JPH0670603B2 - 表面上の薄片試料を毛管流により処理するための方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は適切な平面、たとえば顕
微鏡スライド上に固定化された組織学的、細胞学的、ま
たは血液学的検体などの試料を（１）化学的染色液、あ
るいは（２）溶存試薬、たとえば（ａ）抗体または
（ｂ）標識されたＤＮＡもしくはＲＮＡプローブなど、
それぞれ固定化された試料中に存在する抗原または核酸
配列の検出に用いられる試薬で処理するための方法に関
する。

【０００２】現在の組織学、細胞学および血液学の技術
においては、大部分の臨床実験室または研究室で実験助
手が実施するのに長時間を必要とする手動による染色法
が用いられている。これらの方法は、大量のスライドを
１人の実験助手が１回の染色作業で同時に染色しうるの
で、通常は価格上は効果的である。現在用いられている
手動および自動双方の染色システムとも、各スライドの
一平面上に組織または細胞スミアが固定化された平行な
スライドを含むホルダーを順次、同系列の液体試薬、た
とえば水性試薬または染料もしくは着色剤の有機溶液中
にルーテインまたはプログラミングされた様式で浸漬す
る。組織学、細胞学および血液学的検体についての手動
染色システムの例は組織病理学および細胞病理学の専門
家には周知であり、それらの実施に関するプロトコール
は固定化された検体について染色を行う実験室にはいず
れにも見出される。自動化されたシステムの例にはテク
ニコン・インスツルメンツ・シャンドン・サウザーンお
よびフィッシャーサイエンティフィックにより販売され
るものが含まれる〔フィッシャー・ヒストマチック（Ｈ
ｉｓｔｏｍａｔｉｃ，登録商標）スライド・ステイナー
１７２型の説明に関してはフィッシャー８６カタログ４
２６−４２７頁を参照されたい）。

【０００３】毛管作用は大量自動化スライド染色法を開
発することを試みた下記の先行技術において採用され
た。米国特許４，１９９，６１３号明細書（ジョンソ
ン，１９８０年）には、積重ねられた平行なスライドを
両端付近で一連の一般に平行なシムによりかみ合わせた
システムが記載されている。これらのシムは平行に積重
ねられた隣接スライドの対応する末端の間に置かれ、隣
接するスライドの向かい合った平面にシムの厚さだけ間
隔を置く。この厚さ（たとえば０．００８インチ、０．
２ｍｍ）は、隣接するこれらの対向平面間に毛管流に適
した空間を与える。使用に際しては、一組のスライド
（たとえば５０枚）を垂直に積重ね、連続的な液流（た
とえば染色液）をこれらのスライドの隣接末端部分上へ
流し（垂直に積重ねられた最上スライドから出発す
る）、隣接スライド間の狭い間隙を順次充填する。充填
は水平方向への毛管流による。これらの狭い間隙を充填
するのに必要なものよりも過剰の液体は底部スライドか
ら流れ去る。このシステムは多数のスライドを一連の等
しい試薬で染色することを目的とし、前記の手動および
自動染色法に採用されたと同じ性質のものである。

【０００４】液状検体を鏡検用空間内に捕捉する分野
（この分野は固定化された試料を染色液および液状試薬
で処理するのと同等とは認められない）で、毛管流がし
ばしば利用される。一般に米国特許第４，５０１，４９
６号（グリフィン，１９８５年）及び第３，９６１，３
４６号（ホワイト，１９７５年）明細書に示されるよう
に、液体試料は底板上へ導入され、底板の鏡検面とここ
に乗せられた透明な平面により定められる狭い間隙内へ
毛管流によって移行する。しかし米国特許第４，３０
８，０２８号明細書（エルキンス，１９８１年）におい
ては、ストリップと呼ばれる装置が試験管内の試料（た
とえば遠心分離された尿試料）中へ垂直に伸びた状態で
浸漬される。４欄５３行ないし５欄１４行（エルキンス
の図６および７を参照されたい）に記載されるように、
試料の底部画分からの、粒子に富むアリコートが毛管作
用によりチャンバー（エルキンスの各図面において１４
と表わされる）内へ流入する。エルキンスの明細書中の
他の箇所に、多層の積層によるストリップの構成（１中
間層は短く、一定の厚さをもち、他の少なくとも１層は
長く、透明である）が記載されている（７欄３〜４５
行）。この方法の最後に、ほぼ一定の厚さのチャンバー
１４内の試料をエルキンスの図２２に示されるように未
染色、未処理の状態で、短い中間層の末端を越えて広が
る長い透明な層の一部を通して鏡検する。

【０００５】本明細書に添付した図面につき簡単に説明
する。

【０００６】図１Ａは第１の形態によるスライドアセン
ブリーの側方立面図である。

【０００７】図１Ｂは図１Ａの線１Ｂ−１Ｂに沿って得
た前方立面図である。

【０００８】図１Ｃは図１Ａの線１Ｃ−１Ｃに沿って切
断して得た前方立面図である。

【０００９】図２Ａは第２の形態によるスライド対を分
解した状態の側方立面図である。

【００１０】図２Ｂは図２と同じスライド対をホルダー
部分内で組立ててスライドアセンブリーを構成した状態
の、図２と同じ立面図である。

【００１１】図２Ｃは図２Ｂの線２Ｃ−２Ｃに沿って切
断して得た、ホルダー内のスライドアセンブリーの上面
図である。

【００１２】図２Ｄは第３の形態によるスライドアセン
ブリーの分解した状態を示す、図２Ｂと同様な図であ
る。

【００１３】図２Ｅはホルダー内に入れられた図２Ｄの
スライドアセンブリーの、図２Ｂと同様な図である。

【００１４】図３Ａは、液滴保持器の上方に置かれた、
それぞれ第２の形態によるスライドアセンブリーの配列
を、図３Ｂの線３Ａ−３Ａに沿って切断して得た側方立
面図である。

【００１５】図３Ｂは図３Ａの線３Ｂ−３Ｂに沿って得
た、図３Ａに断面で示した液滴保持器の平面図である。

【００１６】図３Ｃは図３Ａと同じ角度からみた、液滴
１個に接触している１個のスライドアセンブリーの拡大
図であり、液体が本発明方法に従い毛管流によって狭い
間隙内へ垂直方向に引込まれる状態を示す。

【００１７】図３Ｄは液体が毛管流によって狭い間隙か
ら吸収材料中へ垂直方向に引込まれる状態を示す、図３
Ｃと同様な図である。

【００１８】図４は第４の形態によるスライドアセンブ
リーを示す、図１Ｃと同様な前方立面図（断面）であ
る。

【００１９】図５は一部スライド対が装填された、第５
の形態によるスライドホルダーの倒立した状態を示す透
視図であり、配列が５対のスライド５列ではなく１０対
のスライド３列であるという点のみにおいて図２Ａ，２
Ｂ，３Ａ，３Ｂ，３Ｃおよび３Ｄに示した形態と異な
る。

【００２０】図６は図５のスライド対配列を用いた手動
または自動多段階法用のステーションの配列を示す平面
図である。

【００２１】図７は図５および図６の形態による液滴保
持器が一部装填された状態を示す透視図である。

【００２２】本発明により提供される多様な方法によっ
て、高価な液体を控え目に使用でき、同時に処理される
試料または材料の処理液の変更に際し融通性があり、試
料間の相互汚染が最小限に抑えられ、有毒な試薬が実験
室職員に接触するのが防止されるという点で安全であ
り、あるいはこれらの要素を合わせもつという利点をも
って、薄い試料または平面上に固定化された材料を多段
階処理することが可能になる。本方法においては、固定
化された試料を含む表面の前方に狭い毛管間隙を採用す
ることにより（特に間隙が垂直方向に広がる場合）、こ
の間隙の一縁を、特にこの垂直方向に広がる間隙の基底
部において、分離されたアリコートの処理液と接触させ
ることにより、または次いでこの間隙の一縁（特に垂直
方向に広がる間隙の底縁）を吸収材料と接触させること
によって液体を排除することにより、あるいはこれらの
特色の組合せにより、上記の利点が達成される。このよ
うな特色は米国特許第４，１９９，６１３号明細書に記
載の方法にまさる特別な利点を与える。後者の方法は個
々のスライドを独自の試薬で同時に処理することができ
ず、この方法は対照的に水平方向に広がる間隙、連続液
流での液体の導入、およびスライドアセンブリー全体を
回転させることによる液体の排除を採用している。

【００２３】本発明は多数のスライドが単純配列の液体
試薬に系統的に暴露される大量染色に採用できるが、個
々のスライドに独自の系列の試薬が同時に施される別個
の分析器として用いられる場合、先行技術にまさる特別
な利点をもつ。

