IT202100020600A1 - Apparato e metodo di preparazione di un campione biologico per scopi analitici o diagnostici - Google Patents

Description

APPARATO E METODO DI PREPARAZIONE DI UN CAMPIONE BIOLOGICO PER

SCOPI ANALITICI O DIAGNOSTICI

DESCRIZIONE

Campo tecnico dell?invenzione

La presente invenzione si riferisce al settore degli apparati e metodi di preparazione di campioni biologici per successive analisi o per scopi diagnostici.

In particolare, la presente invenzione si riferisce ad un apparato che permette il processamento automatizzato e standardizzato di un campione di fluido corporeo, preferibilmente per analisi o diagnosi basate sulla biopsia liquida, in prossimit? del punto di raccolta del campione di partenza e configurato in modo tale da fornire componenti informative e stabili di detto campione, particolarmente idonee ad analisi di contenuti biologici correlati a molteplici condizioni, tra cui patologie tumorali o degenerative o infettive, o a patologie rilevabili in contesto prenatale.

Background

? noto nei contesti clinici che la fase preanalitica rappresenti un momento cruciale nell?ambito delle attivit? di analisi dei campioni biologici, in quanto comprende differenti passaggi procedurali in cui l?incidenza di diverse variabili pu? influire sulla qualit? del campione medesimo, sui risultati delle successive analisi e sulla loro utilizzabilit?. L?idoneit? e l?accettabilit? del campione sono componenti fondamentali della fase preanalitica su cui parametrare la variabilit? degli esiti delle indagini di laboratorio.

Le variabili preanalitiche sono molteplici e comprendono eventi biologici, fisiologici e modalit? tecniche relative alla raccolta, preparazione, conservazione e trasporto del campione che, spesso, determinano incertezze, errori e, a volte, un?indesiderata voce di spesa da parte del laboratorio per la loro gestione.

Le suddette variabili possono influenzare in modo importante l?esito dei test di laboratorio aggiungendo un ulteriore fattore di incertezza rispetto ai risultati ottenibili o causare risposte non corrispondenti alla reale situazione biologica del paziente, in particolare nelle diagnosi basate sulla cosiddetta biopsia liquida.

La biopsia liquida si riferisce a quel campo della diagnostica, prevalentemente oncologica, volta ad identificare e/o caratterizzare componenti biologiche tramite l?analisi di campioni di fluidi corporei, come ad esempio il sangue periferico, e in particolare degli elementi correlati con la patologia, ad esempio con il tumore, rilasciati nella circolazione sanguigna. Le analisi di biopsia liquida possono essere rivolte alla identificazione e caratterizzazione di cellule tumorali circolanti (CTC) o di cellule fetali, in caso di diagnosi prenatale, oppure di altri elementi cellfree (ad esempio acidi nucleici, proteine, esosomi) che vengono estratti dalla componente liquida (prevalentemente acellulare) del campione dopo aver eliminato la componente cellulare. Le due componenti presentano tuttavia modalit? di analisi ed esigenze di preparazione del campione diverse fra loro che limitano la possibilit? di ottenere da entrambe informazioni cliniche senza ricorrere a prelievi multipli.

Per il mantenimento dell?integrit? e composizione del campione, gli apparati e metodi noti utilizzati nelle attivit? preanalitiche di preparazione del campione affrontano generalmente problematiche dovute a cause molto differenti tra loro, ad esempio alla temperatura di conservazione, l?eventuale presenza di preservanti, stress meccanici/fisici dovuti a centrifugazione, filtrazione, congelamento, trasporto e la tipologia di provette/contenitori utilizzati.

Dal momento stesso del prelievo, il fluido corporeo inizia a deteriorarsi e si possono osservare diversi fenomeni di degradazione. Le cellule modificano la loro morfologia e si disgregano, rilasciando il materiale genetico contenuto al loro interno, che va a mescolarsi con quello circolante nella componente liquida. Il materiale non cellulare presente nella componente liquida (esosomi, proteine, vescicole, acidi nucleici liberi), ad esempio nel plasma in caso di un prelievo di sangue, inizia a danneggiarsi, con conseguente perdita di informazione, e richiede pertanto l?uso di conservanti per fermare o almeno rallentare il processo. Queste sostanze possono per? interferire con la biologia cellulare, ad esempio cambiandone la morfologia o interferendo con l?espressione proteica. Ad esempio, alcune tipologie di conservante sono controindicate nel caso in cui si vogliano eseguire test che richiedono una reattivit? cellulare, quali l?adesione ad un substrato o la reazione ad un marcatore, ad esempio un anticorpo.

Inoltre, nel caso di un campione di sangue, si osserva tipicamente la formazione di coaguli, dovuta ai tempi di attesa e alle modalit? di trasporto del campione stesso, per evitare la quale ? pratica comune aggiungere anticoagulante al sangue prelevato. Il problema ? particolarmente sentito in citologia, ematologia ed oncologia, in particolare nei protocolli di biopsia liquida, nei quali un?eccessiva coagulazione ? una delle cause di non accettabilit? del campione.

Un altro esempio ? il tempo intercorso tra il prelievo e l?analisi dei campioni ematologici, che ? un fattore dirimente per l?ottenimento di risultati attendibili. Infatti, nelle procedure che prevedono l?utilizzo di anticoagulanti, come ad esempio l?acido etilendiamminotetracetico (EDTA), ? noto che un loro contatto prolungato con il campione di sangue provochi modificazioni alle cellule. D?altro canto, qualora dette procedure si avvalessero di conservanti, ovvero sostanze diverse dall?EDTA per permettere di ritardare i sopra citati processi di degradazione come precedentemente descritto, le caratteristiche del sangue e la reattivit? della sua componente cellulare verrebbero alterate e quindi compromessi i test downstream, specialmente nei casi di analisi relative alle cellule tumorali circolanti (CTC).

? sentita, pertanto, la necessit? di soluzioni che superino le difficolt? delle tecniche note associate alle tempistiche con cui devono essere effettuate le analisi sul campione di fluidi corporei, particolarmente nei protocolli di biopsia liquida, a seguito della loro preparazione e al fine di non compromettere la loro validit?.

In considerazione di quanto sopra, e in particolare per le diverse esigenze di trattamento delle diverse componenti del campione di fluido corporeo al fine di rallentarne i processi di degradazione, le metodologie e gli apparati noti prevedono tipicamente la raccolta di una pluralit? di campioni, che sono quindi trattati e analizzati in tempi e modalit? diversi in funzione del tipo di analisi che ? possibile ricercare/individuare in quel momento e nonostante possano comunque afferire alla medesima indagine diagnostica. Questa situazione rappresenta un ulteriore inconveniente, sia in termini di uniformit? del contenuto informativo del campione sia in termini di costi di gestione per il laboratorio di analisi.

