（参
考文献６、参照）。次にこの化合物をホルミル化して、
アルデヒド工Ｃを得ることができる。

Ｒ”ｍ　ＭｅまたはＩｔ この合成は、５−ホルミル−ｑｕ１Ω−１，エチルエス
テル（ｉｃ、Ｗ冒Ｈ，Ｒ曽Ｈ，Ｒ■ＣＨ３）の製造によ
って下記で説明する。当業者はこれらのヒントを利用し
て種々な基のＲ，Ｒ，Ｒ及びＲを含む化合物を合成でき
ろであろう。

Ｒ７とＲ８がキノリンまたはベンゾピラン環の一部であ
り、Ｗ、、ＯＨであるアルデヒド１．の製造は、例えば
２−メチル−６−メドキシー８−ニトロキノタンから開
始される。メトキシ基をＢＢｒ　３または熱Ｈ工によっ
て開裂することによって、６−ヒドロキシ基が得られる
。次にこの基を酸触媒下でのジメトキシメタンとの反応
によって保護することによって、２−メチル−６−メド
キシメチルオキシー８−ニトロキノリンが得られる。こ
れをアルデヒ）（Ｌ　■ｃの上述の合成法の出発物質と
して用いて、Ｗ　ＩＩ＠　ＯＣＨ，ＯＣＨ３の化合物Ｉ
Ｃを得ることができる。この化合物の緩和な酸加水分解
によって、Ｗ、、Ｏｎのアルデヒドｉｃが得られる。

ＲとＲかキノリンまたはベンゾピラン環の一部であり、
Ｗ−ＮＲであるアルデヒ）＃　ｉ　ａは、例えば２−メ
チル−６−（Ｒ−アミノ）キノリンから、アミンをベン
ジルオキシカルボニルとして保護し、ニトロ化もしくは
ニトロソ化し、またはジアゾニウム塩とカップリングさ
せ、次にヨウ素化し、２−ニトロ−４−Ｒ−５−Ｒ−ニ
トロフェノキシト９と縮合させ、還元し、アルキルブロ
モアセテートによってアルキル化することによって製造
することができる（参考文献６、参照）。このような化
合物を炭素担体付きパラジウムで水素化すると、Ｗ−Ｎ
Ｒのアルデヒドが得られる。

２個の発げい光間を含む化合物の合成における重要な中
間体は、化合物Ｈａとして下記に示すジアルデヒ−また
はその同族体である。

Ｒ’−ＭｅまたはＥｔ ５−置換基を有さす、４−置換基として水素、アルキル
またはベンジルオキシを含む一種類または二種類の２−
二トロフェノールを用いて、アルデヒドＩｂについて述
べた合成法に従うことＫよって、“ヴイルスマイヤーホ
ルミル化段階がジアルデヒド■４をもたらす。次にこの
ジアルデヒドを化合物ｉａ　Ｋ関して用いたウイツチヒ
試薬のいずれかと縮合させて、２つの長波長発叶い光間
を含有する最終化合物を得る。ＲとＲかキノリン環系の
一部であり、Ｒ＝Ｈ，Ｒ−Ｈ，アルキルまたはベンジル
オキシであるジアルデヒドＨａを製造するためには、ヘ
テロ環が容易にホルミル化するので、フェニル環ホルミ
ル化に適したヴイルスマイヤーホルミル化条件によって
、目的のジアルデヒド９が得られる。

適当なアルデヒドＩａまたはＨａから出発して、このア
ルデヒドを例えばＲ３−Ｒ３ａ　−ｚ−メチル−トリフ
ェニルホスホランのような、Ｒ３とＲ３＆置換芳香族基
Ｚから成るウイツチヒ試薬と縮合させることによって、
Ｗ−Ｈの化合物の合成が進行する。

例を挙げると、（４−エトキシカルボニル）メチル−）
　ＩＪフェニルホスホニウムプロミド■をアルデヒド■
と縮合させると、究極的に化合物５ｔｉｌ−ｘ（■）が
得られる。（図１と以下の化合物■、■及びＸの合成を
参照）。これに関連する例として（４−Ｎ、Ｎ−）ｌｆ
ルアミノスルホニルフェニル）メチルトリフェニルホス
ホニウムズロミｒ％Ｍ。

をアルデヒＰ■と縮合させると、究極的に化合物ａ　ｔ
　ｉ　ｌ　−２０ＧＩ）が得られる。（図１及び以下の
化合物Ｘ１■及び刈の合成参照）。

これと同様に、分子（Ｙ’　−Ｙ−ＮＲ）の染料部分の
残基にエチレンを結合させることによって、トランス配
置でエチレン橋をロックするようにヘテロ環を含む化合
物も得られる。例として、１ｎｉｏ−１、Ｘ■の合成を
下記に述べる。選択したアルデヒドをオルト−ニトロ基
含有のウイツチヒ試薬と縮合させ、次に亜リン酸トリエ
チルによって還元すると、ニトレン（ｎｉｔｒｅｎｅ）
が得られる、これは直ちに環化してインドールになる（
参考文献１９、参照）。

エチレン橋を分子のキレート化部分に結合させることに
よって、エチレン橋をトランス配置でロックする化合物
を製造することもできる。例として、ＷとＸが一緒にな
って酸素であるベンゾフラン誘導体の製造を、ｆｕｒａ
−１（ＸＸＤＣ）、　ｆｕｒａ−２（ＸＸＸＩＩ）及び
ｆｕｒａ−３（ＸＸＸＶ）の合成として、下記で説明す
る。Ｗ＝ＯＨのアルデヒドから出発して、フェノールの
ヒト１０キシルを電気陰性的に置換したアリールメチル
基によってエーテルに再転化させる；この基は最終生成
物のＺになる。次Ｋ　　　　　　　″′塩基触媒による
クネベナゲル反応がペンゾフラン環を完成する。この縮
合のためには、アルミナ担体上のフッ化カリウムが特に
良好な触媒である（参考文献２２、参照）。この理由は
この塩基が他の塩基に比べて、エステル基の存在に作用
する傾向が小さいからであると考えられる。

インド−ル環を含む同様な化合物（Ｗ、Ｘ−ＮＲ５）は
Ｗ　−Ｘ　、　ＮＲのアルダｔ：）’）ａまたはＩｄか
ら製造される。このアルデヒドを例えばＸＸ■、ＸＸＸ
　またはｘｘｘｍ化合物のような、適当なハロメチル芳
香族化合物と縮合させる（図２゜参照）。アルミナ担体
上のフッ化カリウムのような塩基によって閉環させると
、ＸＸ■、　ＸＸＸ［及びＸＸＸＷと同様に、目的イン
ド−ルが得られる。

疎水性発けい先回「端部」を親水性にすることが必要で
ある場合には、ＲとＲ基が存在する。

ＲとＲも長波長発色団の叶い光性を幾らか変えるこ考え
られる。当業者は、最終化合物がＲ３及び（または）Ｒ
雪−ＣＯ□Ｈ，−Ｃｏ２Ｒ。

−ＣＯＮＲ５Ｒ’　、　−３ｏ３Ｈ，−３ｏ□ＮＲ５Ｒ
６−８ｏ　ＣＦ＋　　　　　２　３１ −ＣＯＣＨ３，もしくは−ＣＮ、またはＲ及びＲか−緒
になって−（Ｃｏ）ＮＲ（Ｃｏ）−であるように、適当
な前駆置換基を用いて、ウイツチヒ試薬またはＺ基を含
む置換アリールメチル化合物を容易に合成できる。他の
可能なＺ基は、ピリジニウムのような第四窒素を有する
ヘテロ環である。このタイプのＺ”基は、ＲまたはＲ置
換基が発叶い先回のけい光波長を変えるためには有効で
あるか、これらのＲまたはＲによって発叶い先回の疎水
性を低下させる必要はない。Ｒ−Ｃｏ２　Ｈ（ｓ　ｔ　
ｉ　ｌ−１ｉｎｄｏ−１、ｆｕｒａ−１、ｆｕｒａ−２
）　、　−ＣＮ（ｆｕｒａ−３）及び−ｂＯ□ＮＭｅ　
２　（ｓ　ｔ　ｉ　ｌ　−２）　　を含む化合物の合成
を、実例によって下記に示す。

これらの合成において、キレート化剤のアセトキシメチ
ルエステルを製造する方法は従来の方法（参考文献２３
．参照）を変更したものであり、この従来方法は乾燥固
体の遊離酸形キレート化剤の製造及び立体障害塩基のエ
チルジイソプロピルアミン存在下でのアセトキシメチル
プロミドとの反応を必要としている。この方法は単純な
りＡＰＴＡ系列のキレート化剤に対しては受容できる結
果を与えたが、ここに述べる新規な染料のような複雑な
誘導体に適用する場合には、収率及び純度が不定である
ことがわかった。１つの問題は、乾燥固体の遊離酸とし
てのキレート化剤の単離が、部分的な分解を（おそらく
脱カルボキシルによって）生ずると考えられることが問
題であるように思われた。

さらに、今までアセチルプロミｌ−”とパラホルムアル
デヒドから製造され、殆んど分離不能な副生成物として
の数モルチのビス（ブロモメチル）エーテルによって汚
染されているアセトキシメチルプロミドの純度が有意な
問題であることがわかった（参考文献２４、参照）。こ
のエーテルはアセトキシメチルプロミドよりも迅速にカ
ルボン酸と反応するため、細胞によって加水分解されに
くいエステルが生じることＫなる。多量に過剰な粗／ロ
ミヒを用いるならば、もちろんこのようなエステルの割
合は増大するが、プロミドをスピニンダバンド・カラム
に通して真空蒸留によって部分的に精製するならば、減
少する。しかし、最良の解決は、ビス（ブロモエチル）
エーテルを生じないような代替ルートによってアセトキ
シメチルプロミド９を製造することである。

本発明の以前に、トリメチルシリルプロミド１がエステ
ルを開裂して、遊離酸（ＴＭＳエステル）とエステル化
剤のプロミドにすることが知られていた（参考文献３９
．参照）。しかし、トリメチルシリルプロミドを用いて
、１，１−ビスアシルオキシアルカンを開裂できること
は、本発明まで知られていなかった。我々の問題は、エ
ステル開裂の標準条件を用いてアセトキシメチルプロミ
ドを得ようと試みたときに１密封管に入れて１１０℃で
一晩加熱してもトリメチルシリルプロミドとメチレンジ
アセテートの間に反応が生じなかったことであった。非
常に意外にも、約１０モルチのルイス酸を加えることに
よって、目的の反応が室温において４８時間内に完成す
ることが発見された。

さらに意外であったのは、ジブロモエタンを生じること
になるアセトキシへのプロミドの分子内転位が起らなか
ったことであった。アセトキシメチルブロミドの蒸留後
に、生成物中にビス（ブロモメチル）エーテルの痕跡も
ＮＭＲによって検出されなかった。

これと同様に、トリフルオロアセトキシメチルブロミト
’　ＣＦ　ａＣＯＯＣＨ２Ｂｒがメチレンビス（トリフ
ルオロアセテート）、ＣＦ３ＣＯ０ＣＨ２０ＣＯＣＦ３
から製造され；ベンゾイルオキシメチルプロミド。

Ｃ６Ｈ５ＣＯＯＣＨ２Ｂｒ　　はメチレンジベンゾエー
トＣ６Ｈ３Ｃ○０ＣＨ２０ＣＯＣ６Ｈ５から製造され、
また１−アセトキシ−１−ブロモアセトンは１，１−ジ
アセトキシアセトンから製造された、１，１−ジアセト
キシアセトン自体は１，１−ジクロルアセトンへの酢酸
ナトリウムの作用によって製造された。

１−アセトキシ−１−ブロモアセトンは１−アシルオキ
シアルキルクロリド化合物の標準製造法によっては製造
が非常に困難または不可能であった。これはこの標準ル
ートが純粋な無水ビルブアルデヒ）”　ＣＨ３ＣＯＣＨ
Ｏを製造してアセチルプロミドと反応させることを必要
としたからである。無水ピルブアルデヒドは特に吸湿性
で不安定であり、重合しゃ丁い。１−アシルオキシアル
キルハライドの上記製造は全て、トリメチルシリルプロ
ミドと触媒量の無水塩化亜鉛を用いて室温において一晩
行ったものである。出発物質の１，１−ジエステルが固
体である場合には、塩素化溶媒（ＣＨ２Ｃｌ２゜ＣＨ（
Ｊ　　またはＣ（Ｊ４）％−加えて、均質な反応混合物
を形成した。生成物は沸点、ＮＭＲ及びＩ・ロゲン化物
滴定によって特徴づけた。メチレンジベンゾエートに対
しては種々なルイス酸をテストした。

Ｚｎ（Ｊ　　　ＺｎＩ　　　ＺｒＣｌ４及びＳ　ｎ　Ｃ
ｌ　４は全て有効で２１　　　　２　＊ あることがわかったが、ＡｌＣｌ３はあまり有効ではな
かった。ＢＦ’３Ｅｔ２０とＣｕ　２　Ｂｒ　２は有効
ではなかった。１−アシルオキシアルキルクロリドもこ
の一般方法によって得られるが、やや強度な条件が必要
であり、収率はやや低い。すなわち、ＣＨＣ００ＣＨ０
ＣＯＣＨとＭθ３ＳＩＣｌをＣＣｌ４中でＡＩＣ１３触
媒を用いて、１００℃において（密封管）６０時間反応
させると、３５チ収率でＣ６Ｈ５Ｃ００ＣＨ２Ｃｌが得
られた。

