JP4923298B2 - 細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用二光子プローブ - Google Patents
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Description
本発明は、細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用の二光子プローブ、その製造方法及び前記二光子プローブを利用した細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング方法に関するものである。より詳細には、二光子吸収効率が大きく、細胞膜とカルシウムイオンとを選択的に認識することができ、高い光安定性を有して細胞内カルシウムイオンのリアルタイムモニタリングに適した細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用二光子プローブ、その製造方法及び該二光子プローブを利用した細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング方法に関する。
カルシウムイオン（Ｃａ２＋）は、多様な細胞機能を調節する様々な細胞内の信号伝達物質である。Ｃａ２＋−シグナル伝達系は、広い動的範囲にかけて機能する多様な細胞過程を調節するために多くの異なる方法で作動する。これにより、カルシウムは数マイクロ秒以内に開口分泌（exocytosis）を誘発し、数分〜数時間以内に遺伝子転写及び増殖を引き起こす。
このような生体内カルシウムの機能を理解するために、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ ＢＡＰＴＡ−１（ＯＧ１）及びｆｕｒａ−２のような蛍光プローブで蛍光イメージを得る方法が最も広く使われて来た。しかし、このようなプローブを一光子顕微鏡に使うためには、短波長光（約３５０〜５００ｎｍ）で励起させなければならず、このために透過深度が非常に浅く（＜１００μｍ）、光退色（photobleaching）、光損傷（photodamage）及び細胞自己蛍光（cellularauto-fluorescence）などの問題点を有しているため、生体組職をイメージ化するのには限界がある。
二光子顕微鏡（two-photon microscopy、ＴＰＭ）は、このような短所を克服することができる。一光子顕微鏡（one-photon microscopy、ＯＰＭ）は、励起のために高エネルギーを有する一つの光子を使うが、ＴＰＭは、励起された蛍光物質を得るために、より低いエネルギーを有する２個の近赤外線光子が用いられる。ＴＰＭはＯＰＭに比べ、局部的に励起可能であること、透過深度の増加（＞５００μｍ）、細胞自己蛍光及び自己吸収の低下、そして、光損傷及び光退色を減少させることができるという長所を有する。従って、ＴＰＭは、組職切片内部に７０μｍ以上延びることもある表面処理の結果による干渉なしに長期間組職内部の深い所をイメージ化することができる。
しかし、現在、ＴＰＭに使われる大部分の蛍光物質プローブは、蛍光物質として低値のＴＰ作用断面（ＴＰ ａｃｔｉｏｎ ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）（Φδ）を有するために、高いプローブ濃度、または高いレーザー電力が要求される。さらに、蛍光量収率が細胞質内より膜の方が高くなるため、膜結合プローブからの蛍光信号が標的ミス（mistargeting）のような重要な誤りを引き起こすことがある。
知る限りにおいて、いまだカルシウムを選択的にリアルタイムに映像化させることができる二光子染料は報告されていない。そのため、光退色または標的ミスの問題なしに、生体組職内部の深い所でカルシウム波を可視化することができる効果的なＴＰプローブを開発する必要性がある。
R.Pethig,M.Kuhn,R.Payne,E.Adler,T.-H.Chen,L.F.Jaffe,Cell Calcium 1989,10491- 498 H.M.Kim,C.Jung,B.R.Kim,S.-Y.Jung,J.H.Hong,Y.-G.Ko,K.J.Lee,B.R.Cho,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,3460-3463 J.N.Demas,G.A.Crosby,J.Phys.Chem.1971,75991-1024 C.Reichardt,Chem.Rev.1994,94,2319-2358 R.Rudolf,M.Mongillo,R.Rizzuto,T.Pozzan,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2003，4579-586 K.A.Connors,Binding Constants;JohnWiley & Sons,Inc.:New York,1987 J.R.Long,R.S.Drago,J.Chem.Ed.1982,59,1037 K.Hirose,J.Incl.Phenom.Macrocycl.Chem.2001，39193 J.R.Long,R.S.Drago,J.Chem.Educ.1982，59，1037-1039 A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10thed.,(Ed.:R.P.Haugland),Molecular Probes, Eugene, OR, 2005 S.K.Lee,W.J.Yang,J.J.Choi,C.H.Kim,S.-J.Jeon,B.R.Cho,Org.Lett.2005，7323-326 H.R.Parri,T.M.Gould,V.Crunelli,Nat.Neurosci.2001，4803-812 C.M.Matias,N.C.Matos,M.Arif,J.C.Dionisio,M.E.Quinta-Ferreira,Biol.Res.2006，39521-530 M.E.Quinta-Ferreira,C.M.Matias,Brain Res.2004，1004，52-60 J.Y.Koh,S.W.Suh,B.J.Gwag,Y.Y.He,C.Y.Hsu,D.W.Choi,Science 1996，272，1013-1016 H.R.Parri,T.M.Gould,V.Crunelli,Nat.Neurosci.2001，4803-812