Un ulteriore svantaggio delle soluzioni note ? attribuibile al fatto che ? prevista comunque un?attivit? significativa di manipolazione da parte dell?operatore durante la preparazione del campione da analizzare, riducendo inevitabilmente la validit? clinica dei saggi e dei test e l?applicabilit? di una medesima ripetibile procedura di preparazione dei campioni anche in diversi contesti diagnostici.

Un altro problema delle tecnologie note ? il fatto che, per poter isolare il materiale biologico di interesse dalle altre componenti del campione, ? necessario l?impiego di tecniche che rappresentano una fonte di stress per il campione stesso e/o che ne provocano una parziale perdita. Si possono citare ad esempio la filtrazione mediante filtri o sistemi microfluidici, l?uso di beads magnetici e la citocentrifugazione. Ad esempio, con specifico riferimento alla gestione dei campioni liquidi contenenti cellule, come il sangue, una delle pi? diffuse soluzioni tecniche ? l?impiego di un?unit? di cito-centrifugazione in cui appunto una centrifuga permette di raccogliere dette cellule schiacciandole direttamente su un supporto, tipicamente un vetrino.

Tale modalit?, attualmente utilizzata e molto comune nei laboratori, comporta tuttavia non solo una perdita cellulare del campione, in quanto le cellule tendono generalmente a distaccarsi dal supporto, ma anche una perdita di morfologia e un?adesione delle cellule in maniera non uniforme e su piani sovrapposti che ? mascherando parzialmente il contenuto cellulare - ne compromette un?adeguata e completa analisi al microscopio. Sebbene siano stati proposti tentativi per mitigare tali effetti negativi di perdita cellulare e danno alla morfologia, tali tentativi sono confinati di fatto in un ambito di soluzioni manuali o empiriche, specifiche per ciascun laboratorio o la cui efficacia ? operatore-dipendente. Tale problematica, se gi? rilevante nelle analisi citologiche, diventa ancor pi? critica nel contesto delle cellule tumorali circolanti data la loro rarit? all?interno del campione di fluido.

Breve descrizione dell?invenzione

Il problema tecnico posto e risolto dalla presente invenzione ? dunque quello di superare le problematiche sopra esposte e, in particolare, di fornire un apparato, come definito nella rivendicazione 1.

Ulteriori caratteristiche della presente invenzione sono definite nelle corrispondenti rivendicazioni dipendenti.

? anche oggetto della presente invenzione un metodo per la preparazione automatizzata di un campione di fluido corporeo, trattato per ottenere una prima componente cellulare immobilizzata, e preferibilmente stabilizzata, su un supporto planare, e una seconda componente liquida, preferibilmente stabilizzata all?interno di una provetta, per analisi cliniche, in particolare di biopsia liquida, come definito nella rivendicazione 10.

L?apparato dell?invenzione ? un apparato per il processamento automatizzato di un campione biologico per analisi cliniche, in particolare di biopsia liquida, che utilizza come materiale di partenza un campione di fluido corporeo. In una forma di realizzazione preferita, il campione di fluido corporeo processato dall?apparato ? un campione di sangue intero.

L?apparato prevede un corpo scatolare comprendente una camera interna e un?apertura di accesso a detta camera. La camera interna reca primi, secondi e terzi mezzi di alloggiamento che sono configurati rispettivamente per ospitare il campione di fluido, elementi reagenti e un supporto planare idoneo all?immobilizzazione di cellule del campione. Preferibilmente, l?apparato comprende anche mezzi di raccolta di scarti liquidi e solidi. L?apparato comprende inoltre mezzi di prelievo e dispensazione del campione e/o dei reagenti e/o di preparati intermedi del campione nella camera interna.

L?apparato comprende ulteriormente mezzi di centrifugazione, operativamente associati a detti mezzi di prelievo e dispensazione, e un?unit? di controllo. L?unit? di controllo ? configurata per comandare i mezzi di prelievo e dispensazione e i mezzi di centrifugazione secondo un protocollo automatizzato.

La configurazione complessiva di detto apparato ? tale che, in accordo a detto protocollo automatizzato, l?apparato permette di ottenere dal campione di fluido biologico in ingresso alla camera interna una prima componente del campione e/o una seconda componente del campione separata e distinta dalla prima componente, in cui la prima componente include cellule del campione immobilizzate su detto supporto planare e la seconda componente include la frazione liquida del campione, ad esempio plasma, preferibilmente resa disponibile in provette.

Vantaggiosamente, l?apparato dell?invenzione permette di preparare per l?analisi campioni biologici su supporti planari, ad esempio campioni di sangue prelevati in provette contenenti esclusivamente anticoagulanti, preferibilmente EDTA, mantenendoli stabili nel tempo, ad esempio fino ad un anno, grazie al loro rapido processamento e alla stabilizzazione effettuati dall?apparato. ? quindi possibile interrompere il workflow del laboratorio e poter, ad esempio, congelare le componenti del campione ottenuto migliorando notevolmente la modalit? di gestione delle attivit? di analisi (laboratory practicability). In altre parole, da un punto di vista biologico, l?apparato dell?invenzione garantisce una validit? dei risultati dell?analisi che non risultano alterati, grazie al processamento immediato a seguito di prelievo di campione, mentre da un punto di vista di gestione del campione l?apparato dell?invenzione permette comodamente di realizzare un flusso di analisi di laboratorio che non costringe l?operatore a lavorare in maniera consecutiva. In particolare, nel caso di campioni di sangue l?apparato dell?invenzione rende possibile ottenere tali vantaggi anche eseguendo prelievi in provette contenenti solo anticoagulanti, preferibilmente EDTA, minimizzando pertanto le alterazioni del campione tipicamente indotte dai conservanti.

Ancora, l?apparato dell?invenzione consente la possibilit? di processare un unico campione, da cui possono essere ricavate entrambe le componenti. Infatti, da un unico campione in ingresso all?apparato, ? ottenibile una prima componente comprendente gli elementi cellulari del campione e una seconda componente comprendente la componente liquida. Vantaggiosamente, ? dunque possibile ottenere in modo simultaneo da un unico campione in ingresso all?apparato, due distinte componenti a contenuto estremamente informativo e clinicamente valido, superando i limiti posti dalle diverse necessit? delle due componenti per assicurarne la conservazione e stabilit? nel tempo.

Un aspetto particolarmente vantaggioso dell?invenzione ? rappresentato quindi dal fatto che l?apparato permette di ottenere da un unico campione in ingresso una pluralit? di informazioni dalle sue diverse componenti, senza dover raccogliere campioni in tempi/momenti diversi per condurre l?insieme delle analisi richieste.