上記方法によって製造したα−アシルオキシアルキルブ
ロミドは本発明のげい光染料のエステルの製造に有用で
ある。例を挙げると、ここに特許を請求する化合物のア
シルオキシメチルエステルは次の方法によって最も良く
製造された二目的キレート化剤（例えば、下記及び図１
と２における化合物に、Ｍ、Ｘ■、ＸＸ■、ＸＸＭまた
はＸＸＸＩＶ　）のメチルまたはエチルエステルをにＯ
Ｈでケン化し、４〜６当量のテトラブチルアンモニウム
塩（好ましくはヒドロキシ）″）を加え、真空下で蒸発
乾固させる。次に残渣を、テトラブチルアンモニウム塩
として染料を溶解するジクロロメタンによって抽出する
。この有機溶液を真空下で完全に乾燥させ、残渣をジク
ロロメタンに加え、約５〜１０当量（染料に対して）の
ア七トキシメチルプロミド（ここに開示する新しい方法
によって製造シタモの、下記のアセチルプロミドの製造
方法参照）と約２当量（染料に対して）エチルジインプ
ロピルアミンと混合し、−晩撹拌した。次に溶媒を蒸発
させ、残渣をベンゼンまたはトルエンに加え、重炭酸塩
水溶液と水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させた。生成物は
使用に対して充分に純粋であったが、必要に応じて、シ
リカゲル上で再度精製することも可能であった。

化合物の合成 この合成に使用される試薬および溶媒はほとんど、ＡＣ
８またはＨＰＬＣグレービであって、アルドリッチ（Ａ
ｘａｒｉｃｈ）　、マリンクロット（Ｍａユ１釦Ｃ−ｋ
ｒｏｄｔ　）、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、または
ジエイ・ティー・ベイカー（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ）から
受けとったまま使用した。乾燥ジメチルホルムアミドお
よび乾燥ピリジンはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）　
、ゴールドラベＡ／　（Ｇｏｌｄ　Ｌａｂｅｌ）から得
て４Ａ分子篩上に貯蔵し、受けとったままで使用した。

ジエイ・ティー・ベイカー（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ）から
のＮａＨ２Ｋ）４は１１０°の炉内で乾燥させてから真
空デシケータ−内で冷却した。ジメチルアミンは、Ｎａ
ＯＨ堅レットしのジメチルアミン塩酸塩から蒸留した。

ジアゾピルビン酸エチルは、標準法によってジアゾメタ
ンおよび塩化エチルオキサリルから製造した。

２−ニトロフェノキシドのカリウム塩は、メタノ−ル中
のニトロフェノールに化学量論量の濃ＫＯＨ水溶液を加
え、次に化学量論量に達するまで溶媒を真空で蒸発させ
ることにより、製造した。

種々の反応生成物を試欣する際に、プロトンＮＭＲスペ
クトルは、パリアン（Ｖａｒｉａｏ　）計測器で、　６
０　ＭＨｚ　（ＥＭ−３６０）、８０　ＭＥ！ｚ　（Ｃ
ＦＴ−２０）、９０ＭＨｚ（ＫＭ−３９０）、および１
００ＭＨｚ（ＨＡ−１００）で記録した。ピークは、以
下に、次の形式で報告している：ＮＭＲ（溶媒、操作周
波数）：テトラメチルシランからの一化学シフト、多重
度（８麿−重線、ｄ−二重線、を−三重線、ｑ−四重線
、ｍ−多重線、ｂｒ−ブロード）、適宜スピン−スピン
結合定数、プロトンの積算数、時には、いくつかの隣接
ピークがあまりに近すぎてその積分・を分離することが
できず、この場合はその一群について全体の積分のみを
記述する。

１−ブロム−２−（２’−二トロー５′−メチルフェノ
キシ）エタン（Ｉｆ）は次のようにして製造した：カリ
タム２−ニトロ−５−メチルフェノキシト９（１１５７
，６ｇ（０，３０モル）、Ｌ２−ジブロムエタン１８７
．４ｇ（１，０モル）、およびジメチルホルムアミ）”
１５１．９を一緒にして１２０°に加熱した。

反応混合物の明かるい橙色がまもなくあせて淡黄色とな
り、白色の沈殿が沈着した。冷却した後、この沈殿を濾
去し、水およびジクロルメタンで洗浄した。不溶性残留
物は、Ｌ２−ビス（２−ニド０−５−）’？ルフエノキ
シ）−二タン、５．８７．９（０，０１８モル）であっ
た。濾液の有機相を合わせて、抽出物中に橙色があられ
れな（なるまで希ＮａＯＨでくり返し洗浄した後、少量
のＮａＨ２ＰＯ４を含有する飽和ＮａＣｊ！水溶液で１
回洗浄した。

Ｍｇ５ｏ４上で乾燥させた後、有機相を蒸発乾固し、残
留物を、石油エーテル（沸点６０−８０’）またはメタ
ノール−水から再結晶させた。■の収量は、３４ｇ（４
４チ）、融点４４−４５°でありた。Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ
　Ｃ１３１６０ＭＨｚ）　：　７−７５．ｄ−８Ｈｚ　
−Ｉ　Ｈｚ６．９−６．７５．ｍ、２Ｈ；　　４．３６
．ｔ、７Ｈｚ、２Ｈ；　　３．６ｙＬ７Ｈｚ、２Ｈ；　
　２．３６．ａ、３Ｈ１−（２−ニトロフェノキシ）　
−２−（２’−二トロー５′−メチルフェノキシ）エタ
ン帖は、次のようにして製造した： ｎ　ｔ　５．３２７７　（２０，５ミリモル）およびカ
リウム２−ニトロフェノキシドＣｍ）３．９８１１Ｃ２
２，５ミリモル）を、ジメチルホルムアミド１０ゴ中で
かくはんし、８０分間、１３０’に加熱した。混合物を
冷却し、水で希釈して１００ｄとして濾過した：沈殿物
ｙＮａ２Ｃｏ３水溶液でくり返し洗浄した後、水で洗浄
した。乾燥後、これ’に５ｍの酢酸を含有する沸騰９５
チェタノール１．２５１から再結晶させ、冷却後これに
少量の水を加えた。■の収量は５．５５，９，８５チ、
融点１５０−１５２゜であツタ。ＮＭＲ，（ＣＤＣＪａ
、　、　８０ＭＨｚ）　：　７．７−’６．６゜ｍ、７
Ｈ；　　４．３４．ａ、４Ｈ；　　２．２６．ｓ、３Ｈ
１−（２−アミノフェノヤシ）−２−（２’−アミノ−
５′−メチルフェノキシ）エタン（Ｖ）は、次のように
して製造した： ５、５５　ｇの■を、９５チエタノール中の０．４６Ｉ
パラジウム（木炭上５チ）触媒を用いて、室温、大気圧
で水素化した。十分な水素が吸収された後（１３時間）
、混合物をあたためて熱いうちに濾過し、少量のＮａＢ
Ｈ４で脱色し、−１０°まで冷やした；白色結晶として
のＶの収量は４．０３Ｌ８９俤、融点１１８−１１９°
であった、ＮＭＲ（ＣＤ（Ｊ３゜８０ＭＨｚ）：６．８
−６．５．ｍ、７Ｈ；　　４．２８．ｓ、４Ｈ；　　３
．５−３．７．ｂｒｓ、４Ｈ；　　２．２４．ａ、３Ｈ
１−（２−アミノフェノキシ）　−２−（２’−アミノ
−５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ。

Ｎ／、Ｎ／−テトラ酢酸、テトラエチルエステルＣＶＩ
＆）またはテトラメチルエステル（■ｌ）　’）は、次
のように２つの方法のどちらか一方により製造した：Ｖ
Ｉ２．５８ｇ（１０ミｌＪ％ル）、Ｌ８−ビス（ジメチ
ルアミノ）す７タレン１１．３１５３ミリモル）、沃化
ナトリウム０．７９１！（５，３ミリモル）、ブロム酢
酸Ｚｆｋ８．９１　ｇ（５３ｍＭ）およびアセトニトリ
ル９．５．！９Ｙ、窒素下で１８時間かくはんし還流さ
せた。冷却した混合物をトルエンで希釈し、濾過した。

濾液をＬ８−ビス（ジメチルアミノ）−ナフタレンが除
去されるまでｐＨ２で燐酸塩緩衝剤を用いて抽出した。

トルエン溶液を乾燥させ、蒸発させて、残留物４５０ｙ
Ｊのエタノールから再結晶させた。テトラエチルエステ
ルｅ　■ａ＋　　の収量は５．２７　ｇ、８７％、融点
１１０−１１０．５°、であった。ＮＭＲ（ＣＤ０Ａ！
　ａ　、１００　ＭＨｚ）　”６．８８−６．６．ｍ、
７Ｈ；　　４．３０．ｅ、４Ｈ；　重なった４、１８．
ｓ、４．１４．ｓ、４．０８．ｑ、７Ｈｚ　　、全体で
１６Ｈ；２．２８．ｓ、３Ｈ；　　１．１８．ｔ、７Ｈ
ｚ、１２Ｈもつと大きな規模のくり返しでは、ブロム酢
酸エチルをブロム酢酸メチルで置き換え、１．８−？”
ス（：）メチルアミノ）ナフタレン’＆、１５０°で乾
燥させたＮａ　２ＨＰＯ４で置き換えた。こうして、Ｖ
２５．８３．９　（１００ミリモル）、乾ｆｉＮａ２Ｈ
ＰＯ４７１，９（５００ミリモル）、Ｎａ工５．９ｇ（
３９ミリモル）、ＢｒＣＨｚＣＯ２Ｍｅ　８４．７　ｐ
　（５５４ミリモル）およびＣ）１３ＯＮ　　Ｉ　Ｏ４
ＩＩを、三日月形の櫂で敏しくかくはんしながら１８時
間、窒素下で還流させた。冷却した反応混合物を水とト
ルエンとの間に分配させた。有機相を蒸発乾固して、メ
タノールかう再結晶させた。テトラメチルエステル、■
ｂの収量は、４０．２ｆ！（７１チ）であった。もう一
度メタノールから結晶させると、融点は９５−９５．５
０°であった。ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，９０ＭＨｚ）　”
６．８３，５１，６．６７、ｍｌ　全体で７Ｈ；　　４
．２４，８，４．１３゜ｓ、４．０９．ｓ、全体で１２
Ｈ；　　３．５６．ｓ、３．５４．ｓ。

全体で１２Ｈ；　　２．２３．ｓ、３Ｈ１−（２−アミ
ノ−５−ホルミルフェノキシ）−２−（２’−アミノ−
５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、、　Ｎ　、　Ｎ
’、　Ｎ／−テトラ酢酸、テトラメチルエステル（■ｂ
）は、次のようにして製造した＝Ｚ１８６．！７（４，
０ミリモル）ノ■１：ｌヲ、乾燥ピリジン０．４　ｍを
含む４．０　ｍの乾燥ジメチルホルムアミド９中にか（
はんしながら溶解させた。混合物を水浴中で冷却し、オ
キシ塩化燐（３，０ｍ１）を滴加した。この反応混合物
はすぐに黒色に変わった。

ＴＬＣ（石油エーテル−酢酸エチル１：１）は０．５時
間後にはほんの痕跡量の生成物を示した。この反応混合
物を６０°で１時間かくはんした後、室温に一夜放置し
た。反応混合物を５０Ｍ！！のＣＨ２ＣＡ！。

に溶解させて、ＮａＯＨ水溶液と混合した砕氷上に注い
だ。水性層を、１０ｍ／づつのＣＨ２Ｃｌ２５部で抽出
した。・合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、
濾過し蒸発させた。一部結晶性の残留物（１，７５９）
を５ゴのイソプロピルアルコールで研和し、濾過し、エ
ーテル−石油エーテル混合物で洗浄して、乾燥させた。

黄色がかった■ｂの結晶を得たが、このものはＴＬＣに
関して均質であって１２６〜７°で融解し、重量は１．
５０　Ｅ　（６５，３％）であった。第二収穫物の結晶
は重量０．１２６Ｉであり合わせた収率は７２チとなっ
た。アセトン−ヘキサンからの再結晶により淡黄色の結
晶が得られた、融点１３１−１３２゜ １−（２−アミノ−５−ＣＣ２−Ｃ４−エトキシカルボ
ニルフェニル）−Ｅ−エテノ−１−イル〕−フエノキシ
）−２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エ
タン、　　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸、テトラメ
チルエステル（ＩＸ）は、次のようにして製−造した： ■ｂ５７４■（１ミリモル）、臭化４−エトキシカルボ
ニルベンジルトリフェニルホスホニウム（８００■、１
．５８ミリモル）、および無水に２Ｃｏ３０．４　ｇ’
ａ’、乾燥ジメチルホルムアミド４ｄ中で１０００で２
．．５時間かくはんした。冷却した反応混合物を水とト
ルエンとの間に分配させた後、水性層をさらにトルエン
で抽出した。溶媒を蒸発させた後の残留物を、石油エー
テル−酢酸エチル９　：　１　（ｖ／ｖ）中のシリカ上
のクロマトグラフにかけた。スチルベン類の混合物乞単
離すると０．３８０９（５３％）の収量であった。酢酸
エチル−石油エーテルから４回再結晶させて、純粋な■
のトランス−異性体、融点１３１−１３２°を得た。単
離および精製段階はうす暗い橙色の安全光の照明下で実
施した。ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，９０ＭＨｚ　）　ニア、
９９．ｄ、８Ｈｚ、２Ｈ；　８．４８．ｄ、８Ｈｚ、２
Ｈ；　７．１−６．８５．ｍ、６．８−６．５．ｍ、全
体で７−８Ｈ；　　４．４−３．９．　　　　　　　　
”ｍ、１４Ｈ；　　３．５８．ｓ、３．５５．ｓ、全体
で１２Ｈ；２．２２．ｓ、３−４Ｈ；　　１．３７’、
ｔ、７Ｈｚ、３−５Ｈホスホニウム塩（■）は、ｐ−ブ
ロムメチル安息香酸エチル、ＸＸ■（参考文献３０を参
照）１２．１６．Ｖ（５０ｍＭ）を、還流トルエン中で
トリフェニルホスフィン１４．．４８ｇ（５５ｍＭ）と
−夜反応させることによって、９２チ収率で製造した。

