JPS59106300A - 螢光発生基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペルオキシダーゼは、多数の甲ましい性質を有するＭ素
である。それは入手容易であり、安価であり、実質的な
範囲の化学的・物理的条件に対して安定であり、そして
高い交代速度を有する。ベ９− ルオキシダーゼの基質の決定のための明らかな用途のほ
かに、それは組織中の決定因子の部位の局所化の診断お
よび広範な種類の分析物の生理学的媒体の決定において
使用することができる。多くの分析物（ａｎａｌｙｔｅ
）は極めて小さい濃度でのみ存在し、そして分析物とそ
の同類の結合性対の構Ｉ＆員との間の単一の結合事象の
結果、信号の高度の増幅を必要とする。しばしば、結合
事象の信号を発する酵素の分子の汐は、測定の条件に基
づいて固定され、そして改良された感度または増大され
た信号レベルは、高い交代速度を看しかつ高い信号レベ
ルを提供する基質に依存する。

基質の開発において、多くの拘束が存在する。

ペルオキシダーゼは比較的低い６真性を有するが、酸化
されうる化合物について制限が存在する。さらに、基質
または生成物は原理的には信号を提供することかでさる
が、低い信号を高い信号にすることが望ましい、したが
って、生成物が測定される場合検出可能な信号への基質
の寄与かあ一１〇− るとしても、それはほんのわずかであるべきである。他
の考慮は、基質の溶解度および測定すべき試料中で直面
しうる物質との相互作用を包含する。追加の考慮は、合
成の容易性、安定性（貯蔵寿命および測定媒質中の両者
）、ペルオキシダーゼの活性への副生成物（あるいは、
５らには所望の生成物）の生産の影響、および検出可能
な信号を提供する生成物を測定する佳力を包含する。

５ａｕｎｄｅｒｓおよびＷ　ａ　ｔ　ｓ　ｏ　ｎ　、　
ＢＬ」見上ｅｍ、Ｊ、（１９５０）４６：６２９−６３
３は、ペルオキシダーゼの基質としてメトキシ置換アニ
リンを記載しいている。ＫｅｓｔｏｎおよびＢｒａｎｄ
ｔ　、Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

（１９６５）１１：ｌ−５は、ペルオキシダーゼととも
に使用中るための蛍光発生物質および生成物を記載して
いる。Ｚａｉｔｓｕおよび０ｈｋｕｒａ、Ｉｂユ（！、
（１９８０）１０９：１０９−１１３は、ペルオキシダ
ーゼを用いる蛍光測定において使用するための種々のフ
ェノール系化合物を記載している。広範な種類のフェノ
ール系化合物およびアミンは、ペルオキシダーゼのため
の発色性および蛍光発生基質として報告された。

環の活性化置換基を有する酸化を受けやすいアリール・
キ＋　＝／ブト（ａｒｙ　１−ｃａｐｐｅｄ）蛍光発生
化合物を用いる、新規な基質の蛍光発生先駆物質が１１
供される。これらの化合物は測定条件）゛でペルオキシ
ダーゼの不存在下に安定であるが、ペルオキシダーゼお
よび過酸化水素の存在において、アリール・キャップ（
ａｒｙｌ　　ｃ　　ａｐ）はペルオキシダーゼにより触
媒される反応において除去されて、安定な蛍光発生生成
物を提供する。とくに、ウンベリフェロンおよびヒドロ
キンキサンチンの誘導体は、ある結合を介してアリール
誘導体へ結合されて、ペルオキシダーゼの基質を提供す
る。この基質は、酸化すると、残留する蛍光物質が高い
蛍光甲子効率を有する場合、アリール・キャ・ンブを除
去する。

過酸化水素の存在下に蛍光発生生成物を生成する。Ａ″
ルオキシダーゼ基質として使用する、新規な化合物が提
供される。これらの化合物は、蛍光化合物Ｈの酸化され
やすいアリール・キャップを含み、蛍光生成物の励起波
長において、キャップド生成物中に蛍光を発生しない、
基質は、アミノ−またはオキシ−蛍光化合物、これは好
ましくはペルオキシダーゼが触媒する分解に対して安定
である、および１ｍ原子へ結合してペルオキシダーゼの
ためのキャップド基質を形成する活性化されたＷ素環式
アリール基、から調製される。

キャップド基質は、活性化アリール基の触媒化酸化的除
去および蛍光化合物の形成を受けやすい。

ペルオキシダーゼのための蛍光発生基質の役目をする。

基質を、広範な種類の基で置換して、水溶性を増大させ
、分光性、たとえば、励起・発光の波長、部子効率およ
びストークスシフトを変更することができ、あるいは問
題の他の特定の性質。

たとえば、、蛍光発生基質の溶解性または光および酵素
安定性に影響を及ぼすことができる。

１３− 蛍光発生基質は、通常、少なくとも約１５個の炭素原子
、より通常少なくとも約１６個の炭素原子および一般に
６０より少ない炭素原子、より通常的５０より少ない炭
素原子を有し、少なくとも３個のＵ種原子かつ約１８情
景丁の異種原子、通常約１２以下の異種原子、これらは
窒素およびコラーゲン（酸素およびイオウ）、ハロゲン
、リンおよびホウ素から選らばれる、を有するであろう
。

アリール・キャップの環炭素原子に結合し、原子番号７
〜８の原子を有する活性化基（オキシ。

ヒドロキシおよびエーテルを包含する；およびアミドお
よびアミノ、第一および第二、および第三アミノを包含
する）の少なくとも１つが存在する。また、アリール・
キャップへ結合する異種原子（Ｎ、Ｏ）含有結合が存在
するであろう、こうして、アリール・キャップが酸化さ
れると、結合は開裂して、キャップが除去された蛍光生
成物を残す。

