JP2614893B2 - 蛍光キレート、蛍光標識した特異的結合試薬、免疫検定法および化合物 - Google Patents

蛍光キレート、蛍光標識した特異的結合試薬、免疫検定法および化合物

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な蛍光ラベル（標識）、さらに詳細に
は、蛍光標識した生理学的活性物質を含む特異的結合試
薬の調製に有用な蛍光ラベルに関する。
〔従来の技術〕
蛍光免疫試薬は、少なくとも免疫系の一員、すなわち
希土類キレートに“結合”した抗体または抗原を含む。
そのような“結合体”は、以下の二通りの方法のどちら
かによって得られる。
ａ）「Fluorescent Antibody Techniques and Their Ap
plication（蛍光抗体法とその応用）」（A.Kawamura
編、University Park Press,Balti−more,Maryland,196
9）に記載の如く、抗原に希土類キレートを標識、すな
わち結合させ、続いて、抗体と抗原が有効な結合を生じ
るように、その結合抗原に抗体を添加する、または ｂ）抗体と抗原の両方に結合する基を介して、抗体にキ
レートを共有結合させる。
米国特許第4,637,988号には、キレート剤としてテル
ピリジンおよびフェナントリンのような環式窒素含有化
合物が開示されている。そのような試薬は、ユーロピウ
ムのようなランタニド金属とキレートを形成する。この
キレートには、免疫検定法（イムノアッセイ）の抗原お
よびホルモンのような生理学的活性物質用の蛍光ラベル
を使用することができる。しかし、この特許には、テル
ピリジン１種およびフェナントリン１種を開示するに過
ぎない。
〔解決すべき課題〕
様々な研究によれば、具体的に開示されたフェナント
リンは、量子収率が低く、蛍光的平衡に極めて達しにく
いことが分かっている。こういった効率上の欠陥によ
り、フェナントリンは、現在使用されている種類の迅速
免疫検定法には、実際問題として不向きである。具体的
に開示されたテルピリジンは、有効な蛍光を有するが、
免疫検定法における、さらに正確な測定にとって高いエ
ネルギー準位の蛍光が望ましい。
〔課題を解決するための手段〕
本発明の化合物に用いて、Eu+3の三重項エネルギーよ
りも大きな三重項エネルギーを有する三重項増感剤であ
る核を含む、Eu+3とキレート化剤との強力な蛍光キレー
トを提供する。
このキレート化剤は、以下の構造式を有する。
式中、Ｒは、水素、アルキル基、アルコキシ基、アル
キルチオ基、アルキルアミノ基、アリール基、アリール
オキシ基、複素環基、酵素、抗原、または抗体を示し、 R1は、水素、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチ
オ基、アルキルアミノ基、置換もしくは非置換アリール
基、複素環基、酵素、抗原、または抗体を示し、 R2は、カルボキシ、ヒドロキシ、カルボニルイミノ二
酢酸、メチレンイミノ二酢酸、ヒドラジニルイリデン二
酢酸、またはそれら酸の塩を示し、 ｎは０〜４、および ｍは０〜１であるが、但し、 （ａ）ｎが０のときだけｍが１となり得、（ｂ）下記構
造式（ｉ）ならびに（ii） を上記一般構造式から除外するものとする。
アルキルとは、メチル、エチル、イソプロピル、２−
エチルヘキシル、デシルなどの炭素原子１ないし12個、
好ましくは１ないし６個の直鎖または分枝アルキル基を
言う。
アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノのアルキ
ル部分というのも、上記と同じ意味である。アリールお
よびアリールオキシとは、フェニル、ナフチルならびに
フェナトリル、およびニトロフェニル、ヒドロキシフェ
ニル、トリル、キシリル、メトキシフェニル、メチルチ
オフェニル、カルボキシチオフェニル、5,5−ジ−フェ
ニル−2,4−イミダゾリジンジオン−３−イルメチルフ
ェニル（トリル基のジフェニルヒダントイン置換体）基
などの上記の置換誘導体といった炭素原子約６ないし12
個の置換または非置換アリール基またはアリールオキシ
基を言う。
複素環とは、５ないし６個の核炭素およびヘテロ原子
を有するピリジル、メチルピリジル、ニトロピリジル、
メトキシピリジル、オキサゾリル、ピラゾリル、キノリ
ルなどの置換または非置換複素環基を言う。
アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキ
ルアミノ基、アリール基、アリールオキシ基、および複
素環基は、生物学的測定法に用いられるタンパク質、特
には、ハプテン、酵素、抗体、および抗原の一部であり
得たり、それらに付随するものであり、例えば、前記の
ヒダントイン置換体が挙げられる。
前記構造式に従って、本発明は、以下の構造式 （１） ［式中、R4は、−H,−SCH3,−OCH3,−CN,−NO2,−CO2CH
3を示す］ （２） ［式中、R5は、−CH3,−NO2,−OCH3を示す］ （３） ［式中、R5は、−NO2または−OCH3を示す］ （４） ［式中、R1は、−Ｈ、炭素原子１ないし８個のアルキル