Vantaggiosamente, l?apparato dell?invenzione permette di ottenere una prima componente del campione in ingresso particolarmente idonea all?identificazione di cellule tumorali circolanti (CTC) e una seconda componente comprendente la frazione liquida, ad esempio il plasma, che ? ampiamente utilizzato, anche nella pratica clinica, per l?analisi di una molteplicit? di analiti, come ad esempio gli acidi nucleici liberi (DNA, RNA), proteine, vescicole ed esosomi per una successiva analisi completa di tutte le componenti del campione proveniente da un unico prelievo.

Un ulteriore aspetto vantaggioso dell?invenzione ? relativo al fatto che l?apparato permette di preparare in modo automatizzato il campione biologico da analizzare, fornendo una standardizzazione pressoch? totale al processo di preparazione del campione e in modo tale che le successive analisi possano essere effettuate in vari contesti clinici e gli esiti abbiano effettiva utilit? clinica.

Secondo una forma di realizzazione preferita, l?apparato ? configurato per operare con mezzi di supporto delle componenti ottenute, in particolare mezzi di supporto planari, che risultano funzionalizzati attraverso una deposizione superficiale di nanomateriali. Detti mezzi di supporto, in particolare nella forma di un vetrino, consentono un'adesione immediata, delicata ed efficiente di qualsiasi cellula vivente, consentendo vantaggiosamente un approccio di cattura totale nei protocolli di biopsia liquida.

L?apparato cos? configurato permette di dispensare i reagenti ed effettuare i successivi lavaggi in modalit? totalmente planare, evitando cos? la necessit? di soluzioni che prevedono l?immersione del substrato in contenitori riempiti con ampi volumi di reagenti.

Quanto sopra risulta dunque particolarmente vantaggioso nei protocolli di biopsia liquida in quanto, grazie alla preparazione immediata, automatizzata e standardizzata del campione, l?apparato restituisce almeno una componente che reca appunto un repertorio sostanzialmente intatto di cellule clinicamente informative da campione fresco (ad esempio CTC) e consente di ottenere la massima sensibilit? anche in contesti di malattia in fase precoce.

Vantaggiosamente, l?apparato dell?invenzione consente quindi una successiva valutazione analitica completa delle caratteristiche morfologiche, proteomiche e genetiche a livello di singola cellula o sulla componente cell-free contenuta nella frazione liquida (la seconda componente ottenuta dal campione). La prima componente ottenuta con l?apparato ? idonea ad implementare tecniche tradizionali di biopsia, come citologia, immunocitochimica, immunofluorescenza, FISH e analisi molecolare. La seconda componente ? invece idonea per le analisi genetiche sugli acidi nucleici liberi e altre analisi su altri analiti (quali ad esempio proteine circolanti ed esosomi). Una combinazione dell'analisi di imaging guidata dall'intelligenza artificiale con il sequenziamento genetico avanzato sulle cellule stesse e le analisi sugli elementi estratti dalla componente liquida dei campioni preparati con l?apparato dell?invenzione consente la massima sensibilit? e specificit? dei test di biopsia liquida in qualsiasi contesto clinico. La combinazione di assenza di conservanti in fase di prelievo e di riduzione dello stress indotto dai metodi pi? comuni per l?isolamento delle componenti significative consente vantaggiosamente di ridurre la perdita di informazione ricavabile dal campione.

In sostanza, l?invenzione mette a disposizione un apparato pre-analitico che garantisce una preparazione standardizzata e automatizzata di un campione di fluido corporeo fresco, idoneo ad implementare i principali protocolli di biopsia liquida e che, preferibilmente, adopera specifici supporti, ad esempio vetrini, funzionalizzati e configurati per conservare le caratteristiche morfologiche delle cellule al fine di fornire una prima componente di detto campione idonea all'identificazione delle componenti cellulari. L?apparato dell?invenzione ? allo stesso tempo configurato per fornire, contestualmente alla prima componente, una seconda componente di detto campione, in particolare una componente comprendente la frazione liquida per l'analisi del suo contenuto privo di cellule, ma senza la necessit? di adoperare provette test-specifiche per la raccolta del sangue, n? l?ausilio di tecnici specializzati.

L?invenzione risulta particolarmente vantaggiosa in contesto oncologico, in particolare nella ricerca di cellule e contenuti rari, quali ad esempio le CTC nella prima componente e acidi nucleici circolanti o altri marcatori tumorali nella seconda.

Infine, il sistema ? programmabile per gestire in contemporanea un numero di campioni variabile da 1 a 8, utilizzando pertanto un numero di vetrini da 10 a 80 per singolo campione, rendendolo flessibile per contesti diagnostici che possono richiedere quantitativi diversi di campione da analizzare.

Altri vantaggi, assieme alle caratteristiche ed alle modalit? di impiego della presente invenzione, risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di sue forme di realizzazione preferite, presentate a scopo esemplificativo e non limitativo.

Breve descrizione delle figure

Verr? fatto riferimento ai disegni riportati nelle figure allegate, in cui:

- la Figura 1 mostra una vista d?assieme che illustra di una forma di realizzazione preferita dell?apparato secondo la presente invenzione;

- la Figura 2 mostra una vista schematica dall?alto dell?interno dell?apparato illustrato in Figura 1;

- la Figura 3 mostra una forma di realizzazione preferita di mezzi di alloggiamento del campione di fluido corporeo da processare implementati nell?apparato di Figura 1;

- la Figura 4 mostra una forma di realizzazione preferita di mezzi di alloggiamento di reagenti implementati nell?apparato di Figura 1;

- la Figura 5 mostra una forma di realizzazione preferita di mezzi di alloggiamento dei supporti planari destinati a recare immobilizzate le cellule del campione di fluido da processare e preferibilmente utilizzati in associazione con l?apparato di figura 1;

- la Figura 6 mostra una forma di realizzazione preferita di mezzi di alloggiamento di componenti sostituibili, in particolare puntali, dei mezzi di prelievo e dispensazione incorporati nell?apparato di Figura 1;

- la Figura 7 mostra una forma di realizzazione preferita dei mezzi di centrifugazione incorporati nell?apparato di Figura 1.

Descrizione dettagliata di forme di realizzazione dell?invenzione

La presente invenzione sar? di seguito descritta facendo riferimento alle Figure suindicate.

Con iniziale riferimento alla Figura 1, ? mostrata schematicamente una vista d?assieme di un apparato per il processamento automatizzato di un campione di fluido biologico, in particolare di sangue, a scopi analitici o diagnostici. L?apparato ? denotato complessivamente con il riferimento 1.

L?apparato trova applicazione preferita nella preparazione di campioni di sangue nell?ambito di procedure di analisi cliniche, in particolare di biopsia liquida.

