JPH03500249A - ランタナイドキレートを用いる核酸配列の多重標識時間分解蛍光分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ランクナイドキレートを用いる核酸配列の多重標識時間分解蛍光分析 核酸の構造分析は分子生物学において中心的役割を担っている。核酸配列の解析 に現在利用されている技術は労力と経費を要し、多くの場合放射性同位元素の使 用を包含する。この理由から、また３Ｘ１０ゝ塩基ものヒトゲノムを含めた無数 の遺伝子の配列決定のためには、核酸配列解析のための自動化された非同位元素 法の開発がきわめて重要である。

一般に用いられている配列決定法はＳａｎｇｅｒらの業績に基づくものである（ Ｓａｎｇｂｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、＆Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ ，、１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７４　：　５４６３〜５４６７）。酵素法を用い、アデノシン（Ａ）、シチジン （Ｃ）、グアノシン（Ｇ）またはチミジン（Ｔ）のいずれかで終結するＤＮＡフ ラグメントを生成させることができる。別の重要な方法がＭａｘａｍらによって 開発された（Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、　＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　ｗ、ｌ　１９８ ＣＬ　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ＋ｎ。

６５　：　４９９〜５５９）　、この化学的方法では、Ｇ、Ｇ＋Ａ、Ｃ＋Ｔおよ びＣで終結する７ラグメントが生成される。いずれの場合も、これらの長さの異 なる４セツトのＤＮＡフラグメントをついで高分解ポリアクリルアミドゲル中、 隣接したレーンで電気泳動に付して分離する。次にゲルのイメージを旧来のオー トラジオグラフィー法で検査することができる。

自動的に電気泳動走査をリアルタイムで読み取る明らかに費用効果の高い方法は 蛍光標識と各電気泳動レーンへの−Ｒ尚な蛍光測定系の使用である。フルオレセ インまたはテトラメチルローダミンを含む慣用の蛍光プローブが適用可能である 。しかしながら、この方法は４種の独立の励起系および検出系を必要とし、不手 際で高価につく。励起用にビームスプリッタ−を付したアルゴンイオンレーザ− の使用は有利で感度が改善される。最近Ｓｍ１ｔｈら　（Ｓｍｉｔｈ、Ｌ、Ｍ、 、５ａｎｄｅｒｓ、Ｊ、Ｚ、、　Ｋａｉｓｅｒ、　Ｒ，Ｊ、。

Ｈｕｇｈｅｓ、　Ｐ、、　Ｄｏｄｄ、　Ｃ，、Ｃｏｎｎｅｌｌ、　Ｃ，Ｒ，、Ｈ ｅ１ｎｅｒ、　Ｃ，。

Ｋｅｎｔ、　Ｓ、Ｂ、Ｈ，＆　Ｈｏｏｄ、　Ｌ、Ｅ、、　１９８６．　Ｎａｔｕ ｒｅ、　３２１　：　６７４〜６７９）は自動配列読み取り装置を発表した。こ のシステムは、各末端（ＡＳＣ，ＧおよびＴ）毎に１種、４種の有機蛍光プロー ブ（フルオレセイン、　ＮＢＤ、テトラメチルローダミンおよびテキサスレッド ）の使用に基づくもので、標識されたＤＮＡフラグメントは同一カラム内で電気 泳動された。電気泳動時のＤＮＡバンドのリアルタイムでのモニタリングにはア ルゴンイオンレーザ−蛍光検出器が用いられた。各色の蛍光シグナルはＤＮＡバ ンドを指示し、その情報は直接コンピューターに保存された。

Ｓｍ１ｔｈら（１９８６）によって報告されたシステムによる方法の利点は、単 一カラムの電気泳動系を使用できることにあフたが、著しく重複した励起および 発光スペクトルをもつ４種の旧来の蛍光プローブの使用は、他の蛍光プローブの 干渉によって生じるシグナルを除去するｔ；めに、アルゴンイオンレーザ−励起 と高度なコンピューターデータの換算を必要とした。レーザー励起はまた、ゲル および関連するガラス管に由来するバンクグランド散乱を低下させるために有用 であった。アルゴンイオンレーザ−の採用はそのシステムの費用をかなり増大さ せる。

本発明の目的は、４種の蛍光プローブを用い４種の塩基に特異的な反応をそれぞ れ同時に読みとる単一カラムの電気泳動系ｌ：よる自動的リアルタイム核酸配列 解析装置を提供することにある。各反応で生成した核酸フラグメントは、蛍光プ ローブの特異的な励起および発光波長に基づいて同定する。しかしながら、慣用 の蛍光プローブはＳｍ１ｔｈらの研究で示されたように著しく重複する励起およ び発光スペクトルを有する。この問題を克服する、ため、自動的リアルタイム核 酸配列決定に蛍光性ランクノイドキレ−の使用の可能性を検討しＩ；。

ランクノイドキレートは、生物特異的検定や細胞分析に際し、標識または染料物 質として有望視されてきた代替品である（Ｈｅｍａｉｌｊｉ、　Ｌ、　１９８５ ．　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、　５７：　１６７６〜１６８１　；　Ｈｅｍｍ１ｌ Ｊ　］、、　Ｄａｋｕｂａ、　Ｓ−、Ｍｕｋｋａｌａ、　Ｖ−Ｍ、。

５ｉｉｔａｒｉ、　Ｈ，＆　Ｌ５ｖｇｒｅｎ、　ｒ−１１９８４，Ａｎａｌ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１３７　：　３３５〜３４３）。しかしながら、多重パラメーター分析における 一般的な問題として異なる発光波長帯を有する十分な数の異なるランタノイドを 利用できるかという点がある。ユウロピウムおよびテルビウムはそれぞれ６１４ ｎｍおよび５４５ｎｍに発光バンドを有し、またこれらは適当なキレートを形成 すると比較的強力な蛍光を与える。サマリニウムはその特異的発光バンドを６４ ０．ｎ　ｍに有し、ＥｕおよびＴｂの発光とは効率的に分離することができて、 したがってＥｕ、　ＴｂおよびＳｍは同一サンプル中の３種のパラメーターの分 析を可能にする。しかしながら、他のランタナイドの蛍光放出は弱すぎるし、ま た現在知られているそれらのキレートは水溶液中で安定でない。したがって、た とえば同一サンプル中で４種の標識を用いる多重パラメーター分析のために、発 光波長の異なる４種のランタナイドを見出すことは困難である。