R.Pethig,M.Kuhn,R.Payne,E.Adler,T.-H.Chen,L.F.Jaffe,Cell Calcium 1989,10491- 498 H.M.Kim,C.Jung,B.R.Kim,S.-Y.Jung,J.H.Hong,Y.-G.Ko,K.J.Lee,B.R.Cho,Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,3460-3463 J.N.Demas,G.A.Crosby,J.Phys.Chem.1971,75991-1024 C.Reichardt,Chem.Rev.1994,94,2319-2358 R.Rudolf,M.Mongillo,R.Rizzuto,T.Pozzan,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2003，4579-586 K.A.Connors,Binding Constants;JohnWiley & Sons,Inc.:New York,1987 J.R.Long,R.S.Drago,J.Chem.Ed.1982,59,1037 K.Hirose,J.Incl.Phenom.Macrocycl.Chem.2001，39193 J.R.Long,R.S.Drago,J.Chem.Educ.1982，59，1037-1039 A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10thed.,(Ed.:R.P.Haugland),Molecular Probes, Eugene, OR, 2005 S.K.Lee,W.J.Yang,J.J.Choi,C.H.Kim,S.-J.Jeon,B.R.Cho,Org.Lett.2005，7323-326 H.R.Parri,T.M.Gould,V.Crunelli,Nat.Neurosci.2001，4803-812 C.M.Matias,N.C.Matos,M.Arif,J.C.Dionisio,M.E.Quinta-Ferreira,Biol.Res.2006，39521-530 M.E.Quinta-Ferreira,C.M.Matias,Brain Res.2004，1004，52-60 J.Y.Koh,S.W.Suh,B.J.Gwag,Y.Y.He,C.Y.Hsu,D.W.Choi,Science 1996，272，1013-1016 H.R.Parri,T.M.Gould,V.Crunelli,Nat.Neurosci.2001，4803-812
本発明の第１の目的は、低プローブ濃度でも鮮明なＴＰＭイメージを得るための高いＴＰ断面と、Ｃａ２＋イオンに対する高い選択性と、環境の極性により生じる発光スペクトルに差があるため細胞質内プローブと膜結合プローブとの識別が可能であることと、高い光安定性とを備えることで、細胞内カルシウムイオンのリアルタイムモニタリングに適した二光子プローブ（ＴＰプローブ）を提供することである。
本発明の第２の目的は、前記二光子プローブの製造方法を提供することである。
また、本発明の第３の目的は、前記二光子プローブを利用した細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング方法を提供することである。
本発明は、前記第１の目的を達成するため、下記式（１）で表わされることを特徴とする、細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用二光子プローブを提供する。
本発明は、前記第２の目的を達成するため、下記式（１）で表わされる細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用二光子プローブの製造方法であって、下記式（２）の化合物と下記（３）の化合物とが反応する段階を含むことを特徴とする二光子プローブの製造方法を提供する。
本発明は、前記第３の目的を達成するため、前記二光子プローブを観察対象とする細胞内に注入した後、放出される二光子励起蛍光イメージを得る段階を含む細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング方法を提供する。
本発明の二光子プローブは、低プローブ濃度でも鮮明なＴＰＭイメージを得ることができるように高いＴＰ断面を有し、Ｃａ２＋イオンに対して高い選択性を示し、例えば、親水性環境、疎水性環境などの環境の極性度によって発光スペクトルが変わるため、細胞質内プローブと膜結合プローブとの識別が可能であり、そして、高い光安定性を有していることから、細胞内カルシウムイオンのリアルタイムモニタリングに適するという特性を有する。
本発明による二光子プローブは、ＴＰ発色団として、２−アセチル−６−（ジメチルアミノ）ナフタレンを使い、Ｃａ２＋イオンキレータとして、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）を使う。
本発明による二光子プローブは、高いＴＰ断面を有し、溶媒極性によって大きいスペクトル移動性を示すので、膜結合プローブの蛍光とは区別して、本発明による二光子プローブ−Ｃａ２＋複合体に対する二光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）を探知することができる。これとともに、本発明による二光子プローブは、生体細胞及び生体組職内でカルシウム波を１００μｍ以上の深度で、長時間にわたり、標的ミス及び光退色なしに探知することができる。
本発明によるリアルタイムモニタリング方法では、後述するように、５００〜６２０ｎｍの範囲の波長を使って二光子励起蛍光イメージを得ることができ、細胞膜に結合された二光子プローブによる発光寄与度を最小化しながら、細胞内に遊離状態で存在するＣａ２＋イオンのみを選択的に測定することもできる。
また、従来技術とは異なり、本発明による細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング方法は、細胞内カルシウムの定性的分析だけではなく、定量的な測定もすることができる。
本発明による二光子プローブは、細胞内カルシウムイオンのリアルタイムイメージングに非常に適しており、Ｃａ２＋に対して４４倍のＴＰＥＦ強化効果を表わし、０．２５±０．０３μＭの解離定数値（Ｋｄ ＴＰ）を有し、Ｃａ２＋と複合体を形成する場合、オレゴングリーン ４８８ ＢＡＰＴＡ−１より５倍強いＴＰＥＦを発光する。また、既存のプローブとは異なり、生体細胞及び生体組職内の細胞内遊離Ｃａ２＋に対する動的水準を、他の金属イオン及び細胞膜結合プローブからの干渉なしに、選択的に探知することができる。さらに、本発明による二光子プローブは、光退色による影響なしにＴＰＭを使って１１００ｓ以上、１００〜３００μｍの深度のカルシウム波を観察することができる。
以下、本発明を、実施例を通じてより詳細に説明するが、下記実施例は、本発明の範囲を制限するためのものではなく、本発明の理解を助けるためのものである。