１４− 大部分、本発明の化合物は、次式を４１するであろう： １、　　Ｘ−Ａｒ−Ｙ−Ｆｌ 式中、 Ｘは環状環へ結合した酸素または窒素を有する活性化基
であり、ＸはＯ〜４、通常０〜３個の炭素原子をもち、
少なくとも１つのＸ基かつ約３つ以下のＸ基が存在し、 Ｙはオキシ、またはカルバミルオキシであり、ここでカ
ルバミルオキシ基は−Ｎ　（Ｒ）ｃｏ２であり、窒素は
Ｆｌへ結合しかつＲは水素、低級アルキル（１〜３個の
炭素原子）、または窒素へ炭素原子を介して結合したｆ
＋７溶化基であり１通常光種原子間に２個の飽和炭素原
子が存在し、モして氷ｉ７溶化基は低級アルキルまたは
フェニルへ結合しており、Ｙは通常水素であり、 Ａｒは活性化基、一般に１〜２個の融合環または非融合
環を有する１通常炭素環式基、とくにフェニル基であり
、この基はペルオキシダーゼが触６１する酸化の時に、
離脱基の役目をし、Ｆｌは芳香族化合物であり、これは
それが結合する顕種原子（０、Ｎ）とともに蛍光化合物
、Ｆｌ−Ｏｆ（またはＦｌ−ＮＨＲまたはそれらの塩を
提供し、 Ｆｌは少なくとも９個の炭素原子、より通常少なくとも
１０個の炭素原子かつ約３０個以下の炭素原子、通常約
２６個以下の炭素原子、および約１６個以下の異種原子
、より通常約１２個以下の巽−１４原子、これは酸素、
窒素、イオウ、ハロゲン、ホウ素およびリンを包含する
、を有する。望ましくは、少なくとも１つかつ約３つ以
ｒの水可溶化基、一般に約１〜２つの水可溶化基、通常
酸性または塩基性の基、を有し、この基はＲ，アリール
（Ａ　ｒ）基、または蛍光（Ｆｌ）基へ結合されていて
もよい。

水ｊｉ）溶化基は、大部分、サルフェート、ス？レホネ
ート、スルフィネート、アミン類、アミデートｔｏ、ア
ンモニウム、ホスフェート、ホスホネート、ポレート、
ポロオート、カルボキシアミド、カルボキシレート、ヒ
ドロキシアルキル基、たとえば、サツカリド類などであ
ろう。水可溶化基は、原炭素原子へ直接結合することが
でき、あるいは結合基、一般に１〜４個の原子、通常炭
素原子の結合基、通常脂肪族基により結合されていても
よい。あるいは、水可溶化基は５芳香族環上に官能的に
存在する異種原子へ結合していてもよく、アリール環の
活性化または蛍光発生基の蛍光性に参加する賢種原子を
含むことができる。

大部分は、本発明の前駆物質の組成物は、次ぎ式中、 Ｘｏはオキシまたはアミンであり、置換されたオキシま
たはアミノを包含し、ここでオキシまたはアミノは置換
されていないか、あるいは水素原１７− 子の一部分またはすべてが１〜４個１通常１〜３個の炭
素原子の基、通常脂肪族不飽和を含まずかつＯ−１／基
の置換基１通常水６７溶化基、前述の基からなる。なら
びにヒドロキシルおよびアミンを有する脂肪族基で置換
されることができ、ここでヤ和脂肪族基の炭素原子へ結
合した異種原子は少なくとも２個の炭素原子により分離
されており、 ｎはＯ〜６であり、 Ｄは１〜３個の炭素原子のアルキル、０〜６個の炭素原
子および１〜６個の異種原子、すなわち、酸素、窒素、
イオウおよびリン、を有する極性基、またはポリオール
、これはモノマー（５〜６個の炭素原子）およびポリマ
ーのポリオール、たとえば、モノ−およびポリ−サツカ
リド、を包含する、であり、モしてＡｒ、ＦｌまたはＲ
へ結合していて、とくに水溶性を提供し、 Ｘｏの少なくとも１つは２または４個の炭素原子により
Ｙ′から分離されおり（オルトまたはバ１８− ラ買換）、 ＹｏはＹと同一・であり、 ｍは１〜？であり。

Ｆｌ’で表示する基は、Ｙｏへ環炭素原子において結合
するベンゼンを有する基であり、モしてＹｏのＷ種属子
と一緒になって蛍光化合物を形成し、この化合物はベン
ンゼン環へ結合するとき、Ｆｌ’−Ｙ’の励起波長にお
いて蛍光性に非常に劣る。こうして、蛍光化合物はキャ
ップド番フェノール系またはアニリノ基を有する。環上
の有効炭素原子はいずれも、ハライドを含む置換基およ
び前述の置換基、ならびにアルキル基およびアルコキシ
基、一般に１〜６４Ｖ４の炭素原子を有する。

より通常１〜３個の炭素原子を有する。で置換されるこ
とができ、前記アルキル基およびアルコキシ基は前述の
置換基のいずれかで、とくに水可溶化官能基で置換され
ることができる。

蛍光発生化合物に使用できる化合物は、クロメン、キサ
ンチンなどのアミノまたはヒドロキシル置換誘導体を包
含する。とくに興味あるものは。

クマリンおよびキサンチンの化合物である。

大部分は、クマリン基を有する本発明の化合物は、次ぎ
の式を有するであろう： 式中。

Ｘｏは上に定義したとおりであり、そして環炭素原子の
いずれも、ならびにＸ“、ここでＸｏはヒドロキシルお
よびアミノである、は前述の置換基のいずれによっても
置換されることができ、適当ならば、％種属子は分離さ
れて安定な化合物を提供すること、および置換基は前駆
化合物がペルオキシダーゼの基質であることを防止する
であろうこと、が理解される。すなわち、異種原子が飽
和炭素原子へ結合されているとき、同一の炭素原子はＸ
ｏへ結合されていないであろう、Ｗは水素、低級アルキ
ル（１〜３個の炭素原子）カルボキシ、カルボキシアミ
ドまたはＮ−１換カルボキシアミドであり、 ｍは１〜２である。