本発明は、修飾されｔ；核酸フラグメントに共有結合する活性官能基を包含し、 ユウロピウムおよびテルビウムとほぼ同等に結合するが異なる励起波長を有する 新規なキレート構造の発見に関連するものである。−例として、リガンドＡは２ ７４ｎｍに、リガンドＢは３０７ｎｍに最大励起を有する。したがって、４種の パラメーターをもつサンプルの分析には４種の異なるランタナイドキレートの以 下の組合せが使用できる。

キレート　励起波長　発光波長 リガンドＡ−Ｅｕ　２７４ｎａ＋　６１４ｎｍ　化合物１２リガンドＢ−Ｅｕ　 ３０７ｎｍ　６１４ｎｍ　化合物２４リガンドＡ−Ｔｂ　２７４ｎｍ　５４５ｎ ｍ　化合物１３リガンドＢ−Ｔｂ　３０７ｎｍ　５４５ｎｎｙ　化合物２５これ らのキレートの励起および発光スペクトルのバンド幅は、第１図〜第４図に示す ように、同一サンプル中のこれらの４種のキレートのそれぞれを濾過蛍光光度計 を用いて十分検出可能な狭さである。実際の測定に際しては、これは上記の表に 従って励起および発光波長を変えて、各測定毎に４つのシグナルを記録すること によって達成される。リアルタイムＤＮＡ配列決定では、同一カラムでの電気泳 動から４種のＤＮＡ末端（Ａ、Ｃ％ＧおよびＴ）のそれぞれの直接記録が適当な 二重励起／二重発光波長蛍光光度計を用いて行われる。この場合、各波長の組合 せの記録は、電気泳動ゲル内のＤＮＡの移動に比較して十分速い。

第１図に示すように、ＴｂおよびＥｕのそれぞれ５４４ｎｍおよび６１４ｎｍに おける発光ピークは十分鋭く、重大な重複や干渉はなく、シグナルはほぼ完全に 分離されている。

第２図および第３図から明らかなように、リガンドＡとのキレートの励起収率は ３０７ｎｍではきわめて低い。第４図および第５図から明らかなように、リガン ドＢとのキレートの２７４ｎｍにおける励起収率は３０７ｎｍにおける最大値の 約２５％である。これは干渉を生じるが、信頼できるデータ換算が可能な低値で ある。

通常一部の他のリガンドは２７４ｎｍまたは他の適当な波長でさらに低い励起収 率を与え、したがってシグナル間の干渉をさらに低くすることが可能で、干渉を 差引くためのコンピューターの容量は必要きしない。

選択性に加えて、電気泳動からの核酸バンドの検出には感度が重要である。生化 学的および生物学的サンプルの最も重大なバンクグランド源は、「自然蛍光」と 散乱である。これらの原因で生じた発光は、生物学的物質の蛍光の崩壊時間がき わめて短いので、励起と同時゛またはその直後に現れる。蛍光プローブとしてラ ンクナイドキレートの使用は、ランタナイドの蛍光の崩壊時間が長いので、バッ クグランドおよび散乱を効果的に低下させる可能性を提供する。時間分解蛍光測 定法では、励起の瞬間からある時間が経過するまで測定が行われないので、プロ ーブの長寿命の蛍光から瞬時のバックグランドが効果的に識別される。すなわち 、これは、長寿命の蛍光を有するグローブの測定にほぼ理想の方法を提供し、短 寿命の有機蛍光プローブによる慣用の測定方法に比べて感度はかなり改善される 。

ランタナイドおよびそれらのキレートは、５０〜１０００μｓｅｃのオーダーの 崩壊時間をもつイオン蛍光を示す特定の群の化合物であり、これらの化合物は時 間分解マイクロセカンド蛍光測定法にきわめて有用である。最良の有機蛍光化合 物と比較して、ランクナイドキレートは時間分解蛍光検出で使用した場合、匹敵 するまたはより優れた総合感度を与えることができる（Ｓｏｉｎｉ　＆　Ｋｏｊ ｏｌａ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　２９：　６５．１９８３）　。これは最良の有機蛍光 化合物の場合の約１０分の１またはそれ以下という低い量子収量にもかかわらず である。低い量子収量は大部分、広いストークス・シフトと蛍光シグナルの長い 崩壊時間に起因する。

高い検出感度は、励起源としてキセノンフラッシュランプを、適当な励起および 発光バンドを選択するための干渉フィルターの使用に基づく簡単な蛍光測定系で 達成テキル。パルスｔ’［１μｓの小型キセノンフラッシュランプは市販品を入 手できるが、これはこの目的によく適合する。

時間分解蛍光測定システムの操作を第６図に模式的に示す。光源から幅ｔ２のパ ルスを発生させる。シグナルは励起パルスの終末において最大瞬間強度１２を有 する。蛍光標識の励起状態は崩壊時間τとともに減衰し、適当な遅延時間ｔｄ後 に検知器からのシグナルをゲート時間ｔｇのある期間収集する。励起は反復頻度 ｆ１パルス間の時間間隔ｔ、−１／ｆで反復される。蛍光シグナルはゲート時間 ｔ８の間に一定数の測定サイクル（ｎ）にわたって集積されることになる。

ランクナイドキレートを用いた時間分解蛍光測定法での検討に役立ち適用可能な 装置には、実際の崩壊時間に比べてきわめて短い光パルスを生成するパルス光源 を装着しなければならない。異なる蛍光錯体の間の干渉は、錯体が異なる崩壊時 間τを有するので、遅延時間ｔｄとゲート時間ｔｇを至適化することによって減 少させることができる。したがって、多重パラメーター解析においては、励起お よび発光バンドを至適化することに加えて、ｔ６およびｔ８を制御することが重 要である。この制御は自動化し、波長制御と同調させなければならない。