［実施例］
［製造例１］ 本発明による二光子プローブの製造
本実施例では、下記の手順によって、下記式（４）の化合物を合成した。
［製造例１］ 本発明による二光子プローブの製造
本実施例では、下記の手順によって、下記式（４）の化合物を合成した。
［製造例１．１］ ５−ニトロ−ＢＡＰＴＡ−テトラメチルエステル（式（５））及び６−アセチル−２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（カルボキシメチル）アミノ］ナフタレン（式（６））の製造
前記化合物は、それぞれ公知の文献に記載の方法に従って製造した（非特許文献１、非特許文献２参照）。
［製造例１．２］ ５−アミノ−ＢＡＰＴＡ−テトラメチルエステル（式（２））の製造
前記製造例１．１で製造した式（５）の化合物（２．２ｇ、３．８ｍｍｏｌ）及びカーボン上の５％Ｐｄ（９０ｍｇ）をエタノールに入れて、水素雰囲気下で５時間撹拌した。この反応混合物を濾過して、熱エタノールで洗浄した後、減圧して溶媒を除去した。得られた産物をカラムエチルアセテート／ヘキサン（２：１）を溶離液として使うカラムクロマトグラフィーによって精製した。
収率：１．１ｇ（５３％）；ｍｐ１２１℃ ＩＲ（ＫＢｒ）：３４３８、３３４６、１７５３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ６．８７（ｍ、４Ｈ）、６．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、６．２８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、６．２２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝３Ｈｚ）、４．２６（ｍ、４Ｈ）、４．１５（ｓ、４Ｈ）、４．０６（ｓ、４Ｈ）、３．５９（ｓ、６Ｈ）、３．５６（ｓ、６Ｈ）、３．５１（ｂｒ ｓ、２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７２．４、１７２．３、１５２．２、１５０．６、１４２．７、１３９．４、１３１．５、１２２．５、１２１．６、１１９．２、１１３．３、１１３．２、１０７．８、１０１．８、６７．３、６７．２、５３．９、５３．５、５１．９、５１．７ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３３Ｎ３Ｏ１０：Ｃ、５７．０３；Ｈ、６．０７；Ｎ、７．６７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５７．１１；Ｈ、６．０５；Ｎ、７．６０。
［製造例１．３］ 式（４）の化合物の製造
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の前記製造例１．１で製造した式（６）の化合物（０．３８ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・ＨＣｌ（０．３４ｇ、１．８０ｍｍｏｌ）の混合物を、２０分間撹拌した。前記混合物に、製造例１．２で製造した式（２）の化合物（０．９０ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（２６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で１２時間撹拌した。得られた産物をクロロホルムで抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた後、減圧して溶媒を除去した。引き続き、産物をヘキサン／エチルアセテート（２：３）を溶離液として使うカラムクロマトグラフィーによって精製し、エタノールによる再結晶でさらに精製した。
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の前記製造例１．１で製造した式（６）の化合物（０．３８ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・ＨＣｌ（０．３４ｇ、１．８０ｍｍｏｌ）の混合物を、２０分間撹拌した。前記混合物に、製造例１．２で製造した式（２）の化合物（０．９０ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（２６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で１２時間撹拌した。得られた産物をクロロホルムで抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた後、減圧して溶媒を除去した。引き続き、産物をヘキサン／エチルアセテート（２：３）を溶離液として使うカラムクロマトグラフィーによって精製し、エタノールによる再結晶でさらに精製した。
収率：０．６２ｇ（５３％）；ｍｐ１４８℃ ＩＲ（ＫＢｒ）：３２６０、１７５５、１６６２ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．３５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１８（ｓ、１Ｈ）、７．９８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．２７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．１６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．８８（ｍ、６Ｈ）、４．２５（ｓ、４Ｈ）、４．１２（ｓ、４Ｈ）、４．１０（ｓ、６Ｈ）、３．５６（ｓ、６Ｈ）、３．５３（ｓ、６Ｈ）、３．２４（ｓ、３Ｈ）、２．６８（ｓ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１９８．０、１７２．２、１７２．０、１６８．０、１５０．８、１５０．５、１４９．３、１３９．４、１３７．３、１３６．４、１３２．３、１３２．２、１３１．６、１３０．４、１２７．０、１２６．６、１２５．２、１２２．５、１２１．７、１１９．４、１１９．２、１１６．７、１１３．３、１１２．９、１０７．７、１０６．１、７７．４、６７．５、６７．１、５９．５、５３．６、５１．９、５１．８、４０．４、２６．８ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４６Ｎ４Ｏ１２：Ｃ、６２．５９；Ｈ、５．８９；Ｎ、７．１２．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６２．５２；Ｈ、５．９３；Ｎ、７．０７。