【００２４】従って本発明は、第１表面上の薄片試料を
一連の処理液で処理するための方法であって、 ａ）第１処理液を試料保有第１表面と対面要素の第２表
面との間隙内の毛管流により、少なくとも試料保有第１
表面上に固定化された試料の位置にまで引込み、 ｂ）第１処理液を間隙内で毛管作用により試料と接触し
た状態に保持し、 ｃ）第１処理液を毛管流により間隙から排除し、そして ｄ）第２処理液を間隙内の毛管流により少なくとも試料
の位置にまで引込む工程からなる方法を提供する。

【００２５】なお、本出願の親出願である特願昭６１−
２１５５７８号（特開昭６２−９８２３１号）において
は、本発明と関連した下記（１）〜（５）の方法又は装
置が開示されている。

【００２６】（１）第１表面上の薄片試料に液体を施す
方法であって、 ａ）第２表面を第１表面に実質的に平行に、これから第
１距離だけ間隔を置いた状態に維持し、これにより第１
表面と第２表面の間に間隙を設け、そして ｂ）この間隙の縁を分離されたアリコートの液体と接触
させる工程からなり、上記の第１距離は、液体を間隙内
で毛管作用により移動させて薄片試料と接触させるのに
十分なほど小さいものである方法。

【００２７】（２） ａ）試料保有第１表面をもつ第１員子を対面要素の第２
表面から一定距離に保持し、その際第１表面および第２
表面が実質的に平行に維持され、これら２表面の第１縁
および第２縁が平行に伸びかつ実質的に上記の第１距離
だけ分離された状態となるためかみ合わせ手段、ならび
に ｂ）第１縁と第２縁の間の空隙を、分離されたアリコー
トの液体と接触させるための接触手段、からなり、上記
の第１距離は液体が上記空隙から毛管作用により第１表
面と第２表面の間を移動して試料と接触するのに十分な
ほど小さいものである、第１表面上の薄片試料を処理す
るための装置。

【００２８】（３） ａ）垂直に広がる状態に配置された材料保有平面を対面
要素の表面から第１距離に保持するかみ合わせ手段であ
って、このかみ合わせ手段が材料保有平面および向かい
合った平面の各下縁が水平に伸び、かつ実質的に平行と
なる、向かい合った平面間の整列を維持するもの、なら
びに ｂ）材料保有平面および向かい合った平面の下縁間の空
隙を液体と接触させるための接触手段からなり、材料保
有平面および向かい合った平面の間の第１距離は、液体
が向かい合った各平面間で毛管作用により少なくとも薄
片材料の高さにまで上方へ移動するのに十分なほど小さ
いものである、平面上の薄片材料を処理するための装
置。

【００２９】上記（１）〜（３）のそれぞれにおいて第
２表面（すなわち対面員子の表面）は第１表面（すなわ
ち材料保有平面）上の薄片状の試料または材料の場合と
同じ処理液が接触している薄片状の試料または材料を保
有してもよい。さらに（あるいは）、複数の表面対の配
列を、液体が毛管作用により各表面対の間隙内へ同時に
引込まれるように配置してもよい。

【００３０】（４） ａ）それぞれ垂直に広がる表面をもつ複数の垂直に広が
るスライド、 ｂ）それぞれ垂直に広がる表面をもつ複数の垂直に広が
るカバー員子（垂直に広がるスライドの各表面は垂直に
広がるカバー員子の表面から０．５ｍｍ以下の第１距離
だけ間隔を置く）ならびに ｃ）垂直に広がるスライドおよび垂直に広がるカバー員
子をそれらの上端に近接した位置で固定した配列に保持
し、その際各スライドの試料面は垂直に広がるカバー員
子の実質的に平行な表面から第１距離にあり、かつ各ス
ライドの下縁は水平に伸び、カバー員子の実質的に平行
な水平に伸びる下縁から第１距離だけ間隔を置いた状態
となるためのかみ合わせ手段からなり、水平に伸びる各
下縁間の間隙は開放されている、スライドアセンブリー
の配列。

【００３１】（５） ａ）水平に広がる硬質の底板、 ｂ）実質的に平らな水平に広がる上面をもつ水平に広が
る弾性員子、および ｃ）水平に広がる上面に対しそれぞれ開放されている、
弾性員子に形成された複数のくぼみからなり、弾性員子
はその上面に、くぼみ内の分離されたアリコートの処理
液が隣接する弾性員子の上面の平面の上方へ広がる凸形
を形成するのに十分なほど処理液と不相容性である材料
を含む、分離されたアリコートの処理液の水平な配列を
保持するための装置。

【００３２】前記のシステム、たとえばジョンソンのシ
ステムは特定の配列の同じ試料を一組の平面（たとえば
顕微鏡用スライド）に施すことはできるが、これらの先
行技術によるシステムは個々のスライドを独自の試薬で
同時に処理しうる融通性をもたない。さらにスライドを
浸漬するのに必要な、容器内の水性または有機の染色液
の体積は、組織もしくは細胞結合抗原また遺伝子配列の
より複雑な分析の特異的工程を、それぞれ抗体指向検出
法または核酸ハイブリッド形成法により経済的に実施す
るためには大きすぎる。この種の特異的工程を伴う多工
程法はいずれも、先行技術によれば、他の工程を実施
し、スライド配列を分解して特異的工程を手動で実施
し、次いでスライド配列を再度組立てて後続の工程を自
動的に実施することによって初めて自動化することがで
きる。このような分解／再組立ては、この種の複雑な分
析に関する自動化の利点を損う。従って、個々のスライ
ド上に固定化された別個の組織または細胞スミアに関す
る多数の別個の分析を同時に、高価な抗体または核酸プ
ローブをわずかにマイクロリットルの量用いて行われる
手動法または自動法が求められており、これが本発明に
より満たされた。

【００３３】本方法は、現在個々の手動操作により別個
の抗原情報または遺伝情報の分析を行っている臨床実験
室または研究室の双方に広く利用されるであろう。

【００３４】スライド対アセンブリーの第１の形態を図
１Ａ，１Ｂ，および１Ｃに示す。図１Ａについて述べる
と、試料を保有する顕微鏡スライド１０は試料保有用前
面１２、第１下縁１４、裏面１６、および上縁１８をも
つ。薄片試料２０（たとえば５〜１０μｍの厚さの組織
学的検体）が前面１２の下部に施されている。スライド
が高さ７５ｍｍ、幅２５ｍｍ、厚さ１ｍｍであるとする
と（顕微鏡スライドについての標準的寸法）、試料は第
１下縁１４の上方少なくとも１．０ｍｍ（たとえば１０
ｍｍ）の位置にあって、２０ｍｍ×２０ｍｍ平方であり
うる。

【００３５】第１スライド１０の前面１２の上方に付着
してシム２２があり、これはこの第１の形態では厚さ
０．２ｍｍ（２００μｍ）の両面接着テープとして示さ
れている。シム２２の一方の粘着面２４が第１スライド
１０の前面の上部に付着する。シム２２の反対側の粘着
面２６は対面要素すなわちスライド３０の対向面３２に
付着する。この形態においては、対面スライド３０も７
５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍの顕微鏡用スライドである。
シム２２は対面スライド３０を第１スライド１０と整列
させた状態に保ち、これにより対面スライドの対向平面
３２は前面１２に平行であり、かつこれからシム２２の
厚さ（２００μｍ）だけ間隔を置き、対面スライド３０
の第２下縁３４は第１スライド１０の第１下縁１４と同
一平面上にあり、対面スライド３０の裏面３６は表面３
２，１２および１６と平行であり、対面スライド３０の
上縁は第１スライド１０の上縁１８と同一平面上にあ
る。

【００３６】２００μｍという距離は、上縁１８と３８
の内縁から前面１２および対向面３２の垂直方向の長さ
に沿って、第１および第２下縁１４および３４の内縁ま
で、実質的に一定である。テープが高さ２５ｍｍである
とすると（その幅はスライド１０および３０の幅２５ｍ
ｍ全体であってもよく、あるいは図示されるようにより
短く、例えば２２ｍｍであってもよい）、前面１２と対
向面３２の間に間隙４０が形成される。この間隙４０
（高さ５０ｍｍ、幅２５ｍｍ、厚さ０．２ｍｍ（２００
μｍ））は下端４２で終わる毛管間隙である。試料２０
はわずか５〜１０μｍの厚さであり、試料２０の高さの
位置においてすら、間隙４０の厚さに対し有意の影響力
をもたない。同様に他の欠陥、閉じ込められた粒子、２
枚のスライドが平行からずれた方向に向くこと、その他
間隙４０に２０％以下の影響を与える因子（すなわち２
００μｍの厚さの間隙を１６０〜２４０μｍの厚さにす
るもの）は不利な影響力をもたず、これよりもわずかに
大きな変動ですら有意に不利な影響力はもたないであろ
う。さらに、この第１の形態の場合、間隙の基本的なま
たは平均的な厚さは０．２ｍｍ（２００μｍ）である
が、０．０５ｍｍ（５０μｍ）程度の小さな間隙、また
は０．５ｍｍ（５００μｍ）程度の大きな間隙も、図４
に関連して以下に述べるように調整された他の寸法（た
とえば高さ）と共に許容される。適宜な状況下では、な
お５０μｍ以下または５００μｍ以上の厚さの間隙も適
切であろう。