ｇＪ７図には、本発明による核酸配列決定装置の原理を例示する。電気泳動カラ ム（３）は上部緩衝液貯蔵部（１）および下部緩衝液貯蔵部（２）に連結する。

波長２７４ｎｍ（５）および波長３０７ｎｍ（６）の光パルスを生じる励起光源 は適当な干渉フィルターおよびレンズ系に導入される。光パルスはカラム（７） および（８）内の点（４）に集束される。カラムからの蛍光発光は検知器（７） および（８）に収集される。検知器には適当なレンズ系と波長５４４ｎｍおよび ６１４ｎｍに対する干渉フィルターが包含される。

励起光源および検知器は電子工学装置によって制御され、周期的に！二とえば次 のように活性化される。

第１サイクル　光源５　検知器７ 第２サイクル　光源５　検知器８ 第３サイクル　光源６　検知器７ 第４サイクル　光源６　検知器８ 両波長における発光が両励起波長について記録され、これらの４サイクルを、統 計的に許容される正確さを得るのに十分な光子数が記録、されるまで反復する。

電子工学的制御システムはまた、時間分解様式で蛍光発光を記録するように調整 される。

フラッシュ光源および検知器の構成は比較的簡単なので、同波長に対して別個の ２個の装置を使用してもシステムの価格が著しく上昇することはない。通常は、 干渉フィルターに対する過当なチョッパーシステムｔ−モつ１個の装置も使用で きる。

リガンドＡおよびＢならびにテルビウムおよびユウロピウムについて上に示した 波長は例として挙げたものでアル。本発明は対としてテルビウムとユウロピウム また対としてリガンドＡ（最大励起２７４ｎｍ）とリガンドＢ（最大励起３０７ ｎ＋＋＋）の使用に限定されるものではなく、適当な波長の任意の他の対が本発 明の範囲内に包含される。

本発明は、本明細書に記述部分の一部を形成する請求の範囲に定義される。本発 明゛を次に実施例によって例示する。使用されたキレートの式および合成経路は スキーム１〜３に示す。

６．６′−ジメチル−２，２′−ビピリジン（１，９７ｇ、　Ｃ１，０１０７モ ル）をクロロホルム（Ｊｏｉｎ）に溶解した。ｍ−クロロ過安息香酸（１，８５ ９，０，０１０７モル）をりｃｏｏホルム（４０ｒｔｒＱ）に溶解し、ビピリジ ン溶液に０〜５℃で徐々に加えた。

室温で２時間撹拌したのち、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で２回、水で３ 回抽出した。クロロホルム相を乾燥し、蒸発させた。生成物をフラッシュクロマ トグラフィーで精製した。

収率ニア０％ ＵＶ（エタノール中）　：　２７０ｎｍ、　２５０ｎｍ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨ ｚ、　ｅＤｃｆｆｓ）　：　２−６１（ｓ、３Ｈ）　；　２．６２（ｓ、３Ｈ） 　；７−１９（ｄ、　ＩＬ　Ｊ−８Ｈｚ）　；　７．２Ｂ（ｄ、　ＩＨ，Ｊ□５ Ｈｚ）　；　７−６９（ｔ、　ＩＢ。

Ｊ＝８Ｈｚ）　；　７．９７（ｔ、　ＩＨ，Ｊ＝５１（ｚ）　；　８．５３（ｄ 、１）！、Ｊ□８Ｈｚ）１１ｉＬ（スキームｌ） ６．６′−ジメチル−４−ニトロ−２，２′−ビピリジン−Ｎ−６，６′−ジメ チル−２，２′−ジピリジン−Ｎ−オキシド（１，５０ｇ、　０．００７４９モ ル）を濃硫酸（８，ＯｍＱ）と発煙硝酸（６，ＯｍＱ）中に溶解し、混合物を１ ００°Ｃに４時間加熱した。

溶液を氷水中に徐々に注ぎ、ｐＨを１０％水酸化ナトリウムで５．５に調整した 。生成物を濾過し、乾燥し！；。

収率：５３％ 融点１６０〜１６３℃ ＵＶ（エタノール中）　：　３３７ｎｍ、　２９４ｎｍ、　２３３ｎｍ’ＨＮＭ Ｒ（４００ＭＨｚ、　ＣＤＣＱｓ）　：　２−６２（ｓ、３Ｂ）　；　２．６５ （ｓ、３Ｈ）　；７．２７（ｄ、　ＩＨ，Ｊ＝８Ｈｚ）　；　７．７５（ｔ　、 　１Ｂ、　Ｊ−８Ｈｚ）　；　８．１０（ｄ、　ＩＨ。

Ｊ＝３Ｈｚ）　；　８．５６（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝８Ｈｚ）　；　８．９３（ｄ、Ｉ Ｈ，Ｊ・３Ｈ２）実施例３（スキームｌ） ６．６′−ジメチル−４−二トキシ−２，２′〜ビピリジン−Ｎ−オキシド（３ ） ６．６′−ジメチル−４−二トロー２，２′−ビピリジン−Ｎ−オキシド（２） 　（１，０９，４−１ミリモル）を、ナトリウム（０，１９９，０，００８３ｇ Ｊｌｊ（子）とエタノール２５ｍｆｉから作ったナトリウムニドキシド溶液に加 えた。混合物を７０℃で３０分蒸発乾固した。生成物をフラッシュクロマトグラ フィー（シリカ、０→５０％メタノール／クロロホルム）で精製しｔ；。