製造されたエステル（０．５０ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を前述した方法によって加水分解した。生じた沈殿物を収集し、蒸留水で洗浄し、ＭｅＯＨＣＨＣｌ３−ペトロリアムエーテルにより結晶化することで精製した。
収率：０．２７ｇ（５８％）；ｍｐ１４５℃ ＩＲ（ＫＢｒ）：３２５０、２９１０、１７４５、１６６０ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ８．３９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．８５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．６５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．４６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．２４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．９６（ｍ、７Ｈ）、４．３１（ｓ、４Ｈ）、４．３０（ｓ、２Ｈ）、３．９１（ｓ、８Ｈ）、３．２４（ｓ、３Ｈ）、２．６３（ｓ、３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ＝１９９．２、１７３．９、１７３．８、１７０．０、１５０．６、１５０．５、１４９．９、１４９．８、１３８．７、１３８．０、１３７．９、１３５．３、１３４．２、１３０．８、１３０．７、１２６．３、１２６．２、１２５．８、１２４．１、１２３．６、１２１．３、１１８．７、１１８．４、１１６．２、１１３．０、１１２．５、１０５．８、６６．８、６６．５、５６．３、５４．５、３９．２、２５．３ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ３８Ｎ４Ｏ１２：Ｃ、６０．８２；Ｈ、５．２４；Ｎ、７．６７．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６０．７２；Ｈ、５．３４；Ｎ、７．５９。
［製造例２］ 本発明による二光子プローブの製造
本実施例では、下記製造例によって、本発明による二光子プローブである下記式（７）の化合物を合成した。
本実施例では、下記製造例によって、本発明による二光子プローブである下記式（７）の化合物を合成した。
ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）中の前記製造例１で製造された式（４）の化合物（０．１１ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ブロモメチルアセテート（０．２４ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、及びＥｔ３Ｎ（０．１４ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）の混合物を、Ｎ２雰囲気下で２４時間撹拌した。その後、減圧して溶媒を除去し、粗生成物をエチルアセテート／ヘキサン（３：１）を溶離液として使うカラムクロマトグラフィーによって精製した。メタノールによる再結晶によって産物をさらに精製して薄い黄色の固体を得た。
収率：８５ｍｇ（５６％）；ｍｐ１３７℃ ＩＲ（ＫＢｒ）：１７５９、１７１０、１６６５ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．３６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．２２（ｓ、１Ｈ）、７．９８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．３１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．１７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８８（ｍ、６Ｈ）、５．６２（ｓ、４Ｈ）、５．６０（ｓ、４Ｈ）、４．２９（ｓ、４Ｈ）、４．１８（ｓ、４Ｈ）、４．１５（ｓ、４Ｈ）、４．１２（ｓ、２Ｈ）、３．２５（ｓ、３Ｈ）、２．６９（ｓ、３Ｈ）、２．０５（ｓ、６Ｈ）、２．０４（ｓ、６Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１９８．０、１７０．４、１７０．２、１６９．７、１６８．１、１５１．０、１５０．６、１４９．３、１３８．８、１３７．３、１３５．７、１３２．９、１３２．３、１３１．５、１３０．３、１２７．０、１２６．６、１２５．２、１２３．２、１２１．９、１２０．４、１２０．０、１１６．７、１１３．８、１１３．１、１０７．７、１０６．５、７９．５、７９．４、７７．５、７７．４、７７．１、６７．５、６７．２、５９．５、５３．５、４０．４、２６．７、２０．９ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４９Ｈ５４Ｎ４Ｏ２０：Ｃ、５７．７６；Ｈ、５．３４；Ｎ、５．５０．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５７．７０；Ｈ、５．３１；Ｎ、５．５２。
［実施例１］ 吸収スペクトル及び発光スペクトル測定
前記式（７）の化合物に対する吸収スペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ８４５３ ダイオードアレイスペクトロメータで記録し、該化合物の蛍光スペクトルは、１ｃｍ標準石英セルを備えたＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ２発光スペクトロメーターを使って得た。公知文献に記載の方法で、Ｃｏｕｍａｒｉｎ３０７を使って蛍光量子収率を測定した（非特許文献３参照）。図１には、それぞれ１，４−ジオキサン、ＤＭＦ、エタノール及びＨ２Ｏ中の前記化合物の吸収スペクトル（ａ）及び発光スペクトル（ｂ）を示す。下記表１には、多様な溶媒中での式（７）の化合物に対する最大吸収値及び最大発光値を示す。