Tuttavia, non sono escluse altre applicazioni di biopsia liquida utilizzando altre tipologie di fluidi corporei, quali urine, liquido cerbro-spinale, liquido pleurico, lavaggi bronchiali, sputum, prelievi citologici mediante ago aspirato. Inoltre, non ? esclusa un?applicazione vantaggiosa in altri ambiti, quali citologia, immunologia, ricerca di agenti patogeni e in alternativa a tutte le applicazioni di citocentrifugazione.

L?apparato ? preferibilmente uno strumento da banco e comprende un corpo scatolare 10 avente una camera interna 20 e un?apertura 12 di accesso a detta camera interna 20. In una forma di realizzazione preferita, le componenti descritte a seguire sono contenute nella camera interna 20, ovvero dove avviene la preparazione del campione biologico.

Come verr? descritto in seguito, l?apparato 1 ? preferibilmente equipaggiato con un sistema di filtrazione dell?aria e/o dei vapori presenti in detta camera interna 20. Tale sistema ? denotato complessivamente con il riferimento 50.

La camera interna 20 ? suddivisa in una pluralit? di aree, o zone, destinate a ricevere mezzi di alloggiamento configurati per ospitare il campione di fluido, suoi preparati intermedi, reagenti e componenti di detto campione ottenute con l?apparato 1.

I mezzi di alloggiamento sono preferibilmente removibili e possono essere inseriti/estratti attraverso l?apertura 12 del corpo scatolare 10 per introdurre /recuperare/sostituire il loro contenuto.

La Figura 2 mostra una vista schematica dall?alto dell?interno dell?apparato 1. In una forma di realizzazione preferita, la camera interna 20 comprende mezzi di guida 21 configurati per un accoppiamento con i mezzi di alloggiamento in modo tale da facilitarne l?estrazione e l?inserimento dal/nell?apparato e di garantire il loro corretto posizionamento. In Figura 2, i mezzi di guida sono illustrati esemplificativamente come binari recati da un piano di supporto 20a della camera interna 20 configurato per ricevere in appoggio e a scorrimento i mezzi di alloggiamento.

L?apparato 1 ? altres? provvisto di un sistema di movimentazione (del campione, dei reagenti e dei suoi preparati intermedi) che comprende mezzi di prelievo e dispensazione configurati per operare, preferibilmente, con puntali sostituibili, ad esempio da 1 millilitro o da 5 millilitri.

Le attivit? di prelievo e dispensazione dei liquidi sono attuate preferibilmente attraverso un braccio mobile, ad esempio lungo una terna di assi mutamente ortogonali, comprendente vantaggiosamente due canali di prelievo/dispensazione indipendenti tra loro.

Detto braccio permette i movimenti nello spazio dei puntali per il loro posizionamento in punti di interesse nella camera interna 20, in particolare in corrispondenza dei mezzi di alloggiamento. Detto braccio permette di movimentare i liquidi in una pluralit? di posizioni intermedie di preparazione del campione nella camera interna 20.

Ad esempio, il movimento del braccio permette un posizionamento dei puntali sul piano xy mentre un movimento relativo di detti canali rispetto al braccio mobile permette il posizionamento dei puntali lungo la direzione z ortogonale al piano xy. Detti canali possono essere accoppiati a scorrimento al braccio mobile mediante guide solidali al braccio mobile per realizzare la movimentazione lungo la direzione z. La distanza (interasse) tra i due canali ? preferibilmente fissa.

Il sistema di movimentazione ha preferibilmente una risoluzione e un?accuratezza di posizionamento dell?ordine del decimo di millimetro. Il sistema di movimentazione, in particolare i mezzi di prelievo e dispensazione, movimenta esclusivamente liquidi e non ad esempio contenitori, flaconi, provette o vetrini che possono essere ricevuti nei mezzi di alloggiamento.

In una forma di realizzazione preferita dell?apparato 1, anche detti puntali sono caricabili nei mezzi di alloggiamento, mostrati in modo esemplificativo nella Figura 6 e denotati con il riferimento 34. Vantaggiosamente, ? possibile sostituire i puntali utilizzati dai canali di prelievo e dispensazione per evitare contaminazioni di reagenti e campioni.

L?apparato comprende inoltre mezzi di centrifugazione 40 operativamente associati ai mezzi di prelievo e dispensazione e un?unit? di controllo. Quest?ultima ? configurata per comandare i mezzi di centrifugazione 40 e i mezzi di prelievo e dispensazione secondo un protocollo automatizzato di preparazione del campione che verr? descritto pi? in dettaglio nel prosieguo. L?unit? di controllo ? preferibilmente collocata all?esterno di detta camera interna 20.

La configurazione complessiva dell?apparato ? tale che il protocollo automatizzato permette di ottenere dal campione in ingresso alla camera interna 20 un preparato finale comprendente una prima componente del campione e/o una seconda componente del campione separata e distinta dalla prima componente. La prima componente include cellule e risulta immobilizzata su un supporto planare per analisi di biopsia liquida destinato ad essere ricevuto dai mezzi di alloggiamento. La seconda componente include la frazione liquida, ad esempio plasma, ed ? anch?essa contenuta in mezzi di alloggiamento dedicati.

Con ulteriore riferimento alle Figure 3-6 sono di seguito descritti esempi di realizzazione dei mezzi di alloggiamento ospitati nella camera interna 20.

Ad esempio, la Figura 3 mostra una forma di realizzazione preferita di primi mezzi di alloggiamento 31 configurati per ricevere il campione di fluido biologico in ingresso all?apparato 1. Come visibile, tali mezzi di alloggiamento comprendono una pluralit? di sedi 31a, a formare ad esempio un rack, conformate in modo tale da ricevere provette contenenti il campione. Ad esempio, ogni campione pu? essere contenuto in una provetta da 10ml. In particolare, un campione di sangue potr? essere contenuto in una provetta tipo Vacutainer? da 10 ml. In una forma di realizzazione preferita, l?apparato pu? ospitare fino a otto campioni diversi con due vial identiche per ciascun campione. Dette sedi 31a possono recare aperture laterali 31b per permettere a mezzi di lettura di eseguire una lettura di codici identificativi e/o di tracciabilit? presenti sulle provette.

La Figura 4 mostra una forma di realizzazione preferita di secondi mezzi di alloggiamento 33 configurati per ricevere reagenti. In particolare, i secondi mezzi di alloggiamento 33 comprendono una pluralit? di sedi 33a ciascuna conformata per ricevere un rispettivo flacone 33b contenente detti reagenti. Esempi di reagenti utilizzati in associazione alle procedure implementate dall?apparato 1 dell?invenzione sono PBS (Phosphate Buffer Saline), RBL (Red Blood Lysis Buffer) e una soluzione di fissaggio comprendente formaldeide, preferibilmente al 4%. L?apparato 1, a pieno carico, pu? ad esempio contenere 400 ml di PBS, 300 ml di RBL e 45 ml di detta soluzione di fissaggio.