置換基を前述のように変更して水溶性を増大することが
できることを、理解すべきである。

化合物の第２群は、キサンチン類に基づき、そして大部
分は、次ぎの式を有するであろう、蛍光物質を包含する
： 式中。

Ｚは式 をもち１式中、 ２１− ＸｏはＦに定義したとおりであり、それらの少なくとも
１つは２または４個の炭素原子により酸素から分離され
ており。

ｍば−Ｆに定義したとおりであり、 ＺｏはＺと同一であるかあるいはオキシ、たとえば、ヒ
ドロキシまたは低級アルコキシであり。

そして Ｎ炭素原子のいずれも前述の置換基のいずれによっても
置換されることができる。

一般に、活性化されたアリール基は、水溶性を増大し、
基質として作用するとき前記基の化学的性質を変更する
ことなどを目的として、環炭素原子へ結合した、あるい
はＸへ結合し、Ｘの水素を置換する、０〜３個、通常０
〜２ｇｉの置換基を有するであろう０問題の基は、１〜
３個、通常１〜２個の炭素原子の低級アルキル基、たと
えば、メチルおよびエチル、２〜４個１個室通常２〜３
炭素原子のカルボキシアルキル、たとえば、カルボキシ
メチルおよびカルボキシエチル、１〜３個、２２− 通常１〜２個の炭素原子のヒドロキシアルキルまたはア
ミノアルキル、たとえば、ヒドロキシメチル、アミノエ
チル、およびアミノメチル、またはアルキルスルホン酸
を包含する。

分子の蛍光発生部分ヒに基は、より広く変化させて、蛍
光化合物の水溶性、蛍光発生の性質などを変更させるこ
とができる。ある数の例示的蛍光発生誘導体は、米国特
許第４，３１８，８４６号、および［新規なアルキル置
換蛍光化合物および複合体］と題する米国特許出願第７
３．１５８Ｊ−１，１９７９年９月７１１出順、（米国
特許第４゜３５１．７６０号・として特許された）、そ
の開示を引用によってここに加える、に記載されている
。

大部分は、これらの化合物は、２〜６個、通常２〜４個
の置換基を有し、これらの置換基の例は１〜３個、通常
１〜２個の炭素原子のアルキル。

１〜３個、通常１〜２個の炭素原子のフルコキシ、カル
ボキシおよびハロ、とくに原子番号９〜１７のハロであ
り、前記アルキルはまたカルボキシで置換されることが
できる。

カルボキシ基は、それ以−にの変更の部位、とくに水溶
性を付榮するための追加の官能性のための部位として使
用することができる。こうして、カルボキシ、イオウま
たはリンの酸基で置換されかつ１〜４個、通常１〜３個
の炭素原子のアルキル基を有するエステルおよびアミド
を製造することができ、カルボキシ基は２〜４個、通常
２〜３個の炭素原子を有する。

フェノール系基をキャップするために使用できるアリー
ル基は、例示すると次ぎのとおりである： ｐ−７ミノフエニル、０−アミノフェニル、ｐ−トルイ
ジニル、０−）ルイジニル、４−アミノ−３，５−ジメ
チルフェニル−１，４−アミノ−２−カルボキシフェニ
ル−１，４−アミノ−２−（２°−カルボキシメチル）
−１−フェニル、２．４−ジメトキシフェニル−１，３
，４−ジアミノフェニル−１，３−メトキシ−４−７ミ
ノフエニルー１，４−アミノ−３，５−ジメトキシフェ
ニル−１，４−アミノ−７−カルボキシナフチル−１、
ｐ−ヒドロキシフェニル、３，５−ジエチル−４−ヒド
ロキシフェニル−１，３−カルボキシメトキシ−４−ヒ
ドロキシフェニル−１，４−ヒドロキシアニリノ、２−
ヒドロキシ−５−（２′−ジメチルアミノエチル）−フ
ェニル−１，４−ヒドロキシ−３−（２−スルフォナト
エトキシ）−フェニル−１および２−ヒドロキシ−４−
ホスファトメチルフェニル−１゜ ・胛光化合物について、種々のＰｌ検基をもつ、広範な
種類の２−オキソ−７−ヒドロキシおよび７−アミノク
マリ：／類を使…できる０次ぎはアリール基へフェノー
ル系ヒドロキシ化基において結合することができるクマ
リン基の例である：３−カルボキシー２−オキソ−７−
クロメニルオキシ、３−（２’−ホスホナトエチル）−
２−オキソー７−クロメニルオキシ、Ｎ−カルボキシ２
５− メチル３−カルボキシアミド−２−オキソ−７−クロメ
ニルオキシ、Ｎ−ホスホナトメチル３−カルボキシアミ
ド−２−オキソ−７−クロメニルオキシ、５−（２°−
アミノエチル）−２−オキソ−７−クロメニルオキシ、
および５−カルボキシメトキシメチル−２−オキソ−７
−クロメニルオキシ、Ｎ−（２−エチルスルホン酸）−
２−オキソ−７−クロメニルアミノ。

ウンベリフェロン化合物は、米国特許第４，２３０．７
９７号中に例示されている。

本発明の化合物は、従来法に従ってアニリノまたはフェ
ノール系蛍光化合物をキャップすることによって、製造
することができる。とくにオルト−またはパラ−ニドロ
アリールハライドを蛍光フェノキシトと一緒に使用する
ことができ、ここでハロゲンは置換されてエーテル結合
が形成される。次いで、ニトロ基を従来法に従って７ミ
ノ基に還元することができる。必要に応じて、アミノ基
を吹いで置換することができる。ヒドロキシ化２６− 合物について、種々の方法、たとえば、γハロシクロヘ
キサノン類との縮合、引き統〈脱水素、あるいはベンジ
ン中間体を用いることなどにより、フェノール系蛍光体
への結合を実施することができる。カルバモイル フェノール系基とともの使用して得ることができる。

上に示したように、本発明の化合物は過酸化物、ペルオ
キシダーゼの測定に，さらに詳しくは標識としてペルオ
キシダーゼを用いる診断測定に使用される。診断の目的
で酵素の使用を記載する多数の特許が存在し、それらの
多くは標識としてペルオキシダーゼの使用を特に記載し
ている。米国特許を例示すると，次ぎのとおりである＝
３。