冷却した反応混合やから沈殿を濾去した。洗浄ならびに
乾燥後に、このものは融点２４１−２４３°を有し重量
は２３．３ｇ、９２％収率であり、その後の使用には十
分に純粋であった。

この化合物は混合されたメチルおよびエチルエステルを
含有しているけれども、適当な■および■のエステルの
使用によりこのささいな差異が解決されるであろうとい
うことがわかるであろう。

エステル化基は混じっていないので混合エステルの存在
は問題ではなく、この化合物はキレート剤として使用す
る前にげん化しなくてはならない。

１−（２−アミノ−５−（、（２−（４−Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアミノスルホニルフェニル）−Ｅ−エテノ−１−イ
ル〕フエノキシ）−２−（２’−アミノ−５′−メチル
フェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸
、テトラメチルエステル（ＸＩＩＩ）は、次のようにし
て製造した： ０．４８６．Ｆ（０，８４ミリモル）の■ｂを、ＣＨ２
（Ｊ２中のホスホニウム塩Ｍ　Ｏ，４２、！７　（０，
８４ミリモル）およびナトリウムメトキシド（５４■、
１ミリモル）とともに−夜還流させた。冷却した反応混
合物を水とクロロホルムとの間に分配させた。粗生成物
をトルエン−酢酸エチル４　：　１　（ｖ／ｖ）中でシ
リカ上のり０￥トゲラフにかけ、濃厚なシロップ（１１
２■、１７％収率）として単離した。

Ｎ　ＭＲ（ＣＤＣｌ３．９０　Ｍ　Ｈｚ　）　：　７．
６５　、　ｄ−９Ｈｚ−２Ｈ、＋＋７．４．ｄ、９Ｈｚ
、２Ｈ；　　７．３−７．０．ｍ、　トルエン汚染によ
り積分は不明確になっている；　６．９９−６−５ｙ＋
７Ｈ；４．２５．ａ、４．２０．ｓ、４．１６．ｓ、全
体で１２Ｈ；　　３．５４゜＠、１２Ｈ；　　２．７７
、ｔｓ、２．７５．θ、全全体６Ｈ；　　２．２５゜ｓ
、３Ｈ。

スルホンアミドホスホニウム塩Ｘは、還流トルエン中で
トリフェニルホスフィンをＮ、Ｎ−ジメチル４−（クロ
ルメチル）ヘンゼンスルホンアミト９と反応させること
圧より、■と同様にして製造した。その融点は２７５−
２８００であった。スルホンアミドは、塩化４−クロル
メチルベンゼンスルホニル（参考文献３１参照）ヲ、エ
ーテル中のジメチルアミンの冷溶液と反応させることに
より製造した。

化合物■１）＋ＸＩＶ−−きＸＶ １−（２−アミノ−５−Ｃ２−（４−エトキシカルボニ
ル−２−二トロフェニル）−Ｅ−エテノ−１−イル−フ
ェノキシ）、２−　（２’−アミノ−５′−メチルフェ
ノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ／−テトラ酢酸、テ
トラメチルエステル（ＸＶ）は、次のようにして製造し
た： ０、］４Ｊ９の■ｂおよび０．２０．９のＸＩＶ、およ
び０、６９のに２Ｃ０３を１ｒＩＬＩ！の乾燥ジメチル
ホルムアミド中、９０°で３時間かくはんした。反応混
合物をトルエンと水との間に分配させ、有機相を蒸発さ
せて、トルエン−酢酸エチル６：１を用いろシリカ上の
クロマトグラフにかけた。プールしたカラムからの分画
な蒸発させて赤味がかった油１３５■、６９％、を得た
。

１、５　ｇのトリフェニルホスフィンを還流トルエン中
の１．２Ｉの４−ブロムメチル−３−ニトロ安息香酸エ
チルと一夜反応させることにより、ホスホニウム塩’）
Ｊ　Ｃｍ点１６５−１６ｓ）ｙｙｒ−１７６チ収率で製
造した。後者のエステルは、濃ａ２ＳＯ４１０ｄ中のｐ
−ブロムメチル安息香酸エチル、ＸＸ■、２．４３ｇ、
を５℃でかくはんし、その間に１１ＨＮＯ３（ｄ　　１
．４）　１−を滴加することにより、製造した。このニ
トロ化混合物を砕氷上に注ぎ、ＣＨ２Ｃノ２で抽出した
。抽出物を希ＮａＯＨで洗浄して乾燥させ、蒸発させて
油ぞ得たが、この油は結局結晶化した、融点４１−４３
°、収量２．３２ｇ１８０％。Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＣＬ４　
、９０　Ｍ　Ｈｚ　）　：　　７８　、ｄ、９１１ｚ　
−７，６７、ｄ、２Ｈｚ、７．５８．ｄｄ、９Ｈｚ＋２
■２．全体で３Ｈ；４．４５．ｓ、２Ｈ；　　３．９．
ｓ、３−４Ｈ化合物ｘｖ−−＞ｘｗ １−（２−アミノ−５−〔６−ニトキシカルポニルイン
ドリルー２−〕フェノキシ）−２−（２’−アミノー５
′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ。

Ｎ　、　Ｎ／、　Ｎ／−テトラ酢酸、テトラメチルエス
テル（ＸＶＩ）は次のようにして製造した：３００η（
０，３９２ミリモル）のＸＶを、２ｄの亜燐酸トリエチ
ルに溶解させて窒素下で一夜還流させた。この反応混合
物を真空で蒸発乾固して、残留物をトルエン−酢酸エチ
ル４：１中のシリカ上のクロマトグラフにかけた。環化
生成物ＸＭを黒っぽい油（１６０ｒｎ？、　５５．６チ
）として得たが、このものは０．１トルで乾燥後に結晶
化した。メタノールからの再結晶によって９６−９７°
で融解する結晶が得られた。ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，９０
ＭＨｚ）：ａ　ｏ　８ｒ　ｓ　ｒ　ＩＨｐ　　ｙ　７３
　＋　ａ　＋　ｓ　Ｈｚ　＊　７．ｓ　＋　ａ　ｚ　ｓ
　ｎｚ　＋全体で２Ｈ；　７．２１．ｍ、２Ｈ；　　６
．９−６．５．ｍ、５Ｈ；　　４．３５゜（１１７Ｈ２
，４，２１，Ｓ１４．１４．θ、４．０９．ａ、全４．
１２−１４Ｈ；　　３．５８．ｓ、３．５４．ｓ、１ｌ
−１２Ｈ；　　２．１７，８ｔ３Ｈ，”　　１．８．ｂ
ｒ　ｅ、約２　Ｈ（Ｈ２Ｏピークを含んでいるであろう
）　；　１．３３　、　ｔ　、　７ＥＩｚ、　３Ｈ化合
物Ｘ■−−ラＸ■ Ｌ４−ジ（ベンジルオキシ）ベンゼン（ＸＩＸ）は次の
ようにして製造した： かくはんした、エタノール１００ゴ中のヒト９０キノン
（Ｘ’、■）　５５．９　（０，５モル）および塩化ヘ
ンシル１４３．１．９　（１，１モル）の懸濁液に、エ
タノール中の水ｉｊ％化カジカリウム、２９（ｏ、９部
モル）の溶液を加えた。１時間後に、混合物乞水中に注
いだ。数時間後に沈殿を濾去して、７０°で乾燥させ、
３５リツトルの沸肺エタノールから再結晶させた。ＸＩ
Ｘの収量は１０５，９，７３チ、Φ点１２８−１３０°
〔文献値（３２）は１２６．５から１３０゜までにわた
っている〕であった。ＮＭＲ（ＣＤ（Ｊ３゜１００ＭＨ
ｚ）：　７．３５．ｓ、ＩＯＨ；　　６．８７．ｓ、４
Ｈ；４．９８，８，４Ｈ ２−ニトロ−Ｌ４−ジ（ベンジルオキシ）ベンゼンＣＸ
Ｘ’）は、次のようにして製造したニア０チ硝酸水溶液
１８．３．９　（０，２０３モル）を氷酢酸で５０−ま
で希釈して、酢酸２００−中のＸＸ５８．１．２００モ
ル）の懸濁液に加えた。混合物をかくはんして、静かに
５０°まであたためると出発物質が溶解し、生成物が晶
出しはじめた。

この混合物を冷却して第一収穫物を濾去した後、水を滴
加して第二収穫物を沈殿させた。ＸＸの全収量は６５．
６，９，９８チ、融点８１−８２．５゜（参考文献３３
には８３°と報告されている）であツタ。ＮＭＲ（ＣＤ
ＣＡａ　、　１００Ｍｋ）　：　７．５−６．９　、　
Ｍ　。

１３Ｈ；　　５．１５．ｓ、５．０３．ｓ、全体で４Ｈ
２−ニトロ−４−ベンジルオキシフェノール（ＸＸ［）
は次のようにして製造した：エタノール中含まないクロ
ロホルム１００ｍＡ’中のＸＸ５０．４．！ｉ！　（０
，１５モル）の溶液を、トリフルオル酢酸１５．０ｄ（
０，２モル）で処理して、室温に４８時間保持すると、
この時、ＮＭＲスペクトルは、４．９２でのピークの大
きさにより判定したとき出発物質の約９０％が変換され
ていることを示した；過剰の酸Ｙ５Ｍの水散化カリウム
水溶液で中和した。水性層が最初のような暗褐色でなく
淡橙色になるまで、有機相を希炭酸カリウム水溶液でく
り返し抽出した。次にクロロホルム溶液を１．５容量の
ジエチルエーテルで希釈し、５Ｍ水酸化カリウム６０ｒ
ｔｔｅで処理した。カリウム４−ベンジルオキシ−２−
ニトロフェノキシビの暗赤色沈殿を櫂去して、希ＨＩＪ
で酸性化し、６ｏｏＩＩ１，１づつの石油エーテル（沸
点６０−８０’）６部で抽出した。抽出物を合わせて石
油エーテルを蒸発させた後、残留物を沸騰メタノールか
ら再結晶させた。冷却後これに水を滴加した。ＸＭの収
量は３１−３２ｇ、８４−８７チ、融点６７−７０゜で
あった。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＣ７４，１００Ｍ　１３　ｚ　）　：　
１　ｏ、２４−　ｓ　、Ｌ　Ｈ、’７．５２．ｄ、３Ｈ
ｚ、ＩＩ（；　　７．３２．ｓ、５Ｈ；　　７．１９．
ｄｄ。

３Ｈｚ、および９Ｈｚ、ＩＨ；　　７．００．ｄ、Ｊ−
９Ｈｚ、ＩＨ；５．０１．日、２Ｈ １−（２−モトロー４−ベンジルオキシフェノキシ）　
−２−（２’−二トロー５′−メチルフェノキシ）エタ
ン（ＸＸＩＩ）は、次のようにして製造した：ＸＸ１２
．４ｓｇ（１０ミリモル）、ｌ１２．８Ｊ（１０８ミリ
ツル）、無水に２Ｃｏ３０．７６．９　（５，５ｍＭ）
、およびジメチルホルムアミド５ｄ、の混合物を１５０
’に加熱し、１５分間か（はんした。

まだかなり温かい間に、このかくはんした混合物ｔ、最
初のＫＢｒ　の沈着物が溶解して生成物が結晶し始める
ｆで、水？滴加することにより処理した。とのものｋｋ
４去して乾燥させ（粗収率９０％）最小限の量の熱アセ
トンに溶解させ、その２倍の答ｆｌの石油エーテルで沈
殿させることによって再結晶させた。ＸＸＩＩの淡黄色
結晶は、融点１４３−１４４°であった。

１−（２−アミノ−４−ベンジルオキシフェノキシ）−
２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタン
（ＸＸ１ｕ）は次のようにして製造した：Ｘ■５　ｇ（
１１，８ミＩＪモル）および木炭上の５条白金０．５　
ｇを無水エタノール１００１１１，１中に懸濁させ、水
素下でかくはんした。理論容量が５時間で吸収されたが
、混合物は一夜水素下に放置した。

その後で累積吸収量は理論量より１９チ高かった。

同じ水素化混合物に別に５９のＸＸｌ［Ｙ加えたところ
これもまた一夜で理論量より同じたけ高い量の水素を吸
収した。生成物ＸＸｆ［Ｉ　Ｙアセトンから再結晶させ
ろと、融点は１２９−１３２°であった。

ｉ（Ｍ　Ｒスはクトルは、ベンジル基が失われていなイ
コとを示した。（ＣＤ　Ｃ６ａ　＋　ＣＤ　ａ　Ｓ　Ｏ
ＣＤ　ａ　、９０　ｋｉＩ　Ｈｚ　）ニア、２９．ｑ、
５Ｈ；　　６．７５−６．４５．ｍ、４Ｈ；　　６．３
２．ｄ。