La Figura 5 mostra una forma di realizzazione preferita di terzi mezzi di alloggiamento configurati per ricevere mezzi di supporto di una delle due componenti del campione ottenuti con l?apparato di figura 1, in particolare la prima componente comprendente cellule.

Analogamente a quanto sopra descritto in relazione ai primi mezzi di alloggiamento, i terzi mezzi di alloggiamento comprendono preferibilmente una pluralit? di sedi 32a, a formare ad esempio un rack, ciascuna preferibilmente conformata in modo tale da ricevere un supporto planare, in particolare un vetrino. In una forma di realizzazione preferita, l?apparato 1 pu? ospitare otto rack in cui ciascun rack pu? ricevere fino a dieci vetrini.

Il sistema di movimentazione eseguir? il processo di dispensazione delle cellule sul supporto planare e l?output del protocollo automatizzato comprende preferibilmente un supporto planare comprendente uno strato omogeneo di cellule, ad esempio globuli bianchi. Preferibilmente, i terzi mezzi di alloggiamento 32, ovvero ciascuna sede 32a e/o ciascun vetrino da essa ospitato, reca un codice identificativo idoneo per permettere all?apparato 1 di generare un report di tracciabilit?.

La frazione liquida del campione, ad esempio plasma, ottenuta con il protocollo implementato dall?apparato ? raccolta in recipienti, preferibilmente in provette, recate da quarti mezzi di alloggiamento non mostrati nelle Figure ma presentanti conformazione analoga a quanto descritto sopra per i primi mezzi di alloggiamento 31. I quarti mezzi di alloggiamento sono previsti nella camera interna 20 per ricevere anche preparati intermedi del campione. In una forma di realizzazione alternativa dell?invenzione, una porzione 31p del rack dei primi mezzi di alloggiamento 31 ? caricata nella camera interna 20 con provette vuote ed ? estratto con provette contenenti la frazione liquida.

Come sopra menzionato, nella Figura 6 ? mostrata una forma di realizzazione preferita dei mezzi di alloggiamento 34 configurati per ricevere i suddetti puntali.

In particolare, i puntali sostituibili sono recati nella camera interna 20 preferibilmente in prossimit? dei mezzi di dispensazione e/o prelievo.

Preferibilmente, l?apparato comprende anche mezzi di raccolta di scarti liquidi e solidi ottenuti durante la preparazione del campione.

Come sopra menzionato, l?apparato 1 dell?invenzione comprende vantaggiosamente mezzi di lettura, preferibilmente integrati nel braccio mobile. In particolare, i mezzi di lettura comprendono vantaggiosamente un primo e un secondo lettore, ad esempio di tipo ottico, in grado di leggere codici identificativi univoci dei campioni, degli elementi reagenti, e dei supporti (provette o vetrini) utilizzati per la prima o seconda componente ottenute dalla preparazione del campione. In questo modo ? garantita la loro completa tracciabilit?. I codici letti dai mezzi di lettura sono trasmessi all?unit? di controllo che, ad esempio, pu? generare un report di tracciabilit?. Preferibilmente, il primo lettore ? configurato per la lettura dei codici associati alle provette dei campioni, alle vial e ai flaconi contenenti i reagenti. Preferibilmente, il fascio ottico del primo lettore ? compreso in un piano sostanzialmente parallelo al piano di supporto 20a della camera interna 20. Il fascio ottico del secondo lettore ? preferibilmente compreso in un piano sostanzialmente ortogonale al piano di supporto 20a della camera interna 20 ed ? preferibilmente configurato per la lettura dei codici associabili ai mezzi di supporto planari e/o alle rispettive sedi 32a.

Con ulteriore riferimento alla Figura 7, ? mostrata una forma di realizzazione preferita dei mezzi di centrifugazione (l?involucro non ? rappresentato in figura), denotati complessivamente con il riferimento 40. I mezzi di centrifugazione comprendono preferibilmente un tamburo, o cestello, rotabile 41 provvisto di una pluralit? di sedi 42 disposte circonferenzialmente in direzione radiale rispetto all?asse di rotazione ? del tamburo 41. Ciascuna sede 42 di detta pluralit? si sviluppa lungo una direzione sostanzialmente parallela a detto asse di rotazione ?ed ? conformata per ricevere una provetta contenete il campione o un suo preparato intermedio. Possono ad esempio essere previste un numero di sedi per contenere fino a otto provette da 30 ml ciascuna.

Preferibilmente, il tamburo 41 e/o le sedi 42 sono basculanti e una posizione di riposo, o statica, delle sedi 42 determina un angolo retto tra la propria direzione di sviluppo e il piano di supporto 20a della camera interna 20. Il tamburo 41 pu? raggiungere una velocit? di rotazione equivalente a 400g. Durante il processo di centrifugazione, a seconda della velocit? raggiunta della centrifuga stessa, le sedi 42 possono inclinarsi fino a raggiungere una posizione parallela al piano di supporto 20a della camera interna 20.

Vantaggiosamente, i mezzi di centrifugazione 40 sono configurati in modo tale che il tamburo 41 e/o le sedi 42 possono essere arrestati dall?unit? di controllo dell?apparato 1 in una posizione predefinita, permettendo quindi al braccio mobile di accedere in modo automatizzato alle provette da essi recate.

Ulteriori componenti strutturali e di attuazione del movimento di detti mezzi di centrifugazione 40 sono alla portata del tecnico del ramo e non verranno descritti in maggior dettaglio.

Come precedentemente menzionato, l?apparato 1 ? preferibilmente equipaggiato con un sistema di filtrazione 50 dell?aria e/o dei vapori presenti nella camera interna 20. Il protocollo automatizzato di preparazione del campione prevede preferibilmente l'utilizzo di una soluzione di fissaggio. Nel caso di un campione di sangue, tale soluzione contiene una percentuale di formaldeide al 4% e, vantaggiosamente, detto sistema di filtrazione 50 permette di poter utilizzare quindi in sicurezza l?apparato 1 senza bisogno di ulteriori mezzi esterni di contenimento, quali le cappe chimiche. Ulteriori forme dell?invenzione possono prevedere l?utilizzo di altri composti organici, anch?essi utilizzabili senza l?impiego di ulteriori mezzi di contenimento grazie alla presenza del sistema di filtrazione 50.

Ritornando alla Figura 2, il sistema di filtrazione 50 ? un sistema attivo, montato preferibilmente su una porzione di sommit? del corpo scatolare 10. Il sistema di filtrazione 50 realizza una depressione che consente di confinare all?interno dell?apparato i vapori dei reagenti filtrandoli mediante un apposito filtro attivo. Il sistema di filtrazione 50 comprendere ventole e filtri (non visibili), ad esempio tre filtri, per creare un flusso d'aria forzato di contenimento dei vapori generati nella camera interna 20.