８１７、８３７、４，２３３，４．０２、４，２７５、
１４９および４．、２９９，９１６、これらは学に広範
な特許の例示である。

特に興味あるものは、ペルオキシダーゼ酵素を特異的結
合対の構成肖と複合させる測定であり、この構喰０は受
容体または配位子でる。配位子はそのための受容体が存
在する問題の分析物であり．−　力受容体は通常抗体で
あるか、あるいは特定の配位子について高い特異性をも
つ自然に産出する化合物である．複合体は種々の方法で
使用することができ、とくにそれが測定媒体中の分析物
の品に比例しである表面に結合するような場合に使用す
ることができる。特定の原案（ｐｒｏｔ。

ｃｏ＋）に依存して、ペルオキシダーゼが結合するよう
になった後、それを試料から除去し，別の溶液中に入れ
ることができ、この溶液は現像剤溶液と呼ばれ、本発明
に従って蛍光発生前駆物質の基質を含有する。

あるいは、過酸化水素をその場で形成するとき、試薬と
して使用できる組成物として、蛍光発生前駆物質とペル
オキシダーゼを複合させることができるので、前駆物質
は試料の存在下に安定な蛍光物質に酸化される。診断の
目的に，本発明の蛍光発生前駆物質を個々の試薬として
，あるいは測定系の他の構成員、とくにペルオキシダー
ゼ複合体と組み合わせて提供されることができる。

本発明の組成物の使用の例は、オキシダーゼ。

たとえば、グルコースオキシダーゼ、が結合される給水
性の相体であり、この相体は，グルコースが供給された
とき、１０体の表面において過酸化水ｔ，源を提供する
．吸水性１０体に配位子または受容体も結合され、これ
らの配位子または受容体は通常分析物に対して類似体で
ある．測定は，試料、ペルオキシダーゼ複合体および本
発明による蛍光発生前駆物質を含有する測定媒質を、吸
収性担体と接触させることによって実施される。蛍光発
生生成物は吸水性担体の表面に生成され、かつ相体へ結
合するので、担体からの蛍光は分析物の存在および驕の
指示として決定される。本発明の１つの実施態様は、米
国特許第４，２９９，９１６号に記載されている。

別の実施態様は、免疫クロマトグラフであり、これは米
国特許第４，１６８，１４６号に記載さ２９− れている。この場合において、免疫クロマトグラフは特
異的結合対の構成員と過酸化水素源，たとえば、グルコ
ースオキシダーゼとの組み合わせであろう。分析物をク
ロマトグラフィーに付した後，ペルオキシダーゼ複合体
、本発明による蛍光発生前駆物質、およびグルコース、
たとえば、ならびに補助的試薬，たとえば、緩衝剤、安
定剤などを含有する溶液を免疫クロマトグラフと接触さ
せ，こうしてペルオキシダーゼ複合体が結合する場合蛍
光発生信号の生成により、分析物の存在または不存在を
観測することができるであろう。

次ぎの実施例により，本発明をさらに説明する。

反応フラスコに，３００ｍｌのトルエン中ノｌＯ．６８
ｇ（４５．６ミリモル）の３−カルポエ３０− トキシウンベリフェロンを導入し、そして３０ｍ１の）
ｈ留物を共沸的に除ノ（シながら、この混合物を１時間
項流加熱し、次いア冷ＪＪシた。次いで冷却した程合物
に１．９２ｇの水素化ナトリウムを加え、７Ｍ合物を０
．５時間項流加熱し、その間溶液をディー・スターク分
離器で除去した。残留物を一夜真空乾燥した。

はぼ１５０ｍ１のＤＭＦ中に懸濁させた約５ｇの［−の
）１−成物に、３．８ｇの無水炭酸カリウムを加えた。

この混合物を加熱し、その間約３０ｍ１のＤＭＦ中の２
．７２ｇのｐ−フルオロニトロベンゼンをゆっくり加え
た。２時間環流刊近に加熱１、た後、ｔｌｃにより反応
を検査し、反応は不完全であった。次いで、さらに２０
　ｍ　ｌのＤＭＦ中の１．７６ｇのｐ−フルオロニトロ
ベンゼンヲ加え、この反応を一夜進行させた。

冷却後、この混合物を氷トに注ぎ、沈殿を濾過により集
め、次いでＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。処理すると、５．
３ｇの黄色固体が得られた。この固体の主要部分を、溶
媒としてＣＨ２Ｃｌ２を用いて準備した、４．２ｃｍＸ
３４ｃｍ　（２００ｇのシカゲル、６０〜２００メツシ
ユ）のカラムで精製した。はぼ３．５ｇの相製物買をｃ
Ｈ２Ｃ１２溶液としてカラムトヘ適用し１次いテ１００
ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２を加え、次いでＣＨ２Ｃｌ２中の５
％の酢酸エチルで溶離した。初めの５０ｍ１のフラクシ
ョンを集めたが、次いで１５ｍ１のフラクションを集め
、そして所望生成物を含有するフラクションをｔｉｅに
より同定した。

フラクションを集めて、約１．２５ｇのカルボエトキシ
−７−（４’−ニトロフェノキシ）クマリン、融点１６
３℃、が得れらた。

３ｍｌの５０％の水性エタノール中に、３８ｍｇの七の
生成物および５２ｍｇの塩化第一・鉄を加えた。この混
合物を徐々に加熱しながら急速にかきまぜ、その間１ｍ
ｌの５０％の水性エタノール中の５ｐＬ１のｍＨｃ　ｌ
の溶液をゆっくり加えた。次いで、この混合物を２時間
環流させた。冷却後、反応混合物を数ｍｌの水で希釈し
、エーテルで抽出した。合わせた抽出液な無水濃酸ナト
リウムで乾燥し、溶媒を蒸発させると、１８ｍｇの３−
カルボエトキシ−７−（４°−７ミノフエノキシ）クマ
リン、融点１３６〜１３８℃、が得られた。ＮＭＲおよ
びｔｌｃは所望生成物と一致した。

トのアミンエステルをジオキサン中に溶解し、等体積の
冷２０％の硫酸を加えた０次いで、混合物を一夜環流加
熱した。冷却後、ｐ）（を水性水酸化ナトリウムでｐＨ
５に調整し、これにより沈殿が形成し、これをｉ！！過
により集めた。沈殿を大きい体積の沸騰水中に溶解し、
急速に熱時濾過し、冷却すると、表題化合物が沈殿した
。融点２１３〜２１４℃（分解）。

