ES2217546T3 - Compuestos destinados a la deteccion de esteres de acido fosforico. - Google Patents
Compuestos destinados a la deteccion de esteres de acido fosforico.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS ESPECIALMENTE ADECUADOS PARA DETECTAR Y SEPARAR COMPUESTOS QUE CONTIENEN ESTERES DEL ACIDO FOSFOLICO. LOS COMPUESTOS DE LA INVENCION COMPRENDEN AL MENOS UN AGENTE QUELADOR, AL MENOS UN ATOMO CENTRAL O ION COORDINADO CON DICHOS AGENTE O AGENTES QUELADORES Y AL MENOS UN COLORANTE, ETCETERA, LIGADO A DICHOS AGENTES QUELADORES.
Description
Compuesto destinados a la detección de ésteres de
ácido fosfórico.
El presente invento se refiere a la utilización
de compuestos (marcadores) para la detección de ésteres de ácido
fosfórico, abarcando los compuestos un radical formador de
quelatos, un átomo central y un colorante fluorescente.
Los ésteres de ácido fosfórico son unos
componentes de vital importancia de los sistemas biológicos y son
partes constituyentes de un gran número de compuestos bioquímicos.
Éstos desempeñan un cometido importante, especialmente en la
función y la regulación de procesos celulares, en los que ellos se
presentan p.ej. como productos intermedios en numerosos procesos del
metabolismo. Ésteres de ácido fosfórico, importantes desde el punto
de vista biológico, son p.ej. mono-, di- y
tri-fosfatos de adenosina, lecitinas, cefalinas,
fosfolípidos, nucleótidos y coenzimas. La fosforilacion y la
desfosforilacion de proteínas por medio de proteína - cinasas o
fosfatasas desempeñan también un cometido especialmente importante
en los casos de procesos de regulación. La detección de moléculas
fosforiladas, o bien el análisis del estado de fosforilacion de
biomoléculas es, por consiguiente, de gran importancia en la
investigación biológica.
Ya es conocido marcar radiactivamente con
^{32}P o ^{33}P a compuestos fosforilados y detectar los
correspondientes radionúclidos. Tales procedimientos tienen, no
obstante, la desventaja de que solamente se deben llevar a cabo
mediando grandes precauciones de seguridad.
Además, es conocido emplear anticuerpos
específicos para la detección de compuestos fosforilados. La
producción de anticuerpos es, no obstante, costosa y, por
consiguiente, cara, y su especificidad es influida en gran manera
por ciertas estructuras que se encuentran fuera de los ésteres
fosfatos que se han de analizar. Por tanto, sigue subsistiendo una
necesidad de compuestos alternativos para la detección de ésteres
de ácido fosfórico.
Los documentos de solicitudes de patentes
europeas EP-A-0.314.480,
EP-A-0.178.775 y el documento de
solicitud de patente de los EE.UU.
US-A-5.576.433 divulgan solamente
cromóforos, que están fijados a un radical formador de quelatos
multidentado, con el fin de detectar Ca^{2+}. El documento
EP-A-0.314.480 enseña estos
compuestos con colorantes de xanteno y fluoróforos de
fluoresceína.
El documento de solicitud de patente
internacional WO-A-9.527.796 divulga
la separación de péptidos fosforilados con respecto de péptidos no
fosforilados, que se realiza fijando los primeros a una fase
sólida, a través de complejos entre Fe^{3+} y radicales
formadores de quelatos (grupos de ácido
N-imino-diacético). Los substratos
peptídicos están marcados en este caso con un colorante, de tal
manera que se puede determinar la cantidad del péptido fosforilado
que se ha fijado a la fase sólida.
Por consiguiente, la misión del presente invento
consiste en poner a disposición utilizaciones de compuestos, que
pueden emplear para un ensayo muy sensible, inofensivo y
específico, tal como p.ej. la detección de ésteres de ácido
fosfórico, o la separación de compuestos tales como proteínas o
péptidos, no debiendo pasar a utilizarse ningún radionúclido ni
ningún anticuerpo.
El problema planteado por esta misión se resuelve
mediante la utilización de un compuesto, que abarca
a) por lo menos un radical formador de
quelatos,
b) por lo menos un átomo o ion central coordinado
con el (los) radical(es) formador(es) de quelatos,
y
c) por lo menos un colorante unido al (a los)
radical(es) formador(es) de quelatos, para la
marcación de péptidos o proteínas, que contienen grupos de éster de
ácido fosfórico.