３Ｈｚ、ＩＨ；　　６．１２．ａｄ、３ｆｌｚ＋７１１
ｚ、ＩＨ；　　４．９３．ｓ。

２Ｈ；　　４，３．ｂｒｓ、４．２６．ｓ、全体で４Ｈ
；　　２．２７．ｓ。

３Ｈ・ １−（２−アミノ−４−ベンジルオキシフェノキン）　
−２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタ
ン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ／−テトラ酢酸、テトラエチルエ
ステル（ＸＸｆ’ｉ’）は、次のようＫして製造した：
ＸＸＩ　　３．６１　（１０ミリモル）、Ｌ８−ビス（
ジメチルアミノ）ナフタレン１０．７２　ｇ（５０ミリ
モル）、乾燥Ｎａ工　２．Ｏｇ（１３ミリモル）、ブロ
ム酢酸エチル８．３５ｇ（５０ミリモル）、およびアセ
トニトリル１５　ｔｄ’ｌｓ　’Ｅ素下で４０時間、か
くはんし還流させたが、この間に、最初の２４時間の後
、さらにブロム酢酸エチル１．５１１ｔｌ！およびＬ８
−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン２ｇを添加した。

冷却した反応混合物を蒸発させて乾燥させ、トルエンで
希釈し、瀞過した；灰色の沈殿を別の少量づつのトルエ
ンでくり返し洗浄した。

プールしたトルエン溶液を、洗液が新しい緩衝剤と同じ
ｐＨ２となるまで、燐酸塩緩衝剤で（り返し抽出した。

次にこのトルエン溶液を水で洗浄して、　Ｍｇ５ｏ４上
で乾燥させた。減圧下でトルエンを蒸発させた後、残留
物を石油エーテル−酢酸エチル９　：　１　ｖ／ｖ　　
で洗浄して、痕跡量のブロム酢酸エチルを除去した。ｘ
Ｘ■の収量は、６．４９（９０％）であり、融点は９５
−９６°であった。

化合物ｘｘｔｖ−−−−＝−ｘｘｖ ｌ−（２−アミノ−４−ベンジルオキシ−５−ホルミル
フェノキシ）　−２−（２’−アミノ−５′−メチルフ
エノキシ）−エタン−Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎ’−
テトラ酢酸、テトラエチルエステル（ＸＸＶ）は次のよ
う圧して製造した： ＸＸＩＶ　　Ｏ，３５ｇ（０，５ミリそル）を２ｄの乾
燥ジメチルホルムアミド９および０，４コのピリジンに
溶解させた。ＯｏでＰＯ（Ｊ３（０，４ｄ、　　４ミリ
モル）を伽えた。０．５時間後に、反応混合物をあたた
めて、−夜室温に放置した。この反応混合物を、氷冷Ｎ
ａＯＨ水溶液で中和も、２０１１１，１づつのトルエン
３部で抽出した。トルエン相の蒸発により結晶性のＸＸ
Ｖ　、融点１１４−１１５°　（２５６■、７３チ収率
）を得た。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３．９０ＭＨｚ　）　：１
０．３３．ｓ、ＩＨ；　　７．３５，８．５−７Ｈ；　
　６．８−６．６．ｍ。

４Ｈ；　　６．３．ｅ、ＩＨ；　　５．０８．ｓ、２Ｈ
；　　４．２５−３．９゜ｍ、２０Ｈ；　　２．２１．
ｓ、３−４Ｈ；　　１．１４．ｔ、７Ｈｚ、１２−１４
Ｈ１ 化合物ＸＸＶ−−＋ＸＸＶ（ １−（２−アミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルミルフェ
ノキシ）　−２−（２’−アミノ−５′−メチルフェノ
キシ）−エタン−Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’、　Ｎ’−テト
ラ酢酸、テトラエチルエステル（ＸＸＶ）は、次のよう
にして製造した： ＸＸＶを、大気圧で木炭上の５％Ｐａ触媒を用いた氷酢
酸中での水素化により脱ベンジル化した。

ＸＸＶＩは融点１０９−１１１°であった。

１−　（２−（４−エトキシカルボニルフェニル）−６
−７ミノベンゾフランー５−オキシ）−２−（２′−ア
ミノ−５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ／
、Ｎ／−テトラ酢酸、テトラエチルエステル（ＸＸＭ）
は、次のようにして製造した：低収率の不純なＸＸＭは
ＤＭＩ’中のＸＸＭおよびＸＸＭを７０時間、１００’
に加熱することによって直接得ることができるけれども
、エステル化とフラン環の閉環な別々の段階で行なう方
がよい。

６５■のＸＸＭ　（ｏ、１ミリモル）、５０■の４−グ
ロムメチル安息香酸エチル（ＸＸＭ）、０．２９のに２
ＣＯ３，および１０■の硫酸水素テトラブチルアンモニ
ウムを、アセトニトリル中で一夜かくはんしながら還流
させた。生成物であるＸＸＭの４−エトキシカルボニル
ベンジルエーテルを、石油エーテル−酢酸エチルＩ　：
　ｌｉ用いる分取層クロマトグラフィーによって単離す
ると、５７■、７１チ収率、融点１０９−１１０°が得
られた。

ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，９０ＭＨｚ）：１０．３４．ｓ、
ＩＨ；　　８．０６゜ｄ、８Ｈｚ、２Ｈ；　　７．４７
．ｄ、Ｒｈ、２Ｈ；　　７．３．８．一部ＣＨＣｌ！３
により不明確となっている；　ｍ、６．８−６．５５゜
３Ｈ；　　６．３．ｓ、ＩＨ；　　５．１６．ｓ、２Ｈ
；　　４．３７．ｑ、７Ｈｚ、４．２１　、ａ、４．１
４．ｓ、４．０５．ｑ、７Ｈｚ、４．０２．ｑ、７Ｈｚ
全体で２２Ｈ；　　２．２３．ｓ、３Ｈ；　　１．３８
．ｔ、７１’［ｚ。

１−１７＋　ｔ、７Ｈｚ、　ｔ、ｘｓ、　ｔｔ７Ｈｚ＋
全７Ｈｚ＋Ｈ。

この゛エーテル３９１１Ｎ！（０，０５ミ１７モル）ｉ
、ジメチルホルムアミＰ１ｔＪ中の弗化カリウム／アル
ミナ試薬（参考文献２２を参照のこと）とともに１５０
０で２時間かくはんした。螢光性生成物を、トルエン−
酢酸エチル１：１を用いるシリカ上の分取層クロマトグ
ラフィーにより２１■（５４％）収量で単離した。ＤＭ
Ｆ’中での反応時間をもっと長くするとエステルの加水
分解が増大する。ＮＭＲ（ＣＤＣ！ｌａ、９０ＭＨｚ）
：　８．１５．ｄ、９Ｈｚ、７．８９ｔａｙ９Ｈｚｔ全
体で４−５Ｈ；　　７．１５−７．０５．ｍ、６．７８
．ｚ、全体で６−７　Ｈｐ　ｍ　＋　３−９−４．５　
ｅ　２．０−２２　Ｈｐ　　２２３１　’　＋３Ｈ；　
　１．０−Ｌ４．ｍ、１３−１７Ｈ］　−（２−（５−
エトキシカルボニルオキサゾール−２−イル）−６−ア
ミノベンゾフラン−５−オキシ）　−２−（２’−アミ
ノ−５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、
Ｎ／−テトラ酢酸、テトラエチルエステル（ＸＸＭ”）
は、次のようにして製造した： この場合には、エーテルの形成とフラン環閉環を一段階
で行なうことができる。ＸｌＯ，５（７）（０，７７ミ
リモル）、２−クロルメチルオキサゾール−５−カルボ
ン酸エチル（ＸＸＸ）　０．２　、！ｉ’　、およびに
２Ｃｏ３０．５　＃を、乾燥ジメチルホルムアミｒ２１
１１，１！中、１００’で１．５時間かくはんした。こ
の反応混合物を冷却し、水で希釈して、ＨＣｌで酸性化
し、ＣＨ（Ｊ３で抽出した。合わせた抽出物を、Ｍｇ５
Ｏ，で乾燥さぜ、蒸発させて、黒っぽい半結晶性残留物
乞得た。シリカゲルの短いカラム７通して濾過し、１：
１トルエン−酢酸エチルで洗浄して蒸発させると、黄色
の結晶が得られた。このものは、ヘキサン−酢酸エチル
９：１で研和し、濾過した後では１３８°ではっきりと
融解した。

収量は４２０キ、６８チであった。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２
゜９０ＭＨｚ）：８．１１．ｓ、ＩＨ；　　７．６９．
ｓ、ＩＨ；　　７．３４゜ｓ　＊　７２９　＋　’　＃
全体で２Ｈ；　　６．９７−６．８７．ｍ、３Ｈ；４．
５７．ｑ、７Ｔｉｚ、４．４５．ａ、４．３５．Ｂ、４
．２５．Ｐ、４．３５゜ｓ、４．２５．ｅ、４．１８．
ｑ　、７Ｆｉｚ、４．２２ｔｑｔ７ｆｌｚ＋全体で２２
Ｈ；　　２．３１．ｓ、３Ｈ；　　１．４４．ｔ、７Ｈ
ｚ、３Ｊ　　１．２１゜ｔ　、　７Ｈｚ、　１．１９　
、　ｔ　、　７Ｈｚ、全体で１２Ｈ。

２−メチルオキサゾール−５−カルボン酸エチルの合成
（参考文献３４を参照のこと）と同様にして、クロル−
アセトニトリルをジアゾピルビン酸エチルと反応させる
ことにより、２−クロルメチル−オキサゾール−５−カ
ルボン酸エチル（ＸＸＸ）を製造した。ジアゾピルビン
酸エチル０．１，９１７セチルアセトン酸第二銅数■、
およびクロルアセトニトリル０．４ｄを、ベンゼン溶液
にして一夜６０°に保った。冷却した反応混合物をＮａ
ＨＣＯａ水溶液およびエーテルの間に分配させた。有機
層を乾燥させ、蒸発させて、シリカ上のクロマトグラフ
にかげ、石油エーテル−酢酸エチル９：１　　　　　　
　　ｉｖ／ｖ　　で溶離した。単離した生成物を、１２
トル、９０°空気浴温度でのバルブ−トウーバルブ（ｂ
ｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｌｂ）蒸留により、てさらに精製し
た。

ＮＭＲスペクトルはまだかなりの不純物を示したけれど
も、ＧＯ−ＭＳ分析は、ずばぬけて優勢な分画が正確な
親Ｍ／ｅ＝Ｈ３９と、］　６１　（−ｃ２ａ４または−
ＣＯ）、１５４（−（Ｊ）、１４４　（−ＱＣ２Ｈ５）
に断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）　ｆ、セして１１６　（−
ＣＯＯＣ２Ｈ５）　Ｋ基礎ピークを有するＸＸＸ　Ｋ対
して期待される等方性パターン、とｔ有していることを
示した。

１−（２−（４−シアノフェニル）−６−アミツーベン
ゾフラノキシ−５−）　−２−（２’−アミノ−５′−
メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’。

Ｎ′−テトラ酢酸、テトラエチルエステル（ＸＸＸＩＶ
）は、次のようにして製造した： ＸＸ間１４　ｏｍｉ　Ｏ，２２ミｌＪモル）、塩化ｐ−
シアノベンジル８８■（１０，５８ミリモル）、Ｋ２Ｃ
Ｏ３３５０■、および硫酸水素テトラブチルアンモニウ
ム３０■ｔ、ジメチルホルムアミド３ゴ中で、１２５°
で４時間か（はんした。黒っぽい反応混合物を水で希釈
し、トルエン中に抽出した。蒸発させたトルエン相ヲ、
トルエン−酢酸エチル混合物を用いるシリカ上のクロマ
トグラフにかけた。速行性の螢光帯を捨てた；それに続
く主ピークを蒸発させると８２■の油が得られ、これは
結晶化した。おそらくもつとよい溶媒が見い出されたで
あろうが、石油エーテル−酢酸エチルからさらに再結晶
させると、融点は１２０−１２１°であった。収率は５
１チであった。

ＮＭＲは犬ざつばには予想通りであったが、厳密には指
定できなかった。Ｎ　ＭＲ（ＣＤＣ１ａ　、　９０　Ｍ
Ｈｚ）　：　７．９−７．１．ｍ、７．０３．ｍ、６．
７０．ｍ、４．１−４．３．ｍ、２２５゜θ＋０−８−
１．４．ｍ・ その十分にイオン化された塩はこれよりかなり安定であ
るけれども、固体の遊離酸は２．３日しか安定でない。

最終生成物はＮＭＲによっては特性を決定されなかった
が、ＵＶ、螢光、および２＋ Ｃａ　　滴定により注意深く研究された（表１を参照の
こと）、Ｃａ　　滴定は、どの製造例でも１０チより多
いジーまたはトリーカルボン酸エステル化合物は含んで
いないことを示した（データは示されていない）。

化合物■−−−）Ｘ １−（２−アミノ−５−（（２−（４−カルボキシフェ
ニル）−Ｅ−エチニル−１〕−フェノキシ）−２−（２
’−アミノ−５′−メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ、
Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸国は■のけん化によって製
造した。

１−（２−アミノ−５−Ｃ（２−（４−Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルアミノスルホニルフェニル）−Ｅ−エチニル−１−〕
−フェノキシ）　−２−（２’−アミノ−５′−メチル
フェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸
（Ｘｌｕ）は、■のけん化によって製造した。

１−（２−アミノ−５−〔６−カルポキシインドリルー
２−〕フェノキシ）　−２−（２’　　−アミノ−５′
−メチル−フェノキシ−）エタン−Ｎ、Ｎ。

Ｈｔ、Ｈｚ−テトラ酢酸（Ｘ■）は、Ｘ■のけん化によ
り製造した。

化合物ＸＸ■−−）ＸＸ］Ｘ １−（２−（４−カルボキシフェニル）−６−アミツー
ベンゾフラノキシ−５−）　−２−（２’−アミノ−５
′−メチルフェノキシ）−二タンーＮ、Ｎ。