【００３７】図１Ｂは前面から見た同一のスライド対ア
センブリーを示す。対面スライド３０（その裏面３６が
前方にある）は第１スライド１０を対面スライド３０の
上縁３８から下縁３４まで完全に覆う。シム２２の粘着
面２６が対面スライド３０の上部の下に見える。試料２
０（試料スライド１０上に固定化されている）は対面ス
ライド３０の下部の下の中央に見える。図１Ｂに示すよ
うに垂直方向に正確に整合することは決定的なものでは
ない。この方向に２ｍｍ（あるいは５ｍｍすら）の不整
合は、有意の不利な影響力をもたない。さらに上記のよ
うに、各幅がすべて等しい（たとえば２５ｍｍ）必要は
ない。

【００３８】図１Ｃは図１Ｂと同じ前面図を示すが、こ
の場合は対面スライド３０の後方が見えるような断面図
である。シム２２の前面２６が目視できる表面の上方２
５ｍｍを占めている。第１スライド１０の前面１２の下
部５０ｍｍ×２５ｍｍ（シム２２の下端４４の下方）が
ここでは目視できる。毛管間隙４０に対し露出している
のはこの５０ｍｍ×２５ｍｍである。試料２０は試料保
有面１２のこの５０ｍｍ×２５ｍｍ部分内の中央に位置
する１０×１０ｍｍ部分を占める。間隙の高さは、シム
としてこれよりも短いかまたは長いテープ片、たとえば
幅２５ｍｍ、長さ（高さ）２０，３０，４０または５０
ｍｍのテープを用いることによって調整できる。

【００３９】図２Ａ，２Ｂおよび２Ｃはスライド対アセ
ンブリーの第２の形態を示す。第１下縁１４、前面１２
を備え、試料２０を保有する第１スライド１０は図１Ａ
の対応する要素に等しい。対面スライド１３０も７５ｍ
ｍ×２５ｍｍ×１ｍｍの顕微鏡用スライドであり、対向
面１３２および第２下縁１３４を備えているが、この場
合シム１２２は下端１４４をもつ４０ｍｍ×２５ｍｍ
（または２２ｍｍ）×０．１５ｍｍのガラス製カバース
リップである。シム１２２の４０ｍｍ×２５ｍｍの第１
面１２４は（図２Ｂにおいて隣接して組立てられた場
合）、第１スライド１０の前面１２の上部に面する。シ
ム１２２の４０ｍｍ×２５ｍｍの第２面１２６は対面ス
ライド１３０の対向面１３２の上部に接着される。

【００４０】対面スライド１３０の裏面１３６に沿っ
て、Ｏリング、圧縮可能な薄板ばねまたはローラーもし
くはソリッドディスク状の上部および下部エラストマー
プロチュバランス１４６および１４８が施され、これら
は勾配付き上部（図示されていない）を備えていてもよ
い。

【００４１】図２Ｂにおいては、図２Ａのスライド対が
スライド１０と１３０を互いに平行に配置し、それらの
上端をホルダー１５０内に形成された高さ３０ｍｍ、幅
２６ｍｍ、厚さ２．４ｍｍの寸法のくぼみに滑り込ませ
ることにより組立てられている。このくぼみは下方へ開
き、その頂部に垂直方向に広がる整合面１５６をもつ。
第１スライド１０および対面要素１３０の上縁１８およ
び１３８は整合面１５６に隣接する。プロチュバランス
１４６および１４８は、ホルダー１５０に形成されたく
ぼみの裏壁内に垂直方向に広がる下開きスロット１５２
内にかみ合わせられ、これにより対面要素１３０の上部
およびシム１２２全体を第１スライド１０の上部に押し
つける。このかみ合わせ手段の組合わせによって、第ス
ライド１０および対面スライド１３０が平行に、シム１
２２の厚さ（０．１５ｍｍ）、スライド１０および１３
０の幅（２５ｍｍ）、ならびにシム１２２により覆われ
ていない高さ（３５ｍｍ）の間隙をもって整合される。
下縁１４と１３４は同一の高さにあり、互いにシムの厚
さ（すなわち０．１５ｍｍ）と実質的に等しい距離だけ
の間隙を保つ。

【００４２】図２Ｃは図２Ｂの線２Ｃ−２Ｃに沿って得
た図２Ｂの上面図である。この断面図においては、プロ
チュバランス１４８がスライドホルダー１５０内にくぼ
み内の下開きスロットとして切込まれたスロット１５２
の内側に見える。プロチュバランス１４８はスロット１
５２に押付けられ、対面要素１３０の反対側に接着され
たシム１２２を圧迫する。これによって、ホルダー１５
０により適所に保持された第１スライド１０の上部に圧
力が与えられる。こうして対面スライド１３０と第１ス
ライド１０の上部が接触状態に保たれ、下方へ垂直に懸
垂される。スロット１５２は下方へ開くので、対面スラ
イド１３０および第１スライド１０はスロット１５２が
プロチュバランス１４６および１４８に与える案内作用
によって、容易にホルダー１５０に挿入し、これから取
出すことができる。

【００４３】図２Ｄおよび２Ｅは第３の形態であり、プ
ロチュバランス１４６′および１４８′がこの場合、対
面要素１３０の裏面１３６上ではなくホルダー１５０′
内のくぼみの内側に配置されるという点で図２Ａの場合
と異なる。

【００４４】図２Ｄについて述べると、試料保有用の顕
微鏡スライド１０は第２の試料保携用の顕微鏡スライド
１３０′およびその試料保有面１３２′に面した試料保
有前面１２をもつ。試料保有用の顕微鏡スライド１０上
の薄片試料２０は対向する試料保有スライド１３０′上
の試料１２０′の反対側に存在する。

【００４５】図２Ｅについて述べると、試料保有スライ
ド１０および１３０′はそれらの上部に押しつけられた
エラストマープロチュバランス１４６′および１４８′
の圧力によってホルダー１５０′内のくぼみの適所に保
持されている。シム１２２′はそれらの上部にはさまれ
ている。第２の試料保有スライド１３０′の試料保有面
１３２′上に固定化された試料１２０′は、適所に保持
された各試料保有面が近接並置されることにより生じた
間隙内に、試料４０からみて間隙４０を横切って反対側
に、シム１２２′に対するプロチュバランス１４６′お
よび１４８′ならびに２枚の試料保有スライド１０およ
び１３０′の上部にあるホルダーの圧力により保持され
る。

【００４６】図３Ａおよび３Ｂはスライド２５対の配列
を整列させ、使用する方式を示す。図３Ａには、スライ
ド５対１列が示されている。各対の第１スライド（１０
ａ，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄおよび１０ｅ）はシムによ
って第２すなわち対面スライド（２３０ａ，２３０ｂ，
２３０ｃ，２３０ｄおよび２３０ｅ）から一定の距離を
置く。垂直方向の整列はホルダー２５０の底面に形成さ
れた５個のくぼみの上縁（２５６ａ，２５６ｂ，２５６
ｃ，２５６ｄおよび２５６ｅ）により維持される。

【００４７】こうしてシムの厚さをもつ垂直に広がる間
隙が図２Ａおよび２Ｂに関連して先きに示したように形
成され、これらはそれぞれ第１スライドおよび対面スラ
イド１０ａ／２３０ａ，１０ｂ／２３０ｂ，１０ｃ／２
３０ｃ，１０ｄ／２３０ｄおよび１０ｅ／２３０ｅの整
合した第１下縁と第２下縁の間の下部空隙４２ａ，４２
ｂ，４２ｃ，４２ｄおよび４２ｅにおいて終結する。下
縁のすべての組は共通の水平面にあって、ホルダー２５
０の下面の下方一定の距離にある。

【００４８】液滴保持器はこの水平面の下方に位置し、
硬質の支持体６２および水平に広がる弾性員子６４から
なる。図３Ａに示すように、５個の孔６６ａ〜６６ｅが
弾性員子６４内に形成され、これらの孔はそれぞれ一定
容積（たとえば１５０μｌ）の分離したアリコートすな
わち液滴６８ａ〜６８ｅで満たされる。のちにより詳細
に述べるように、各液滴６８ａ〜６８ｅは弾性員子６４
の上面から突出している。スライドホルダー２５０が下
降すると、下部空隙４２ａ〜４２ｅにそれぞれ液滴６６
ａ〜６６ｅが接触するように整合される。液滴は普通は
上方から（たとえばマイクロピペット装置により）導入
されるが、硬質の支持体６２に形成された狭い通路によ
って下方から導入することもできる。同様な液滴保持器
が図７に示されている。