La velocit? delle ventole pu? essere regolabile a seconda delle fasi del protocollo automatizzato. Ad esempio, il flusso d?aria generato dalle ventole sar? regolato al minimo, ovvero sufficiente per evitare fuoriuscite di vapori dall?apparato 1, durante le prime fasi del protocollo quando la soluzione di fissaggio ? ancora nel flacone. Durante la dispensazione della soluzione di fissaggio, ovvero quando il rate di evaporazione ? massimo, le ventole garantiranno al contrario un flusso maggiore per abbattere la concentrazione di vapori di fissativo. Il sistema di filtrazione 50 pu? essere dimensionato per garantire un carico di lavoro equivalente ad almeno sei mesi di lavoro. L?unit? di controllo dell?apparato ? preferibilmente configurata per segnalare all'utilizzatore la necessit? di un intervento di manutenzione per la sostituzione dei filtri. In una forma di realizzazione preferita, le ventole possono essere fatte funzionare al massimo della loro velocit? al termine del protocollo automatizzato per accelerare il tempo di asciugatura dei supporti planari dai residui di reagenti rimasti su di loro.

In una forma di realizzazione preferita, l?apparato 1 ? operativamente associato ad un dispositivo configurato per contare il numero di cellule presenti nel campione biologico. In una forma preferita dell?invenzione, tale dispositivo ? configurato per contare il numero di globuli bianchi.

Tale dispositivo configurato per contare il numero di cellule pu? essere incorporato nell?apparato 1 o essere un dispositivo esterno accoppiato operativamente ad esso e permette appunto di determinare le opportune diluizioni per la preparazione del campione. Il conteggio delle cellule avviene preferibilmente in una fase eseguita durante il caricamento del campione nella camera interna 20 e pu? avvenire aliquotando il campione in ingresso durante la fase di caricamento.

Ad esempio, ? stata verificata sperimentalmente la correlazione lineare tra la conta dei globuli bianchi presenti nel sangue intero e l?altezza del pellet (globuli bianchi precipitati sul fondo della provetta) che si ottiene con il processo di lisi. Con questa correlazione si ottiene per ciascun campione di cui si conosce la concentrazione dei globuli bianchi, l?altezza del pellet rispetto al surnatante. ? quindi vantaggiosamente possibile rimuovere in modo predeterminato la frazione di surnatante nel protocollo di lisi. Inoltre, ? possibile calcolare facilmente anche il volume del pellet e il numero totale di globuli bianchi presenti nella singola vial. Aliquotando nella provetta un volume di buffer dipendente dai due parametri sopracitati, ? possibile ottenere una risospensione cellulare con densit? equivalente per ciascun campione. Questo procedimento consente di dispensare un numero paragonabile di cellule su ciascun supporto planare per ogni campione.

L'elaborazione della conta delle cellule fornisce dunque vantaggiosamente alcuni parametri di funzionamento del protocollo automatizzato implementato dall?apparato 1. Come verr? descritto in dettaglio nel prosieguo, preferibilmente detti parametri comprendono l?altezza degli elementi cellulari (o pellet) precipitati nella provetta durante il processamento del campione e il volume di risospensione per ottenere una densit? paragonabile di cellule da dispensare sul supporto planare.

Come sopra menzionato, l?unit? di controllo dell?apparato implementa un protocollo automatizzato di preparazione del campione che permette di fornire in uscita una prima componente che include cellule immobilizzate su un supporto planare, e/o una seconda componente separata e distinta che include la frazione liquida e ricevuta preferibilmente in provette.

? descritto a seguire, in modo esemplificativo e non limitativo dell?ambito di applicazione della presente invenzione, una forma di realizzazione preferita del protocollo automatizzato implementato dall?apparato 1 con riferimento ad un campione di fluido biologico costituito da sangue intero.

Inizialmente, una provetta con un campione di sangue da processare ? caricata nell?apparato 1 dell?invenzione, oltre ad eventuali reagenti. In particolare, la provetta opportunamente etichettata ? introdotta nella camera interna 20 ed ? alloggiata nel rispettivo rack 31. L'inserimento del rack 31 nella corrispondente area del piano di supporto 20a attiva la procedura di lettura dei codici di tracciabilit? associati ai campioni (e, nel caso, ai reagenti). Se non gi? presenti nella camera interna 20, sono altres? caricati i supporti planari, o vetrini, i puntali sostituibili (monouso) e provette nelle sedi 42 del cestello 41 dei mezzi di centrifugazione 40.

Una prima aliquota di sangue viene trasferita dai mezzi di prelievo e dispensazione mediante pipettate multiple in una provetta presente nel cestello 41. Una volta concluso il processo di trasferimento del campione di sangue inizia la separazione del plasma dalla parte cellulare del sangue mediante centrifugazione. I mezzi di centrifugazione 40 raggiungono la velocit? di regime, la mantengono preferibilmente per dieci minuti e successivamente sono decelerati in modo blando per evitare la risospensione del contenuto della provetta. Sono cos? ottenute due componenti del campione di sangue, una prima componente contenente cellule e una seconda componente contenente plasma.

Il cestello 41 ? arrestato in una posizione predefinita e il braccio mobile preleva e trasferisce la componente del campione contenente il plasma in elementi di contenimento dedicati, recati preferibilmente da una partizione dei mezzi di alloggiamento 31 della camera interna 20, in particolare in una nuova provetta destinata alla successiva conservazione o allo smaltimento. L'operazione di trasferimento ? preferibilmente effettuata mediante una serie di pipettate. ? trasferito un volume di plasma preferibilmente pari a circa 6 ml.

Successivamente si prelevano i reagenti e si dispensano nella provetta del cestello 41 che contiene la parte cellulare del campione di sangue (da cui, ovvero, ? stato rimosso il plasma) per una successiva lisi dei globuli rossi, preferibilmente a volume fisso, ad esempio con un rapporto di diluizione 1:4 e con un volume finale di 16 ml. Si esegue preferibilmente anche un?operazione di risospensione per omogeneizzare il contenuto di detta provetta contenente solo la parte cellulare e si ottiene quindi un preparato intermedio.

A seguire, il protocollo automatizzato prevede preferibilmente una serie ciclica di operazioni sul preparato intermedio che comprende, in sequenza, le fasi di diluizione, risospensione, centrifugazione e rimozione del surnatante fino ad ottenere una componente del campione di sangue che contiene cellule, in particolare globuli bianchi.

In dettaglio, nella fase di diluizione, i mezzi di movimentazione prelevano reagente e lo dispensano ad alta velocit? nella provetta contenente la frazione cellulare (risospensione) per omogeneizzare il contenuto della provetta. In rapida successione quest?ultima operazione ? preferibilmente ripetuta cinque volte. Segue una attesa, preferibilmente di cinque minuti.