Ｎ’、　Ｎ’−ｆ　トラ酢酸（ＸＸ′ｖＩＩ［）ハ、Ｘ
Ｘ間のけん化により製造した。

１−（２−（５’−カルボキシオキサゾール−２′−イ
ル）−６−アミツーペンゾフラノキシー５−）−２−（
２’−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタｙ−Ｎ、
Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　−ｆ　）　ラ酢酸（ＸＸｘ［）ハ、Ｘ
ＸＸ［のけん化により製造した。

化合物ＸＸＸＷ−−＞ＸＸＸＶ １−（２−（４−シアノフェニル）−６−アミツーベン
ゾフラノキシ−５−）　−２−（２’−アミノ−５′−
メチルフェノキシ）エタン−、Ｎ、Ｎ、、Ｎ’。

Ｎ′−テトラ酢酸（ＸＸＸＶ）は、ＸＸＸ■のげん化に
　　　　　　１゛より製造した。

遊離酸へのけん化 本合成反応においては、エチルまたはメチルエステルは
、そのエステルをメタノール、エタノール、またはジオ
キサンのような水と混和性の溶媒に溶解させて、過剰の
水酸化ナトリウム、カリウム、またはテトラブチルアン
モニウム水溶液ン加えることによってけん化されて遊離
のキレート化剤ホリ陰イオンとなる。我々は、時忙は短
時間あたためることにより、水溶液の添加により沈殿す
るエステルの加水分解が始まりやすくなることを見出し
た。しかしながら、このキレート化剤が少なくとも０．
１　Ｍ過剰のＮａＯＨまたはＫＯＨを含有する均質な溶
液中に３３時間存在する限り、ブタノール−酢酸−水４
：１：１または４：１：５ｖ／ｖ　　Ｙ用いるシリカ上
の薄層クロマト／ラフイーまたはＣａ　　滴定により判
定したとき加水分解は完全であった。水酸化テトラブチ
ルアンモニウムはより遅いように思われたが、これはお
そらくこの陽イオンかに＋またはＨａ　　よりも、加水
分解の中間段階の電荷と対になってこれを部分中和する
力が弱く、そのため水酸化物の静電斥力がそれ以上の加
水分解を遅くするためであろう。

Ｑｕｉｎｌ、テトラエチルエステル ｑｕｉｏｌ／Ｉｔ　、　２−　（Ｃ２−（ビス〔エトキ
シカルボニル）メチルシアミノ）−５−メチルフェノキ
シクーメチル）−８−（ビス〔（エトキシカルボニル）
メチルシアミノ）キノリンの合成は参考文献６に記載さ
れている。

５−ホルミル−ｑｕｉｏｌ、テトラエチルエステル２−
（〔２−（ビス〔（エトキシカルボニル）メチルシアミ
ノ）−５−メチルフェノキシコメチル）−５−ホルミル
−キノリン−８−（ビス〔（エトキシカルボニル）メチ
ル〕、アミノ）、２ａは次のようにして製造した： ６４、１１ＦＷのｑｕｉｏｌ／Ｅｔ　（１０３マイクｏ
　％ル）ン、Ｏｏの、４２．３■のＰＯＣＪ３（２７６
マイクロモル）および５０マイクロリツトルのジメチル
ホルムアミドの混合物に加えた。次にさらに５０マイク
ロリツトルのＤＭＦを使ってｑｕ１Ω１／Ｅｔ粉末をフ
ラスコの側面からすすぎ洛とした。最終的に透明な暗橙
色のシロップが形成されたので、これを室温に２時間放
置すると、この時薄層クロマトダラフイー（シリカ、４
９：１ｖ／ｖ　　クロロホルム−メタノール）は、反応
が完了していることを示した。この反応混合物を水で希
釈し、トルエンで洗浄した。水性相’＠ＮａＨＣＯ３で
部分中和してｐＨ２としてトルエンで再抽出した。プー
ルしたトルエン相をＮ　ａ　ＨＣＯａ水溶液で一回洗浄
した後、Ｎａ２ＳＯ４上で一夜乾燥させた。トルエンを
蒸発させると、黄橙色のゴム、６３．４■が残った；こ
れをジ−インプロピルエーテルを用いて研和すると、は
じめにこのゴムが溶解するがまもなく非常に淡い黄色の
粉末が結晶して出て来た。これを濾過して乾燥させたと
き、２ａの結晶は重さ４３．８■、ロアマイクロモル、
６°５％収率、であった。

ＮＭＲ（８０Ｍｈ、　ＣＤＣｌ３＋ＣＣＪ４）　：　９
．９６　、　ｓ　、　ＩＨ；９．６１．ｄ、ＩＨ，９Ｈ
ｚ；　　７．７５．ｄ、９Ｈｚ、７．７１．ｄ、８Ｈｚ
全体で２Ｈ；６．８−６．６．ｍ、４Ｈ；　　５．１２
．ｓ、２Ｈ；４．４５．ａ、４．２３．ｑ、７Ｈｚ、４
．０８．ｓ、４．０３．ｑ、７．Ｈｚ全全体１６Ｈ；　
　２．１４．ｓ、３Ｈ；　　１．２４．ｔ、７Ｈｚ。

１．１３　、　ｔ　、　７Ｈｚ、全体で１２Ｈ臭化アセ
トキンメチルの製造方法 臭化アセトキシメチル、ＣＨ３ＣＯＯＣＨ２Ｂｒ　、　
　は、メチレンジアセテ−）４．０ｇ（３０ｍＭ）およ
び臭化トリメチルシリル５−０９　（３３ｍＭ）を、無
水ＺＣＩＣ１２６０ηを存在させるが溶媒は加えないで
室温で４８時間かくはんすることにより製造した。

生成物を、１０トル、４０−６０°でざっと蒸留した後
、１０）ル、５５−５７°でビグロー（Ｖ４ｇｒｅａｕ
ｃ　）カラムを通して再精留すると、４．０４ｆｉ、８
７％が得られ、ＢｒＣＨ２０Ｃｆｉｚ　ＢｒはＮＭＲに
より検知できなかった。ルイス酸触媒作用は必須であり
、これがなげれば封管中１１０°に一夜おいても反応は
起こらない。メチレンジアセテートはバラホルムアルデ
ヒドおよび無水酢酸から製造され（参考文献３５を参照
）注意深く蒸留してＣＨ３Ｃｏ０ＣＨ２ｏＣＨ２０ＣＯ
ＣＨ３ヲ除去シタ。

実験法 本新規染料の合成および試験に使用した実験法には次の
ようなものが含まれる： ＵＶ吸収スペクトルを２２±２℃でキャリー（Ｃａｒ７
）　２１０分光光度計で記録した。螢光ス、ベクトルは
パーキｙ　−ｘ　ルーｒ　−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ）　ＭＰＦ’−４４Ａ螢光分光光度計またはスペック
スフルオロログ（Ｓｐｅｘ　Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ）　１
１１のどちらかで記録したが、これらはどちらもローダ
ミンＢ量子計数装置を用いた比率型である。発光モノク
ロメータ−および光電子増倍管に対する補正率は基準化
合物のスペクトルをそれらの公知の量子分布（参考文献
９を参照）と比較することにより得られた。量子収率は
、補正した試験試料の発光スペクトルの積分をＩＮ硫酸
中のキニン重硫酸塩の溶液のそれと比較することにより
決定された。キニンの濃度を、励起波長でこの試料と同
じ吸光度を与えるよ５に調整した。キニンの量子効率は
０．５５とした（参考文献１０参照）。

高いイオン強度でのＥＧＴＡのカルシウムおよびマグネ
シウム親和力は１２５マイクロモルづつのＥＧＴＡ（フ
ル刀−ケミカＡ／　（Ｆ’１ｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　）　。

ｐｕｒｉｅｓグレート９〕を１．ＯＯＭＫＯＨ（：）エ
イ・ティー・ベイカー（Ｊ、Ｔ、−、”イカ−）、低炭
酸塩〕で滴定することにより測定した。ＥＧＴＡは、２
２５ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭＭａＣ１，およびある場合ニ
ハ１０ｍＭ　ＣａＣｌ２または２１　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ
　　’ｌ含有する２５−の媒質中に溶解させた。この溶
液を、放射計（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）　’ｒＴＡ８０
滴定器中でかく話中し、連続的に窒素ン通して泡立て、
そして１８℃に温度調節しながら、ＫＯＨをＡＢＵ８０
　　自動ビユレットから、００５または、０１ｄ　のア
リコートとして添加した。ｐＨをＰＨＭ８４計器で測定
し、Ｇ２０４０Ｃ電極およびＡｇ／ＡｇＣＪ基準電極を
、３　Ｍ　ＫＣｌで満たした１、０１　インチのカテー
テル管材料１本によって滴定溶液につなぎ、この電極鎖
は、米国標準局処方書（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｕｒｅａ
ｕ　ｏｆＳｔａｏａａｒａｓｒｅｃｉｐｅθ）に従って
製造したフタル酸塩（４，００１）、燐酸塩（６，８８
９）、および硼砂（９，２４５）緩衝剤を使って検定し
た。各滴定における５０ないし８０のｐＨの読みを、セ
イス（Ｓａｙｃｅ）のフォートラン（ＦＯＲＴＲＡＮ）
　　プログラム５ＣＯＧＳＫより分析した（参考文献３
６を参照）。

こうして得られるＥＧＴＡに対するプロトンイオン化定
数は９．５３７および８．９６１であり、これらは各々
計算された不確定性±０．１２および士、００８をとも
なっていた。これらのｐＫａ値は“混合された”定数、
丁なわちａＨ＋（Ｆ２ＧＴＡ’−）／（Ｈ’ＥＧＴＡ３
−）　−１０Ｍ（ここでａｎ　＋−１０−ｐＨ）である
。

−９，５４ Ｃａ″ＥＧＴＡおよびＭｇ″ＥＧＴＡに対するｌｏｇ絶
対安定度定数は、１０．７７７±、０１１および４．５
６７±、０２１であると計算された；Ｃａ″ＥＧＴＡお
よびＭｇ″ＥＧＴＡに対するプロトンｐＫａ　’　は各
々３．５１±、４９および７．８８５±、０５で得られ
た。このイオン強度およびすべてのｐＨ＞４で、有効安
定度定数”Ｑ＆は（ａｎｔｉｌｏｇ　１０．７７　）　
・（１＋ａｎｔｉｌｏｇ（３，５１−ｐＨ）　）／（１
＋ａｎｔｉｌｏｇ　（９，５３７−ｐＨ）　＋ａｏｔｉ
ｌｏｇ（９，５３７＋＆９６１−２・ｐＨ）Ｃ単位リッ
トル１モル）として計算することができる。同様Ｋ　”
　Ｍｇ　−（ａｎｔｉｌｏｇ４．５６７　）　・（１＋
ａｎｔｉｌｏｇ　（７，８８５−ｐＨ）　）／（１＋ａ
ｎｔｉユｏｇ（９，５３７−ｐＨ）＋ａｏｔ１１ｏｇ（
９，５３７＋８．９６１−２・ｐＨ））。

遊離の（Ｃａ　　）水準は、ｏ、　ＩＭ　ＫＣＩ中ｐＨ
７，００ｐ２０℃テ３８０ｏＭ；　０．　Ｉ　Ｍ　ＫＣ
ｌ１中ｐＨ７，２０，２０’Ｃで１５１ｎＭ；　１３０
ｍＭＫＣｌ　、　ＮａＣＪ　２０ｍＭ中ｐＨ７，０５、
３７℃で２１４ｎＭ；　および２２５ｍＭＫＣｌ。

２５ｍＭＮａＣＪ中ｐ）１７．０２，１８℃で４９０ｎ
Ｍ；のＣａ−ＥＧＴＡに対する見かけの解離定数を仮定
してＣａ−ＥＧＴＡ緩衝液により調節した。最初の３つ
の見かけの解離定数を参考文献１および１２で論議した
ようにマーチル（Ｍａｒｔｅｎ　）およびスミス（Ｓｍ
ｔｔｈ）の表（参考文献１１を参照）から計算した。最
後の値は、比較的高いイオン強度では適轟な絶対定数が
得られず、生物学的文献（参考文献１３−１７参照）中
にある推定値は受は入れられないほど大きな領域、すな
わち）　０．５　ｌｏｇ単位で変わるので、この研究で
新しく決定した。この決定のために我々は過剰の金属イ
オンの存在および不在におけるｐＨ滴定という典型的な
信頼できる方法を選んだ（参考文献１８参照）。詳細は
上記の合成法の項に示されている。

遊離の（Ｍｇ　　）は同様に、１３０ｍＭＫ（Ｊ中ｐＨ
７，１８，２０°で２１ｍＭ；　　１３０ｍＭＫＣｌ、
　２０ｍＭＮａＣ７中ｐＨ７，０５，３７°で８．９６
ｍＭ、および２２５ｍＭ　ＫＯ／　、　２５ｍＭ　Ｎａ
ＣＡ！中ｐＨ７，０２，１８°で９９ｍＭ；のＭｇｆＧ
ＴＡに対する見かけの解離定数を仮定して、Ｍｇ−ＥＧ
ＴＡ緩衝剤によって調節した。ここでも、最後の値は、
この研究で新しく決定した。