基を示し、そしてR9は、−H,−OCH3,−NO2を示す］ （５） （６） （７） ［式中、R7は、−H,−OCH3,−NO2を示す］、 および （８） ［式中、R8は、−H,−OCH3,−NO2を示す］ を有するものから選択された化合物を提供する。
試薬は、蛍光標識した抗原、ハプテン、抗体、植物レ
クチン、含水炭素、ホルモン、酵素、および他の種−特
異的物質を吸着および共有結合させることによって作成
する。
Eu+3は、それ自体より大きな三重項エネルギーを有す
る三重項増環剤である核を含むキレート化剤と錯体を形
成する。ここで有用な三重項増感剤の例として、四座
（quater）ピリジン、五座（quir−qne）ピリジン、三
座（ter）ピリジン、およびフェナントロリンといた、
複素環および芳香族窒素含有化合物が挙げられる。Eu+3
とキレート化剤は、キレート化剤の水溶液と、pH7ない
し10の水溶液中に溶解したEu+3塩を単に混合することに
よって容易に錯体を形成する。Eu+3塩とは、EuCl3・6H2
Oまたは他のハロゲン塩のような、水溶性の金属塩であ
る。キレートは、一般にpH8ないし11、好ましくはpH8な
いし９の水溶液中で調製する。キレートは、至適pHを得
るために、任意にリン酸およびホウ酸のような緩衝液で
混合する。
キレートは、吸着または共有結合によりこれと多様な
生理学的活性物質を結合させて、この物質を標識するた
めに用いられる。この方法で標識される生理学的活性物
質の中には、酵素ならびに対応する基質、抗原、抗体、
すなわち、適当な条件下で何らかの検出法により、抗
体、含水炭素、代謝産物、薬剤、他の製剤ならびに対応
する受容体、およびその他の結合物質と特異的に反応し
得る如何なる物質をも挙げられる。特異的結合試薬は、
米国特許第3,557,555号、第3,853,987号、第4,108,972
号、および第4,205,058号に記載されている。
特異的結合検定法において、測定対象の分析物に対し
て構造的類似性を有する化合物を、ここでは配位子と称
し、標識した化合物を配位子類似体（アナログ）とい
う。配位子および配位子アナログを特異的に認識してそ
れらに結合する化合物は、受容体と呼ばれる。
このようなタイプの測定法を実施するに際し、この配
位子は、受容体との結合に関して、配位子アナログと拮
抗的状態に置かれる。
配位子の未知濃度は、標識した配位子アナログの信号
の測定値から推定する。その反応は、以下のように進行
する。
配位子＋（標識した）配位子アナログ＋受容体⇔ 配位子／受容体＋配位子アナログ／受容体 例示を目的とした場合、以下の考察には、ある特殊な
タイプの特異的結合測定法、すなわち蛍光性拮抗結合の
免疫検定法が記載されている。
この系は、本発明の蛍光ラベルで標識した抗原、未標
識の天然抗体（試料中）および特異抗体から成り、未標
識抗原とその抗体に結合した標識抗体との間に拮抗反応
が生じる。
系の試料中で未標識抗原の濃度が増すほど、抗体に結
合する標識抗原が少なくなる。標識抗原および抗体の濃
度が一定で、唯一の変数が未標識抗原濃度とすると、抗
原−抗体複合体を遊離抗原（標識および未標識）から生
理学的に分離すること、そして、標識抗原（遊離または
標識）の蛍光を、同じ方法で処理した既知量の抗原量範
囲から得られた値をプロットした標準曲線と比較するこ
とによって、未知レベルの未標識抗原を定量することが
できる。
上記に記載した通りに調製すると、蛍光標識した生理
学的活性物質は、蛍光性特異的結合測定法、特に、ドイ
ツOLS第2,628,158号に記載のバックグラウンドとは異な
った特異的検出信号の時間的分解を利用した測定法にと
って有用である。この時間−分解法（すなわち、時間的
分解）において、試料を間欠的に励起すると、暗サイク
ル中にのみ情報が得られる。それは、長寿命の蛍光ラベ
ルがなお強い放射を生じる場合であって、他の蛍光源が
崩壊したときではない。不連続励起は、パルスレーザ
ー、連続励起ビームの機械的チョップ、および励起ビー
ムに対する試料の出し入れを含めた、様々な方法によっ
て発生させる。なお、不連続励起は、試料により大量の
エネルギーが吸収されずに強い放射力を使用でき、試料
の光分解の可能性が低下する、という点を利用してい
る。
ここに記載した免疫特異的結合試薬は、米国特許第3,
988,943号、第4,202,151号、第3,939,350号、第4,220,4
50号、および第3,901,654号に記載されている。
好ましい実施態様では、特異的結合検定法は、1981年
３月24日に付与された米子特許第4,258,001号に記載さ
れた如く、乾式分析用要素中で行われる。この態様にお
ける要素は、支持体ならびに重合性ビーズを含む展開試
薬層、および光学的表示層から成る。場合によって、展
開層が、試薬層から別れていることがある。展開試薬層
および表示層は、光学的に重合性ビーズ構造をとってい
る。試薬層の重合性ビーズには、その表面に吸着した抗
体のような受容体が付いている。
本発明のキレートラベルは、試料湿潤の前に特異的反
応が生じないように、試薬層の上もしくは下、または中
に置かれる。あるいは、それを、試料と共に、または試
料に続いて要素上にスポットする。ただ、標識した配位