Nella fase successiva di centrifugazione, l?unit? di controllo attiva i mezzi di centrifugazione, preferibilmente fino ad una velocit? rotazionale equivalente a 400g, per un tempo di centrifugazione preferibilmente pari a cinque minuti cui segue una fase di decelerazione. La decelerazione pu? essere attuata attraverso una frenatura meccanica. Quando il cestello 41 ? arrestato, il braccio mobile si posiziona per prelevare il surnatante, generalmente circa 15 ml, e lo dispensa in una provetta o flacone destinato agli scarti. In particolare, il volume residuo di frazione cellulare contenuto nel preparato intermedio ? stimato dal protocollo automatizzato in funzione del numero di globuli bianchi determinato dal dispositivo di conta.

Detta serie ciclica di operazioni ? preferibilmente ripetuta per tre volte fino a quando la provetta alloggiata nei mezzi di centrifugazione 40 contiene preferibilmente circa 0,5 ml di pellet. Le fasi di diluizione del prodotto intermedio con i reagenti sono condotte preferibilmente in un rapporto 1:4, ad esempio utilizzando come reagente RBL. Le fasi di risospensione sono condotte preferibilmente in un rapporto 1:10 utilizzando preferibilmente PBS.

Una volta ottenuta la componente del campione che reca la concentrazione ottimale di cellule, in particolare di globuli bianchi, il protocollo automatizzato prevede, preferibilmente cinque, cicli di risospensione.

Successivamente, la componente cellulare ? prelevata e dispensata sui supporti planari alloggiati nei secondi mezzi di alloggiamento 32 della camera interna 20. La fase di dispensazione della componente cellulare sui vetrini prevede vantaggiosamente la deposizione di un singolo strato sostanzialmente uniforme di globuli bianchi, preferibilmente circa due milioni di globuli bianchi, su ciascun supporto planare e in modo tale che risultino sostanzialmente non sovrapposti. La fase di dispensazione avviene vantaggiosamente con un unico movimento continuo del puntale di dispensazione. In particolare, il puntale si posiziona in corrispondenza della superficie funzionalizzata del vetrino ed esegue una dispensazione continua durante lo spostamento del puntale medesimo lungo la dimensione maggiore, in particolare l?asse maggiore, della superficie funzionalizzata del vetrino. Questa dispensazione ha il vantaggio di essere rapida e di garantire una sostanziale uniformit? dell?adesione. Altri metodi di dispensazioni sono possibili. Ad esempio, ? possibile prevedere una dispensazione contemporanea della componente cellulare da due puntali fermi posizionati in corrispondenza della superficie funzionalizzata del vetrino, anche se tale modalit? richiede tempi maggiori. La fase di dispensazione si conclude preferibilmente entro venti minuti dall?ultimo ciclo di risospensione effettuato.

Successivamente, il protocollo prevede una fase di adesione della componente cellulare sul supporto planare, il quale ? vantaggiosamente trattato per conservare le caratteristiche morfologiche delle cellule. I supporti planari adoperati in associazione con l?apparato dell?invenzione nel protocollo automatizzato qui descritto presentano caratteristiche superficiali specifiche e sono preferibilmente funzionalizzati con una deposizione superficiale di nanomateriali. L?adesione della componente cellulare ? condotta a temperatura ambiente ed ha una durata di circa venti minuti.

Segue una fase di aspirazione del surnatante dal supporto planare, preferibilmente con due puntali in due punti distinti in modo tale da lasciare solamente una frazione di liquido (ad esempio 100 ul) sul supporto planare.

A seguire si alternano fasi di dispensazione ed aspirazione (del surnatante) sul/dal supporto planare, prima di PBS, poi della soluzione di fissaggio e infine di una soluzione di lavaggio. Tali operazioni sono eseguite sempre su punti predefiniti, ad esempio quattro punti o due punti, del supporto planare e tutte alla stessa distanza dal supporto medesimo calcolata lungo la direzione z.

In particolare, la dispensazione del reagente avviene contemporaneamente attraverso i due puntali fermi e posizionati in corrispondenza della superficie funzionalizzata del vetrino. I puntali, una volta caricati di reagente, si posizionano sopra i punti definiti ad una distanza predeterminata dalla superficie del vetrino e rilasciano la quantit? voluta di reagente. La distanza ottimale di dispensazione e di aspirazione dal vetrino ? definita sulla base di un intarvallo di valori ottenuto sperimentalmente. Oltre la soglia superiore di detto intervallo (la tolleranza ? inferiore al millimetro), i residui dei reagenti lasciati sul vetrino hanno un volume paragonabile al successivo reagente e questo comporta una diluizione del reagente dispensato successivamente. Al di sotto della soglia inferiore di detto intervallo, l?adesione della componente cellulare ? disturbata dalla presenza del puntale che determina zone del vetrino in cui sono assenti o carenti cellule appunto in corrispondenza delle posizioni assunte dal puntale. Come per tutti i liquidi dispensati sul vetrino (componente cellulare del campione compresa) la presenza di un bordo idrofobico esterno del vetrino e della superficie interna funzionalizzata con materiale idrofilico, preferibilmente nanomateriale idrofilico, consentono al liquido di espandersi e di andare a coprire l?intera area all?interno del confinamento.

Alla dispensazione della soluzione di fissaggio segue preferibilmente un tempo di fissaggio pari a circa venti minuti.

Sar? apprezzato come, vantaggiosamente, i mezzi di prelievo e dispensazione dell?apparato sono dunque ulteriormente configurati per permettere una stabilizzazione ?temporale? delle componenti del campione di sangue attraverso il prelievo e la dispensazione di una soluzione di fissaggio.

In particolare, la fase di stabilizzazione si realizza attraverso la somministrazione della soluzione di fissaggio a detta prima componente e/o a detta seconda componente.

Tale configurazione preferita permette di disporre di un unico apparato automatizzato che ? in grado di migliorare ulteriormente la qualit? del contenuto informativo delle componenti del campione di sangue e di separare in maniera ottimale la fase pre-analitica di preparazione del campione di sangue in ingresso dalla successiva fase analitica delle sue componenti ottenute in uscita, sia in termini temporali (stabilizzazione) che spaziale (immobilizzazione).

Ad esempio, potr? essere utilizzata una soluzione di fissaggio contenente formaldeide in concentrazione non superiore al 4% per la stabilizzazione della componente del sangue che include cellule adese al supporto e una soluzione di fissaggio contenente composti che inibiscono l?apoptosi delle cellule sia contenenti formadeide che non contenenti formaldeide per la stabilizzazione della componente del sangue che include plasma.