Unas formas preferidas de realización son objeto
de las reivindicaciones dependientes.
En este caso, se emplean de manera preferida
radicales formadores de quelatos multidentados, tales como los de
ácido imino-diacético (IDA) y sus derivados, de
ácido nitrilo-triacético y sus derivados, de ácidos
polioxicarboxílicos y sus derivados, de poliaminas y sus derivados,
o de ácido etilen-diamina-acético y
sus derivados.
La fijación selectiva de IDA a través de una
quelatacion de Fe^{3+} con ésteres de fosfato ya es conocida,
compárense las citas de Anderegg, G. & Schwarzenbach, G. (1955)
Helv. Chim. Acta 38, 1.940-1.942; Muszynska, G. y
colaboradores (1992) J. Chromat. 604, 19-28;
Schwarzenbach, G. y colaboradores (1995) Helv. Chim. Acta 38,
1.147-1.170; Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland,
N., Hoekstra, M.F., Piwnica-Worms, H. & Cantley,
L.C. (1994) Current Biology 4, 973-981. También es
conocido emplear un IDA inmovilizado para purificaciones o
enriquecimientos por afinidad de biomoléculas junto a soportes
cromatográficos y membranas. Así, por la entidad Pharmacia Biotech
se distribuye un correspondiente material quelatante para
cromatografía bajo el nombre de Chelating Superose/ Sepharose.
Además, por la entidad QIAGEN se distribuye un
sistema para la purificación de proteínas. El referido sistema se
puede emplear para el aislamiento de proteínas y péptidos, que se
habían marcado con seis restos consecutivos de histidina. Estos
restos tienen una gran afinidad para los iones de níquel
inmovilizados, que, por su parte, son fijados mediante quelatacion a
resinas de ácido nitrilo-triacético
(Ni-NTA). Una desventaja esencial de este sistema
reside, no obstante, en que las proteínas y los péptidos tienen que
ser marcados con los restos de histidina.
Por otro lado, por la entidad QIAGEN se ofrecen
conjugados de Ni-NTA con anticuerpos, peroxidasa,
fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano rusticano.
Sin embargo, no se conoce todavía el empleo del
efecto de quelatación para ensayos, en particular para la detección
directa y/o la separación de ésteres fosfatos por medio de un
compuesto de un radical formador de quelatos con un colorante
(cromóforo).
De acuerdo con el invento, el por lo menos un
átomo o ion central coordinado con el radical formador de quelatos,
es de manera preferida un átomo o un ion metálico, en particular un
átomo o ion de un metal de transición, tal como hierro y/o níquel,
pero también puede constituir uno (o varios) grupo(s)
adicional(es), que tienen pares de electrones solitarios o
lagunas de electrones. Se emplea de manera preferida
Fe^{3+}.
Si pasan a emplearse varios átomos o iones
centrales, los compuestos que se han de utilizar de acuerdo con el
invento pueden abarcar uno o varios ligandos de puente.
Los colorantes empleados de acuerdo con el
invento están unidos de manera preferida por vía química al radical
formador de quelatos, pero también pueden ser asociados de otra
manera con el radical formador de quelatos. El concepto de
colorantes, que se utiliza aquí, abarca, junto a los colorantes
usuales, también pigmentos y otros grupos cromóforos y sus eductos,
que se forman p.ej. tan sólo después de la reacción con el (los)
radical(es) formador(es) de quelatos para dar
cromóforos. Como colorantes se pueden emplear p.ej. colorantes de
xanteno, tales como colorantes fluorescentes, en particular
fluoresceína y sus sales y derivados, tales como isotiocianato de
fluoresceína.
Un compuesto preferido, que se ha de utilizar de
acuerdo con el invento, es el complejo con hierro(III) del
N-diacetiliminoetil-N'-fluoresceinil-tiourea.
[*"diacetiliminoetil" es el radical del
ácido etil-imino-diacético]
Los compuestos se pueden preparar por medio de un
procedimiento, en el que por lo menos uno de los radicales
formadores de quelatos que se han expuesto precedentemente se hace
reaccionar con por lo menos uno de los colorantes designados
precedentemente, en unas condiciones apropiadas, y luego se añade
por lo menos uno de los átomos o iones centrales definidos
precedentemente, en unas condiciones apropiadas.
En el siguiente esquema se representa una forma
de realización preferida del procedimiento: Se hace reaccionar un
ácido
amino-etil-imino-diacético
(1) con el isotiocianato de fluoresceína (2) para dar el compuesto
(3). Después de un tratamiento con FeCl_{3}, se puede separar por
precipitación el quelato (4).