中和した媒質を酢酸エチルまたはジエチルエーテルで抽
出し、生ずる抽出液を精製することにより、増大した収
率を得ることができた。

−叉漉剣１− ３３− ３ユカルポキシ−７−（３’−メチルー（二二約１０ｍ
１の乾燥ＤＭＦ中に、３３０　ｍ　ｇ　（１’）３−カ
ルボエトキシウンベリフェロンのナトリウム塩を懸濁さ
せ、この混合物を約１３０℃に加熱し、このとき塩の大
部分は溶解した。はぼ３００〜４０θ＃Ｌｌの３−メチ
ル−４−二トロフルオロベンゼンをゆっくり滴下しく２
〜３分／滴）、その間窒素雰囲気を維持し、温度をゆっ
くり５時間にわたり約１７０℃にトげた。次いで反応を
停止１−し、溶液えを冷却し、氷水を加え、次いでジエ
チルエーテルで抽出した。合わせたエーテル抽出液を胡
和重炭酸ナトリウム、プラインで２回洗節し１次いで無
水流酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発すると、固体
の美色物質が残り、これを分離用ｔｉｅにより精製して
、はぼ１４０ｍｇの純粋なほぼ白色の化合物、融点１５
８℃、が得られた。

２５ｍ１のの５０％の水性エタノール中に、ｌ３４− ５５ｍｇの１−の生成物および１８０ｍｇの塩化第一鉄
および１５Ｌ１の７５１−ＩＣＩを加え、これを添加前
水性エタノールで希釈した。この混合物を３詩間加熱環
波させ、次いで濾過し、ＣＨ，Ｃ１２で抽出した。抽出
液を洗節し、乾燥し、蒸発乾固し、そして生成物を分離
用ｔｌｃで精製した。芳香族アミン化合物は、精製の間
分解するように思われた。

１２ｍ１の２０％（ｖ／ｖ）（７）水性硫酸とジオキサ
ンとの１ｔ１混合物中に、５０ｍｇの」二の生成物を懸
濁させ、この混合物を一夜環流加熱した。冷却後、溶液
をＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ約５に中和した。形成し
た沈殿を濾過により集め、約８０ｍ１の水中に懸濁させ
た。この混合物を加熱沸騰させ、熱時銭過し、濾清を冷
却し、沈殿した生成物を濾過により’Ｉ’Ｊすると、約
１８ｍｇが乾燥後に得られた。ｔｌｃは、微敬の３−カ
ルポキシウンベリフエロンの汚染が存在しうろことを、
示した。融点２０４〜２０６℃８（分解）。

造 約５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に５窒素の雰囲気中で２１８ｍ
ｇ（０，ロアミリモル）の３−カルボエトキシフェノキ
シ）クマリンを溶解した。少掛の無水炭酸ナトリウムを
加えた後、４２１ｍｇのヨード酢酸エチルを室温におい
て非常にゆっくり滴下し、次いでこの混合物を室温にお
いて数時間かきまぜた。ｔｌｃが少量の生成物を示した
ので１反応混合物を約４０℃に１時間加熱し１次いで室
温に冷却し、かきまぜを２日間続けた。混合物を水１−
に往ぎ、ＣＨ２Ｃ１ｔで抽出することにより、反応を什
上げた。合わせたＣＨ２Ｃｌ２抽出液を飽和水性重炭酸
ナトリウム、ブラインで洗節し１次いで無水液酸ナトリ
ウムで乾燥した。溶媒を除去することにより、はぼ２５
０ｍｇのオレンジ色の固体残留物が得られた。融点１１
８〜ｌ１９℃。

５ｍｌのジオキサン中に、２１８ｍｇの上の生成物を溶
解し、次いで等体積の冷１０％（Ｖ／Ｖ）の水性硫酸を
加えた。５時間加熱環流せた後、反応混合物をエーテル
の抽出により什−Ｌげ。

鋭い界面を得るとき多少の困難に直面した０合わせたエ
ーテル抽出液を飽和水性重炭酸ナトリウムで分配した。

水°層を分離し、４Ｎ　　ＭＣＩで酸性化し、次いでエ
ーテルで抽出した０合わせたエーテル抽出液を硫酸マゲ
ネシウムで乾燥し、溶媒を真空乾燥すると、ψ色固体が
得られた。融点１６５℃（分Ｍ、１５０℃でオレンジ−
赤に変わる）。生成物はＨＲＰ；ｌ１ｔｉｆｉとして有
用であることがわかった。

３７− １．５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に、１０２ｍｇ（ｏ、３３ミ
リモル）の実施例ＩＩの生成物、３８ｍｇ（０，３３ミ
リモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび７８　
ｍ　ｇのジシクロへキシルカーポジイミドを加え、この
混合物を窒素のもとに約６時間かきまぜ、次いでガラス
ウールで濾過した。

タウリン（８０ｍｇ）を１　ｍ　ｌの上流水中に溶解し
、ＰＨをＯ，ＬＮ　　ＮａＯＨで約７．５ニ１ｊｉＪ整
した６次いで、この溶液を徐々に上の混合物に加えた。

くもりおよび多少の沈殿を、ＤＭＦの添加により実質的
に除去した。混合物を熱水浴（約５０℃）中に浸漬し、
−夜かきまぜ、その間温度は室温に低下した。

沈殿をガラスクールのプラグを通す濾過により分離し、
ｔ！！液を蒸発乾固し、残留物をｔ）ＭＦ中に懸濁させ
、濾液を再蒸発乾固させると、　７１色残留物が残った
０分離用液体クロマトグラフィーを、メタ／−ｊｌｚ：
ｆｉｉ化メチレン：木（１０：６０：３８− ■）とともに使用し、生成物をＤＭＦおよび水の溶液中
に加えた。基線刊近の賛色帯をかき取り、ＤＭＦで溶離
した。生成物を乾燥した。大きいバ・ン〃グラウンドは
蛍光汚染物の存在を示したので、　’ｉｌ＆物をセファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１０カラム（１，Ｉ
Ｘｌｌｃｍ）の使用によりさらに精製し、０．５ｍｌの
水中の５ｍｇの生成物の溶液をカラトに加え、生成物を
氷で溶離した。フラクション（１ｍｌ）を集め、蛍光ス
ペクトルを測定した。低い蛍光を有するフラクションを
集め、プールした。この手順を反復して、バックグラウ
ンドの蛍光を減少させた。