【００４９】図３Ｂには、２列の液滴５組６８ａ〜６８
ｙおよび６９ａ〜６９ｙを含む弾性員子６４が示されて
いる。スライド１０ａ〜１０ｅおよび対面スライド２３
０ａ〜２３０ｅの断面を見ると、これらが液滴６８ａ〜
６８ｅおよび６９ａ〜６９ｅに接触することが認められ
る（たとえば下部空隙４２ａは下部空隙４２ａの２末端
付近の液滴６８ａおよび６９ａと接触するであろう）。

【００５０】１列のスライド対１０ａ／２３０ａ〜１０
ｅ／２３０ｅが液滴６８ａ〜６８ｅおよび６９ａ〜６９
ｅに接触するのに伴って、５対のスライドのうちの他の
４列それぞれを、それぞれ２）液滴６８ｆ〜６８ｊおよ
び６９ｆ〜６９ｊ、３）液滴６８ｋ〜６８ｏおよび６９
ｋ〜６８ｏ、４）６８ｐ〜６８ｔおよび６９ｐ〜６９
ｔ、ならびに５）６８ｕ〜６８ｙおよび６９ｕ〜６９ｙ
に接触するように整合させることができる。第１スライ
ド、対面スライド、従って下部空隙はすべて共通の水平
面内に正確に整合して保持され、弾性員子６４は液滴の
配列全体を共通の水平面内に正確に整合させて保持する
ので、それぞれ第１スライドおよび対面スライドの第１
下縁と第２下縁の間の下部空隙それぞれを再現性をもっ
て液滴２個に接触させることが可能である。さらにのち
に述べるように、液滴６８ａ〜６８ｙと６９ａ〜６９ｙ
が分離されていることにより、各第１スライド上の試料
を施される処理液に関してそれぞれ他の第１スライドと
同様に、あるいは異なって処理する融通性が得られる。

【００５１】次いで図３Ｃには、孔６６ａ中の液滴が接
触する空隙４２ａ（スライド１０ａおよび２３０ａの第
１下縁１４ａと第２下縁２３４ａの間）の効果が示され
る。液体の毛管７０ａは毛管作用により毛管間隙２４０
（図１Ａの間隙と同じ）中を上昇する。この作用は液体
と弾性員子６４の表面との相対的な不相容性によって高
められる。たとえば水性液滴は弾性員子６４の疎水性表
面によって撥水される。またこのような不相容性（員子
６４に用いられる弾性材料の平面上に置かれた場合、処
理液がビーズ状となることにより証明される）によっ
て、液滴が員子６４の上面の上方に立ち上がる。

【００５２】毛管７０ａが毛管作用の及ぶ限り上昇した
のち（上記の０．１５ｍｍの間隙において一般に約３０
〜４０ｍｍ）、スライドアセンブリーをホルダー２５０
により弾性員子６４から離して持ち上げることができ
る。各スライド対（たとえば１０ａ／２３０ａ）はその
下部空隙（たとえば４２ａ）が接触していた液滴（たと
えば６８ａおよび６９ａ）から受け取った処理液を毛管
作用により保持するであろう。液体が間隙内に任意の時
間滞留したのち、スライドアセンブリーを次いで図３Ｄ
に示すように吸収材料７２上へ下降させる。液体はスラ
イド１０ａおよび２３０ａの表面よりも吸収材料７２の
方とより相容性であるため、ここで毛管７０ａは下降
し、処理液は下側および外側へ液体前面７４ａとして吸
収材７２内へ広がる。数秒以内に、恐らく試料に、ある
いはスライド間隙２４０または下縁１４ａ、２３４ａに
付着している可能性のある少量を除いて、スライド対は
この毛管作用により本質的に完全に液体が排除されるで
あろう。液体がスライド間隙２４０から排除されると、
スライド対を次の工程のために他の液滴保持器に、また
は処理液のシートもしくは浴に移動させることができ
る。

【００５３】図４は図１Ｃの場合と同様に、１枚の７５
ｍｍ×２５ｍｍのスライド上に３個の垂直に広がる試料
保有面が形成された形態を示す。スライドはその７５ｍ
ｍの下縁３１４を水平にして広がる。高さ２５ｍｍ、幅
２ｍｍおよび厚さ０．２５ｍｍの２枚の外側シムが前面
（７５ｍｍ×２５ｍｍ）上に垂直に広がる。２枚の内側
シム３２２′は同様に２５ｍｍ×２ｍｍ×０．２５ｍｍ
の寸法をもち、外側シムから等しい間隔を置き、これら
に平行である。これらのシム３２２および３２２′は熱
硬化性材料（たとえばエポキシまたはシリコーン）をガ
ラススライドの表面に施すことにより形成できる。従っ
て被覆されていない隔離された面は３１２ａ，３１２ｂ
および３１２ｃであり、それぞれ下縁３１４から上方へ
２５ｍｍ広がり、幅がそれぞれ約２２．３３ｍｍであ
る。対面スライドをこの第１スライド上に乗せ、これに
より厚さ０．２５ｍｍ、高さ２５ｍｍおよび幅２２．３
３ｍｍの間隙が面３１２ａ，３１２ｂおよび３１２ｃ上
に形成されるであろう。下縁３１４に隣接したこれらの
面それぞれの下部空隙を処理液に接触させ、次いで吸収
材料に接触させることにより、液体試薬を前記のように
それぞれの間隙に引込み、かつここから排出することが
できる。この種のスライド対を手動により液滴に施し、
あるいは処理液の浴またはシートに施すことができる。

【００５４】あるいは、それぞれ３個の垂直に広がる毛
管間隙を備えた一連のこの種の水平に広がるスライド対
を、たとえば米国特許第４，１９９，６１３号明細書
（ジョンソン）の図１に示すスライドラックを用いて、
各試料保有スライドの下縁３１４が処理液の液滴または
シートと接触しうる状態にしておくのに必要な変更を行
って、ホルダー内に保持しておくことができる。この形
態の場合、ジョンソンの“シム”は試料スライドとその
相手の対面スライドの間に配置されてこれらの間に毛管
間隙を形成するのではなく、むしろ対面スライドおよび
試料保有スライドの横両端および外表上に位置し、対面
スライドおよび試料保有スライドを前記のシム３２２に
押しつけることによりこれらを互いに押しつける。この
形態においては、図４のシム３２２および３２２′は対
面スライドと試料保有スライドの間の毛管間隙の第１距
離を定める唯一の部品であろう。

【００５５】次いでホルダー内のくぼみの側壁の厚さが
対面スライドと試料保持スライドの平行な各対を分離す
る第２の距離を定めるであろう。この第２の距離は毛管
作用のために設定されたものではなく、各組のスライド
対を分離し、これにより図３Ａおよび３Ｂに示すように
液体試薬が分離された液滴から毛管間隙を通ってこれら
へ引込まれるためのものである。この第２の距離は２ｍ
ｍ以上のいかなる厚さであってもよく、これはジョンソ
ンのシムの２００ミクロンまたは本発明のシムよりも著
しく厚い。この第２の距離、従ってスライドホルダー内
の下開き式のスライド用くぼみの縁を形成する側壁の好
ましい厚さは、５〜７ｍｍである。この範囲を採用する
と、最大数のスライドを隣接スライド対間に毛管間隙か
ら液体試薬を引上げ、インキュベートし、そして排除す
る目的で、スライドホルダー内へはめ込むことができ
る。

【００５６】この第２の距離範囲により図３Ａ中の隣接
毛管間隙、たとえば４２ａおよび４２ｂを７〜９ｍｍ離
した状態に維持することができる。この距離では、液滴
保持器中の個々の液滴、たとえば６８ａおよび６８ｂと
６９ａおよび６９ｂ（図３）を、弾性員子６４の表面と
液滴保持具中の個々の液滴との不相容性が不注意に克服
されて相互に混入することなしに、離しておくことがで
きる。このような利点はジョンソンのスライドラックに
よっては不可能であろう。その場合、２００ミクロンは
液滴保持器上の隣接する試薬液滴を安定に分離しておく
ためには近すぎる。従ってジョンソンのスライドラック
は、本発明の利点を達成するためにはそのもとの記述か
ら完全にかつ本質的に修正されなければならないであろ
う。

【００５７】液体を下縁３１４から１５〜２０ｍｍ上方
へ上げるためには、間隙（シム３２２および３２２′の
厚さ）は最初の各形態（それらの場合、液体は下縁１４
の上方へ２５〜４５ｍｍ上昇することを意図する）にお
いて最も好ましい０．１５〜０．２０ｍｍの厚さよりも
大きくてよい。ルーテイン実験により、試料保有スライ
ド面に対し液体を目的とする高さまで垂直に上昇させる
ために、間隙を調整することができる。