子アナログは、湿潤の際に要素を透過し、続いて配位子
−受容体錯体の形成時に試料中の未知量の配位子と拮抗
する。この測定法は、残存している遊離の標識配位子ア
ナログの量、または結合した標識配位子アナログの量を
測定することによって行われる。
〔実施態様〕
以下の実施例により本発明の優れた実例を示すが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
三座ピリジン、四座ピリジン、および五座ピリジン
は、以下の構造式を有する。
式中、Ｒは、水素、アルキル基、アルコキシ基、アル
キルチオ基、アルキルアミノ基、アリール基、アリール
オキシ基、複素環基、酵素、抗原、または抗体を示し、 R1は、水素、アルキル基、アルコキシ基、アルキルチ
オ基、アルキルアミノ基、置換もしくは非置換アリール
基、複素環基、酵素、抗原、または抗体を示し、 R2は、カルボキシ、ヒドロキシ、カルボニルイミノ二
酢酸、メチレンイミノ二酢酸、ヒドラジニルイリデン二
酢酸、またはそれら酸の塩を示し、そして、ｎは０ない
し４である。
フェナントロリンは、以下の構造を有する。
式中、R1は、水素、アルキル、アルコキシ基、アルキ
ルチオ基、アルキルアミノ基、置換もしくは非置換アリ
ール基、複素環基、酵素、抗原、または抗体を示し、そ
して、 R2は、カルボキシ、ヒドロキシ、カルボニルイミノ二
酢酸、メチレンイミノ二酢酸、ヒドラジニルイリデン二
酢酸、またはそれら酸の塩を示す。
ユーロピウムでは、三重項エネルギーは少なくも約47
Kcalでなければならない。
錯体は、如何なる比のEu+3金属：キレート化剤も含
む。好ましい態様において、Eu+3とキレート化剤のモル
比は、1:1ないし2:1となる。モル比1:1の錯体が特に好
ましい。
以下のようなキレート化剤が特に好ましい。
式中、R3は、−Ｈ、または炭素原子約１ないし８個の
アルキル基を示し、ならびに、 R9は、−H,−OCH3,−NO2を示し、 および 式中、R5は、−CH3,−NO2、または−OCH3を示し、 および 式中、R9は、−H,−OCH3,−NO2を示す。
三座ピリジン、四座ピリジン、および五座ピリジンの
合成は、同様の方法で行われる。1H−NMRスペクトル
は、質量スペクトル、および赤外スペクトルは、以下の
各実施例における望ましい生成物に一致した。
図式Ｉ 三座ピリジン化合物は、以下の反応図式に従って産生
される。
AcOは、アセトキシ（CH3OCC）を示す。
実施例１ 4,4″−ビス（４−メトキシフェニル）6,6″−ジカルボ
キシ−2,2′:6,2″−三座ピリジンの調製 F.Krne,「Synthesis」,1,1〜24（1976）の方法に従
って、R1がメトキシ基の化合物１（7,96g,34.9mmol）と
ビスピリジニウム塩２（10.0g,17.5mmol）の混合物を、
600mlのMeOH中で15gのNH4OAcと共に18時間還流させた。
溶液を濾過し、固体を熱希HClと共に粉砕した。得られ
た三座ピリジン二酸を濾過して集め、MeOH、次いでEt2O
（ジエチルエーテル）で洗って乾燥し、白色粉末の生成
物4.74gを得た（51％）。
C31H23N3O6・H2Oの元素分析 計算値:C,67.5;H,4.6;N,7.6、 実測値:C,67.8;H,4.4;N,7.5 三座ピリジン化合物13,14および15は、次の反応図式
に従って、R1が−CH3の化合物３から生成した。THFは、
テトラヒドロフランである。
有用な三座ピリジンに関する、その他の代表例を第１
表に示す。
式中、R4は、−H,−SCH3,−OCH3,−CN,−NO2,−CO2CH
3などを示し、 式中、R5は、−CH3,−NO2,−OCH3などを示し、 式中、R5は、−CH3,−NO2,−OCH3などを示し、 式中、R3は、Ｈ、炭素原子約１ないし８個のアルキル
基を示し、および R9は、−H,−OCH3,−NO2などを示し、 式中、R7は、−H,−OCH3,−NO2などを示し、 式中、R8は、−H,−OCH3,−NO2などを示す。
四座ピリジン化合物は、以下の反応図式に従って合成
した。Buは、ブチル基である。
実施例２ 4,4−ビス（４−メチルフェニル）6,6−ジカルボキ
シ−2,2′:6′,2″:6″,2−カトルピリジンの調製 6,6′−ジアセチル−2,2′−ビピリジンは、J.E.Park
s,B.E.WangerおよびR.H.Holm,「J.Organomet Chem.56",
53〜66（1973）の方法に従って合成した。ヨウ化ビスピ
リジニウムは、ジアセチルピリジン2.00g（8.33mmol）
を、ピリジン50ml中で4.23gのI2（16.7mmol）と共に１
時間還流することによって生成した。この溶液を冷やし
て濾過し、固体は、最初にピリジンで、次いでEt2O（ジ
アセチルエーテル）で洗い、乾燥後、砂色の固体として
望みの生成物4.46gを得た（82％）。
C24H20I2N4O2の元素分析 計算値:C,44.3;H,3.1;N,8.6、 実測値:C,44.4;H,3.2;N,8.8 ビスピリジニウム塩（3.00g,4.62mmol）とメチル基の
R10を有する化合物１（1.75g,9.23mmol）を混合して、5