重金属結合定数は、次のようにして測定した。

ｚＤ２＋に対する５ｔｉｌ−１およびｆｕｒａ−２の親
和力は、１２０ｍＭＫＯＡ！、　５ｍＭＫ２Ｈ２ＥＧＴ
Ａ、１０ｍＭＭ０ＰＳ。

５ｍＭＴｒｉｓ中の１−２マイクロＭの染料をマイクロ
メーターシリンジから小出しにしたＩ　Ｍ　ＺｎＣ１ｚ
で滴定することにより測定した。この滴定の各段階（添
加した全Ｚｎ　Ｃ１２０から７ｍＭまで１３段階）で、
塩基を用いてｐＨが７．１２の、０２単位内にあるよう
に調節し、実際のｐＨ値’ｇｐＺｎ　の計算のために記
録し、室温で励起スペクトルを記録した。

そのスペクトル群は図３とほぼ同様の外観を有しており
、３４０および３８０　ｏｎでの螢光のヒル（Ｈｔ　１
１　）プロットにより、すなわち、ｌｏｇ（（Ｆ’−Ｆ
ｍｉｎ　）／　ＣＦ！ｌ１ａｘ−Ｆ’　）　）対１０ｇ
〔遊離ｚＯ〕（ここでＦｍ１ｎおよびＦｍａｘは各々ゼ
ロＺｎ　　および過剰２＋ ＺＯでの螢光である）をプロットすることにより、同様
に分析した。遊＠ＺＯの計′ｉ￥　Ｋは、２＋ Ｚｎ　　に対するＥＧＴＡの有効解離定数を、ｐＨ７，
１１で４．２７ｏＭでありｐＩ′ｉの、０１増加あたり
、　０２　ｌｏｇ単位減少するようにとった（参考文献
１１参熊）。

２＋　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２＋Ｍｏ　　およびＦ
ｅ　　はｆｕｒａ−２１：消すので、Ｃａと比較したこ
れらのイオンに対する親和力は、各々化学量論的に過剰
な金属イオンの間の直接競争によって評価することがで
きた。ヘスケス（Ｈｅｓ−ｋｅｔｈ　）外の方法（参考
文献２６参照）に類似のこの方法にはＥＧＴＡまたはそ
の他の緩衝剤は含まれない。室温で０．５マイクロＭの
ｆｕｒａ−２の螢光は、１００ｍＭＫＣｌ、　　１０ｍ
ＭＫＭＯＰＳ、　ｐＨ７，２を含有する溶液中で記録し
た。一つのシリーズではまた０、０．１またはｌ　ｍＭ
のＭｏ　ＳＯ４と０　、１．１　、２．２　、４．４ま
たは８．８ｍＭのＣａ　Ｃｌ　２　　とを含有しており
；別のシリーズでは２ｍＭのＣａＣ１２と０．０．１．
０．２，０．５゜１、．２ｍＭのＦ’ａ　（ＮＨ４）　
２（ＳＯ４）　２　　とを有シ；ソシテ第三のシリーズ
では、０．２　ｍＭのＦｅ　（ＮＨ４）　２（Ｓｏ、　
）　２と０．０．２，０．４，０．８，２．４および８
ｍＭのＣａＣＡ！　ｚとを含んでいた。Ｆｅ（ＩＩ）に
ついての測定は、隔壁により密封し絶えず窒素で泡立て
ているクヴエット中で行ない、溶液は実験の終了後に隔
壁？とり除くまで透明でほぼ無色のままであり、隔壁の
除去により黄色のＦ”ｅ　（ＯＨ）　ａ　　が迅速忙析
出した。

膜ヘノ結合は、１４５ｍＭＮａＣＡ’、５ｍＭＫ（Ｊ。

１０ｍＭ　ＭＯＰＳ、１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ
ＭｇＣＪ２および１ｍＭＥＧＴＡまたは１　ｍ　Ｍ　Ｃ
ａ　Ｃ１２のどちらかを含有する媒質中の％１．５ｄの
容量の２マイクロＭ　ｆｕｒａ−２、ｆｕｒａ−３、ま
たは１ｎａｏ−１に、十分に洗浄してから沈殿させたヒ
トの赤血球０．３ｄづつを加えることによって評価した
。数分間平衡させた後、懸濁液を遠心分離し、上澄みの
螢光を前面形状寸法により測定した。赤血球を加えた平
衡の前のその水準からの螢光のわずかな損失は、赤血球
中の残留細胞の外の水による希釈またはもれた痕跡量の
ヘモグロビンからの内部フィルター効果もまた螢光を減
らす傾向があるであろうから、膜への染料の結合に関し
ての上限であるとした。

本発明の特性と具体化は、下記の実施例にその概略が示
される。このような実施例は詳しい説明を目的としてい
るだけで、決して特許請求の範囲の趣旨を制限しようと
するものではない、Ｃａ　　の存在下または不在での、
５ｔｉｌ−１゜５ｔｉｌ−２、１ｎｄｏ−１、ｆｕｒａ
−１、ｆｕｒａ−２およびｆｕｒａ−３により例示した
ようなここに示した新規指示薬についての吸光度および
螢光特性７１下記の表Ｉに示す。この表中のデータが示
すように、新規指示薬に対する吸収ス４クトルはスチル
ベン発色団に対して期待される範囲内にある。吸光最大
値は近紫外の中にあり、吸光係数は２−３Ｘ　　　　　
１０Ｍ　　ｃｒｎ　の領域内である。表Ｉ中のデータは
またＣａ　　の結合がすべての吸収スペクトルを短波長
側にシフトさせることをも示している。

この中に示す新規指示薬に対する螢光励起スペクトルは
吸収スペクトルと同様に（Ｃａ　　）が増大するにつれ
て短波長にシフトする。一つの例が図３に示されている
が、これには（Ｃａ　　）を変化させた検定緩衝液中の
ｆｕｒａ−２に対する一組の励起スペクトルが表わされ
ている。このような検定データが与えられると、本染料
を含有する未知溶液中の（Ｃａ　　）をその励起スペク
トルの形から演鐸することができる。この検定のために
解明された式は、実施例■で誘導される。螢光励起スペ
クトルと比べ、それが発光波長シフトについては各本指
示薬の間には大きな変化がある。本化合物はすべて多少
のシフトを示すけれども、インドール型の化合物（１ｎ
ｄｏ−１によって例示したような）だけはかなりのシフ
ト乞示す。

スチルベン型（５ｔｌｌ−１および５ｔｉｘ−ｚにより
例示）およびベンゾフラン型（ｆｕｒａ−１，ｆｕｒａ
−２およびｆｕｒａ−３により例示）指示薬は、　Ｃａ
　　を結合させたときその発光波長χはとんど変えない
ので、°異なる（Ｃａ　　）でのそれらの発光スはクト
ル群は、すべての曲線がお互いに交わる点を示さない。

このことはインドール型指示薬についてはあてはまらな
いことであるが、それはこれらの２＋ Ｃａ　　−錯体がそのＣａ　　を含まないものよりもは
るかに短い発光波長を有しているからである。

したがって、１ｎｄｏ−１によって例示したようなイン
ドール型の発光スペクトルは、それか、Ｃａ乞含まない
形およびＣａ　　−結合した形を励起させる相対効率に
彫響を及ぼすため、その位置が励起波長に依存している
明らかな交錯点を示す。これは、図４に具体的に示され
ている。この図はまた、励起波長３５５−３５６　ｎｍ
　（クリプトンレーザーにより得られるであろう）で１
ｎａｏ−１が、長波長および短波長のピークが匹敵する
大きさを有している発光スペクトル群を与えることをも
示している。

全新規指示薬に対する螢光の量子収率は非常に注目すべ
きものであり、Ｃａｉともなう１ｎｄＯ−１およびｆｕ
ｒａ−２に対しては約０．５までに上る。

すべての場合にＣａ　　−錯体はＣａ　　を含まない染
料より１．３倍から２１倍高い量子効率を有している。

比較すると、Ｃａ　　を含む場合と含まない場合のｑｕ
ｉＱ２の量子効率は各々０．１４および０．０２９であ
る（参考文献６を参照）。半飽和のｆｕｒａ−２は、半
飽和のｑｕｉｎ−２より４ないし５倍高い量子効率を有
しており、　ｆｕｒａ−２はｑｕｉｎ　２よりも約６倍
高い吸光係数ン有しているので、ｆｕｒａ−２はｑｕｉ
ロー２よりも約３０倍明かるいはずだと予測されるであ
ろう。この判断は図５によって確証される。すなわち図
５は、高Ｃａ　　および低Ｃａ　　での１マイクロＭの
ｆｕｒａ−２の螢光は、全く同じ条件下でのλＯマイク
ロん１のｑｕｉｎ　２のそれＫよりはさまれていること
を示している。

ここに示した、キレート化剤ｏｔｉニー１　、５ｔｉｌ
−２、１ｏｄｏ−１、ｆｕｒａ−１、ｆｕｒａ−２およ
びｆｕｒａ−３により例示されるような新規指示薬に対
する解離定数（下記の表Ｉ参照）は、イオン強度０．１
位から０．５で１１００−３００ｎの範囲内である。こ
のような値は、親化合物ＢＡＰＴＡ　（参考文献６参照
）の解離定数（１１０ｎＭ）に近く、残りの発色団を形
成している置換基はわずかに電子？ひきつげるだけであ
ることを示す。ｆｕｒａ−２はもつと高いイオン強度、
約２５０ｍＭ　（２２５ｍＭＫ（Ｊ、２５ｍＭＮａＣ１
）でも検査した。Ｃａ　　結合強度Ｋかなりの減少が観
察され、見かけの解離定数は７６０ｎＭとなった。

このように強いイオン強度への依存性は４価陰イオンの
２価陽イオンとの反応に関しては驚くべきことではない
。

ここに示した、５ｔｉｌ−１およびθｔ１ニー２により
例示したようなスチルベン型の指示薬は、シスおよびト
ランス異性体として存在することができる。

両異性体はウィツテイヒ反応の生成物（例えば■。

■およびＸＶ）　に含まれている。これらの異性体の分
離はθｔｉ１−１／ＭθおよびＥｔについてのみ試みら
れた。ＡｇＮ０３Ｑ含ませたシリカ上の薄層クロマトグ
ラフィー（クロロホルム：メタノール９：１または１９
　：　１　ｖ／ｖ）はかろうじて日ｔｉｌ−１／Ｅｔ　
　の２つの異性体を分割することができ、シス異性体の
方がゆっくり移行″′ｇ″４・。オクタデシル逆相カラ
ム〔スペルコシＡ／　（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｘ　）　Ｌ
Ｃ−１８２５ｃ扉Ｘ　４．６　ｍｍ、ペンシルバニア州
、ベルフオンテ、スペルコ社（Ｓｕｐｅｌｃｏ、　ＩＤ
Ｃ，）　：ｌ上の高圧液体クロマトグラフィーおよび９
２：８ｖ／ｖ　メタノール−水による溶離によっても両
異性体を分離できた。各々の場合にシス−異性体はその
非螢光により識別された。所望のトランス異性体の予備
単離は、エステル、　５ｔｉ１−１／Ｍｅ　Ｙ　＜り返
し再結晶させることにより最良の結果が得られた。暗所
での純粋なトランスエステルのけん化はトランス−ペン
タ−陰イオンを与えるために行なわれた。水溶液中のこ
の陰イオンに３６５　ｎｍの光を照射てると、長波長の
吸光度と螢光の両方が減少した。

トランス異性体のみが螢光性であると仮定すると°２＋ （参考文献２５参照のこと）、Ｃａ　　の不在での光定
常状態は約７５チのトランス体、２５％のシス体ヲ含有
している。このシス体に対するトランス体の比率は、ス
チルベンの光定常状態に対して異常に高い。もし、もと
のシスおよびトランス異性体の混合物を含有する粗製の
５ｔｉｌ−１／Ｍｅを加水分解するならば、この陰イオ
ン混合物の照射が吸光度と螢光とχ増大させる。光異性
化は、トランスｅｔｉｌ−１の螢光指示薬としての使用
ンかなり錯雑させる。Ｃａ　　測定が始まる前に光定常
平衡に達するために５ｔｉｌ−１を強（光照射すること
、およびその時でさえ励起ビームの強度を最小にして、
ある１つの励起波長での絶対螢光強度からよりもむしろ
２つの波長での励起効率の比からＣａ”？読むことが必
要となってくる。不幸にして、５ｔｉｌ−１はまた、シ
ス−トランス異性の上にもう一つ遅いとはいえ、光化学
反応をも受ける。この遅い反応により長い（）３００ｎ
ｍ）励起波長での螢光が徐々に起こってくる。これは、
θｔｉｌ−１の試料を非常に低い（Ｃａ　　）で光照射
してからその励起スペクトルの測定の間高いＣａ　　に
暴露するとき最も顕著である。もつともらしいが証明さ
れていない説明は、非螢光性のシス異性体が光源化して
、比較的長い励起波長で極めて螢光性に冨むフェナンス
レン（参考文献２５参照）となるということである。こ
うしたスチルベン類の複雑さすべてが、示された１ｎｃ
ｌｏ−型およびベンゾフラン−型の染料の合成（これら
の染料ではこのような光化学反応は複素環の形成により
妨げられる）を好ましいものとする。