収率：９０％ ＵＶ（エタノール中）　：　２７２ｎｍ、　２３９ｎｍ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨ ｚ、ＣＤＣｌ２り：　１．４５（Ｌ、３Ｈ，Ｊ−７，０Ｈｚ）；２．５８Ｊ□３ ．４Ｈｚ）　；　７．２０（ｄ、ＬＨ，Ｊ謬７−７、Ｈｚ）　；　７−５４（ｄ 、ＩＨ，Ｊ弓、４Ｈｚ）　；７．７０（ｔ、ＩＨ，Ｊニア、７Ｈｚ）　；　８． ６５（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）実施例４（スキーム１） ６．６′−ジメチル−４−二トキシ−２，２′−ビピリジン−Ｎ−オキシド（３ ）　（０４６ｇ、　３．９３ミリモル）をクロロホルム（３４ｍ１２）に溶解し た。三臭化リン（３，Ｏｍｆｆ）を加えたのち混合物を１．５時間還流した。溶 液を氷上に注ぎ、クロロホルムを適宜加えて相を分離した。クロロホルム相を水 で抽出した。水相を合し、水酸化ナトリウム溶液でアルカリ性とし、クロロホル ムで抽出した。有機相を蒸発させ、ついでシリカゲルクロマトグラフィーに付す と純粋な標記生成物が得られた。

収率：６９％ ＵＶ（エタノール中）　：　２８６ｎｍ、　２４３ｎｍ”ＨＮＭＲ（４００ＭＨ ｚ、　ＣＤＣｆｆ５）　：　１．４５（ｔ、３）！、Ｊ−７．０Ｈｚ）　；　２ ．５６（ｓ、３Ｈ）　；　２．６２（ｓ、３Ｈ）　；　４．１Ｂ（ｑ、２Ｈ，Ｊ ＝７．０Ｈｚ）　；　６．６７（ｄ、ＩＨ。

Ｊ＝２．１Ｈｚ）　；　７．１４（ｄ、１）］、Ｊ＝７．６Ｈｚ）　；　７．６ ７（ｔ、ＩＨ，に７．６Ｈｚ）　；７．７５（ｄ、ＬＨ，Ｊ□２．ＩＨｚ）　； 　８．１６（ｄ、ＩＨ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）えｍｆｌ１５ ４−エトキシ−６，６′−ビス（ブロモメチル）　−２，２’−ビ化合物（４Ｘ ＣＯＸＣ上ル）を四塩化炭素（１００１ＩＩ＋２）に溶解した。Ｎ−ブロモスク シンイミド（９，０ミリモル）と触媒量の過酸化ジベンゾイルを加え、混合物を 一夜還流した。混合物を濾過し、溶液を蒸発乾固した。フラッシュクロマトグラ フィーで分離して純粋な生成物が単離された。

収率：１９％ ＵＶ（エタノール中）　：　２８６ｎｍ、　２２５ｎｒａ’ＨＮＭＲ（４００Ｍ Ｈｚ、　ＣＤＣＱｓ）　：　１−４５（ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）　；４．１９（ｑ 。

Ｊ−７，０Ｈｚ）　；　４．５５（ｓ）　；　４．６０（ｓ）　；　６．９５（ ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ）　；　７．４３（ｄｄ、Ｊ＝０．９Ｈｚおよび７．６Ｈｚ ）　；　７．７７（ｔ、Ｊ・７．６Ｈｚ）　；　７．９０（ｄ、Ｊ６−ブロモ− ２−ピリジンカルボキシアルデヒド（Ｊ。

Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、、　９１（１１）　：　３５００　（１９７０） ）　（１１，３８ｇ、　６２．２ミリモル）を乾燥メタノール（２００ｍＱ）と オルトギ酸トリメチルエステル（２６，５９，２５０ミリモル）の混合物に溶解 した。ｐ−トルエンスルホン酸−水和物（２５０ｍｇ）を加えたのち混合物を１ 時間還流し、冷却し、ピリジン（５＋ＩＩＱ）を加えて中和した。溶媒を蒸発さ せ、生成物を減圧下に蒸留すると、純粋なジメチルアセタールが無色の液体とし て生成した。

収率：９６％ ’ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ、ＣＤＣＱ３）：　３−３６（ｓ、６Ｈ）；　５．２５ （ｓ、ＩＨ）；７７−４６（，３Ｂ） 実施例７（スキーム２） ビス（６−シメトキシメチルー２−ピリジル）ケトン６−ブロモ−２−ジメトキ シメチルビリジン（１４）（１４，２ｇ、　６１ミリモル）を乾燥ジエチルエー テル（２００＋＋＋ｆｆ）に溶解し、還流冷却器および滴下洲斗を付しツ：丸底 三頚フラスコ中で一７０℃に冷却した。この間、混合物には、電磁撹拌器で撹拌 しながら、乾燥アルゴンを穏やかに通した。ブチルリチウム（２５，１ｍｆｆ（ ２，６Ｍ　）、　６５．３ミリモル）〕を滴下し、反応混合物の温度は一６０° Ｃ以下に保持した。

添加完了後さらに１時間混合物を撹拌し、乾燥ジエチルエーテルに溶解したクロ ロギ酸エチル（４，５２ｇ、　４１．７ミリモル）を、温度が一６０°Ｃを越え ないような速度で導入した。黄色の懸濁液を一６０℃で４５分間、ついで−４０ ℃で１５分間撹拌した。反応をメタノール（２０ｍＱ）で停止させたのち反応混 合物を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注いだ。エーテル相を分離し、水相を ジクロロメタン１００ｒｎＱで２回抽出した。有機相を合し、蒸発させ、ついで トルエンと共蒸留すると、粗製の標記化合物が生成した。

’ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ、　ＣＤＣＱ、）　：　３．３８（ｓ、１２Ｈ）　；　 ５．３０（ｓ、２Ｈ）　；８．１８１．６４（ｍ、６Ｈ） 実施例８（スキーム２） ビス（６−ホルミル−２−ピリジル）ケトン（１６）粗製のビス（６−シメトキ シメチルー２−ピリジルケトン（１５）をジオキサン（４０ｔｉΩ）と水（２５ ＋ｎＱ）に溶解した。

濃塩酸Ｃ３ｍρ）を加え、混合物を電磁撹拌器で撹葎しながら１５分間煮沸した 。暗色の溶液を次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００＋＋＋１２）中に注ぎ 、クロロホルム（３Ｘ１００π１２）で抽出した。抽出液を蒸発させたのちの残 留物を短いシリカゲルカラムを通し、溶媒として４％ＥｔＯＨ／ｃｈｒ、ａｓを 用いて濾過し、生成物を含有する分画を蒸発させた。生成物を熱トルエン（］Ｏ ｈ＋Ｑ）から結晶化させた。