生成１物は、Ｌの化合物を水溶液中でＨＲＰおよびＨ２
Ｏ，と結合し、そして蛍光発生生成物の発生を観測する
ことにより、ＨＲＰ基質として有用であることを示した
。

４十ぜＩ１造 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを実施例■に記仔するよ
うにしてｆＭ造した。２−アミノ−？−デオキシグルコ
ース塩酸ｔｌ（３９ｍｇ、０．１８１ミリモル）を少緻
の水に溶解し、ｐＨをＯ，ＬＮの水酸化ナトリウムで７
．５〜７．６にした。窒素雰囲気のもとで、トのエステ
ル（５１、９ｍｇの酸、０．１ロアミリモル）のＤＭＦ
溶液をかきまぜながら加え、かきまぜを−夜続けた。前
述の溶媒系を用いて分離溶液体クロマトグラフィー（Ｐ
ＬＫＣ１８Ｆｌｌ状に逆相板）により、精製をア施した
。中央のＲｆ成分をかき取り、メタノールで溶離し、少
酸のバインダーを加えた。

試料を焼結ガラスフィルターで濾過して透明溶液を形成
し、溶媒を蒸発させ、残留物を５ｍｌのＤＭＦ中に溶解
した０次いでこの溶液を蒸発乾固し、１ｍｌのＤＭＦ中
に溶解し２次いで４ｍｌのｆａＩｔｉ液で希釈し、測定
を前述のように１００＃Ｌ１の基質を用いて実施した。

生成物はＨＲＰ基質としてイｆ用であることがわかった
。

弊燗 フラスコに、５９ｍｇ　（０，１７５ミリモル）の３−
カルボキシ−７−（３’−メチル−４′−アミノフエノ
キシ）クマリン（実施例■参照）、３４ｍｇ　（０，１
９ミリモル）（７）Ｎ−ブロモスクシンイミドおよび１
．４５ｍ１の乾燥Ｉ）Ｍｌｌ’を導入し、フラスコを隔
壁で密閉し、窒素の流れを維持した。溶液は暗色のパー
プルに変わり、この混合物を室温で一夜かきまぜた。反
応混合物を氷水Ｈに注ぎ、この溶液をＣＴ（２Ｃ１２で
抽出し、合わせた抽出液を飽和重炭酸ナトリウム、ブラ
インで洗炸し、次いで無水濃酸ナトリウムで乾燥した。

溶媒を除去し、残留物をｔｉｅにより精製した。

９、素化生成物（１０−１５ｍｇ）を約１ｍｌの一４１
＝ ジオキサン中に溶解し、０．５ｍｌの２０％の硫酸を加
え、この混合物を加熱し、−夜環流した。

冷却後、この溶液を沈殿が形成するまでＩＮの水酸化す
トリウムで中和し、沈殿を沈降させ、この混合物を濾過
した。固体の沈殿を熱水中に溶解し、これを沸騰加熱し
、次いで濾過した。ｉＬ！液を冷却し、次いで約４０ｍ
１に真空Ｓ縮し、沈殿を一過により集めた。ＤＭＦ中に
溶解し、濾過した後、生ずる騎色溶液を蒸発させると、
約ｌＯ〜１１ｍｇの生成物が残った。前述のように測定
することにより、生成物は活性なｆ（ＲＰ基質であるこ
とが示された。

２０ｍ１の蒸留水中のＨＲＰ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、１５
０ｍｇ）に、４ｍｌのＯ，１モルのＮａＩＯ４を加え、
この混合物を室温において２０分間かきまぜ、次いで２
．４ｍｌの１モルのグリセロール４２− を加えた。室温において３０分間かきまぜた後。

この反応混合物を３　Ｘ　５００　ｍ　ｌの２ミリモル
の酢酸ナトリウム、Ｐ）（４，５、で透析した。

抗ＰＲＰ溶液（Ｉ（ｅｍ刈」ｈ　ｉ　ｌ　ｕ　ｓ　　１
四」１ｕｅｎｚａｅ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　ａｎｄ　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｈｅ　ａ　１　
　ｔｈ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　５ｔａｔｅ、から入手
できる、Ｍ−３ロット　２８Ａ）を、９ｍｌに希釈し、
３　Ｘ　５００　ｍ　１（７）　ｌ　ＯミリモルのＮａ
２ＣＯ：＋　、ｐＨ９，５、で透析した。透析後、１：
５０に希釈して、０Ｄ２８゜＝０．６５６（約２３．４
３ｍｇ／ｍｌ）を１１トだ。

２１．４６ｍ１　（６７，７３ｍｇ）の活性化されたＨ
ＲＰを４．６７ｍ１　（１０９，４ｍｇ）の抗Ｐ　ＲＰ
に加え、この混合物を１０ミリモルのＮａ、Ｃｏ、、ｐ
Ｈ９、６、−ｃ　２９　、９　ｍ　ｌに希釈し、ＰＨを
０　、ＩＮのＮａＯＨで９．６に調整１、た。室温にお
いて２時間かきまぜた後、この混合物を水浴中で冷却し
、１　、５　ｍ　ｌ　（４ｍｇ／′ｍ　１　）のＮａＢ
Ｈ，を加え、その間反応４昆合物を光りから保護しかつ
０℃において２時間かきまぜた。次いで、この混合物を
１立のｐＢｓｍ＊Ｗｌ（１０ミリモルのＰＯ４，０，１
５モルのＮａＣ１、ｐＨ７，２）に対して透析した。