Los compuestos, que se han de utilizar de acuerdo
con el invento, se pueden utilizar en un ensayo, preferiblemente
para la detección y/o para la separación de compuestos, que
contienen, por lo menos de una manera parcial, grupos de éster de
ácido fosfórico. En este caso, son posibles las siguientes
variaciones:
Se pueden analizar y separar (también separar por
vía física) proteínas o péptidos, que tienen unas secuencias
iguales o casi iguales, teniendo los péptidos o las proteínas o los
respectivos grupos de ellos/ellas un número diferente de grupos de
éster de ácido fosfórico. La expresión "secuencias casi
iguales" significa, en este caso, de manera preferida, que las
secuencias se diferencian en no más de un aminoácido por cada 20
aminoácidos, de manera más grandemente preferida por cada 30
aminoácidos, de manera todavía más grandemente preferida por cada
40 aminoácidos, y de la manera más grandemente preferida por cada
100 aminoácidos, de la secuencia total.
Así, se pueden analizar y/o separar proteínas o
péptidos, que se diferencian sólo por el número de sus grupos de
éster de ácido fosfórico. En este caso se puede proceder de la
siguiente manera:
Se prepararon p.ej. dos tipos de perlas, que
llevan en cada caso una secuencia de un octapéptido, y que sólo se
diferencian en el hecho de que una de las secuencias contiene un
fosfato de serina y la otra contiene una serina no modificada.
Después de haber incubado las perlas con el derivado de IDA (4)
antes mencionado, se investigaron las dos poblaciones mediante
mediciones en un aparato de FACS (un aparato explorador,
escrutibador y clasificador de células). El resultado se representa
en la siguiente figura, de la que se desprende que la marcación por
fluorescencia de la secuencia con el fosfato de serina es
manifiestamente más intensa; y que los dos tipos de perlas están
separados aproximadamente por unas líneas de base.
Además, se pueden analizar y/o separar (también
separar por vía física) proteínas o péptidos, que se diferencian
tanto en lo que se refiere al número de sus grupos de éster de
ácido fosfórico como también en lo que se refiere a sus secuencias.
En este caso, se puede proceder de la siguiente manera:
Dos tipos de perlas de agarosa (con un diámetro
de 20-40 \mum) con las
hepta-secuencias peptídicas
X-X-X-X-S-A-A
fijadas (con X = proporciones iguales de
fenil-alanina, tirosina y triptófano; S = serina, no
fosforilada), y
A-A-R-R-S(P)-A-A
(con S(P) = serina fosforilada, después de haber incubado las
perlas con una PKA), se trataron, después de su mezclamiento a
razón de 1:1, con un compuesto de acuerdo con el invento, y se
investigaron en el aparato de FACS. La Figura 1 muestra las dos
poblaciones de perlas de las secuencias fosforiladas (B) y no
fosforiladas (A). Las abscisas indican las intensidades de
fluorescencia (FL1-H). Son posibles una
diferenciación nítida de las dos poblaciones y una clasificación
física en aparatos clasificadores de células.
Además, se pueden analizar y/o separar (también
separar por vía física) proteínas o péptidos, que tienen un número
igual o similar de grupos de éster de ácido fosfórico, pero tienen
también otras diferencias, tales como diferentes secuencias
peptídicas o proteínicas. En este caso, la clasificación
(separación) física puede tener lugar en aparatos clasificadores de
células.
La expresión "un número similar de grupos de
éster de ácido fosfórico" significa, de manera preferida, que el
número de los grupos de éster de ácido fosfórico de los diferentes
péptidos o proteínas varía en como máximo un 10%, de manera
preferida en como máximo un 5%, de manera todavía más grandemente
preferida en como máximo un 2%, y de la manera más grandemente
preferida en menos de un 1%, referido al número de grupos de éster
de ácido fosfórico del compuesto que tiene la mayor cantidad de
grupos de éster ácido fosfórico, consistiendo la diferencia en por
lo menos un grupo de éster de ácido fosfórico.
La expresión "secuencias diferentes"
significa en este caso, de manera preferida, que las secuencias se
diferencian en por lo menos 1 aminoácido por cada 19 aminoácidos de
la secuencia total.
En este caso se puede proceder de la siguiente
manera:
Se mezclan perlas que tienen las correspondientes
secuencias no fosforiladas (p.ej.