競争する陽イオンに対する結合定数は、ｆｕｒａ−２に
ついて最も完全に調査された。Ｍｇ　　を用いた滴定（
図６参照）は、０．１−０．１５　Ｍイオン強度で、３
７℃で約５．５ｍＭセして２０’で９．８ｍＭという解
離定数を示した。それ故に、　ｆｕｒａ−２はｑｕｉｎ
２〔このＭｇ　　解離定数は３７°およびほぼ２２°で
各々約１ｍＭおよび２ｍＭである（参考文献６および７
参照）〕はど強＜Ｍｇ　　を結びつけない。その上、図
６を図３と比較することにより分かるように、ｆｕｒａ
−２ス（クトルに関するＭｇ　　　結合の効果は、Ｃａ
　　の効果と比較して非常に小さい。さらに、極端に高
い水準（１００ｍＭかそれ以上）までＭｇ　　ｉ増大さ
せると、励起スペクトルはそれ以上に上がるどころかむ
しろ下がってしまうことになる。この挙動は２Ｍｇ２＋
−１染料錯体が部分形成されていることを反映している
であろう。

ｆｕｒａ−２の、生理学的により重要な２価重金属のあ
るものへの結合もまた、簡単に検査された。

ｅｔｉｌ−１およびｆｕｒａ−２は両方とも解離定数的
１、６−２　ＩｌｌＩＭ（ｐＫｚ、　　８．６−８．ａ
　）で亜鉛と結合する。これらの値はＺｎ　　：Ｃａ　
　５先の大きさの程度が２であることを示すけれども、
これらは、大きさの程度３．５でＺｆｌＩ　　がＣａ　
　に対して優先するｑｕｉｎ　２に対する値よりも良好
である（参考文献２６＄照）。不思議なことにＺｎ　は
Ｃａ２＋と同じようにｆｕｒａ−２スペクトルをシフト
させるが、一方２Ω　はｑｕｉｐ　２　Ｙ消滅させ、そ
のため２＋ Ｃａ　　　と反対に作用をする。Ｍｕ　　をしりぞける
点でｆｕｒａ−２もまたｑｕｉｎ２　　よりも優れてお
り、Ｍｏ”：　Ｃａ２＋優先は各々４２倍および５１０
倍である（参考文献２６参照）。不安定な細胞内の銀の
主酌化状態は＋２であり（参考文献２７参照）；２＋ Ｆ’ｅ　　はＣａ　　より３ないし１０倍強（ｆｕｒａ
−２を結合させる。もつと正確な推定値は実験上のばら
つきによって妨げられたが、このことは１：１よりもさ
らに複雑な化学量論または不完全な無気条件を反映して
いるであろう。Ｍｎ　　およびＦ’ｅ　”は多くの不対
電子？もつ金属について期待される通り、ｆｕｒａ−２
’％：消減消滅る。これに比べて、ＮＧＴＡは各々約５
０、約２０、および約８−倍の率でＣａ　　に対してＺ
ｏ、Ｍｏ　　およびＦ’ｓ　　を優先する（参考文献１
１参照）。

生理学的領域内でのｐａの変化のｆｕｒａ−２に関する
効果は、非常に小さいように思われる。図７は、合理的
な細胞白値領域にわたるｐＥ１変化が２＋ Ｃａ　　Ｙ含まないかまたはＣａ　　結合したもののス
にクトルまたは有効Ｃａ　　解離定数にほとんど影＠１
を及ぼさないことｔ示す。

添加および除去が容易であるため、赤血球な結合の試験
のためのモテルの膜として使用した。溶液中１７チのｆ
ｕｒａ−２、ｆｕｒａ−３または１ａｄｏ−ＩＹ含むヘ
マトクリット管に加えた後、遠心分離した赤血球は上澄
みの螢光を５チ未満減少させた。この螢光のわずかな低
下は、充てん赤血球とともに加えられた避けることので
きない少量の細胞外液体による希釈そのものであり得た
。たとえそれが完全に結合のせいであるとしても膜に結
合した染料の量は厚さ０．２ミクロンの隣接水溶液の層
に含有されるものよりは少ないであろう。このような無
視できる結合は、媒質が１ｍＭのＣａ　　を含有してい
ようとＣａ　　なしのｍＧＴＡＹ含有していようと、見
出された。

ここに記載した新規染料の重要な特徴は、Ｃａ”＋が強
度ではなく、螢光スペクトルの形および波長分布を変化
させる能力である。ｑｕｉｎ−２も２＋ Ｃａ　　によりそのピーク励起波長ｔシフトさせるけれ
ども（図５参照）％実際にはその励起スペクトルの長−
波長末端はあまりに低い強度をもち、２＋ Ｍｇ　　Ｋ対してあまりに敏感である。そのためｑｕｉ
ｎ−２はほとんどいりでも３３９　ｏｍに中心をおく励
起に使用されてきた。これらの条件下ではその染料を高
Ｃａ　　飽和と低Ｃａ　　飽和という２つの公知の状態
に無理にもっていく実験の終りの破壊検定と比較するま
で、与えられた細胞内ｑｕｉｎ−２からの螢光の読みは
定量的な意味をもだない。どんな間に入る染料の損失ま
たは計器の感度の変化も検定ン危＜シ、（Ｃａ　　）ｉ
における変化と間違えられるかもしれない。これと対熱
的にもし染料がＣａ　　を結合したとき波長をシフトす
るならば、ちょうど２つの励起波長ラムダーおよびラム
ダ　でのその染料の螢光の強度工□および■　の比Ｒは
、全染料濃度、ＤＴ１路長、または計器の絶対感度と無
関係に、一般原則として（Ｃａ”）ｗ計算するのに十分
である。この終りまで、単位濃度および励起波長ラムダ
□およびラムダ２での全（Ｃａ−ン含まない染料の螢光
を２＋ Ｆ　およびＦＡ２であると定義しよう。完全にＣａｌ で飽和された染料に対する類似のパラメータはＦ　およ
びＦ　である。各濃度Ｄ　およびＤＢでＢＩ　　　　　
　　　Ｂ２　　　　　　　　　　　　　　　Ａの遊離指
示薬とＣａ　　結合した指示薬との混合物については、
総螢光強度は： ニーＤＦ＋ＤＢＦＢ１（■ａ） ＡＡＩ １鍵ＤＦ　　＋ＤＢＦＢ□　　　　（１ｂ）ＡＡ２ によって与えられるであろう。しかしながら、Ｄ　およ
びＤＢは、１：１錯化に対する方程式、Ｄｐ−ＤＡ（Ｃ
ａ　　）／Ｋａ　　　　　　　（２）によって（Ｃａ　
　）に関係づけられる、ここでＫａは、有効解離定数で
ある。螢光比Ｒは、比重、Ａ２−（ＤＡＦＡよ＋ＤＢＦ
Ｂ□）／（ＤＡＴＡ２＋ＤＢＦＢ□）−（Ｆ’　　＋Ｆ
　　（Ｃａ”）／Ｋｄ）／ＣＦ’、＋Ｆ’Ｂ□（Ｃα２
”）／Ｋｄ）ＡＩ　　　Ｂ１ −Ｒ（３） である。（Ｃａ　　）について解くと、検定方程式：が
得られる。ＦＡ□／ＦＡ□は単にＲがゼロ〔Ｃα２＋〕
でもつことのできる極限値であり、そのためＲｍｉ。と
考えることができ、一方ＦＢ□／ＦＢ□は、その比が飽
和ＣＣａ　　）でもつ同様の極限値Ｒｍａ　ｘであるこ
とて注＊されたい。それ故に、上記の方程式は： と書くことができるが、これは唯一つの波長での強度値
を用いる染料についての検定方程式二によく似た形であ
る。両方穆式（５）および（６）は、この染料がＣａ　
　と単純な１：１錯体を形成すること（方程式２）、そ
れが検定媒質中と同じように細胞内で行動すること、お
よびそれが十分に希薄であって螢光の強度は螢光性物質
の濃度に比例すること（方程式１）を仮定している。し
かしながら方程式（６）は、Ｆ％Ｆｍ１ｎ、およびＦｍ
ａｘがすべて同一の計器感度、光路長、および染料の有
効総濃度、で決定されることを必要とする。Ｆ’ｒｎａ
ｘおよびＦｍ１ｎ　Ｙ：測定するための唯一のほんと５
に確実な方法は、細ＪｊＪＹ溶解し、解放された染料を
滴定することに必要とするので、これらの要求は、単一
層に限定された細胞を観察するかまたは顕微鏡下または
流動血球計算器中で細胞を観察するときは満足するのが
むずかしい。クヴエット中に懸濁させた離解細胞を用い
たときだけ、光路中の染料濃度は溶解にもかかわらず変
化しないままであることを期待することができる。これ
らの方法は、例えば染料なＣａ　　で飽和させた後それ
？Ｍｏ”で消滅させるためにイオン泳動を用いることに
よって、溶解馨ともなわないで検定するために提案され
たけれども（参考文献２６参照）、イオン泳動がこの仕
事を完全圧行なう証拠は溶解との比較に基づく、このよ
うな方法も主記録期間中の漂白または漏れによる染料の
損失を補償しない。比および方程式５を用いると、染料
含有量および計器感度は、それらが各地中で消えるので
、自由に１つの比ともう１つの比との間で変わることが
できる。もちろん、各々の単一定量の測定の範囲内で安
定性が必要とされ、またＲ、Ｒｍｉｎ、Ｒｍａｘも、ど
の波長の偏りもそれらのすべてに等しく影響を及ぼすよ
うに、すべて同一の手段で測定されなくてはならない。

図３からの励起ラムダ□−３４０ｏｍおよびラムダ２＝
３８０ａｍでのデータは、Ｒｍｉｎ　ＷＯ，７６８，Ｒ
ｍａｘｍ３５．１、ＦＡ２／Ｆ８□−１５，３、および
Ｋｄ−１３５０Ｍで方程式５によ（一致する。明らかに
これらの方程式は１ａｄｏ−１の発光比にちょうど当て
はめられる。発光ラムダ□＝４００ｏｍおよびラムダ２
２−４９０ｎでの図４のデータに対しては、Ｒｍｉｎ−
０，１２１、Ｒｍａｘ−２，６０、ＦＡ２　／ＦＢ２７
２．０１およびＫｄ＝２５０ｎＭである。

比演算が２つの主たる不利？有することは特に注目され
ねばならない。もしも組織の自己螢光が有意のものであ
るならば、比を形成する前にこれを引かなくてはならず
、一方それがカルシウムに依存していない限り、これは
方程式６においては自動的に消える。幸いにして、本新
規染料の明かるさのため自己螢光を圧倒することは容易
である。

励起波長を丁ぼやく交代させ、螢光の強度の比を計ｎｊ
る手段もまだ標準通りには得られない。カリフォルニア
大学の我々の実験室では、我々は、２つの光源と２つの
モノクロメータ−とが、１゜−３０Ｈｚで回転している
蝶の形をした扇形鏡によって交代で選択されるクステム
を作成した。強度の大きな変動の相殺は単一層および単
一小細胞を研究するには全く価値がない。しかしながら
、流動血球計算において安定な相対強度の逐次励起波長
を与えることは比較的困難であり、そのため１ｎｄｏ−
１の発光シフトにより、それがこの出願で特に人目をひ
くものとなっている。

【図面の簡単な説明】

第１図は５ｔｉｌ−１、５ｔｉｌ−２及び１ΩｄＯ−１
に導く合成経路を説明する化学的フローチャートである
、第２図はｆｕｒａ−１、ｆｕｒａ−２及びｆｕｒａ−
３に導く合成経路を説明する化学的フローチャートであ
る。 第３図は、くＯＭから〉１０μＭまでの範囲の遊離Ｃａ
２＋値を含む緩衝液中のｆｕｒａ−２の２０℃における
励起スペクトル系列を示すグラフである。 第４図は、遊離Ｃａ　　の関数として１ΩｄＯ−１の発
光スペクトルを示すグラフである。 第５図は、同じセットの条件下における１μＭｆｕｒａ
−２と３０μＭ　ｑｕｉＤ２の励起スペクトルヲ示すグ
ラフである。 第６図は、ｆｕｒａ−２４Ｃ対するＭｇ　　の影響な示
すグラフである。 第７図は、零、２００ｎＭ及び１ｍＭの遊離Ｃａ”にお
けるｆｕｒａ−２に対する６、７５〜７．０５のｐＨ変
化の影響を示すグラフである。 ６　　　　　　　　図面の浄書（内容に変更なしン手続
補正３（方式） 昭和６０年！２−月一６日 １、事件の表示 昭和６０年　シー１″＋願第　ｔ’１７ぷ３Ｉ　号３、
補正をする者 事件との関係　　　出　願　人 住所 Ｓｆ＃￥　す″、レーケ゛ン゛／　オフ”す′°・ユニ
ハ′°−ンティ・せ７゛カリ７第１し一ヤ ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和６０年　１１月−日（発送
日）６、補正の対象 口Ｉｆ＋の旨ｔｃａｂ’＃―口 法人国二証明言及訳文 ２補正の内容 手続補正書 昭和６０年７Ｄ月２／９日 ２、発明の名称 −カルシウム特異性叶い光指示薬染料 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 ４、代理人 ６、補正の内容 ＋１）　　明細書第４４貝下６行の「Ｃ０〜Ｃ４」を「
Ｃ１〜Ｃ４」と補正する。 以　　　上