00mlのMeOH中で20gのNH4OAcと共に還流させた。溶液
は、冷却して濾過しいた。固体は、化合物３で用いた方
法（実施例１）により操作し、次いでN,N−ジメチルフ
ォルムアミド（DMF）から再結晶化したところ、クリー
ム色の粉末として標題の化合物0.80gを得た（30％）。
C36H26N4O4・H2Oの元素分析 計算値:C,72.5;H,4.7;N,9.4、 実測値:C,72.4;H,4.4;N,9.3 実施例２の方法によって合成した四座ピリジン化合物
には、R11＝−CH3および−OCH3が含まれる。
五座ピリジンは、以下の反応図式に従って調製した。
実施例３ 4,4−ビス（４−フリル）−6,6−ジカルボキシ−2,
2′:6′,2″:6″,2:6,2−五座ピリジン（20）の
調製 先に引用したParksらの方法によって得た化合物16（1
8.1g,74.2mmol）を、LiAlH4から新たに蒸留したEt2O 40
0ml中に溶解した。温度を−50℃に保持し、2.1Mn−BuLi
35.3ml（74.2mmol）をN2下で攪拌しながら滴下した。
−50℃でさらに0.5時間攪拌した後、乾燥CO2（ガス）を
溶液に通気して、温度を22℃に上昇させた。２時間後、
混合物を希NaHCO3溶液で抽出した。有機相は、水で洗浄
して水相と混ぜ、HClでpH2に酸性度を下げてから、CH2C
l2で抽出した。CH2Cl2相は、水で２回洗浄してから、Na
2SO4上で乾燥させた。リグロイン添加後の濾過、および
溶媒の除去によって、黄色の固体を得た。シクロヘキサ
ンからの再結晶化により、灰白色の固体として化合物17
を得た（7.2g,46％）。
C10H11NO4の元素分析 計算値:C,57.4;H,5.3;N,6.7、 実測値:C,57.2;H,5.3;N,6.7 化合物17（6.1g,29.2mmol）を、N2下にて3N HCl 100m
l中で２時間還流させた。得られた溶液は、NaHCO3で処
理してから、CH2Cl2で３回抽出した。有機相を集めて、
Na2SO4上で乾燥して濾過し、蒸発させると、灰白色粉と
して4.4gの化合物18が得られた（91％）。
C8H7NO3の元素分析 計算値:C,58.2;H,4.3;N,8.5、 実測値:C,58.0;H,4.3;N,8.4 化合物18（0.50g,3.0mmol）を、２−フルアルデヒド
（0.29g,3.0mmol）と共に、N2下にて0.2gのKOHを添加し
たMeOH 25mg中で1.5時間還流させた。この溶液をNaHCO3
液100ml中に注ぎ、CH2Cl2で抽出して、この抽出液を捨
てた。水相を酸性化し、CH2Cl2で２回抽出した。その有
機相を化合物18用の方法で最終処理したところ、明緑色
のカルコン19が得られ、その泡は純粋で消えにくかっ
た。
カルコン19（0.60g,2.5mmol）と化合物２（0.71g,1.2
mmol）を一緒にして、5gのNH4OAcと共に100mlのMeOH中
で16時間還流させた。溶液は冷却して濾過した。得られ
た固体を、R10が−OH3の三座ピリジン二酸３のための手
法で最終処理したところ、黄褐色粉末の化合物20が得ら
れた（0.40g,53％）。
C35H21N5O6・1/2H2Oの元素分析 計算値:C,68.2;H,3.6;N,11.4、 実測値:C,68.3;H,3.5;N,11.5 五座ピリジン20とEuCl3・6H2Oの10-6 M溶液は、長波長
のUV光下で強く発光した。
実施例４ 三座ピリジンとEu+3、および四座ピリジンとEu+3を用い
た蛍光キレートの調製 三座ピリジンの10-5 M貯蔵溶液。Eu+3錯体は以下のよ
うにして調製した。適量の三座ピリジンを秤量して容積
１のフラスコに入れ、10-2 M EuCl3溶液1.00mlを添加
し、続いてpH10のホウ酸緩衝液で希釈した。発光対濃度
の試験では、pH10のホウ酸緩衝液に溶解した10-5 M Eu+3
溶液を用いて希釈を行った。一定のEu+3濃度に保つと、
三座ピリジンは低濃度で錯体の状態を接続する（Ka＝約
５×106 M -1）。
四座ピリジン二酸の溶液。Eu+3錯体を調製したとこ
ろ、Eu+3濃度は四座ピリジン二酸濃度の10倍で維持し
た。
三座ピリジン四酸・Eu+3のキレート溶液では、Eu+3濃
度は、配位子濃度の２倍で維持した。
キレート化剤の発光特性を、第２、第３、および４表
に示す。
一連のフェナントロリンキレート化剤は、以下の反応
図式を用いて調製した。化学構造式中、tBuは四級ブチ
ルである。
実施例５ ２−ブロモメチル−９−メチル−1,10−フェナントロリ
ン（22）の調製 2,9−ジメチル−1,10−フェナントロリン6.3g（0.03m
ol）、30％H2O2 6ml、およびトリフルオロ酢酸（TFA）3
0mlの混合物を３時間還流させた。反応終了後、反応混
合物を1H−NMR解析にかけた。最初にロータリーエバポ
レーター、次いで真空ポンプを用いて揮発成分を除去し
たところ、黄金色シロップの一窒素酸化物が単離し、こ
れをTFA塩としてEt2Oから再結晶化した。1 H NMR（CF3CO2H）2.9（s,3H）;3.1（s,3H）;7.95（AB
q,1H）;8.1（ABq,1H）:8.2（s,2H）;8.35（ABq,1H）;8.