前記式（７）の化合物に対する吸収スペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ８４５３ ダイオードアレイスペクトロメータで記録し、該化合物の蛍光スペクトルは、１ｃｍ標準石英セルを備えたＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ２発光スペクトロメーターを使って得た。公知文献に記載の方法で、Ｃｏｕｍａｒｉｎ３０７を使って蛍光量子収率を測定した（非特許文献３参照）。図１には、それぞれ１，４−ジオキサン、ＤＭＦ、エタノール及びＨ２Ｏ中の前記化合物の吸収スペクトル（ａ）及び発光スペクトル（ｂ）を示す。下記表１には、多様な溶媒中での式（７）の化合物に対する最大吸収値及び最大発光値を示す。
１）カッコ内の数値は、溶媒極性に対する正規化された実験的パラメータである（非特許文献４参照）。
前記式（７）の化合物に対する吸収スペクトル及び発光スペクトルから分かるように、１，４−ジオキサン＜ＤＭＦ＜エタノール＜Ｈ２Ｏの順に溶媒極性に応じて、徐々に赤色移動を示す。このような効果は、吸収スペクトルの場合（１７ｎｍ）より、発光スペクトルの場合（８２ｎｍ）でより顕著であり、従って、式（７）の化合物を極性プローブとして使うのに適するということが分かる。これに加えて、ＤＭＦ中の式（７）の化合物のλｍａｘ ｆｌは、膜結合プローブの数値と類似し、（図４（ｂ））、このような事実から式（７）の化合物が、膜結合プローブに対するモデルとして使われうるということが示唆される。
図２は，多様な濃度の遊離カルシウムイオン（０〜３９μＭ）存在下での式（４）の化合物１μＭ（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）に対する一光子発光スペクトル（ａ）及び吸収スペクトル（ｂ）である。また、図３は、多様な濃度の遊離カルシウムイオン（０〜３９μＭ）存在下での式（４）の化合物（●）及びＯＧ１（○）に対する二光子励起スペクトルであり、図４は、多様な濃度の遊離カルシウムイオン（０〜３９μＭ）存在下での式（４）の化合物１μＭ（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）に対する二光子発光スペクトルである。
ＭＯＰＳ緩衝溶液（３０ｍＭ、ｐＨ７．２）中の式（４）の化合物にカルシウムイオンを添加する場合には、吸収スペクトルに影響を与えずに、蛍光強度が金属イオン濃度に比例して急激に増加し（図２）、これは金属イオンとの複合体形成による光誘導電子輸送（photo-induced electron transfer、ＰＥＴ）の遮断のためであると推測される。
これによく似た結果が、二光子過程でも観察された（図３及び図４）。式（４）の化合物に対する蛍光強化因子［（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／Ｆｍｉｎ］は、３９μＭ Ｃａ２＋の存在下で４０であり、これはＯＧ１に対して既に報告されている数値である１４より、３倍近く大きい数値である（非特許文献５参照）。さらに、図５から分かるように、傾き１．０を有するＣａ２＋結合に対して測定された線形Ｈｉｌｌプロットは、プローブと陽イオンとの間で１：１複合体を形成することを示す（非特許文献６参照）。
［実施例２］ 解離定数（Ｋｄ）の決定
多様な濃度の［Ｃａ２＋］を含有する一連の較正溶液を、２種類の溶液（１０ｍＭ Ｋ２ＥＧＴＡを含む溶液Ａ及び１０ｍＭ ＣａＥＧＴＡを含む溶液Ｂ）を多様な比率で混合することで製造した。溶液Ａ及び溶液Ｂは、すべて、１μＭの式（４）の化合物、１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳを含み、ｐＨ７．２に調整されている。
多様な濃度の［Ｃａ２＋］を含有する一連の較正溶液を、２種類の溶液（１０ｍＭ Ｋ２ＥＧＴＡを含む溶液Ａ及び１０ｍＭ ＣａＥＧＴＡを含む溶液Ｂ）を多様な比率で混合することで製造した。溶液Ａ及び溶液Ｂは、すべて、１μＭの式（４）の化合物、１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳを含み、ｐＨ７．２に調整されている。
式（４）の化合物−Ｃａ２＋に対するＫｄを決定するために、蛍光スペクトルを２０℃で２．０ｍＬの溶液Ａ（０μＭ遊離Ｃａ２＋）で記録した。引き続き、前記溶液２０３μＬを廃棄し、これを２０３μＬの溶液Ｂで置換した後（３９μＭ遊離Ｃａ２＋）、スペクトルを記録した。このような作業によって、プローブまたは総ＥＧＴＡの濃度変化なしに、ＣａＥＧＴＡ濃度を１．００ｍＭで、［Ｃａ２＋］遊離の濃度を約０．０１７μＭで調節することができた。前記［Ｃａ２＋］遊離は、下記数式２を使ってＣａ２＋（１５０．５ｎＭ）に対するＥＧＴＡのＫｄから計算された。
また、２２３μＬ、２５１μＬ、２８５μＬ、３２７μＬ、４２１μＬ、４７９μＬ、６６７μＬ、４２０μＬ、３５０μＬ、４１２μＬ、９０５μＬ、１０２８μＬ、９２６μＬ、９９２μＬの溶液Ａを連続的に廃棄し、それぞれを同一の量の溶液Ｂに置換することによって、０．０３８μＭ、０．０６５μＭ、０．１０１μＭ、０．１５０μＭ、０．２３０μＭ、０．３５０μＭ、０．６０１μＭ、０．８００μＭ、１．００μＭ、１．３０μＭ、２．５０μＭ、５．３０μＭ、１０．０μＭ、２０．０μＭの遊離Ｃａ２＋溶液を得た。
もし、式（４）の化合物とＣａ２＋イオンとの間に１：１金属−リガンド複合体が形成される場合、その平衡状態は下記数式３のように表現することができる。
（数式中、Ｌ及びＭは、それぞれ式（４）の化合物とＣａ２＋イオンとを表わす。）
総プローブ及び金属イオン濃度は、それぞれ［Ｌ］０＝［Ｌ］＋［ＬＭ］及び［Ｍ］０＝［Ｍ］＋［ＬＭ］と定義され、［Ｌ］０及び［Ｍ］０の値が与えられる場合に、Ｋｄは下記数式４または数式５で表わされる。
総プローブ及び金属イオン濃度は、それぞれ［Ｌ］０＝［Ｌ］＋［ＬＭ］及び［Ｍ］０＝［Ｍ］＋［ＬＭ］と定義され、［Ｌ］０及び［Ｍ］０の値が与えられる場合に、Ｋｄは下記数式４または数式５で表わされる。
（数式中、Ｆは、測定された蛍光強度であり、Ｆｍｉｎは、最小蛍光強度であり、Ｆｍａｘは、最大蛍光強度である。数式５による適正曲線（図６）に最もよく適合するＫｄ数値を、商用エクセルプログラムを使って計算した（非特許文献７，非特許文献８参照）。）
また、二光子過程に対するＫｄ ＴＰを決定するため、７８０ｎｍの波長及び１２３０ｍＷの出力に設定し（焦点平面から略１０ｍＷの平均出力に相当）、設定が固定されたチタン−サファイアレーザー光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）によって励起されるＤＭ ＩＲＥ２ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ）を使ってＴＰＥＦスペクトルを得た。これによりＴＰＥＦ滴定曲線（図６）を得て、これを数式３に適合（fitting）させた。