収率：６５％（化合物１４に基づいて）’）Ｉ　ＮＭＲ（６０ＭＨｚ、　ＣＨＣ Ｑｓ）　：　８−４８−８．１１（ｍ、６Ｈ）　；　１０．７（ｓ。

２Ｈ） 実施例９（スキーム２） ビス（６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル）ケトン乾燥エタノール（５０ｍｆ ｆ）中の化合物（１６）　（２，５ｇ、　５２．５ミリモル）に、乾燥エタノー ル（３０＋１２）中に溶かした水素化ホウ素ナトリウム（４００πｇ、　５２． ５ミリモル）を、穏やかに撹拌しなから０℃で滴下した。約２７．の水素化ホウ 素を添加し終わったとき、満足すべき比のジオール（１７）／ドルオールが得ら れた。アセトン（２ｈ＋ｆｆ）を加えて未反応の還元剤を分解し、混合物を蒸発 させ、クロロホルム／エタノール　］：１に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウムで 抽出した。有機相を蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、シリカゲルカラムクロマ トグラフィーにより溶出溶媒としてＥｔＯＨ／ＣＨＣＱｘ　１　：　９を用いて 精製した。

収率：４８％ ’ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ、ＣＤＣＬ十ＣＬＣＤ）：　４．７７（ｓ、４Ｈ）；　 ７．９８−７．２７（ｍ、６Ｈ） 実施例１０（スキーム２）　、 ビス（６−プロモメチルー２−ピリジル）ケトン（１８）ビス（６−ヒドロキシ メチル−２−ピリジル）ケトン（１７）　（４１０１１１ｇ、　１−６８ミリモ ル）をジ／）ｏｏメタン（１５＋ｎＱ）中に懸濁し、５０１１１１２の丸底フラ スコ中室温で撹拌した。三臭化リン（１，８２９，６，７２ミ！Ｊモル）を一度 に加え、混合物を５分間還流した。冷却した混合物を飽和炭酸水素ナトリウムと クロロホルムに分配した。有機相を集め、蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、溶 媒としてクロロホルムを用いフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。

収率：８７％ ＵＶ（ジクロロメタン中）：２８２ｎｍ’ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ、　ＣＤＣＬ） 　；　４−５５（ｓ、４Ｈ）　；　８．１６−７．２２（ｍ。

６Ｂ） 塩化チオニル（５，０＋＋＋Ｑ、　８−０６９．６８ミリモル）を５００ｙＪの 水冷乾燥エタノール中に滴下した。撹拌した混合物をこの温度に２０分間保持し 、Ｌ−リジン塩酸塩（２０ｇ、　１０９　ミリモル）を加えた。

次に、混合物を３時間還流し、容量約２００＋Ｑに濃縮した。ジエチルエーテル ２００ｍＱを加え、結晶した生成物を濾過した。

収率：二塩酸塩９７％ Ｌ−リジンＨＣ４（５９，２７，４ミリモル）を水５０＋ｎＱに溶解し、５Ｍ　 ＮａＯＨを滴下してｐＨを１Ｏ８５とした。ジオキサン（５０ｍｆｆ）中４−二 トロペンゾイルクロリド（６−６９，３６ミリモル）と５ＭＮａＯＨを徐々に加 え、この間激しく撹拌した反応混合物のｐＨを１０．５に保持した。

添加が完了し、桃色が消えたのちに、反応混合物を濃塩酸でｐＨ２の酸性とし、 ジエチルエーテルで４回抽出した。水相を濃縮乾固し、２００！ｌＩＱの乾燥エ タノールと２回共蒸発させ、ついで予め１０ｍ１の塩化チオニルで処理した乾燥 エタノール２５０１１１Ｑ中に懸濁した。混合物を３時間還流し、濾過し、蒸発 させた。残留物質を飽和炭酸水素ナトリウムとクロロホルム／エタノール　１： ｌに分配し、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥すると粗生成物が得られ、これ を溶出液として５％ＥＬＯＨ／りｅ７ｅ７ホルムを用いたフラッシュクロマトグ ラフィーによって精製しｔ；。

収率：１２％ ’ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ、　ＣＤＣ＋Ｑｚ）　＝　８．２５（ｄ、２Ｈ，Ｊ−９ Ｈｚ）　；　７−９３（ｄ。

２Ｈ，Ｊ□９Ｈｚ）；　６．８７（ｓ、ｂｒｏａｄ、ＩＨ）；　４．１７（ｑ、 ２Ｈ，Ｊ□７Ｈｚ）；３．３（１３−６０（ｍ、３Ｈ）；　ｌｌ−４Ｏ−１−７ ５（，８Ｈ）；　１．２４（ｔ、３Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ） 実施例１３（スキーム３） ａ−Ｎ−（メトキシカルボニルメチル）−ω−Ｎ−（４−ニトロベンゾイル）− Ｌ−リジンエチルエステル化合物（２７）　（０，５４９，１，７ミリモル）を トルエンと共蒸発し、乾燥アセトニトリル（１０ｍ１２）に溶解した。ブロモ酢 酸メチルエステル（０，２６５ｇ、　１．７ミリモル）、ついで粉末炭酸ナトリ ウム（２−ｈ）を加えた。混合物を３時間還流した。

無機塩を濾過し、アセトニトリルを蒸発させると油状の粗生成物が得られ、これ をフラッシュクロマトクラフィーで精製した。

収率：６８％ ’ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ、　ＣＤＣＱｓ）　：　８．２５（ｄ、２Ｈ，Ｊ□９Ｈ ｚ）　；　７−９３（ｄ。