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中 Ｒ＾１は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−Ｆ、−Ｃｌ及び−Ｂｒか
   ら成る群から選択され； Ｒ＾２は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ及び
   Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルコキシから成る群から選択され； Ｒ＾３またはＲ＾３＾ａは互いに関係なくＨ；または−
   ＣＯ＿２Ｈ、−ＣＯ＿２Ｒ＾４、−ＣＯＮＲ＾５Ｒ＾６
   、−ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿２ＮＲ＾５Ｒ＾６、−ＳＯ＿
   ２ＣＦ＿３、−ＣＯＣＨ＿３及び−ＣＮから成る群から
   選択された極性電子求引性 官能基であるか、または Ｒ＾３またはＲ＾３＾ａは一緒になって−（ＣＯ）ＮＲ
   ＾５（ＣＯ）−であり； Ｒ＾４はα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受
   容できるエステル化基であり； Ｒ＾５とＲ＾６は互いに関係なく−Ｈ、メチルまたはエ
   チルであり； Ｚはトランスエチレン結合を通して、１つの２−アミノ
   フェノキシ環の５位置に結合した 芳香族またはヘテロ芳香族系であり、該エ チレン結合自体が芳香族またはヘテロ芳香 族環系の一部であってよく； ＷはＨであり、ＸもＨであるか；または ＷとＸは一緒になってＯまたはＮＲ＾５であり；ＹはＨ
   であり、Ｙ′もＨであるか（ＡがＮＲ＾５、ＯまたはＳ
   でないかぎり）；または ＹとＹ′は一緒になってＮＲ＾５であり、ＡがＣであり
   ； ＡとＡ′は互いに関係なくＣ、Ｎ、ＯまたはＳであり； ＤはＯ、Ｎ、ＮＨまたはＮアルキルであり；ＱはＤがＮ
   である場合には二重結合であり、他の場合は単結合であ
   り；ならびに Ｒ＾７はＨであり、Ｒ＾８もＨであるか；またはＲ＾７
   とＲ＾８は、ヘテロ原子Ｄ、Ｒ＾７に隣接する炭素、及
   びＲ＾８に隣接するフェニル環と一緒になつてキノリン
   環系（Ｄ＝Ｎ、Ｑ＝二重 結合）を形成する〕 を有する化合物ならびに薬剤学的に受容できるその非毒
   性塩及びエステル。
2. （２）四酢酸エステルがα−アシルオキシアルキルエス
   テル基を含む特許請求の範囲第１項記載の化合物。
3. （３）該α−アシルオキシアルキルエステル基がアセト
   オキシメチルエステル基である特許請求の範囲第２項記
   載の化合物。
4. （４）Ｚがベンゼン環であり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＹ′が−
   Ｈである特許請求の範囲第１項記載の化合物。
5. （５）ＷとＸが一緒になつて酸素であり、エチレン橋と
   １個の２−アミノフェノキシ環とともに、置換ベンゾフ
   ランを形成する特許請求の範囲第１項記載の化合物。
6. （６）Ａが炭素であり、ＹとＹ′が一緒になつて窒素で
   あつて、エチレン橋及び環Ｚとともに置換インドールを
   形成する特許請求の範囲第１項記載の化合物。
7. （７）次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中 Ｒ＾１は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−Ｆ、−Ｃｌ及び−Ｂｒか
   ら成る群から選択され； Ｒ＾２は−Ｈ、−ＣＨ＿３、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ及び
   Ｃ＿１〜Ｃ＿４アルコキシから成る群から選択され； Ｒ＾３またはＲ＾３＾ａは互いに関係なくＨ；または−
   ＣＯ＿２Ｈ、−ＣＯ＿２Ｒ＾４、−、ＣＯＮＲ＾５Ｒ＾
   ６、−ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿２ＮＲ＾５Ｒ＾６、−ＳＯ
   ＿２ＣＦ＿３、−ＣＯＣＨ＿３及び−ＣＮから成る群か
   ら選択された極性電子求引官能基であるか、または Ｒ＾３またはＲ＾３＾ａは一緒になつて共に−（ＣＯ）
   ＮＲ＾５（ＣＯ）−であり； Ｒ＾４はα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受
   容できるエステル化基であり； Ｒ＾５とＲ＾６は互いに関係なく−Ｈ、メチルまたはエ
   チルであり； Ｚはトランスエチレン結合を通して、１つの２−アミノ
   フェノキシ環の５位置に結合した 芳香族またはヘテロ芳香族系であり、該エ チレン結合自体が芳香族またはヘテロ芳香 族環系の一部であつてよく； ＷはＨであり、ＸもＨであるか；または ＷとＸは一緒になつてＯまたはＮＲ＾５であり；ＹはＨ
   であり、Ｙ′もＨであるか（ＡがＮＲ＾５ＯまたはＳで
   ないかぎり）；または ＹとＹ′は一緒になつてＮＲ＾５であり、ＡがＣであり
   ；及び ＡとＡ′は互いに関係なくＣ、Ｎ、ＯまたはＳである〕 を有するビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ
   ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸ならびに薬剤学的に受容できるそ
   の非毒性塩及びエステル。
8. （８）該四酢酸エステルがα−アシルオキシアルキルエ
   ステルを含む特許請求の範囲第７項記載の化合物。
9. （９）該α−アシルオキシアルキルエステル基がアセト
   キシメチルエステル基である特許請求の範囲第８項記載
   の化合物。
10. （１０）Ｚがベンゼン環であり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＹ′が
    −Ｈである特許請求の範囲第７項記載の化合物。
11. （１１）ＷとＸが一緒になつて酸素であり、エチレン橋
    と１個の２−アミノフェノキシ環とともに、置換ベンゾ
    フランを形成する特許請求の範囲第７項記載の化合物。
12. （１２）Ａが炭素であり、ＹとＹ′が一緒になつて窒素
    であつてエチレン橋と環Ｚとともに置換インドールを形
    成する特許請求の範囲第７項記載の化合物。
13. （１３）次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中 Ｒ＾３とＲ＾３＾ａは互いに関係なくＨ；または−ＣＯ
    ＿２Ｈ、−ＣＯ＿２Ｒ＾４、−ＣＯＮＲ＾５Ｒ＾６、−
    ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿２ＮＲ＾５Ｒ＾６、−ＳＯ＿２Ｃ
    Ｆ＿３、−ＣＯＣＨ＿３及び−ＣＮから成る群から選択
    された極性電子 求引性官能基であるか、または Ｒ＾３またはＲ＾３＾ａは一緒になつて−（ＣＯ）ＮＲ
    ＾５（ＣＯ）−であり； Ｒ＾４はα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受
    容できるエステル化基であり； Ｒ＾５とＲ＾６は互いに関係なく−Ｈ、メチルまたはエ
    チルであり； Ｚはトランスエチレン結合を通して、１つの２−アミノ
    フェノキシ環の５位置に結合した 芳香族またはヘテロ芳香族系であり、該エ チレン結合自体が芳香族またはヘテロ芳香 族環系の一部であつてよく； ＷはＨであり、ＸもＨであるか；または ＷとＸが一緒になつてＯまたはＮＲ＾５であり；ＹはＨ
    であり、Ｙ′もＨであるか（ＡがＮＲ＾５、ＯまたはＳ
    でないかぎり）；または ＹとＹ′は一緒になつてＮＲ＾５であり、ＡがＣであり
    ； ＡとＡ′は互いに関係なくＣ、Ｎ、ＯまたはＳであり； ＤはＯ、Ｎ、ＮＨ、またはＮアルキルであり；ＱはＤが
    Ｎである場合には二重結合であり、他の場合は単結合で
    あり；ならびに Ｒ＾７はＨであり、Ｒ＾８もＨであるか；またはＲ＾７
    とＲ＾８は、ヘテロ原子Ｄ、Ｒ＾７に隣接する炭素、及
    びＲ＾８に隣接するフェニル環と共にキノリン環系（Ｄ
    ＝Ｎ、Ｑ＝二重結合）を 形成する〕 を有する化合物ならびに薬剤学的に受容できるその塩及
    びエステル。
14. （１４）該四酢酸エステルがα−アシルオキシアルキル
    エステルを含む特許請求の範囲第１３項記載の化合物。
15. （１５）該α−アシルオキシアルキルエステル基がアセ
    トキシメチルエステル基である特許請求の範囲第１４項
    記載の化合物。
16. （１６）Ｚがベンゼン環であり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＹ′が
    −Ｈである特許請求の範囲第１３項記載の化合物。
17. （１７）ＷとＸが一緒になつて酸素であり、エチレン橋
    と１個の２−アミノフェノキシ環とともに、置換ベンゾ
    フラン環を形成する特許請求の範囲第１３項記載の化合
    物。
18. （１８）Ａが炭素であり、ＹとＹ′が一緒になつて窒素
    であつて、エチレン橋と環Ｚとともに、置換インドール
    を形成する特許請求の範囲第１３項記載の化合物。
19. （１９）次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、 Ｒ＾３とＲ＾３＾ａは互いに関係なくＨ；または−ＣＯ
    ＿２Ｈ、−ＣＯ＿２Ｒ＾４、−ＣＯＮＲ＾５Ｒ＾６、−
    ＳＯ＿３Ｈ、−ＳＯ＿２ＮＲ＾５Ｒ＾６、−ＳＯ＿２Ｃ
    Ｆ＿３、−ＣＯＣＨ＿３及び−ＣＮから成る群から選択
    された極性電子 求引性官能基であるか、または Ｒ＾３またはＲ＾３＾ａは一緒になつて−（ＣＯ）ＮＲ
    ＾５（ＣＯ）−であり； Ｒ＾４はα−アシルオキシアルキルまたは薬剤学的に受
    容できるエステル化基であり； Ｒ＾５とＲ＾６は互いに関係なく−Ｈ、メチルまたはエ
    チルであり； Ｚはトランスエチレン結合を通して、１つの２−アミノ
    フェノキシ環の５位置に結合した 芳香族またはヘテロ芳香族系であり、該エ チレン結合自体が芳香族またはヘテロ芳香 族環系の一部であつてよく； ＷはＨであり、ＸもＨであるか；または ＷとＸが一緒になつてＯまたはＮＲ＾５であり；ＹはＨ
    でありＹ′もＨであるか（ＡがＮＲ＾５、ＯまたはＳで
    ないかぎり）；または ＹとＹ′は一緒になつてＮＲ＾５であり、ＡがＣであり
    ；及び ＡとＡ′は互いに関係なくＣ、Ｎ、ＯまたはＳである〕 を有するビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，
    Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸ならびに薬剤学的に受容できる
    その非毒性塩及びエステル。
20. （２０）該四酢酸エステルがα−アシルオキシアルキル
    エステルを含む特許請求の範囲第１９項記載の化合物。
21. （２１）該α−アシルオキシアルキルエステル基がアセ
    トキシメチルエステルである特許請求の範囲第２０項記
    載の化合物。
22. （２２）Ｚがベンゼン環であり、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＹ′が
    −Ｈである特許請求の範囲第１９項記載の化合物。
23. （２３）ＷとＸが一緒になつて酸素であり、エチレン橋
    及び１個の２−アミノフェノキシ環とともに、置換ベン
    ゾフランを形成する特許請求の範囲第１９項記載の化合
    物。
24. （２４）Ａが炭素であり、ＹとＹ′が一緒になつて窒素
    であつて、エチレン橋と環Ｚとともに、置換インドール
    を形成する特許請求の範囲第１９項記載の化合物。
25. （２５）１−（２−アミノ−５−〔（２−（４−カルボ
    キシフェニル）−Ｅ−エテニル−１〕フェノキシ）−２
    −（２′−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタン−
    Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸ならびに薬剤学的に受容で
    きるその非毒性塩及びエステルから成るけい光カルシウ
    ム結合性化合物。
26. （２６）１−（２−アミノ−５−〔（２−（４−Ｎ，Ｎ
    −ジメチルスルホンアミドフェニル）−Ｅ−エテニル−
    １〕フェノキシ）−２−（２′−アミノ−５′−メチル
    フェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸なら
    びに薬剤学的に受容できるその非毒性塩及びエステルか
    ら成るけい光カルシウム結合性化合物。
27. （２７）１−（２−アミノ−５−〔６−カルボキシイン
    ドリル−２〕フェノキシ）−２−（２′−アミノ−５′
    −メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四
    酢酸ならびに薬剤学的に受容できるその非毒性塩とエス
    テルから成るけい光カルシウム結合性化合物。
28. （２８）１−（２−（４−カルボキシフェニル）−６−
    アミノベンゾフランオキシ−５）−２−（２′−アミノ
    −５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ
    ′−四酢酸ならびに薬剤学的に受容できるその非毒性塩
    及びエステルから成るけい光カルシウム結合性化合物。
29. （２９）１−（２−（４−シアノフェニル）−６−アミ
    ノ−ベンゾフランオキシ−５）−２−（２′−アミノ−
    ５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′
    −四酢酸ならびにその薬剤学的に受容できるその非毒性
    塩及びエステルから成るけい光カルシウム結合性化合物
    。
30. （３０）１−（２−（５′−カルボキシオキサゾール−
    ２′−イル）−６−アミノ−ベンゾフランオキシ−５）
    −２−（２′−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタ
    ン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸ならびに薬剤学的に受
    容できるその非毒性塩及びエステルから成るけい光カル
    シウム結合性化合物。
31. （３１）約１当量の１，１−ジアシルオキシアルカンと
    約１〜１．５当量のトリメチルシリルブロミドを、反応
    器においてルイス酸触媒約０．１〜０．２当量の存在下
    で、反応が完了するまで撹拌しながら反応させることか
    ら成るα−アシルオキシアルキルブロミドの製造方法。
32. （３２）該ルイス酸がＺｎＣｌ＿２、ＺｎＩ＿２、Ｚｒ
    Ｃｌ＿４、ＳｎＣｌ＿４及びＡｌＣｌ＿３から成る群か
    ら選択されたものである特許請求の範囲第３１項記載の
    方法。
33. （３３）該１，１−ジアシルオキシアルカンがジアセチ
    ルオキシメタンであり、該ルイス酸がＺｎＣｌ＿２であ
    る特許請求の範囲第３１項記載の方法。