9（ABq,1H）． この窒素酸化物を90mlのAc2Oに溶解し、続いて還流中
のAc2O 250mlに20分かけて添加した。Ac2O無水酢酸であ
る。さらに30分間還流した後、暗色溶液を冷やし、Ac2
を真空除去した。粗残渣は、CH2Cl2を用いたシリカゲル
のクロマトグラフィーによって精製し、２−アセトキシ
メチル−９−メチル−1,10−フェナントリン（21）が溶
出した。1 H NMR（CDCl3）2.06（s,3H）;3.82（S,3H）;5.53（s,2
H）;7.4（ABq,1H J＝9Hz）;7.57（ABq,1H,J＝9Hz）;7.6
2（s,2H）;8.0（Abq,1H,J＝9Hz）;8.13（ABq,1H,J＝9H
z）． アセテート（21）を、31％HBr酢酸溶液60mlに溶解
し、４時間還流させた。冷却後、溶媒をすべて真空除去
した。得られた黒色残渣は、CH2Cl2と希NaHCO3液の混合
液に懸濁した。200mlのCH2Cl2で４回抽出して、溶媒表
面の不溶性浮遊物質から望みのシュウ化物を除去した。
Na2SO4での乾燥および溶媒の除去後、暗色残渣の固体
は、痕跡量の2,9−ジメチル−1,10−フェナントリンを
含む比較適純粋なフェナントロリン（22）となった。暗
色の不純物は、溶出液としてCH2Cl2を用いたシラカゲル
のクロマトグラフィーによって除かれ、3.5gの化合物22
が得られた（42％）。1 H NMR（CDCl3）2.9（s,3H）;4.94（s,2H）;7.43（ABq,
1H,J＝9Hz）,7.6（s,2H）;7.8（ABq,1H,J＝9Hz）;7.97
（ABq,J＝9H）;8.1（ABq,1H,J＝9Hz）． 実施例６ ２−〔ジ−（ｔ−ブトキシカルボニルメチル）−アミノ
メチル〕−９−メチル−1,10−フェナントロリン（23）
の調製 第一級：ジ−四級ブチルイミノジアセテート 5.0gのイミノジアセテート（38mmol）、4.5mlのHClO4
（50mmol）、および100mlの四級ブチルアセテートの混
合物を、反応が均一になるまで、20℃にて約20分間攪拌
した。３日間放置した後、溶液を10％NaHCO3液に注ぎ、
１回50mlのCH2Cl2で３回抽出した。Na2SO4上で乾燥し、
エバポレーターを用いて溶媒を除去した後、ジ−四級ブ
チルイミノジアセテートと四級ブチルアセテートの油状
混合物が得られた。この粗生成物を50mlのCH2Cl2に溶解
し、０℃にて6M HCl 100mlで抽出した。そして、この際
の水相をCH2Cl2で２回抽出し、続いてNaHCO3で飽和した
氷水の中に注いだ。得られたアルカリ溶液は、CH2Cl2で
３回抽出した。Na2SO4上で乾燥して揮発成分を除去する
と、化合物26が得られ、これ−５℃で放置すれば固化す
る黄色油として単離した。1 H−NMR（CDCl3 1.4（s,18H）;2.0（s,1H）;3.23（s,4
H）.Mass spec m/e 質量スペクトルm/e254（M+）,133 第二部：四級ブチルエステル（23） 900mlのジ−四級ブチルイミノジアセテート（3.6mmo
l）800mgの（22）臭化物（2.8mmol）、および0.5mgのジ
イソプロピルエチルアミンの混合物を、8mlの乾燥DMF中
で25℃にて45時間攪拌した。この溶液を希NaHCO3脱イオ
ン溶液に注ぎ、CH2Cl2で３回抽出した。Na2SO4上で乾燥
させて溶媒を除去した後の1H−NMR解析によって、残渣
は化合物23とジ−四級ブチルイミノジアセートの混合物
であることが分かった。そして、この物質をフロリシル
のクロマトグラフィーにかけた。その際、シクロヘキサ
ン中の40％CH2Cl2混合物で溶出させると、ジ−四級ブチ
リイミノジアセテートの後にジアセテートと化合物23の
混合物が溶出した。CH2Cl2により200mgの純化合物23が
溶出した。1 H NMR（CDCl3）1.3（s,9H）;2.7（s,3H）;3.35（s,4
H）;s,3（４、2H）;7.4（ABq,1H）;7.5（s,2H）;7.6（A
Bq,2H）;8.05（ABq,1H）;8.05（m,2H）． Mass spec （field desorption）m/e 451（M+）． 質量スペクトル（電場脱離）m/e451（M+） 実施例７ ２−〔N,N−ジ（カルボニルメチル）−アミノメチル〕
−９−メチル−1,10−フェナントロリン（42 第２表）
の調製 200mgの化合物23と5mmのトリフルオロ酢酸の混合物を