【００５８】図５は第５の形態によるスライド対で一部
充填されたホルダーを示す。これはスライド５対の５列
ではなくスライド１０対の３列を供給するという点で、
特に図３Ａおよび３Ｂに示した第２の形態と異なる。

【００５９】図５に示したスライドホルダーの本体４５
０は、後記のようにその下面にスライド対アセンブリー
を受容するために形成された一連のスロットを備えてい
る矩形の立体状である。

【００６０】あるいは、下面に形成された一連のスロッ
トがたとえばジョンソンの米国特許第４，１９９，６１
３号明細書、図１のスライドラック（その場合、“シ
ム”は有意により厚く、スライド対アセンブリーを分離
するために用いられ、毛管作用を生じるために用いられ
るのではない）の実質的な変形を採用してコラプシブル
であり、スライド対アセンブリーの上部に締めつけられ
るホルダー内にスライド対を保持してもよい。

【００６１】図５においてスライドホルダーはスライド
対の挿入のためその使用時の配置と比較して逆転してい
るので、この下面が上部に現われている。以下の記述に
おいては、使用時の相対配置（たとえば下面のスロッ
ト）を記述する。

【００６２】プレート４５１は本体４５０の上方に（フ
ランジとして）両水平方向にあり、これにより本体４５
０の矩形の断面積よりも大きな矩形の断面積を覆う。ア
ーム４７６はプレート４５１の一方側から垂直に上方へ
伸び、傾斜した部分２か所４７８および４８０をもつ。
同様なアーム４７６（傾斜した部分４７８および４８０
をもつ）がプレート４５１の反対側から垂直に上方へ伸
びているが、視野から隠されている。水平な棒４８２が
これら２本のアーム４７６を結びつけている。本体４５
０の下面に１０個の長いスロットが形成され、それぞれ
垂直に、かつ水平な棒４８２に対し水平方向に９０°の
角度で伸びている。これら１０個の長いスロットはそれ
ぞれ間仕切により３個のスロットに分割され、合計３０
個のスロットとなる。図５において最も近い３個のスロ
ットは４５５ｊ，４５５ｔおよび４５５ｄｄと表示さ
れ、これらのスロットはそれぞれ１０個のスロットの列
の近い方の末端にある。試料保有スライド１０ａ，１０
ｋおよび１０ｕは３列それぞれの遠い方の末端にあるス
ロットから外側へ伸びた状態で示される。対面スライド
４３０ｕにより示されるように、対面スライドは各試料
保有スライドと共に共通のスロットに挿入される。各試
料保有スライドおよび隣接する対面スライドが間隙の下
端を定める。これらはそれぞれスライド１０ａ，１０ｋ
および１０ｕにつき下端４４２ａ，４４２ｋおよび４４
２ｕとして示されている。各スライド対は断面において
は実質的に図２Ｂに示したとおりである。

【００６３】試料保有スライド３０枚を処理したい場
合、図５に示す残りのスロット（スロット４５５ｊ，４
５５ｔおよび４５５ｄｄまで）を満たし、スライドホル
ダー全体を逆転させる。種々のスライドを監視するため
に、視覚的にまたは機械で読取ることができるしるしが
存在してもよく、または施してもよく（たとえば試料か
ら離れた各スライドの艶消し部分に）、これにより処理
の前後に読取ることができ、あるいは（しるしが適所
に、たとえば試料の位置の真上に配置されている場合）
スライドがホルダー内にある場合にも読取ることができ
る。さらにホルダーに番号をつけて、ホルダーから個々
のスライドを取出さずにその位置づけをするのを容易に
し、またスライド対アセンブリーが相互作用する液滴保
持器（図３Ｂおよび図７に示す）の特定の孔を表わす対
応番号を施すことにより試薬の取扱いを容易にする。

【００６４】次いで、ブラケットと水平な棒４８２およ
びアーム４７６とのかみ合わせによりスライドアセンブ
リーが保持され整合される（垂直方向および水平方向
に）まで、アーム４７６の傾斜した部分４７８に沿っ
て、水平な棒４８２の幅をもつブラケット中へ下降させ
る。この時点で機械はアセンブリーを後記のように一連
のステーションに導通することができる。あるいはホル
ダーの水平な棒４８２を手動によりかみ合わせ、これに
より前進させることもできる。

【００６５】図６は本発明を実施するための自動化され
たシステムの内部の平面図を示す。これはフィッシャー
８６カタログ（フィッシャー・サイエンティフィック，
１９８５年）の４２６頁に示されたヒスト・マチック
（ＨＩＳＴＯＭＡＴＩＣ、登録商標）スライドステイナ
ー（１７２型）の内部と類似し、これを本発明の実施の
ために改造したものである。

【００６６】図６は完全に組立てられた図５のスライド
配列を後記のように連続操作により浸漬しうるステーシ
ョンの配列を示す。ステーション１〜６（数字５０１〜
５０６）は、この配列様式の場合、ヒストマチック・ス
ライドステイナー、１７２型（１１５Ｖ、６０Ｈｚ変
型）についてこれまで用いられている一般型の染色容器
を含む。フィッシャー８６カタログ、４２６−２７頁
（フィッシャー・サイエンティフィック、１９８５年）
を参照されたい。各容器は液体（キシレン、エタノー
ル、エタノール／水混合物、または蒸留水、図面に示
す）のプールを保有し、上部断面積は図５の各スライド
対の下端の配列よりも大きい。このような幾何学的形状
により、この配列が容器のへりに打ち当たることなく各
プールと接触しうる。同様にステーション８（数字５０
８）、１０（数字５１０）、１２（数字５１２）および
１７（数字５１７）は後記の組成の染色容器を含む。

【００６７】ステーション７（数字５０７）は標準的な
電熱器により３７℃±５℃に維持され（後記のように閉
じたのち）、室内のスライド配列の最下水平面が達する
高さよりも下方に水のプールが置かれているため水蒸気
で飽和されている湿潤室である。この湿潤室の上部は図
５のスライド配列よりも大きく、ただし図５のフランジ
４５１よりも小さな水平寸法をもつ（長方形または正方
形）。従ってステーション８（数字５０７）の湿潤室内
へ図５のスライド配列４５０を下降させると、フランジ
４５１（図５に示す）が湿潤室の閉鎖を完結する。

【００６８】ステーション９および１１は、スライド配
列を適宜なステーション中へ下降させたときスライド配
列の下部空隙（図２Ｄの４２ａ参照）が同時に接触する
のに十分な高さでありかつ水平である上面を備えた乾燥
用ブロッター（吸収材料）、たとえば紙、木綿または超
吸収性のガーゼパッドを含む。この場合、スライド配列
がブロッター材料を短距離だけ押し下げてもよい。

【００６９】ステーション１３，１４，１５および１６
（数字５１３，５１４，５１５および５１６）は図３Ａ
および３Ｂの素子６２および６４と同様な液滴保持器を
含む。ただし孔および液滴は１０個ずつ２重の３列に配
列されている。たとえばステーション１３（数字５１
３）においては、スライド１０枚の最上列は図３Ａおよ
び３Ｂに示した液滴６８ａ〜６８ｅおよび６９ａ〜６９
ｅについて述べたと同様な様式で、同時に液滴４６８ａ
〜４６８ｊおよび４６９ａ〜４６９ｊと接触するであろ
う。液滴４６８ｋおよび４６９ｋで始まる第２の２重列
には第２列のスライド１０対の下部空隙が同時に接触す
るであろう。液滴４６８ｕおよび４６９ｕで始まり、液
滴４６８ｄｄおよび４６９ｄｄで終わる第３の２重列に
は、スライド対配列がステーション１３（数字５１３）
に下降したとき第３列のスライド１０対が同時に接触す
るであろう。

【００７０】同様にステーション１４（数字５１４）、
１５（数字５１５）および１６（数字５１６）は、それ
ぞれ液滴１０個の２重の３列（各ステーションに６０個
の液滴）を正確な配列で保有する液滴保持器をそれぞれ
含む。図６の下列はステーション１４の場合は液滴５６
９ｕ〜５６９ｄｄ、ステーション１５の場合は６６９ｕ
〜６６９ｄｄ、ステーション１６の場合は７６９ｕ〜７
６９ｄｄと表示される。ステーション１８は図６に示し
た配列の場合、空である。追加の処理工程を希望する場
合、これは他の上記のステーションと同様に適宜、染色
容器、液滴保持器、または温度浴を含むことができる。