また、二光子過程に対するＫｄ ＴＰを決定するため、７８０ｎｍの波長及び１２３０ｍＷの出力に設定し（焦点平面から略１０ｍＷの平均出力に相当）、設定が固定されたチタン−サファイアレーザー光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）によって励起されるＤＭ ＩＲＥ２ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ）を使ってＴＰＥＦスペクトルを得た。これによりＴＰＥＦ滴定曲線（図６）を得て、これを数式３に適合（fitting）させた。
解離定数（Ｋｄ ＯＰ）は、公知の文献に記載された方法で、図６の蛍光滴定曲線から計算した（非特許文献９参照）。
多様な濃度の遊離マグネシウムイオン（０〜３０ｍＭ）存在下での式（４）の化合物（３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）に対する一光子発光スペクトル、線形Ｈｉｌｌプロット及び一光子蛍光滴定曲線を得た。これらをそれぞれ図７〜図９に示す。
式（４）の化合物のＣａ２＋及びＭｇ２＋に対する一光子解離定数（Ｋｄ ＯＰ）は、それぞれ０．２７±０．０１μＭ及び６．８±０．７ｍＭであり、類似した数値が二光子過程でも測定された［Ｋｄ ＴＰ（Ｃａ２＋）＝０．２５±０．０３μＭ］。式（４）の化合物は、Ｚｎ２＋及びＭｎ２＋に対しては中間程度の反応を示し、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋及びＣｏ２＋に対してはさらに弱い反応を表わし、Ｃｕ２＋に対しては全く反応を示さなかった（図１０）。
細胞内遊離Ｍｎ２＋の濃度は無視できるほどであり、キレート化が可能なＺｎ２＋は海馬ＣＡ３領域のような特殊な領域を除いてはほとんど存在しないために、本発明によるプローブは、他の金属イオンからの干渉を最小化しながら、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を選択的に探知することができる。さらに、式（４）の化合物は、生物学的に関連性あるｐＨ範囲内では、ｐＨに敏感ではない（図１１）。
［実施例３］ 二光子励起スペクトルの観察
緩衝溶液のうちＣａ２＋イオンの式（４）との複合体及びＯＧ１との複合体に対する二光子励起スペクトルは、式（４）の化合物−Ｃａ２＋のΦδに対して７８０ｎｍで１１０ＧＭを示し、これはＯＧ１−Ｃａ２＋の場合よりさらに５倍大きい値である。従って、式（４）の化合物で染色された試料に対するＴＰＭイメージは、通常的なプローブで染色されたものなどより遥かに明るい。これに加えて、二光子適正曲線から計算された二光子蛍光強化因子（ＴＰＥＦ）は４４であり、これはＴＰＭでＣａ２＋を探知することができるということを意味する（表２）。
緩衝溶液のうちＣａ２＋イオンの式（４）との複合体及びＯＧ１との複合体に対する二光子励起スペクトルは、式（４）の化合物−Ｃａ２＋のΦδに対して７８０ｎｍで１１０ＧＭを示し、これはＯＧ１−Ｃａ２＋の場合よりさらに５倍大きい値である。従って、式（４）の化合物で染色された試料に対するＴＰＭイメージは、通常的なプローブで染色されたものなどより遥かに明るい。これに加えて、二光子適正曲線から計算された二光子蛍光強化因子（ＴＰＥＦ）は４４であり、これはＴＰＭでＣａ２＋を探知することができるということを意味する（表２）。
［ａ］すべてのデータは、遊離Ｃａ２＋（３９μＭ）の存在下または不存在下で共に、３０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．２の条件で測定された。
［ｂ］一光子吸収及び発光スペクトルのλｍａｘは、ｎｍ単位である。
［ｃ］蛍光量子収率、±１０％
［ｄ］一光子（Ｋｄ ＯＰ）及び二光子（Ｋｄ ＴＰ）過程によってμＭ単位で測定されたＣａ２＋に対する解離定数、±１２％
［ｅ］一光子（ＦＥＦＯＰ）過程及び二光子（ＦＥＦＴＰ）過程によって測定された蛍光強化因子（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／Ｆｍｉｎ
［ｆ］ｎｍ単位の二光子励起スペクトルに対するλｍａｘ
［ｇ］１０−５０ｃｍ４ｓ／光子（ＧＭ）単位のピークＴＰ断面、±１５％
［ｈ］二光子励起断面
［ｉ］ＤＭＦ中からΦ＝０．２７±０．０２（式（４））及び０．２２±０．０２（式（７））
［ｊ］二光子励起蛍光強度は、断面を正確に測定するには余りにも弱かった。
［ｋ］Ｍｇ２＋に対する式（４）の化合物のＫｄ ＯＰ数値は、６．８±０．７ｍＭであった。
［ｌ］公知文献を参照して行った（非特許文献１０参照）。
ＴＰ断面（δ）の測定は、フェムト秒（ｆｓ）蛍光測定技法（非特許文献１１参照）を使って行った。
［ｂ］一光子吸収及び発光スペクトルのλｍａｘは、ｎｍ単位である。
［ｃ］蛍光量子収率、±１０％
［ｄ］一光子（Ｋｄ ＯＰ）及び二光子（Ｋｄ ＴＰ）過程によってμＭ単位で測定されたＣａ２＋に対する解離定数、±１２％
［ｅ］一光子（ＦＥＦＯＰ）過程及び二光子（ＦＥＦＴＰ）過程によって測定された蛍光強化因子（Ｆ−Ｆｍｉｎ）／Ｆｍｉｎ
［ｆ］ｎｍ単位の二光子励起スペクトルに対するλｍａｘ
［ｇ］１０−５０ｃｍ４ｓ／光子（ＧＭ）単位のピークＴＰ断面、±１５％
［ｈ］二光子励起断面
［ｉ］ＤＭＦ中からΦ＝０．２７±０．０２（式（４））及び０．２２±０．０２（式（７））
［ｊ］二光子励起蛍光強度は、断面を正確に測定するには余りにも弱かった。
［ｋ］Ｍｇ２＋に対する式（４）の化合物のＫｄ ＯＰ数値は、６．８±０．７ｍＭであった。
［ｌ］公知文献を参照して行った（非特許文献１０参照）。
ＴＰ断面（δ）の測定は、フェムト秒（ｆｓ）蛍光測定技法（非特許文献１１参照）を使って行った。
［実施例４］ 本発明による二光子プローブを使った細胞観察
生後１日齢のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＳＤ）の大脳皮質から得られた星状細胞を３Ｕ／ｍｌのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、ＮＪ、米国）を含有するＨａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）を入れた７５ｍｍフラスコにプレーティングした。精製した星状細胞を培養するために、フラスコを撹拌機上で３７℃に６時間撹拌した後、培地内の浮遊細胞を除去した。星状細胞を５分間０．２５％トリプシンで処理し、５０〜１００細胞／ｍｍ２となるようにポリ−Ｄ−リシンコーティングされたガラスカバースリップ上に再びプレーティングした後、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％牛胎児血清が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）を使って、３７℃のＣＯ２培養器内で保持した。７〜１５日間にインビトロで保持した後、星状細胞は無血清培地で３回洗浄し、無血清培地中の２μＭ濃度の式（７）の化合物とともに３７℃で２０分間培養した。細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ社製）で３回洗浄した後、１５分間無色の無血清培地中でさらに培養した後に観察した。