20℃にて１時間放置した。NMRで反応を監視するため
に、真空下に溶媒を除去した。TFAに再溶解した残渣の1
H−NMR解析によれば、ｔ−ブチルエステルは除かれてい
た。
実施例８ ２−（Ｎ−四級ブトキシカルボニルメチル−Ｎヒドロキ
シエチルアミノメチル〕−９−メチル−1,10−フェナン
トロリン（24）の調製 第一部：四級ブチルＮ−（２−ヒドロキシエチル）グリ
シネート（10） CH3CN 15ml中の四級ブチルブロモアセテート6g（0.03
mmol）の混合物を、20℃で攪拌しながら、２−アミノエ
タノール30gのCH2CN溶液30mlに30分かけて加えた。３時
間攪拌した後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒
を除いた。
残渣をH2Oに注ぎ、CH2Cl2で６回抽出した。Na2SO4上
で乾燥してCH2Cl2を除去した後、白色液体として3.1gの
化合物10（60％）が得られた。1 H NMR1.35（s,9H）;2.1（broad s,1H）;2.67（t,2H）;
3.18（s,2H）;3.5（t,2H）． 第二部： 第一部から得られたグリシネート3.1g（18mmol）、化
合物22の臭化物4.0g（11mmol）、およびジイソプロピル
エチルアミン2.5g（19mmol）のCH2Cl2 15mlの混合物
を、30℃にて24時間攪拌した。この溶液を希NaHCO3脱イ
オン水に注ぎ、CH2Cl2で３回抽出した。Na2SO4上で乾燥
させて溶媒を除去した後、3gの残渣が得られたが、これ
は実質上純粋な化合物24であった。フルオロシルのクロ
マトグラフィーで純粋な化合物24を溶出させるには、１
〜10％のMeOH/CH2Cl2が必要であった。1 H NMR（CDCl3）1.44（S,9H）;2.83（s,3H）;2.94（t,2
H）;3.4（s,2H）;3.6（t,2H）;7.4（ABq,1H）;7.6（s,2
H）7.7（ABq,1H）;8.0（ABq,1H）;8.1（ABq,1H）． 実施例９ ２−（Ｎ−四級ブトキシカルボニルメチル−Ｎ−プロピ
オニルオキシエチル）アミノメチル−９−メチル−1,10
−フェナントロリン（25）の調製 100mgの化合物24とトリエチルアミン0.3gのCH2Cl2 2m
lの混合物に、0.2gの塩化ピロピオニルを加えた。この
反応混合物を15時間攪拌し、希NaHCO3脱イオン水に注
ぎ、CH2Cl2で３回抽出した。Na2SO4上で乾燥させて溶媒
を除去した後、残渣を溶出液CH2Cl2でフルオロシルのク
ロマトグラフィーにかけたところ、110mgの化合物25が
溶出した。1 H NMR（CDCl3）1.03（t,3H）;1.43（s,9H）;2.3（q,2
H）;2.87（s,3H）;3.0（t,2H）;3.35（s,2H）;4.16（t,
2H）;4.33（t,2H）;7.43（ABq,1H,J＝9Hz）； 質量スペクトル（電場脱離）m/e437 実施例10 2,9−ビスフォルミル−9,10−フェナントロリン（26）
の調製 C.J.Chandler,L.W.Deady、およびJ.A.Reiss,JHeteroc
yclic Chem.,18,599（1981）に記載の如く、2,9−ジメ
チルフェナントロリン9.0g（43.2mmol）と二酸化セレニ
ウム22.5g（0.2mol）の混合物を、４％のH2Oを含有する
600mlのジオキサン中にて還流させた。熱い暗色溶液
は、セライト を通して濾過し、冷却すると固体が得ら
れ、これを濾過によって集めた。風乾後、黄色固体とし
て単離した8.0gの化合物26（80％）が得られた。1 H NMR（DMSO−d6）8.2（s,2H）;8.32（ABq,2H）;8.7
（ABq,2H）10.35（S,2H）． 実施例11 2,9−ビス（ヒドロキシメチル）−1,10−フェナントロ
リン（27）の調製 40mlのDMFに溶解した2.0gのジアルデヒド26とエタノ
ール5mlの混合物に、800mgのNaBH4を添加した。この溶
液を30℃にて６時間攪拌し、続いて5mlのアセトンを添
加した。この溶媒を真空除去し、残渣を50mlのH2Oから
再結晶化させると、1.7gのジオールが得られた（27）。1 H NMR（DMSO−d6）4.7（s,4H）;5.45（broad s,2H）;
7.6（ABq,2H）;7.7（s,2H）;8.25（ABq,2H）． 実施例12 2,9−ビス（ブロモメチル）−1,10−フェナントロリン