２Ｈ，Ｊ□９Ｈｚ）　；　６−６３（ｓ、ｂｒｏａｄ、　ＩＨ）　；４．１３（ ｑ、２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）　；３．６８（ｓ、３Ｈ）　；　３−３０−３．６０（ ｍ、３Ｈ）　；　］、４０１．７５（ｍ、７Ｈ）　；　１．２４（ｔ、３Ｈ，Ｊ ＝７Ｈｚ） λ１」ｕｌ 出発原料としてα、ωジアミノ酸の誘導体を用いて反応性リガンドまたはキレー トを合成する一般操作ａ）　ｊ！当なジハロメチルビピリジン（１ミリモル）を 乾燥７セトニトリル（１０ｍ１２）中、粉末乾燥炭酸ナトリウムの存在下、室温 で激しく撹拌しながら、化合物（２８）（１ミリモル）と反応させる。−夜撹拌 したのち、未反応ジハロメチル誘導体、モノハロメチルジエステルおよび対称テ トラエステルからなる得られた混合物を蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、フラ ッシュクロマトグラフィーに付すと純粋なモノハロメチルジエステルが得られる 。

ｂ）得られたモノハロメチルジエステル（０，２ミリモル）を乾燥アセトニトリ ルと共蒸発し、アセトニトリル３ｍＣに溶解し、粉末炭酸ナトリウム１９ついで イミノ酢酸ジエチルエステル（０，２５ミリモル）を加える。混合物を一夜還流 し、濾過し、蒸発させる。短いカラムでクロマトグラフィーを行うと、新型の官 能化されたテトラエステルが得られる。

Ｃ）化合物（２８）を実施例１４ａ）の出発原料として用いる場合には、エステ ル基の加水分解およびキレート形成に先立ってニトロ基をアミン基に還元しなけ ればならない。

これは以下の方法で実施する。

実施例１４ｂ）からの相当する生成物の混合物に固体の水素化ホウ素ナトリウム （０，３ミリモル）、ついで乾燥エタノール５ｒｎＱ中パラジウム黒（１０％） 　０．２ｇを加える。混合物を室温で１０分間撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム とクロロホルムに分配する。有機抽出液を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフ ィーＪこ付すと、反応性のアミノ基を含有する、相当するテトラエステルが生成 する。

実施例１５（スキーム１） ４−エトキシ−６−（Ｎ−（メトキシカルボニルメチル）−Ｎ　−（１−（’５ −　（ｐ−ニトロベンズアミド））−１−（エトキシカルボニル）−ペンチル） −アミノメチル）−６′−ブロモメチル−２，２′−ビピリジン（６）この化合 物は出発原料として４−エトキシ−６，６′−ビス（ブロモメチル”）　−２， ２’−ビピリジン（５）および修飾イミノジ酢酸エステル（化合物２８）を用い 、実施例１４ａの一般操作に従って合成された。

収率：３８％ ”ＨＮＭ’Ｒ（４００ＭＨｚ、　ＣＤＣＱｓ）　：　１．３０（ｔ、Ｊ□７Ｈｚ ）　；　１．４５（ｔ。

Ｊ・７Ｈｚ）　；　１−１−５５−１−６８（；　１．７５７５−１−８３（； 　３−３−４５（；　３．５０（ｍ）　；　３．５５（ｄ、Ｊ−１５）１ｚ）　 ；　３．８４（ｓ）　；　３−６６（ｄ、Ｊ−１５Ｈｚ）　；　３．９４（ｄ、 １５Ｈｚ）　；　４．０３（ｄ、Ｊ＝１５）１ｚ）　；　４．１８（ｑ、ｊ＝７ Ｈｚ）　；　４．１９（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；　４−５８（ｓ）　；　６．８３ （ｓ）　；　７．４５（ｓ）　；　７．６２（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；７．７６（ ｔ、Ｊ□７Ｈｚ）　；　８．００（ｄ、Ｊ−９Ｈｚ）　；　８．２５（ｄ、　Ｊ −９Ｈｚ）　；　８．２８（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）　：　８．３５（ｓ）対称二ｆｔ 換テトラエステル（７）もまた２６％の収率で得られた。

憲ｍｆｌ１６（スキーム１） −（エトキシカルボニル）−ペンチル）−アミノメチルメチル−２，２′−ビピ リジン（８） この化合物は出発原料として化合物（６）とイミノジ酢酸シュチルエステルを用 い、実施例１４ｂの一般操作に従って合成した。

収率：６２％ ＵＶ（エタノール中）　：　２８７ｎｍ、　２２２ｎｍ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨ ｚ、　ＣＤＣＬ）　：　１．２６（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；　１．２８（ｔ、Ｊ＝ ７Ｈｚ）　：　１．４６（ｔ、　Ｊ＝７Ｈｚ）　；　１−５９（ｒｎ）　；　１ ．７６（ｍ）　；　３．３５（ｍ）　；３．４９（ｍ）　；　３．５８（ｄ、　 Ｊ＝１５Ｈｚ）　；　３．６５（ｓ）　；　３．６６（ｓ）　；　３．６７（ｓ ）　；　３．７１（ｄ、Ｊ・１５Ｈｚ）　；　３．９６（ｄ、Ｊ□１５Ｈｚ）　 ；　４．０５（ｄ、　Ｊ□１５Ｈｚ）　；　４．０９（ｓ）　；　４．１４（ｑ 、Ｊ□７Ｈｚ）　；　４．１７（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；　６．８８（ｓ）　；　 ７．１５（ｄ、Ｊ＝２）ｌｚ）　；　７．５０（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；　７．７ ５（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；７．８３（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ）　；　８．０１（ｄ、Ｊ ＝９Ｈｚ）　；　８．２４（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；　８．２６（ｄ、Ｊ−９）Ｔ ｚ） 実施例１７（スキーム１） ４−エトキシ〜６−（Ｎ−（メトキシカルボニルメチル）Ｎ−（１−（５−（ｐ −アミノベンズアミド））−１−（エトキシカルボニル）−ペンチル）−アミノ メチル）−６’　−（Ｎ、Ｎ−１＝’ス（エトキシカルボニルメチル）アミノメ チル’）　−２，２’−ビピリジン（９）この化合物は、出発原料として化合物 （８）を用い実施例１４ｃのニトロ基還元のための一般操作に従って合成した。