次いで、この複合体を、コロジオン装置によりＢｉｏｇ
ｅｌ　　ＡＳＭカラム（０，５Ｘ９０ｍｌ）のクロマト
グラフィーに付し、５ｍｌのクラクションを集め、０．
０１％のＮａＮ、を含有するＰＢＳで溶離した。フラク
シゴン３９〜４８をプールした。Ａ２ａｏ＝０．６１９
；Ａａｏｓ　＝０．３３２゜ 本発明の蛍光発生前駆物質の実用性をＸ″ｆ証するため
に１次ぎの典型的な測定を実施した。微小力価（ｍｉｃ
ｒｏｔｉｔｅｒ）の板のくぼみを、アミン変性グルコー
スオキシダーゼ（ｔ　：　１９０の希釈、７．６ｍｇ／
ｍｌｆｇ、溶液）およびポリリポースホスフェートに対
する抗体（６０ミリモル（７）　）＆酸塩緩衝液、ｐＨ
９，６、中のｌ：２０００希釈）の溶液（２５０ｇ　ｌ
　／　＜ぼみ）でコーティングした。１夜静置後、０．
０５％のツイーン２０（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳでく
ぼみを洗浄した。

原溶液を実施例ＩＩの蛍光発生基質から調製した。３．
３ｍｇ／１０ｍ１のＤＭＦ溶液（１，２２ミリモル）を
、使用前にＰＢＳ緩衝掖で液：１０に希釈した。５００
ＩＬｌの前記原溶液、６９４μｌの１．８モルのグルコ
ース、および４００ｇ１の原カタラーゼ溶液を含有する
基質混合物を調製し、そして体積をＰＢＳ緩衝液で２ｍ
ｌにした。カタラーゼ（Ｃ−５℃ｇｍａ）をＰＢＳｐＨ
７，２中で透析することにより、原カタラーゼ溶液（３
、１〜４ｍｇ／ｍ　ｌ：）を調製した。

次いで１次ぎの原案を測定に用いた。アミノグルコース
オキシダーゼ（米国特許出願第３９８゜５０５号、１９
８２年７月１５１１出願：および欧州特許出願第８３．
３０４０９４．２号、１９８４５− ３年７月Ｉ４［１出願、カナダ国特許出願第４３２４４
６号、１９８３年７月１４Ｆ＋出願、および特願昭５８
−１２７０６９号、１９８３年７月１４日出願、参照）
および抗ＰＲＰをコーティングした各微小力価のくぼみ
の中に、１００ルｌの５０ｎｇ／ｍｌのＰＲＰまたはｔ
ｏｏｇｔｃｙ）ｐＢ３ｆｉ衝液（ｐＨ７，２）を加え、
この混合物を１時間室温で保温した。この時間の終りに
おいて、５０μｌのＨＲＰ−抗ＰＲＰ複合体を加え、次
いでさら１時間保温した。この時間の絆りにおいて、ｌ
ＯＯ用ｌの基質混合物を加え、次いで振盪しながら３７
℃において１０分■１保温し、その後２００ｇ１の保温
混合物を１．８ｍｌの０９１モルのリン酸用緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）で九釈し、蛍光を読取った。

下表は、ＰＲＰの存在および不存在において、ＨＲＰ−
抗ＰＲＰ複合体の濃度を変化したときの結果を示す。

４６− 表ニ ー　　蛍光　□ ＨＲＰ−抗ＰＲＰ　　　　　　　　　ＰＲＰの不存（７
）ｆ？４Ｌ　　　　　ＰＲＰの存在　在１：８０　　　
　　　　　　７９．５　　　　　６７．１１：３２０　
　　　　　３１．８　　　　　１１．０１：３２０　　
　　　　　２９．６　　　　　１４．２１　・　３２０
　　　　　　　３２．５　　　　　１３．４１＋１２８
０　　　　　１３．８　　　　　　　５．２０　　　　
　　　　　　　　２．２　　　　　　　２．４次ぎのＭ
１定にいおいて、実施例１の蛍光発生前駆物質を使用し
た。この試験により、実施例１の化合物がＨＲＰの基質
であることが、証明された。

実施例１の発色化合物、過酸化水素、セイヨウワサビの
ベルオキシグーゼおよび緩衝液（０，１モルのリノ酸塩
、ｐＨ８，０）からなる測定溶液を調製し、そしてこの
溶液の蛍光の変化を６０秒の間隔で測定した。加えた基
質溶液は緩衝液中の３　、９　ｍｇ　／　１００　ｍ　
ｌの濃度であり、過酸化物は９．８ＸＩＯ−’モルであ
り、ＨＲＰ溶液は０．５ｍｇＢＳＡ／ｍｌを含有する６
、６ｎｇ／ｍ１であり、そして緩衝液は０．１モルのリ
ン酸用、ｐＨであった。下表に結果を示す。

−人里− Ｘ：質　　Ｈ２Ｏ２ＨＲＰ　　緩衝液 −１−−ニュー　−上」　−上ユ　　ΔＦ８００　　１
００　　　０　１００　　６．６８００　　１００　　
２０　　８０　１１．０８００　　１００　　５０　　
５０　１６．２８００　　１００　１００　　　０　２
９．７８００　　１００　１００　　　０　３０．４」
二の結嗅から明らかなように、主題の組成物はＨＲＰの
ための効率よい基質である。蛍光発生前駆物質は蛍光発
生生成物に急速に転化される。アリール・キャップから
生ずる生成物は、蛍光発生生成物の蛍光を妨害せず、し
かも酵素反応を阻害しない。さらに、セイヨウワサビの
ベルオキシターゼが高い活性を有する適当なＰＨにおい
て、蛍光発生生成物は安定であり、かつ高い量子効率を
有する。こうして、主題の蛍光発生基質は不均質または
均質のいずれにおいても、問題の広範な種類の分析物の
蛍光測定を実施する１便利なかつ簡単な方法を提供する
。

理解を明瞭とする目的で、例示および実施例により、本
発明を詳述してきたが、特許請求の範囲の範囲内である
種の変化および変更を行なうことができることは、明ら
かであろう。