【００７１】洗浄器５１９はヒストマチック・スライド
ステイナー１７２型と共に供給される、スライド配列洗
浄用の標準ユニットである。これは１回貫流式のリンス
液、または再循環式の処理液を備えている。後者の様式
が一般に本発明に採用される。実際に作動する際、この
ユニットはソレノイドにより改造され、スライド配列が
洗浄器内にある場合にのみリンス液の再循環流を供給
し、機械が貫流式で操作される場合のように連続排液さ
れる代わりに排液を行わない。乾燥器５２０は本発明に
おいては一般に使用されないステーションである（ブロ
ッティング（吸取り）ステーション５０９および５１１
を用いるため）が、存在することが好ましく、これによ
り上記の１７２型スライドステイナーと共に市販される
標準４０区画スライドホルダーを用いた場合、垂直に広
がり、他から０．５ｍｍ以上の距離（たとえば２．０ｍ
ｍ）分離して配列されたスライドの通常の染色にもこの
機器を使用しうる。

【００７２】本発明の融通性は、すべての染色容器、液
滴保持器、および湿潤室を完全に取り除き、使用者の自
由裁量で交換できるという事実により示される。従っ
て、たとえばステーション１３，１４，１５および１６
（図６の数字５１３，５１４，５１５，５１６）は機器
の作動中ですら容易に、すべてのスライド対アセンブリ
ーを等しい試薬で処理するための浅い共通試薬のトレー
と、またはこれらを排液するための追加のブロッター
と、またはこれらをインキュベートするための湿潤室と
交換することができる。本方法の融通性はさらに、組織
切片を抗体に対する抗原部位に関連するもので染色する
ための下記の具体的方法により示される。下記の染色法
のログは前記の図６中の数字を示す。ログに続いて個々
の工程数種についての考察、および下記の３種の異なる
タグを使用するためにこの手順をいかに変化させるかに
ついての考察を示す：アビジン−ビオチニル化ワサビ
（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）パーオキシダーゼ複合体、
ヤギ抗マウス抗体に結合したアルカリホスファターゼ、
ならびに初期プローブとして一次ビオチニル化ヘテロ一
次抗体、未標準単クローン抗体、またはビオチンに結合
したＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖〔ワード、ワイルドロップ
およびラングナーの欧州特許出願第６３，８７９号（１
９８２年１１月３日、米国特許出願第２５５，２２３号
に基づく）、あるいはワード、リーリイおよびブリガテ
ィの国際特許出願８４／０４９７０号（１９８４年１２
月２０日、米国特許出願第５０３，２９８号に基づく）
による；両出願ともエール大学に譲渡〕米国化学アカデ
ミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）８
０巻、４０４５−４９頁（１９８３年）；バイロロジ
ー、１２６巻、３２−３６頁（１９８３年）も参照され
たい。

【００７３】染色の手順は、ホルマリン固定されたのち
ろうに包埋された組織塊から切り取られた薄い（たとえ
ば厚さ５μｍ）組織切片〔たとえばヒストマチック２６
６ＭＰ型組織処理装置（フィッシャー・サイエンティフ
ィック）（米国特許第４，１４１，３１２号、ラウダ
ー、１９７９年２月２７日発行）による〕から始まる。
各工程を以下に番号、ステーション（および図６中に対
応する数字）、時間、および溶液もしくは他の処理によ
り記述する。

【００７４】 ステーション 時 間 工程 （図６の数字） （ 分 ） 溶液または他の処理 １Ａ １（５０１） １．０ キシレン １Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ２Ａ １（５０１） １．０ キシレン ２Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ３Ａ １（５０１） １．０ キシレン ３Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ４Ａ ２（５０２） ０．６ キシレン １７Ｂ ７（５０７） ６０ ３７℃湿潤室 １７Ｃ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り １８Ａ Ｒ（５１９） ２．０ 緩衝液 １８Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り １９Ａ Ｒ（５１９） １．０ 緩衝液 １９Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り ２０Ａ １６（５１６） ０．６ アビジン＆ビオチン−アルカリホス ファターゼ複合体 ２０Ｂ ７（５０７） １０ ３７℃湿潤室 ２０Ｃ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ２１Ａ Ｒ（５１９） ０．６ 緩衝液 ２１Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り ２２Ａ Ｒ（５１９） ２．０ 緩衝液 ２２Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り ２３Ａ １７（５１７） ０．６ ＢＣＩＰ＆ＩＮＴ（酵素試薬） ２３Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り ２４Ａ １７（５１７） ０．６ ＢＣＩＰ＆ＩＮＴ ２４Ｂ ７（５０７） １０ ３７℃湿潤室 ２４Ｃ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ２５Ａ １７（５１７） ０．６ ＢＣＩＰ＆ＩＮＴ ２５Ｂ ７（５０７） １０ ３７℃湿潤室 ２５Ｃ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ２６Ａ Ｒ（５１９） ２．０ 緩衝液 ２６Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り ２７Ａ ８（５０８） ６．０＊ （ヘマトキシリン染色ハリス） ２７Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ２８Ａ １０（５１０） ０．６ トライトンＸ−１００（０．０１％ ）（蒸留水中） ２８Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ２９Ａ １２（５１２） ０．１ 酸アルコール（ヘマトキシリンを分 別する） ２９Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り ３０Ａ Ｒ（５１９） ２．０ 緩衝液（ブルーヘマトキシリンｐＨ ７．５） ３０Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り ３１ ６（５０６） ０．６ トライトンＸ−１００（蒸留水中） ４Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ５Ａ ３（５０３） ０．２ 試薬用アルコールまたは無水アルコ ール ５Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ６Ａ ３（５０３） ０．２ 試薬用アルコールまたは無水アルコ ール ６Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ７Ａ ４（５０４） ０．６ ９５％エタノール ７Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ８Ａ １２（５１２） ５．０ 酸アルコール ８Ｂ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り ９Ａ ５（５０５） ０．２ ３０％エタノール ９Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り １０Ａ ６（５０６） ０．２ トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ^TM）Ｘ− １００（０．１％）（蒸留水中） １０Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り １１Ａ ６（５０６） ０．２ トライトンＸ−１００（０．１％） （蒸留水中） １１Ｂ １１（５１１） ０．２ 吸取り １２Ａ Ｒ（５１９） １．０ 緩衝液（０．１ＭトリスＨＣｌ，０ ．１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５， ０．０１％トライトンＸ−１００） （再循環式） １２Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り １３Ａ＊＊ １３（５１３） ０．６ 酵素消化液 １３Ｂ＊＊ ７（５０７） ２．０ ３７℃湿潤室 １３Ｃ＊＊ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り １４Ａ＊＊ Ｒ（５１９） ２．０ 緩衝液 １４Ｂ＊＊ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り １５Ａ １４（５１４） ０．６ ０．２５％ゼラチン（０．１Ｍトリ ス ＨＣｌ，０．１Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ７．５中） １５Ｂ ７（５０７） ２．０ ３７℃湿潤室 １５Ｃ ９（５０９） ０．６＊ 吸取り １６Ａ Ｒ（５１９） ０．６ 緩衝液 １６Ｂ １１（５１１） ０．６＊ 吸取り １７Ａ １５（５１５） ０．６ （ビオチン標識）一次抗体） ＊ 指示した吸取り工程それぞれにつき、機械の制限に
より０．６分（３６秒）を用いた。再プログラミンによ
り大部分の吸取り工程は１２〜１８秒に短縮されるであ
ろう。

【００７５】＊＊工程１３Ａ−１４Ｂは、組織の目的抗
原部位を露出するために蛋白質消化工程（たとえばプロ
ナーゼ、トリプシンまたはペプシンによる；それぞれ適
宜な緩衝液および補助因子を用いる）が必要とされる方
法にのみ必要である。薄い組織試料を用いる作業にはこ
の種の工程は一般に必要なく、従ってこれらの工程を省
略し、ステーション１３の液滴保持器の代わりに０．１
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６））および０．１Ｍ・Ｎａ
Ｃｌ中の１％ウシ血清アルブミンを保有する平たい槽と
交換した。

【００７６】上記の処理全体を考えると、工程１〜７お
よび９〜１２はワックスを除去し、緩衝化された水性媒
質に変換するものである。凍結試料が薄い試料にスライ
スされている場合、工程１〜７および９は不必要である
（ワックスは存在しないから）。界面活性剤が工程１
０，１１および１２に含まれ、比較的粘稠な液体の毛管
流が生じるのを容易にする。工程８は組織の内生アルカ
リホスファターゼ活性を遮断するために採用される。他
の酵素を用いる場合（すなわち工程２０で）、異なる内
生酵素遮断処理が採用されるであろう。工程２０で酵素
としてパーオキシダーゼを用いる場合、過酸化水素０．
９％を含む無水メタノールが工程８のためのステーショ
ン１８における溶液として用いられるであろう。ステー
ション１２の酸アルコールはなお工程２９で用いられる
であろう。凍結切片を処理するためには、スライドをま
ず冷アセトン中で１０分間固定し、次いで蒸留水中の
０．０１％トライトンＸ−１００に０．６分間浸漬し
（ステーション１０）；０．６分間吸取り（ステーショ
ン１１）、酸アルコールで処理して内生アルカリホスフ
ァターゼ酵素活性を遮断し（ステーション１２）、次い
で工程１３に始まる上記の残りの染色プログラムを行
う。