収率ニア１％ ＵＶ（エタノール中）　：　２８６ｎｍ、　２２２ｎｍ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨ ｚ、ＣＤＣＱ、）：　１．２６（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）：　１．２８（ｔ、Ｊ＝７Ｈ ｚ）；　１．４６（ｔ、Ｊ−７Ｈｚ）；　１−１−６０（；　１．７５（ｍ）； 　３．４１（ｍ）；３．４４（ｍ）　；　３−５４（ｄ、Ｊ＝１５Ｈｚ）　；　 ３．６２（ｄ、Ｊ−１５Ｈｚ）　；　３．６４（ｓ）　：３．６９（ｓ）　；　 ３．９２（ｄｊ＝１５Ｈｚ）　；　４．０１（ｓ）　；　４．０４（ｄ、Ｊ＝１ ５Ｈｚ）　；４．１６（ｑ、Ｊ□７Ｈｚ）；　４．１７（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ）；　 ６．３０（ｓ）；　６．６４（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ）　；　７−１６（ｃｌ、Ｊ−２ Ｈｚ）　；　７．５０（ｄ、Ｊ−７Ｈｚ）　；　７−６３（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ）； ７．７８（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）　；　７．７８（ｓ、Ｊ＝２Ｈｚ）　；　８．２４ （ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ）実施例１８（スキーム１） ４−エトキシ−６−（Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（１−（５−（ｐ−アミ ノベンズアミド））−１−カルボキシペンチル）アミノメチル）−６’−（Ｎ、 Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノメチル）　−２，２’−ビピリジンなら びにそのユウロピウム（１０）およびテルビウム（１１）キレート 化合物（９００，２５ミリモル）をアセトン（ｌｏｒｎΩ）に溶解し、２０°Ｃ で水酸化す；・リウム（ｌ　Ｍ　、　ＩＯ＋＋＋ｆｆ）により１時間処理した。

アルカリ性の溶液を濃塩酸で中和し、アセトン（２０ｍｆｆ）を加えると大部分 の塩が沈殿した。塩を濾過し、有機溶媒を蒸発させた。残ったテトラ酸の水溶液 のｐＨを５．０に調整し、これを二等分した。それぞれに尚量のＥｕＣｆ１３ま たはＴｂＣｆｆ、を水（５ｉ＋２）溶液の形で加え、両温合物をこのｐｕで３０ 分間撹拌したところ、ｐＨは８．０に上昇した。両反応混合物中のいずれにもわ ずかに沈殿を生じたので濾過した。水を減圧下に大部分蒸発させ、アセトン（５ ０ｍ（２）から沈殿させるとユウロピウム（１０）およびテルビウム（１１）キ レートが固体物質として単離されＩ；。

え乳１胆（スキーム１） インチオシアノキレート アミノキレート（１０）または（１１）を５ｍＱの水に別個に溶解し、激しく撹 拌しながら、クロロホルム（３＋ｎ１２）に溶解したチオホスゲン（８０μＱ） を一度に加え、混合物を室温で１時間撹拌した。

水相を分離し、クロロホルム（３Ｘ３ｍ＋２）で抽出し、容量０．５ｍＱに濃縮 した。エタノール（］０＋＋＋Ｑ）を加えると、インチオシアノ官能化ユウロピ ウムキレート（１２）およびテルビウムキレート（１３）が白色固体として定量 的に沈殿した。　ＴＬＣ（アセトニトリル／ＨｚＯ４：　１）　８よびアセトニ ルアセトン／ＥｔＯＨ（１：　２０）による蛍光発光で唯一の生成物が認められ 、これは遊離アミンに対する７０レスカミン試験に陰性であった。

実施例２０（スキーム２） ６−プロモメチルー６’−（Ｎ、Ｎ−ビス（ニドキシカルボニル）メチル）アミ ノメチル”）　−２，２’−ジビリジルケ［・ンモノブロモメチルジエステル（ １９）は、化合物（１８）と１モル当量のイミノジ酢酸ジエチルエステルに出発 し、実施例１４ａの場合と同様の反応で合成された。

収率：６２％ ’ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ、　ＣＤＣＬ）　：　１．２１（ｔ、６Ｈ）、３．６０ （ｓ、４Ｂ）。

４．０８（ｓ、２Ｈ）、　４．１５（ｑ、４Ｈ）、　４．５８（ｓ、２Ｈ）、　 ７．２２−８．１５（＋ｎ。

６Ｈ） 同じ反応で対称テトラエステル（２ｏ）が得られ、２１％の収率で単離された。

実施例２１（スキーム２） ６−（Ｎ−（メトキシカルボニルメチル）−Ｎ−（１−（５−（ｐ−アミノベン ズアミド）−１−（エトキシカルボニル）−ペンチル）アミノメチル−６’−（ Ｎ、Ｎ−ビス（エトキシカルボニルメチル）アミノメチル）　−２，２’−ジピ リジルケトン（２１） ａ）化合物（２８）　（２，ｉｇ、　５ミリモル）中のニトロ基を、乾燥メタノ ール２ＯｗｒＱ中、パラジウ充黒（１０％、　０．２９）の存在下、水素化ホウ 素ナトリウム（１ｏミリモル）で還元しｔ；。反応混合物を室温で１５分間撹拌 し、飽和炭酸水素ナトリウムとクロロホルムの間に分配した。有機相を蒸発させ てフラッシュクロマトグラフィーに付すと、ＴＬｃおよびＮＭＲで純粋な油状の 生成物（反応式３の２９）が得られた。収率８４％ ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣＱｓ）　；　１．２５（ｔ、３Ｈ）、　１． ４５−１．８０（ｎ。

６Ｈ）、３．３９−３．４８（ｍ、３Ｈ）、３．５７（ｓ、２Ｈ）、３．７０（ ｓ、３Ｈ）、４．１７（ｑ、２Ｈ）、６．２８（５ＬＨ，ｂｒｏａｄ）、６．６ ４（ｄ、２Ｈ，Ｊ−８，７Ｈｚ）、　７．６３（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ） ｂ）化合物（１９）を、上述の還元誘導体（２８）　（２当量）と、実施例１４ ｂに記載した条件下に反応させた。