X-X-X-X-S-A-A
y
A-A-R-R-S-A-A)
y se incuban con una PKA (proteína - cinasa) y se fosforilan.
Después del tratamiento con un compuesto de acuerdo con el invento,
se obtuvo el resultado de acuerdo con la Figura 2. Se efectuó una
separación nítida e inequívoca de las dos poblaciones, que permite
una clasificación física en aparatos clasificadores de células.
En un ejemplo adicional, perlas con la biblioteca
de péptidos
A-X-X-A-S-A-A
preparada por vía sintética (X = todos los aminoácidos naturales,
con excepción de la cisteína (Cys)) se incuban con una PKA y, a
continuación, se tratan con un compuesto de acuerdo con el invento.
Las perlas con la fluorescencia más alta se seleccionaron con un
aparato clasificador FACS (dos poblaciones, R2 y R3, de acuerdo con
la Figura 3). El análisis de secuencias de la agrupación de las
perlas reunidas (Figura 4) muestra que las perlas llevan en las
posiciones X predominantemente arginina (R), lo que corresponde al
conocido motivo de reconocimiento de esta proteína - cinasa.
El procedimiento es apropiado por lo tanto para
identificar un gran número de motivos de consenso de p.ej. proteína
- cinasas identificadas, pero poco caracterizadas.
Los compuestos se pueden emplear también en
muchos ensayos adicionales, tal como p.ej. en el caso del análisis
y la separación de proteínas y péptidos que contienen grupos de
éster de ácido fosfórico, en geles con proteínas o en borrones de
transferencia (en inglés blots), en la electroforesis capilar
y en la electroforesis en gel.
En operaciones de separación en un sistema de
electroforesis capilar, la ovoalbúmina (albúmina de huevo) como
proteína fosforilada se pudo marcar intensamente con el complejo
entre fluoresceína, IDA y hierro conforme al invento, y detectar
con un correspondiente aparato detector (Figura 5). La proteína
testigo no fosforilada, glucosa -oxidasa, mostró solamente una débil
fluorescencia de fondo (Figura 6).
Este sector de empleo permite el control
eficiente de procesos biológicos de fosforilacion en ensayos in
vitro e in vivo.
Las proteínas se pueden separar mediante una
electroforesis en gel. Las proteínas individuales se pueden
seguidamente transferir en forma de borrones a una membrana de
soporte. En estos borrones (de nitrocelulosa) se marcaron
específicamente proteínas fosforiladas con el complejo entre
fluoresceína, IDA y hierro.
Finalmente, los compuestos que se han de utilizar
de acuerdo con el invento, se pueden emplear para la detección de
péptidos o proteínas recombinantes con marcas (en inglés
tags) de His (p.ej. con una secuencia adicional de 6 restos
de histidina), realizándose que como átomo o ion central se pueden
emplear otros metales de transición distintos del hierro, tales como
p.ej. átomos o iones de Cu, Ni, Co y/o Zn.
A modo de resumen, se ha de hacer constar que el
presente invento hace posible p.ej. una cuantificación y una
separación fáciles de proteínas y péptidos, puesto que se efectúa
una cuantificación estequiométrica, estable en el tiempo, del grupo
fluorescente. Una ventaja adicional resulta a partir del carácter
reversible de la coloración, que se puede anular mediante una
adición de fuertes radicales formadores de quelatos (de EDTA), o
mediante una modificación del valor del pH.
15 g (0,13 mol) de carbonato de dietilo se
calientan a 90ºC con 10 g (0,17 mol) de
etilen-diamina en un baño de aceite, mediando
refrigeración a reflujo, durante cinco horas. A continuación, el
alcohol etílico, que se ha formado durante la reacción, se separa
por evaporación rotatoria. El producto se destila a partir del
residuo en un aparato de destilación del tipo de tubo de bolas (en
alemán Kugelrohr).
Transición: 160ºC (a 4 mbar)
Rendimiento: 8,5 g (50% del teórico)
8,5 g (64 mmol) de
N-carboetoxi-etilen-diamina,
8,85 g (64 mmol) de carbonato de potasio y 19,58 g (128 mmol) del
éster metílico de ácido bromo-acético se reúnen en
este orden de sucesión. Se inicia una reacción enérgica, tras cuya
extincion la mezcla se calienta a 95ºC a reflujo durante cuatro
horas en un baño de aceite. Después de aproximadamente una media
hora se inicia un desprendimiento de CO_{2}, que se extingue de
nuevo poco después. Después de haber transcurrido el periodo de
tiempo de reacción, el residuo se hierve en 100 ml de dietil-éter,
el éter se separa por evaporación rotatoria y el éster se destila
en un aparato de destilación del tipo de tubo de bolas.