生後１日齢のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＳＤ）の大脳皮質から得られた星状細胞を３Ｕ／ｍｌのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、ＮＪ、米国）を含有するＨａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）を入れた７５ｍｍフラスコにプレーティングした。精製した星状細胞を培養するために、フラスコを撹拌機上で３７℃に６時間撹拌した後、培地内の浮遊細胞を除去した。星状細胞を５分間０．２５％トリプシンで処理し、５０〜１００細胞／ｍｍ２となるようにポリ−Ｄ−リシンコーティングされたガラスカバースリップ上に再びプレーティングした後、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％牛胎児血清が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）を使って、３７℃のＣＯ２培養器内で保持した。７〜１５日間にインビトロで保持した後、星状細胞は無血清培地で３回洗浄し、無血清培地中の２μＭ濃度の式（７）の化合物とともに３７℃で２０分間培養した。細胞をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ社製）で３回洗浄した後、１５分間無色の無血清培地中でさらに培養した後に観察した。
２μＭの式（７）の化合物で標識されて培養された星状細胞に対する擬似彩色（pseudo colored）ＴＰＭイメージは、強い点及び均一な領域を示した（図１２）。前記イメージは、細胞内Ｃａ２＋と式（４）の化合物との複合体及び膜結合プローブから発光されたＴＰＥＦであると推定されるが、これはＭＯＰＳ緩衝溶液中の式（４）の化合物−Ｃａ２＋に対する蛍光量子収率及びＤＭＦ中の式（７）の化合物（０．２７）に対する蛍光量子収率が、ＭＯＰＳ緩衝溶液中の式（４）の化合物（０．０１２）及び式（７）の化合物（０．０６０）の蛍光量子収率より遥かに大きいためである（表２）。従って、ＤＭＦ中の式（７）の化合物は、λｍａｘ ｆｌにおけるその類似性のために膜結合プローブに対する立派なモデルになるものと推測される。
図１２で、強い点及び均一な領域に対するＴＰＥＦスペクトルは、４４５ｎｍ（図１２（ｂ）の１の曲線）及び４９４ｎｍ（図１２（ｂ）の２の曲線）で最大発光度を示す。さらに、前記１の曲線の発光バンドは非対称的であり、４４５及び４８８ｎｍで最大発光度を有する２個のガウス関数に適合させることができた（図１２（ｂ）の３及び４の曲線）。一方、前記２の曲線の発光バンドは、５００ｎｍで最大発光度を有する単一ガウス関数に適合させることができた（図１２（ｂ）の５の曲線）。ＭＯＰＳ緩衝溶液中で測定された発光スペクトル（図２（ａ））と比べて、分離されたスペクトルの短波長バンドは顕著に青色移動を示したが、長波長バンドは類似して保持された。このようなスペクトル移動は、プローブが極性の異なる２つの領域に位置することができるということを意味する。
このような環境の極性を分析するために、下記のように式（７）の化合物で標識された星状細胞に対する寿命イメージ（lifetime image）を得た。
１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、カバースリップ上に星状細胞を成長させた。細胞をＰＢＳ中で軽く洗浄した後、２μＭの式（７）の化合物を使って３７℃で２０分間培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ホルムアルデヒド（３．７％ ＰＢＳ）で１０分間固定した後、ＰＢＳで３回洗浄し、封入溶液を使って封入した。蛍光消滅は、Ｌｅｉｃａ ＴＳＣ−ＳＰ２−ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡で同期されたＳＰＣ８３０ ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｂｏａｒｄ（Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｈｉｃｋｌ社製、独国）を使って、時間相関単一光子計数法（ＴＣＳＰＣ）によって解読した。結果を図１３に示す。
図１３を参照すると、強い点は１．８ｎｓの励起状態寿命を表わし、これは中心から０．８ｎｓでの寿命分布曲線の最上端より２倍以上長いものである。これは、本発明によるプローブが２個の互いに区別される環境下に存在することを反映するものであって、そのうちの一つは親水性の細胞質環境で短寿命である赤色光を放出し、他の一つは疎水性の細胞膜結合環境で長寿命である青色光を放出するものである。
細胞内Ｃａ２＋は、膜結合プローブによる誤差を最小限にして検出されることができる。分離されたガウス関数の短波長バンド（図１２（ｂ）の３の曲線）に対するスペクトルは、〜５００ｎｍで基底線まで減少し、これは膜結合プローブから発光されたＴＰＥＦがλ＞５００ｎｍでは無視できる程度の干渉現象であるということを意味する。類似して、ＤＭＦ中の式（７）の化合物を膜結合プローブに対するモデルとして考慮する場合には、λ＞５００ｎｍでの蛍光は総発光バンドの約５％のみを占める（図１（ｂ））。従って、５００〜６２０ｎｍで得られたＴＰＥＦイメージは強い点がなく均一であるが（図１４（ｂ）、３６０〜４６０ｎｍで得られたＴＰＥＦイメージはこのような強い点が表われた（図１４（ａ））。従って、５００〜６２０ｎｍの検出ウインドウを使う場合には、細胞内Ｃａ２＋を選択することができる。
本発明によるプローブの有用性を立証するために、生体細胞及び組職内での［Ｃａ２＋］ｉ波を観察した。２μＭの式（７）の化合物で標識された培養星状細胞に対するＴＰＭイメージは星状細胞過程（１）から体細胞（２）に、再び末端（３）への自発的Ｃａ２＋信号伝達が７．５±２．２μｍ／ｓ（ｎ＝５星状細胞）の速度で発生することを示す（図１５（ａ）及び図１５（ｃ））。また、［Ｃａ２＋］ｉの自発的な増加も星状細胞の間で発生し、これは隣接星状細胞での遅延された活性によって観察された（図１５（ｂ）及び図１５（ｄ））。