【００７７】前記の工程１３および１４組織内の自動抗
原の大部分にとって不必要であるが、到達困難な抗原性
マーカー、たとえば組織結合性イムノグロブリン、ケラ
チン、ウイルス性抗原たとえばサイトメガロウイルス、
アデノウイルスおよび肝炎Ｂウイルスの表面抗原および
コア抗原に、ならびに核酸プローブを用いる方法には採
用されるであろう。

【００７８】工程１５は一般蛋白質を大部分の組織検体
に見出される非特異性蛋白質結合部位に付着させるもの
である。これらの部位を遮断させないと、工程１７およ
び２０において一次抗体またはアビジンもしくはビオチ
ン−酵素複合体の非特異的付着による望ましくないバッ
クグラウンド水準を与えるであろう。工程２０において
二次抗体（たとえば一次抗体が未標識マウス単クローン
抗体である場合、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マ
ウス免疫グロブリン抗体）をアビジン−ビオチンアルカ
リホスファターゼ複合体の代わりに用いる場合、工程１
５における非特異性蛋白質、たとえばゼラチンの遮断作
用は二次抗体の非特異性結合を排除するのには不十分で
あろう。従って工程２０で用いられる二次抗体と同一種
の正常（感作されていない）血清（すなわち前記の場合
は感作されていないヤギ血清）を用いることができる。
ＤＮＡプローブの作業には非特異性ＤＮＡおよび蛋白質
を工程１５に施すことが望ましいであろう。

【００７９】工程１７は目的とする抗原部位を標的とす
るために用いられる一次抗体を提供する。一般にこれは
ビオチン標識されているが、二次抗体を工程２０で用い
る場合は未標識抗体を工程１７で用いてもよい。あるい
は一次抗体が放射性標識または蛍光標識されていてもよ
い。適切な前処理工程が行われるならば、ＤＮＡまたは
ＲＮＡプローブ（たとえばビオチン標識されたもの）を
工程１７に用いることもできる。このような場合、これ
らを施したのち、スライドアセンブリーを変性するのに
十分なほど高い温度（例えば１００℃）の室内に数分間
入れたのちハイブリッド再形成のために３７℃の湿潤室
（工程１７Ｂ）に入れるべきである。上記の方法におい
て工程１８および１９で表わされる洗浄工程は、回数お
よび期間、ならびにＤＮＡプローブ用液体の種類を著し
く拡大することができる。たとえば米国特許第４，５３
３，６２８号明細書（マス、１９８５年８月６日）およ
びそこに引用された参考文献を参照されたい。

【００８０】工程２０は前記のように一次抗体に化学的
に結合したビオチンを検出試薬（たとえば四価卵白結合
性蛋白質であるアビジンによる酵素）に化学的に結合し
た第２ビオチン部分に架橋させるものである。アビジン
（ベクター・ラブズからの卵白アビジンはその安定性が
良好であるため、ストレプトアビジンよりも使用され
る。適切な前処理を行うならば、他のビオチン標識され
た検出系たとえばワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）ま
たはβ−ガラクトシダーゼとビオチンの結合体も使用で
きる。ＨＲＰはアルカリホスファターゼを用いて得られ
る発色性の酵素反応生成物〔たとえば３−ブロム−４−
クロル−５−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）およ
びインドニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）もしくはニト
ロブル−テトラゾリウム（ＮＢＴ）〕よりも確実に組織
内で結合する発色性の酵素反応生成物（たとえばジアミ
ノベンジジンテトラ塩酸塩の重合生成物）を形成すると
いう利点をもつ。アルカリホスファターゼ発色体の付着
はステーション６および１０でトライトンＸ−１００を
除き、機器を直接に他の２回の蒸留水中でのリンスサイ
クルへ進めることにより高められる（ステーション１０
およびこれに続く吸取りステーション１１）。次いでア
ンモニア水の浅いトレーを入れたステーション１８へス
ライドを移す。次いでスライドを０．１ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）および０．１Ｍ・ＮａＣｌ中４００ｍｇ
／ｍｌでポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−４０）に直接
に固定する。しかしＨＲＰは工程２３〜２５で必要とな
る酵素反応体が光に対して不安定であり、発癌性をもつ
疑いがあるという欠点をもつ。従って、ＨＲＰを用いる
場合は新鮮な試薬を調製してステーション１７に入れる
までプログラムを工程２１または２２で停止することが
好ましい。次いでプログラムを手動により再開する。こ
の時間は工程２４Ｂおよび２５Ｂのインキュベーション
時間を短縮することにより補償される。さらにこの酵素
反応生成物はスライドを工程３１ののちステーション
６，５，４，３および２へと戻し（工程１〜７および９
の逆の順序）、その際幾つかのステーションで多数回接
触させ、各接触ののち吸取るのに十分なほど不溶性であ
る。得られた染色試料を次いでキシレンで被覆すると、
たとえばパーマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ、登録商標）
マウンド剤でドライマウントできる状態になる。

【００８１】あるいは工程２０で蛍光性タグ、たとえば
アビジン−フルオレセイン結合体を用いることもでき
る。この場合、工程２３〜２６は不必要である。

【００８２】工程２３〜２５は工程２０で導入された酵
素タグ（アルカリホスファターゼ）と共に不溶性発色体
を生成するのに適した酵素試薬（ＢＣＩＰ＋ＩＮＴ）を
供給する。工程２７，２９および３０は、標識抗原部位
が見出される組織を核視覚化（ｎｕｃｌｅａｒ ｖｉｓ
ｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）するための対比染色（ｃｏｕｎ
ｔｅｒｓｔａｉｎ）としてのヘマキシリンを施し、発色
させる工程である。

【００８３】上記の方法において工程１７および２０は
特に高価な試薬を用いるので、それぞれステーション１
５および１６で液滴保持器を用いて行う。このような液
滴保持器は、すべての液滴が同一であってもこれらの試
薬を控え目に使うために普通に用いられ、これによりす
べての試料がこの工程で同等に処理される。しかし多く
の場合、特にステーション１５の一次抗体に関して、こ
れらの液滴保持器で個別化する必要がある。図７に示す
一部充填された液滴保持器は、異なる液体を希望するい
かなる様式でも液滴として施すのが可能であることを示
す。

【００８４】水平に広がる硬質の底板４６２が水平に広
がる弾性因子４６４を与える。６０個の孔が員子４６４
全体に１０個の２重３列に設けられている。

【００８５】第１の２重列は第１処理液の液滴２０個で
満たされている（４６８ａ，４６８ｊ，４６９ａおよび
４６９ｊを含む）。第２および第３の２重列の孔（４６
６ｋ，４６６ｔ，４６６ｕおよび４６６ｄｄを含む）は
空である。これらを所望により第２および第３の処理液
で満たし、第１列の液滴が第１列のスライド対に施され
る間に異なるスライド対に施されてもよい。

【００８６】工程１３で酵素消化を採用する場合、液滴
保持器をステーション１３（図６の５１３）にも使用で
きる。この工程での個別化は、この時点で消化の様式ま
たは程度を変えたい場合に採用できる（たとえばある液
滴はペプシン不含の緩衝液、あるものはペプシン含有緩
衝液である）。同様に工程１５において、ステーション
１４でゼラチンよりも高価な遮断剤を用いる場合、また
は遮断の様式が可変であることを希望する場合、ステー
ション１４に液滴保持器が用いられるであろう。

【００８７】ステーション８および１７はトレーとして
示されているが、工程２３〜２５および２７においても
個別化するために液滴保持器を採用してもよい。適切な
スライドおよび検体が得られるならば、等しい試料のレ
プリカを形成するために酵素が発現する染色および対比
染色の異なる色彩水準を達成し、これにより、選択すべ
きものとコントラストをなす一定範囲の水準を生じるこ
とが望ましいであろう。

【００８８】中程度に高価な処理液（たとえばヘマトキ
シリン染色）を施すためにトレーを用いる工程に関して
も、本発明はジョンソンらのシステム（７５ｍｍ×２５
ｍｍの毛管空間の大部分を満たす）よりも少量の液体を
用いる。本発明方法の場合、一部（約３０〜４０ｍｍ×
２５ｍｍ）が満たされるにすぎないからである。さら
に、排液は回転よりもむしろ吸取りによって著しく容易
に行われる。