Transición: 220ºC (0,1 mbar)
Rendimiento: 10,12 g (57% del teórico)
10,12 g (37 mmol) del éster dimetílico de ácido
N-carboetoxi-\beta-amino-etil-imino-diacético
se añaden a 650 ml de una solución 0,15 molar de hidróxido de
bario. La mezcla se calienta a 95ºC a reflujo durante dos horas en
un baño de aceite. Después de haber enfriado, se añaden gota a gota,
mediando agitación intensa, 9,95 g de un ácido sulfúrico al
95-97%. A continuación, la suspensión se centrifuga
y se concentra por evaporación rotatoria. El producto puro se
obtiene mediante recristalizacion a partir de una mezcla de agua y
etanol.
Rendimiento: 4,00 g (61% del teórico)
50 mg (0,28 mmol) de ácido
amino-etil-imino-diacético
se disuelven en 5 ml de agua. La solución se ajusta a continuación
con una solución 0,2 M de hidróxido de sodio a un pH de 10,5. Para
ello se pipetean 3 ml de una suspensión etanólica de isotiocianato
de fluoresceína (correspondientes a 120 mg (0,30 mmol) de FITC). El
pH no debería quedar por debajo del valor de 8 y se corrige
posteriormente al valor inicial de manera alternada con la adición
de la suspensión.
La corrección del pH se efectúa, después de
haberse completado la adición, una vez por hora durante todavía
aproximadamente cinco horas. La mezcla se agita luego durante 48
horas mediando exclusión de la luz a la temperatura ambiente, y se
ajusta posteriormente varias veces durante este periodo de tiempo a
un pH de 10,5. Hacia el final de la reacción, el valor del pH
permanece estable. La solución se ajusta a continuación con HCl 1 M
a un pH de 2,5, con lo que precipita el producto. Éste se lava en 5
ml de etanol y se seca en vacío.
Rendimiento: 100 mg (66,6% del teórico)
20 mg (0,035 mmol) de la
N-diacetiliminoetil-N'-fluoresceinil-tiourea
se disuelven en 5 ml de agua y la solución se ajusta por medio de
una solución de hidróxido de sodio a un pH de 7,0. A la solución se
le añade a continuación una solución que se compone de 10 mg (0,037
mmol) de FeCl_{3} x 6 H_{2}O en 5 ml de agua, de este modo
precipita inmediatamente un material sólido de color negro, que se
separa por filtración y se lava posteriormente con 5 ml de agua.
Rendimiento: 20 mg
Claims (7)
1. Utilización de un compuesto, que abarca
- a)
- por lo menos un radical formador de quelatos,
- b)
- por lo menos un átomo o ion central coordinado con el (los) radical(es) formador(es) de quelatos, y
- c)
- por lo menos un colorante fijado al (a los) radical(es) formador(es) de quelatos, para la marcación de péptidos o proteínas que contienen grupos de éster de ácido fosfórico.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1,
caracterizada porque el (los)
radical(es) formador(es) de quelatos se seleccionan
entre radicales formadores de quelatos multidentados, tales como el
ácido imino-diacético y sus derivados, el ácido
nitrilo-triacético y sus derivados, ácidos
polioxicarboxílicos y sus derivados, poliaminas y sus derivados, y
el ácido etilen-diamina-acético y
sus derivados.
3. Utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizada porque el (los)
átomo(s) o ion (iones) central(es) es (son) por lo
menos un átomo o ion de un metal, en particular por lo menos un
átomo o ion de un metal de transición, de modo especial
Fe^{3+}.
4. Utilización de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes,
caracterizada porque el (los)
colorante(s) es (son) por lo menos un colorante de xanteno,
tal como un colorante fluorescente.
5. Utilización de acuerdo con la reivindicación
4,
caracterizada porque el colorante
fluorescente posee un radical de fluoresceína.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, a saber el complejo con hierro(III) de
N-diacetiliminoetil-N'-fluoresceinil-tiourea
7. Utilización de uno de los compuestos definidos
en una de las reivindicaciones 1 a 6 para la identificación de
motivos de consenso de proteína - cinasas.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19711796 | 1997-03-21 | ||
| DE19711796 | 1997-03-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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