４８−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペルオキシダーゼの基質から生成され且つ蛍光測定
   信号を発生する生成物の量を測定することにより、ペル
   オキシダーゼの触媒の活性を決定する方法において。 蛍光発生基質として、アリール拳キャップド拳アリール
   蛍光化合物から成るジアリール有機化合物を使用し、前
   記蛍光化合物は環炭素原子へ結合した窒素または酸素を
   もつ結合基を有し、そして前記ジアリール有機化合物は
   、前記キャップとしてｉｊｉ′素環式アリール基へ結合
   したとき、前記蛍光化合物の励起波長において非蛍光性
   であり、前記アリール基のキャップは、前記結合基へ結
   合した環炭素原子から、２または４個の環炭素原子によ
   って１分離された環炭素原子上のオキシまたはアミノ置
   換基を有し、前記炭素環式アリール基はペルオキシダー
   ゼが触媒する除去を行なって前記７リ一ル蛍光化合物を
   生成する、 ことを特徴とする方法。 ２、前記炭素環式アリール基はヒドロキシフェニルであ
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記炭素環式アリール基はアミノフェニルである。 特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、＠記基はパラ位置に存在する、特許請求の範囲第２
   または３項記載の方法。 ５、標識としてペルオキシダーゼを使用し、前記ペルオ
   キシダーゼは特異的結合性対の１員へ複合されており、
   前記対は配位子と受容体とから成り、分析物が前記対の
   構成負である、ある試料中の分析物の存在を決定する方
   法であって、前記方法は、前記複合体、前記試料、過酸
   化物源およびペルオキシダーゼの基質を組み合わせ。 その際前記基質は検出可能な信号を発生する生成物を生
   じ、そして 前記試料中の分析物の品−に関係する生成された生成物
   のｌｌｌ−測定、することを包含する方法において、 蛍光発生基質として、アリール・キャップド・アリール
   蛍光化合物から成るジアリール有機化合物を使用し、前
   記蛍光化合物は環炭素原子へ結合した窒素または酸素を
   もつ結合基を有し、そして前記ジアリール有機化合物は
   、前記キャップとして炭素環式アリール基へ結合したと
   き、前記蛍光化合物の励起波長において非蛍光性であり
   、前記アリール基のキャップは、前記結合基へ結合した
   環炭素原子から、２または４個の環炭素原子によって、
   分離された環炭素原子上のオキシまたはアミノ置換基を
   有し、前記炭素環式アリール基はペルオキシダーゼが触
   媒する除去を行なって前記アリール蛍光化合物を生成す
   る、 ことを特徴とする方法。 ６、前記過酸化水素源はオキシダーゼと前記オキシダー
   ゼの基質との組み合わせである。特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ７、前記アリール基はオキシアリールである。 特許請求の範囲第５または６項記載の方法。 ８、前記アリール基はアミノアリールである、特許請求
   の範囲第５または６項記載の方法。 ９．４ｆｊ記アリール基はフェニルである、特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 １０、式 ％式％ 式中、 Ｘはオキシまたはアミノであり、少なくとも１つのＸが
   存在し、 Ａｒは１〜２個の環をもつ炭素環式芳香族基であり、 Ｙはオキシまたはカルバモイルオキシであり、そして ＦＷはＹのＯまたはＮとともに蛍光である芳香族化合物
   である、 の化合物。 式中、 Ｘｏはオキシまたはアミノであり、 Ｆ９．°は７−ヒトロキシクロメノンおよび３．６−ジ
   ヒドロキシキサンテン類から成る群より選ばれたフェノ
   ール系蛍光化合物であり、 ｎはθ〜６であり、そして Ｄは１〜３個の炭素原子のアルキルであるかまたは水溶
   性を増大しかつ０〜６個の炭素原子と１〜６個の異種原
   子を有する極性基である、 の化合物。 １２、Ｘはパラ位置に存在する。特許請求の範囲第１θ
   項記載の化合物。 １３、Ｘはヒドロキシである。特許請求の範囲５− 第ｉｏ項記載の化合物。 １４、Ｘはアミノである、特許請求の範囲第１θ項記載
   の化合物。 １５、Ｆｌ”は９−フェニル置換３，６−シヒドロキシ
   キサンテンである、特許請求の範囲第１θ項記載の化合
   物。 １６、Ｆｌ”は７−ヒトロキシクロメノンである、特許
   請求の範囲第１０項記載の化合物。 １７、式 式中、 Ｘｏはヒドロキシまたはアミンであり、そして少なくと
   も１つのＸｏは該酸素から２または４個の環員により分
   離されており、 ｍは１または２であり、そして Ｗは水素、カルボキシ、カルボキシアミドまたはＮ−置
   換力ルポキシアミドであり、６− Ｘ”または環炭素原子は１〜３Ｍの炭素原子のアルキル
   、１〜３個の１ν素原子のフルコキシ、およびカルボキ
   シから成る群より選ばれた構成０で置換されることがで
   き、前記カルボキシはさらに置換されて、１〜４個の炭
   素原子の酸性基置換アリレカノールまたはアルキルアミ
   ンのエステルまたはアミドを形成することができる、 の化合物。 １８、式 式中。 ２は式 Ｘｏはオキシまたはアミノであり、そして２または４個
   の炭素原子により該酸素から分離されており、 Ｚ゛はＺと同一であるかあるいはオキシであり、そして Ｘ“または環炭素原子は、１〜３個の炭素原子のアルキ
   ル、１〜３個の炭素原子のフルコキシ、およびカルボキ
   シから成る群より選ばれた構成負で置換されることがで
   き、前記カルボキシはさらに置換されて、１〜４個の炭
   素原子の酸性基置換アルカノールまたはアルキルアミン
   のエステルまたはアミドを形成することができる、 の化合物。 １９．３−カルボキシ−７−（３°−アミノフェノキシ
   ）クマリン。 ２０．３−カルボキシ−７−（３’−メチル−４°−７
   ミノフエノキシ）クマリン。 ２１．３−カルボキシ−７−（Ｎ−カルボキシメチル−
   ４°−アミツブエノキシ）クマリン。 ２２、活性化された炭素環式アリール基Ｘ−Ａｒ、式中
   ＡおよびＡｒは特許請求の範囲第１Ｏ項において定義し
   たとおりである、をアミノ−またはオキシ−蛍光化合物
   に結合することを特徴とする特許請求の範囲第１θ項記
   載の化合物を製造する方法。 ２、特許請求の範囲第１θ〜２１項のいずれかに記載の
   化合物を１種の試薬として含む、測定系。