【００８９】全体の処理期間中にスライド間隙から排液
されるべき各種液体をすべて吸取るために十分な吸収容
量をもつ吸収材料を使用し、かつこれに十分な数の吸収
材料ステーション（図６においてステーション９（５０
９）および１１（５１１））を採用することが好まし
い。あるいは本方法の適宜な時点（たとえば工程１７Ｂ
において）各吸収材料を新たな吸収材料と交換するか
（ステーション９および１１）；あるいは１か所の吸収
材料ステーションが使用されている間に（たとえば工程
９Ｂ〜１４Ｂにおいてステーション１１）、他方のステ
ーション（ステーション９）の吸収材料を交換してもよ
い。

【００９０】本発明の好ましい形態においては、２表面
間の間隙が垂直位置に維持され、分離されたアリコート
の液体試薬が対向する２表面（たとえば２枚の顕微鏡用
ガラススライド）の下縁間に生じた空隙接触し、毛管作
用により上方へ流動し、間隙の内面を覆う。処理後に上
記空隙のいずれかの地点を吸収材料と接触させることに
より、液体試薬を平面の間から排除することができる。
このような方法は多数の固定化された試料を一連の液体
試薬で処理することを伴い、かつ液体試薬を順次施し、
そして同一の被分析体をその方法における次の液体試薬
に暴露する前に、試料である被分析体から液体試薬を排
除する必要がある複雑な処理の管理を能率化するのに特
に有用である。これは、貴重な、または有害な、または
高価な液体試薬、たとえば溶存したタグ付きもしくはタ
グなしの抗体、核酸プローブ、放射性物質、またはヒト
との接触を最小限にすることが望ましい、生物災害をも
たらす材料を最小量用いることが望まれる場合に特に有
用である。

【００９１】平行な表面（従ってそれらの間の間隙）が
垂直でなく、上方へ傾斜しているか、または水平に広が
っている、本発明の他の形態がある。このような場合そ
れぞれ、間隙の適宜な縁に、分離されたアリコートの処
理液（個別化可能である）が接触すること、または毛管
作用により間隙から液体を排除すること（たとえば間隙
の縁に吸収材料が接触することにより、各液体の急速排
除を伴う多工程処理が可能となる）、あるいはこれら両
者に起因する本発明の利点は、前記の各形態と同様に得
られる。同様に、実質的に平行な表面である必要はな
く、たとえば円筒形または円錐形の断片の場合のように
彎曲していてもよい。

【００９２】本発明の垂直および水平の形態は双方と
も、現在別個の抗原情報または遺伝情報の分析を個々の
手動操作により行っている臨床試験所および研究所でル
ーチンに行われている手動染色法による先行技術と同じ
用途、ならびにそれらにまさる利点をもつ。これらの用
途には下記のものが含まれるが、これらに限定されるも
のではない。固体表面、たとえば顕微鏡用ガラススライ
ド、ニトロセルロース、もしくは酢酸セルロースメンブ
ランフィルター、または平らな有機可塑性（ｏｒｇａｎ
ｏｐｌａｓｔｉｃ）支持体に固定化された、ヒト、植
物、または動物組織、細胞スミア、または抽出物におい
て診断および予報上重要な抗原の検出。これらの用途に
はさらに、一致するヒト、植物または動物の組織および
組織抽出物を、それらの特異的遺伝子に対する核酸ハイ
ブリッド形成法およびそれらのＲＮＡ転写によりスクリ
ーニングすることが含まれる。これらの方法は実験室で
１個の組織を数種の異なる組織化学的マーカーにつき染
色する特殊な染色法、たとえばムシカルミン（ｍｕｃｉ
ｃａｒｍｉｎｅ）、銀、グラム、ギムザ、パパニコロー
その他の組織学的、または血液学的、または細胞学的染
色にも用いられる。

【００９３】あるいは多数の異なる解剖部位および異な
る種から得た組織を、特に用いる試薬が高価であるかま
たはわずかにμｌの量で得られる場合、単一系列の試薬
で染色することができる。制限された上清または腹水か
ら直接得られた単クローン抗体を用いる単一組織型のス
クリーニングとしてのこの種のシステムの体積要件が低
いことが、平面上に固定化された薄い試料を垂直または
水平位の毛管流を用いて処理するためにデザインされた
方法および装置にとって理想的な利用法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは第１の形態のよるスライドアセンブリ
ーの側方立面図である。図１Ｂは図１Ａの線１Ｂ−１Ｂ
に沿って得た前方立面図である。図１Ｃは図１Ａの線１
Ｃ−１Ｃに沿って切断して得た前方立面図である。

【図２】図２Ａは第２の形態によるスライド対を分解し
た状態の側方立面図である。図２Ｂは図２Ａと同じスラ
イド対をホルダー部分内で組立ててスライドアセンブリ
ーを構成した状態の、図２Ａと同じ立面図である。図２
Ｃは図２Ｂの線２Ｃ−２Ｃに沿って切断して得た、ホル
ダー内のスライドアセンブリーの上面図である。図２Ｄ
は第３の形態によるスライドアセンブリーの分解した状
態を示す、図２Ｂと同様な図である。図２Ｅはホルダー
内に入れられた図２Ｄのスライドアセンブリーの、図２
Ｂと同様な図である。

【図３】図３Ａは液滴保持器の上方に置かれた、それぞ
れ本発明の第２の形態によるスライドアセンブリーの配
列を、図３Ｂの３Ａ−３Ａに沿って切断して得た側方立
面図である。図３Ｂは図３Ａの線３Ｂ−３Ｂに沿って得
た、図３Ａに断面で示した液滴保持器の平面図である。
図３Ｃは図３Ａと同じ角度からみた、液滴１個の接触し
ている１個のスライドアセンブリーの拡大図であり、液
体が本発明方法に従い毛管流によって狭い間隙内へ垂直
方向に引込まれる状態を示す。図３Ｄは液体が毛管流に
よって狭い間隙から吸収材料中へ垂直方向に引込まれる
状態を示す、図３Ｃと同様な図である。

【図４】図４は第４の形態によるスライドアセンブリー
を示す、図１Ｃと同様な前方立面図（断面）である。

【図５】図５は一部スライド対が装填された、第５の形
態によるスライドホルダーの倒立した状態を示す透視図
であり、配列が５対のスライド５列ではなく１０対のス
ライド３列であるという点のみにおいて図２Ａ，２Ｂ，
３Ａ，３Ｂ，３Ｃおよび３Ｄに示した形態と異なる。

【図６】図６は図５のスライド対配列を用いた手動また
は自動多段階法用のステーションの配列を示す平面図で
ある。

【図７】図７は図５および図６の形態による液滴保持器
が一部装填された状態を示す透視図である。これらの図
面において各記号は下記のものを表わす。

【符号の説明】

１０：試料保持スライド １２：１０の前面 １４：１０の下端 １６：１０の裏面 １８：１０の上端 ２０（１２０′，３２０）：試料 ２２（１２２，１２２′，３２２，３２２′）：シム ２４（１２４），２６（１２６）：シムの粘着面 ３０（１３０，２３０，４３０）：対面スライド ３２（１３２，１３２′）：３０（１３０，１３０′の
前面（対向平面） ３４（１３４，２３４，）：３０（１３０，２３０）の
下端 ３６（１３６）：３０（１３０）の裏面 ３８（１３８）：３０（１３０）の上端 ４０（２４０）：スライド間隙 ４２：４０の下端 ４４（１４４）：シムの下端 １４６，１４８，１４６′，１４８′：プロチュバラン
ス １５０（１５０′，２５０，４５０）：スライドホルダ
ー １５２：１５０の下開きスロット １５６（２５６）：１５０（２５０）の整合面 ６２（４６２）：液滴保持器の支持体 ６４（４６４）：液滴保持器の弾性員子 ６６（４６６）：孔 ６６，６９（４６８，４６９，５６８，５６９，６６
８，６６９，７６８，７６９）：液滴 ７０：毛管 ７２：吸収材料 ７４：液体前面 ３１２：試料保持スライドの前面（シムで被覆されてい
ない） ３１４：試料保持スライドの下端 ４４２：スライド間隙下端 ４５１：スライドホルダー上部プレート ４５５：スロット ４７６：アーム ４７８，４８０：アームの傾斜部 ４８２：水平な棒

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第１表面上の薄片試料を一連の処理液で
   処理するための方法であって、 ａ）第１処理液を試料保有第１表面と対面要素の第２表
   面との間隙内の毛管流により、少なくとも試料保有第１
   表面上に固定化された試料の位置にまで引込み、 ｂ）第１処理液を間隙内で毛管作用により試料と接触し
   た状態に保持し、 ｃ）第１処理液を毛管流により間隙から排除し、そして ｄ）第２処理液を間隙内の毛管流により少なくとも試料
   の位置にまで引込む工程からなる方法。
2. 【請求項２】 平らな試料保有表面が顕微鏡スライドの
   表面である、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 第１表面および第２表面が引込み工程
   （ａ）および（ｂ）ならびに排除工程（ｃ）に際して垂
   直に広がる方向に維持される、請求項１または２記載の
   方法。