濾過し、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーに付すと、芳香族アミ ノ基を介したカップリングで生じる異性テトラマーの微量の夾雑がない生成物が 得られた。

’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、　ＣＤＣＪ）：　１．２０−１．３０（ｍ、９Ｈ） 、　ｌ−４５−１−８０（＋ｎ、６Ｈ）、　３．５０−３．６７（ｄ、ｄ、、２ Ｈ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ）、　３．６４（ｓ、４）１）。

３．７０（ｓ、３Ｈ）、　Ｃ０Ｉ（ｓ、２Ｈ）、　３−８９−４．０５（ｄ、ｄ 、、２Ｈ）、　４．１１２−Ｃ２Ｏ（，６Ｈ）、６．２８（ｔ、］Ｈ，ｂｒｏａ ｄ）、６．６４（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）。

７．２０−７．８０（ｍ、６．Ｈ）、　７．６３（ｄ、２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ） 実施例２２（スキーム２） ６−（Ｎ−（カルボキシメチル）　−Ｎ−（１−（５−（ｐ−アミノベンズアミ ド）−１−カルボキシペンチル）アミノメチル−６’＝（Ｎ、Ｎ−ビス（カルボ キシメチル）アミ化合物（２１）の加水分解、ユウロピウム（２２）およびテル ビウム（２３）キレートの形成、およびそれらのチオホスゲンとの反応によるイ ンチオシアノ誘導体（２４）および（２５）の形成はそれぞれ、実施例１８およ び実施例１９に記載のように行われた。両最終生成物はエタノール沈殿の形で保 Ｍ１３７アージ配列決定プライマーのヘキサデカマーオリゴヌクレオチドは、Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　Ｇｅｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ固相核酸シンセサイザー（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、推薦された条件に従って合成した。

オリゴヌクレオチドの合成が完結したのち、脱トリチル化化合物をＮｕｃｌｅｉ ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１４　：　７９ｇ７〜７９９４　（１９８ ６）に従い、１．１′−カルボニルジイミダゾールおよびジアミノヘキサンとの 反応に付した。

このような合成プライマーの脱保護は標準条件下に行い、ついで製造用ＦＰＬＣ に付した。単離された５′−アミノ修飾ヘキサデカマーは、クロマトグラフィー および電気泳動分析で純粋なことが明らかにされた。

上記オリゴヌクレオチド４部分（各５０Ｄ）をそれぞれランクナイドキレート１ ２．１３．２４および２５　（３１１１ｇ）と、室温で６時間反応させた。各反 応とも炭酸ナトリウムＣ０−２Ｍ、　１０ｍ（１）を含む溶液中で実施した。

反応液はＦＰＬＣでモニタリングし、各反応液からの標識生成物を逆相ＦＰＬＣ 系を用いたイオン対様式で分離した。

精製されＩ；配列は、非結合標識の場合と同一であることが明らかにされたそれ らの蛍光スペクトルによって特性づけされブニ。

しかも、４種の異なる標識をもつプライマーは、２０％アクリルアミドゲル上実 際の配列決定条件下に流した場合、それらの電気泳動移動度に全く差は認められ なかった。これは、使用したすべての標識が実際にきわめて類似した関連構造を もつことを示している。電気泳動で遊離の標識を流した場合でも差は認められな かった。

まツ；、かなり高いゲル温度（５０℃）にもかかわらず、さらに電気泳動緩衝液 中には別の錯体形成剤（ＥＤＴＡ）が存在するにもかかわらず、ランクナイドキ レートの不安定性を示す徴候は全く認められなかったことｌこ注目すべきである 。

寅施例２４ 配列決定反応 本発明のマーカーの、核酸配列決定用タダとしての適用性を証明するために、異 なる標識を有するすべてのオリゴヌクレオチドを、標準方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４　：　５４６３〜５４６７）で実施し放射性標識とし てａ　３２Ｐ　ｄｃＴＰを用いる配列分析における配列決定プライマーとして使 用した。各場合とも１種のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ）のみを用い、 得られた混合物を配列決定ゲル上に平行して流した。

すべてのプライマーが同じ配列パターンを示し、これは誘導体化したプライマー が相補性の鎖に特異的にハイブリダイズする能力を維持していることを示してい る。

得られたバンドがその移動度を異にする所見は認められなかった。

適当なバンドを切り取り、ユウロピウム１の存在はＡｒｃｕｓ　Ｆｌｕｏｒｏｍ ｅｔｅｒ　（Ｗａｌｌａｃ　Ｏｙ、　Ｆｉｎｌａｎｄ）と増感溶液（Ｗａｌｌａ ｃ　Ｏｙ）を用いて見出された。

スキーム　２つづき Ｆｉｇ、６ Ｆｉｇ、　７ 国＠調査報告 １ｍ閂ｔ＋・鳴■＾ｅｅｌｌ１ｍ＋ｉｍｍ、ＰＣ１／Ｓ［Ｂ９１００３７８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 異なる長さと４種の異なる末端を有する核酸フラグメントを各末端塩基ごとに異 なる蛍光標識で標識し、−４種の標識フラグメントの混合物を分離メジウム中単 一のレーンで電気泳動的に分離し、 −フラグメントが移動する上記メジウム中の予め定められたスポットに蛍光励起 光を集光し、−フラグメントがそのスポツトに移動すると上記の光によって励起 されて各標識から発する光子を検出し、−異なる標識から発する光子に基づいて 核酸配定を決定する、 同時かつリアルタイムでの蛍光核酸配列決定方法において、 フラグメントは以下の 標識１＝リガンド１＋ランクナイド１ 標識２＝リガンド２＋ランタナイド１ 標識３＝リガンド１＋ランクナイド２ 標識４＝リガンド２＋ランタナイド２ （この場合、リガンド１と２は異なる励起波長を有し、ランタナイド１および２ は異なる発光波長を有する）同じ２積のランタナイドと同じ２種のリガンドから なる４種の異なる標識で標識され、 励起光はリガンドの異なる励起波長で交互に光パルスの形として発生させ、 標識によって発する光子はランクナイドの異なる発光波長で周期的に検出する ことを特徴とする方法。