（28）の調製 31％HBrの酢酸溶液10mlに溶けた250mgのジオール27を
３時間還流させた。得られた有機溶液の溶媒部分を真空
除去し、残渣をCH2Cl2と希NaHCO3脱イオン水に取った。
溶解度が低いため、不溶性物質から二臭化物28のすべて
が濾出するまで、３回のCH2Cl2抽出が必要であった。Na
2SO4上で乾燥させて溶媒を除去した後、暗色固体として
220mgの化合物28（〜60％）が得られた。これをNMR解析
で調べたところ、純粋な化合物であった。CH2Cl2を用い
たシリカゲルのクロマトグラフィーでは、白色固体の化
合物28が溶出した。1 H NMR（CDCl3）4.87（s,4H）;7.63（s,2H）;7.83（AB
q,2H,J＝8Hz）;8.13（ABq,2H,J＝8hHz）． 実施例13 2,9−ビス〔N,N−ジ−四級ブトキシカルボニル−メチル
アミノメチル〕−1,10−フェナントロリン（32）の調製 220mgの二臭化物28（0.57mmol）、400mgのジ−四級ブ
チルイミノジアセテート（1.6mmol）、ジイソプロピル
エチルアミン0.5gのCH2Cl2/CH3CN（1:1）5mlの混合物
を、25℃にて15時間還流させた。この溶液をNaHCO3脱イ
オン水に注ぎ、CH2Cl2で３回抽出した。Na2SO4上で乾燥
させて溶媒を除去した後、残渣をフルオロシルのクロマ
トグラフィーにかけた。残渣のイミノジアセテートとテ
トラエステルは、20〜50％CH2Cl2のシクロヘキサンで溶
出させた。そして、５％MeOH/CH2Cl2で、純粋な化合物3
2が溶出した。1 H NMR（CDCl3）1.30（s,18H）;1.36（s,18H）;3.42
（s,8H）;4.23（s,2H）;4.33（s,2H）;7.60（s,2H）;8.
05（ABq,4H）． 実施例14 1,10−フェナントロリン−2,9−ジカルボン酸塩化物（3
0）の調製 実施例10で引用したChandlerらの方法に従って、0.6g
のビスアルデヒド26（2.5mmol）の80％硝酸溶液12mlを
３時間還流させた。冷却直後に、反応液を氷上に注ぎ、
二酸化合物29を濾過して回収した。風乾によって、0.5g
の化合物18（75％）が単離した。
was isolated 1H−NMR（DMSO−d6）8.20（s,2H）;8.45
（ABq,2H）;8.75（ABq,2H）． 0.5gのジカルボン酸化合物29の混合物を、5mlの塩化
チオニル中で５時間還流させた。反応の進行に伴って、
この懸濁液は徐々に溶液に変化した。ロータリーエバポ
レーターを使用して揮発成分を除去した。そして、残渣
を２回ベンゼンに溶解し、ストリップして乾燥させた。1 H NMR（CDCl3）8.05（s,2H）;8.45（s,4H）． 実施例15 N,N−ビス（ｔ−ブトキシカルボニルメチル）−N,N−ビ
ス（２−ヒドロキシエチル）−1,10−フェナントロリン
−2,9−ジアミド（34）の調製 Et3N 400mg（4mmol）とCH2Cl2 3mlに溶けた四級ブチ
ルＮ−（２−ヒドロキシエチル）グリシネート0.5g（3m
mol）の20℃における混合物に、0.3gの二酸塩化物30（1
mmol）を加えた。この溶液を一晩攪拌し、Na2HCO3/H2O
中に注ぎ、CH2Cl2で３回抽出した。Na2SO4上で乾燥させ
て溶媒を除去した後、残渣をフロリシルのクロマトグラ
フィーにかけた。生成物は、主にCH2Cl2−５％MeOH/CH2
Cl2を用いるとよく得られるが、残渣のグリシネートが
夾雑していた。この物質を4mlのEt2Oでスラリーとし、
これに1mlの石油エーテルを加え、そして、この溶液を
デカンテーションして純粋な生成物20を得た。1 H NMR（CDCl3）1.13（s,9H）;1.4（s,9H）;3.79（m,8
H）;4.2（s,2H）;4.3（s,2H）;7.83（s,2H）;7.87（AB
q,1H）;8.35（m,3H）． Mass spec（FD）m/e 582. 質量スペクトル（電場脱離）m/e582。
実施例16 N,N,N′,N′−テトラ（ｔ−ブトキシカルボニルメチ
ル）−1,10−フェナントロリン−2,9−ジアミド（33）
の調製 3.0gの二酸化合物29（11.2mmol）と100mlの塩化チオ
ニルの混合物を、16時間還流して、冷却し、真空下でス
トリップした。その後精製せずに、粗ビス化合物（酸塩
化物）30を、乾燥THF200mlに懸濁した。そして、この懸
濁液に、ジ−ｔ−ブチルイミノジアセテート6.03g（24.