自発的に発生する波動の伝播速度は、１．８±１．１μｍ／ｓ（ｎ＝７、星状細胞）であり、この結果は報告されているデータと一致した（非特許文献１２参照）。従って、式（４）の化合物は、ＴＰＭを使って培養された星状細胞の細胞内及び細胞間のカルシウム波を可視化することができるということが明らかである。
［実施例５］ 新生児ラットの視床下部切片の観察
切片は、２日齢のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＳＤ）の海馬及び視床下部から得た。冠状切片（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｌｉｃｅｓ）を、人工脳脊髓流体（ＡＣＳＦ；１３８．６ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＫＣｌ、２１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、９．９ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２）中の振動刃ミクロトームを使って４００ｕｍの厚さに切り出した。切片をＡＣＳＦ中の１０μＭの式（７）の化合物で、３７℃で９５％ Ｏ２及び５％ ＣＯ２で３０分間気泡を吹き込みながら培養した。引き続き、切片をＡＣＳＦで３回洗浄し、ガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ社製）に移した後、スペクトル共焦点多重光子顕微鏡で観察した。
切片は、２日齢のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＳＤ）の海馬及び視床下部から得た。冠状切片（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｌｉｃｅｓ）を、人工脳脊髓流体（ＡＣＳＦ；１３８．６ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＫＣｌ、２１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、９．９ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び３ｍＭ ＭｇＣｌ２）中の振動刃ミクロトームを使って４００ｕｍの厚さに切り出した。切片をＡＣＳＦ中の１０μＭの式（７）の化合物で、３７℃で９５％ Ｏ２及び５％ ＣＯ２で３０分間気泡を吹き込みながら培養した。引き続き、切片をＡＣＳＦで３回洗浄し、ガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ社製）に移した後、スペクトル共焦点多重光子顕微鏡で観察した。
キレート化によって毒性を生じさせることなく、Ｚｎ２＋を除去することができる膜透過性Ｚｎ２＋キレータ（非特許文献１３参照）であるＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラキス（２−ピリジル）エチレンジアミン（ＴＰＥＮ）２０μＭの存在下、ＣＡ１領域のＴＰＭイメージを得るために、ＴＰＥＮの２０ｍＭストック溶液を８．５ｍｇのＴＰＥＮを１．０ｍＬのエタノールに溶解させて製造した（非特許文献１４参照）。前記製造された溶液１．０μＬを１．０ｍＬのＡＣＳＦに添加し、ＡＣＳＦ中にＴＰＥＮが２０μＭとなるようにした。式（７）の化合物で標識された海馬切片に対するＴＰＭイメージを得た後、ガラスボトムディッシュ内のＡＣＳＦ溶液をマイクロピペットで除去し、ＡＣＳＦ中に２０μＭのＴＰＥＮを１ｍＬ添加した後、ＴＰＭイメージを得た。
図１６は、１０μＭの式（７）の化合物で染色されたモルモット視床下部微細切片に対する類似彩色されたＴＰＭイメージであり（図１６（ａ）は１９５ｓ経過後、図１６（ｂ）は２１４ｓ経過後）、図１７には、図１６（ａ）及び図１６（ｂ）の体細胞（１）、星状細胞過程（２）及び隣接細胞（３）で記録された自発的Ｃａ２＋輸送を示すグラフである。
図１７を参照すれば、体細胞での自発的なＣａ２＋波は、約１６ｍＨｚの周波数で明確に可視化することができ（ｎ＝４）、明らかな減少現象なしに１１００ｓ以上保持された。さらに、星状細胞過程でのスパイクは体細胞でのスパイクの若干前に現れる。これは信号が星状細胞過程から体細胞に漸進的に伝播されるという従来公知の事実を裏付けるものである（非特許文献１５参照）。
同様の結果が、ｆｕｒａ−２で染色されたＴＴＸ処理された視床切片に対して報告されたことがあるが（非特許文献１６参照）、前記報告でのイメージは、組職表面で細胞が損傷しており、そして、本発明でのＴＰＭイメージに比べて鮮明度が落ちるものであった。また、ＴＴＸ蛍光強度は、５００ｓ以後になると顕著に減少する。
本発明で改善されたＴＰＭイメージは、本発明のプローブが組職の深い深度まで観察できるだけではなく、高い光安定性及び低い光毒性を有するため、１７０μｍの深度での観察を、より長時間行うことを可能にした。
最後に、星状細胞過程でのスパイクは、７００ｓ以後には非常に弱くなったが、これは顕微鏡下の接触地点から遠くなったためであると思われる。また、図１７の隣接細胞に対するデータから分かるように、類似したカルシウム波が隣接細胞から観察された。
Claims (5)
- 下記式（１）で表わされることを特徴とする、細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用二光子プローブ。
- 前記Ｒ３は、ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３であることを特徴とする請求項１記載の細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用二光子プローブ。
- 下記式（１）で表わされる細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング用二光子プローブの製造方法であって、下記式（２）の化合物と下記式（３）の化合物とが反応する段階を含むことを特徴とする二光子プローブの製造方法。
- 請求項１または請求項２記載の二光子プローブを観察対象とする細胞内に注入した後、放出される二光子励起蛍光イメージを得る段階を含むことを特徴とする細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング方法。
- 前記二光子励起蛍光イメージは、５００〜６２０ｎｍの範囲の波長を使って得ることを特徴とする請求項４記載の細胞内カルシウムのリアルタイムモニタリング方法。
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