6mmol）、次いでトリエチルアミン3.4ml（24.6mmol）を
添加した。200℃にて２時間攪拌した後、この溶液を濾
過した。濾液は、濃縮後、25％ EtOAC/CH2Cl2 EtOAcの
濃度勾配による、フロリシルのクロマトグラフィーにか
けたところ、3gの化合物33（37％）が溶出した。これ
は、消えにくい泡を形成する純粋油であった。1 H NMR（CDCl3）1.13（s,18H）;1.53（s,1H）;4.37（s,
4H）;5.07（s,4H）;7.8（s,2H）;8.17（ABq,2H,J＝8H
z）;8.27（ABq,2H,J＝8Hz）.Mass spec （FD）m/e723 質量スペクトル（電場脱離）m/e723（M+） C38H50N4O10の元素分析 計算値:C,63.1;H,7.0;N,7.8、 実測値:C,62.8;H,7.0;N,7.9 実施例17 N,N,N′,N′−テトラ（カルボキシメチル）−1,10−フ
ェナントロリン−2,9−ジアミド（39、第５表）の調製 25mlのTFAに溶けた800mgの化合物21（1.1mg）の混合
物を、20℃にて１時間静置した。溶媒を真空除去し、残
渣をEt2Oで洗浄すると、白色粉末として単離した0.54g
の生成物が得られた（98％）。1 H NMR（CDCl3/DMSO−d6）4.32（s,4H）;4.84（s,4H）;
8.05（ABq,2H,J＝8Hz）;8.1（s,2H）;8.57（ABq,2H,J＝
8Hz）.Anal Calcd.for C22H18N4O10 1/2 C22H18N4O10・1/2H2Oの元素分析 計算値:C.52.1;H,3.8;N,11.0、 実測値:C,52.1;H,3.8;N,11.0 実施例18 N,N−ビス（四級ブトキシカルボニルメチル）−1,10−
フェナントロリン−２−カルボン酸アミド（38）の調製 塩化チオニル10mlに溶けた200mgの9,10−フェナント
リン−２−カルボン酸（0.9mmol）の混合物を、６時間
還流させた。反応は決して均一化しなかったが、揮発成
分がロータリーエバポレーターの使用によって除去され
た。残渣をベンゼンに懸濁し、乾燥するまでストリップ
した。粗生成物は、10mlのCH2Cl2に溶解し、240mgのジ
−四級ブチルイミノジアセテート（1mmol）、次いで300
mgのトリエチルアミンと混合した。30℃にて24時間攪拌
した後、反応液をNaHCO3/脱イオン水に注ぎ、CH2Cl2で
３回抽出し、Na2SO4上で蒸発乾固させた。この残渣を１
〜５％MeOH/CH2Cl2を用いた、フロリシルのクロマトグ
ラフィーにかけたところ、望ましい100mgのアミド化合
物38（24％）が溶出した。1 H NMR（CDCl3）1.1（s,9H）;1.37（s,9H）;4.2（s,2
H）;4.63（s,2H）;7.5（d,1H）;7.65（s,2H）;8.0（d,1
H）;8.03（d,1H）;8.13（d,1H）;9.0（m,1H）.Mass spe
c （FD）m/e 451. 質量スペクトル（電場脱離）m/e451 加水分解が、化合物39（第５表）用の方法によって定
量的に進行した結果、二酸化合物43（第５表）が得られ
た。その他、同様の方法で生成した化合物も第５表に示
す。
実施例19 Eu+3のフェナントロリン四酸錯体の調製 このフェナントロリンキレート化剤の10-4 M貯蔵溶液
は、適量を秤量して容積１のフラスコにいれ、10-2 M
EuCL3溶液10mlを添加し、そしてpH10のホウ酸緩衝液で
希釈して調製した。化合物43（第５表）の場合、溶液は
直後に一定の発光強度に達した。化合物39（第５表）で
は、一定の発光強度に達するまで、８日間静置する必要
があった。この実施例で調製したキレート化剤の非量子
効率（Φ）、最大吸収、および発光強度を、第６表なら
びに第７表に示す。
〔発明の効果〕 本発明のキレート化剤は、水溶性であり、pH7ないし1
0の低濃度にて安定を示し、感度が高く、そして、好ま
しいモル消衰係数（10,000〜40,000）および好ましいλ
maxを有する。通常、このキレート化剤の蛍光性は、米
国特許第4,637,988号のキレート化剤に比べ、改良され
ている。特にこれは、上記の一般式で表される四座（カ
トル）ピリジンおよび五座（クインケ）ピリジンにおい
て言える。さらに、この一般式のキレート化剤のなかに
は、タンパク質のような他の望ましい基を結合させるた
めの優れた中間体も含まれている。その他のキレート化
剤は、ユーロピウム（Eu+3）に対する高い結合定数を有
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 401/14 ２１３ Ｃ０７Ｄ 401/14 ２１３ // Ｃ０７Ｄ 471/04 １１２ 471/04 １１２Ｔ 471/22 471/22 Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の構造式 （１） ［式中、R4は、−H,−SCH3,−OCH3,−CN,−NO2,−CO2CH
    3を示す］ （２） ［式中、R5は、−CH3,−NO2,−OCH3を示す］ （３） ［式中、R5は、−NO2または−OCH3を示す］ （４） ［式中、R1は、−Ｈ、炭素原子１ないし８個のアルキル
    基を示し、そしてR9は、−H,−OCH3,−NO2を示す］ （５） （６） （７） ［式中、R7は、−H,−OCH3,−NO2を示す］、 および （８） ［式中、R8は、−H,−OCH3,−NO2を示す］ を有するものから選択された化合物。
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