? opportuno chiarire in che modo il protocollo automatizzato descritto nell?esempio e implementato dall?apparato dell?invenzione si distingue nell?utilizzo della soluzione di fissaggio sulle componenti del campione di sangue rispetto a quanto prevedono le soluzioni note e quali sono, pertanto, gli associati vantaggi che l?apparato medesimo garantisce.

Come precedentemente menzionato, ad oggi vengono usati tipicamente dei conservanti su campioni di sangue intero che servono, nel caso delle analisi CTC, a evitare che le cellule si deteriorino e muoiano. Tuttavia, a causa della presenza della frazione liquida del campione di sangue, tale modalit? di preservazione riesce di fatto solamente a limitare questo processo. Nel caso della analisi del plasma, detti conservanti servono invece a evitare che le cellule presenti muoiano e rilascino DNA sano, che andrebbe a contaminare il campione. Di fatto, dunque, sono trattate due esigenze complementari ovvero da un lato di preservare la componente cellulare del campione da analizzare e dall?altro di impedire di contaminare il plasma da analizzare.

In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, l?apparato e il protocollo che esso implementa permettono ? diversamente dalle soluzioni note ? di non utilizzare nessun preservante in fase di prelievo del campione di sangue ma solo EDTA che garantisce il minor impatto possibile sul campione, in quanto il campione pu? essere immediatamente processato attraverso un suo inserimento nell?apparato 1.

Infatti, ? vantaggiosamente possibile fissare la prima componente, ottenuta in uscita e contenente cellule, successivamente alla loro immobilizzazione sul supporto, in modo definitivo al fine di renderla stabile e analizzabile nel loro contesto gi? preparato per l'analisi, esattamente come avviene nel caso di fissaggio di sezioni di tessuto su vetrino. In questo caso il fissativo congela lo stato delle cellule che possono essere analizzate all?occorrenza in una fase successiva.

In relazione alla seconda componente comprendente plasma, essendo essa gi? separata dalle cellule, avr? al pi? un contenuto di cellule minimo, comportando un rischio significativamente ridotto di contaminazione e pertanto sar? possibile un utilizzo di conservanti, ovvero una soluzione di fissaggio, ma in quantit? estremamente ridotte rispetto a quanta ne viene utilizzata nelle tecniche note per il sangue intero.

In sostanza, dunque, ? vantaggiosamente possibile sia interrompere il processo di degradazione delle cellule potendo vantaggiosamente fissarle sul proprio supporto (condizione altrimenti non ottenibile con il sangue intero) sia ridurre significativamente (o addirittura eliminare completamente) l'utilizzo dei conservanti per quanto attiene al plasma perch? esso risulta immediatamente sprovvisto della grande parte della componente cellulare potenzialmente contaminante.

Un operatore pu? dunque estrarre i mezzi di alloggiamento 31, 32 dalla camera interna 20 e recuperare la prima e/o la seconda componente in cui ? stato preparato il campione di sangue in ingresso all?apparato 1.

La presente invenzione ? stata fin qui descritta con riferimento a sue forme di realizzazione preferite. ? da intendersi che ciascuna delle soluzioni tecniche implementate nelle forme di realizzazione preferite, qui descritte a titolo esemplificativo, potranno vantaggiosamente essere combinate diversamente tra loro, per dar luogo ad altre forme di realizzazione, che afferiscano al medesimo nucleo inventivo e tutte comunque rientranti nell?ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate.

Claims (15)

RIVENDICAZIONI

1. Apparato (1) per il processamento automatizzato di un campione di fluido corporeo, preferibilmente di sangue intero, per analisi cliniche, in particolare di biopsia liquida, il quale apparato (1) comprende:

? un corpo scatolare (10) comprendente una camera interna (20) e un?apertura (12) di accesso a detta camera interna (20),

? primi mezzi di alloggiamento (31) configurati per ospitare in detta camera interna (20) detto campione,

? secondi mezzi di alloggiamento (33) configurati per ospitare in detta camera interna (20) reagenti,

? terzi mezzi di alloggiamento (32) configurati per ospitare un supporto planare idoneo a ricevere cellule di detto campione,

? quarti mezzi di alloggiamento (31p) configurati per ospitare un recipiente atto a contenere la frazione liquida di detto campione, ? mezzi di prelievo e dispensazione del campione e/o dei reagenti e/o di preparati intermedi del campione in detta camera interna (20), ? mezzi di centrifugazione (40) operativamente associati a detti mezzi di prelievo e dispensazione,

? un?unit? di controllo configurata per comandare detti mezzi di prelievo e dispensazione e detti mezzi di centrifugazione (40) secondo un protocollo automatizzato,

la configurazione complessiva dell?apparato essendo tale che detto protocollo automatizzato permette di ottenere dal campione in ingresso a detta camera interna (20) una prima componente del campione di fluido e/o una seconda componente del campione di fluido separata e distinta da detta prima componente, in cui detta prima componente include cellule del campione immobilizzate su detto supporto planare e in cui detta seconda componente include la frazione liquida del campione contenuta in detto recipiente, in particolare una provetta.

2. Apparato (1) secondo la rivendicazione 1, in cui detti mezzi di prelievo e dispensazione sono ulteriormente configurati per stabilizzare detta prima componente attraverso il prelievo e la dispensazione di una soluzione di fissaggio.

3. Apparato (1) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detti mezzi di prelievo e dispensazione sono ulteriormente configurati per stabilizzare detta seconda componente attraverso il prelievo e la dispensazione di una soluzione di fissaggio.

4. Apparato (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, operativamente associato ad un dispositivo configurato per contare il numero di cellule, in particolare di globuli bianchi, presenti nel campione di fluido.

5. Apparato (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detti mezzi di dispensazione sono configurati per dispensare un singolo strato uniforme di cellule in modo sostanzialmente non sovrapposto sul supporto planare.

6. Apparato (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detti mezzi di prelievo e dispensazione comprendono mezzi di lettura configurati per l?identificazione del campione di fluido corporeo, dei reagenti, della prima componente e/o della seconda componente.

7. Apparato (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detti mezzi di prelievo e dispensazione sono configurati per operare con puntali sostituibili e caricabili in quinti mezzi di alloggiamento (34).

8. Apparato (1) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti e ulteriormente comprendente un sistema di filtrazione (50) configurato per confinare e filtrare i vapori generati dai reagenti in detta camera interna (20).

9. Sistema comprendente un apparato (1) per il processamento automatizzato di un campione di fluido corporeo, preferibilmente di sangue intero, per analisi cliniche, in particolare di biopsia liquida, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, e almeno un supporto planare destinato a ricevere la prima componente e comprendente una superficie di immobilizzazione di elementi cellulari trattata con nano-materiali.

10. Metodo per la preparazione automatizzata di cellule immobilizzate su un supporto planare e della frazione liquida a partire da un campione di fluido corporeo, attraverso un apparato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, il quale metodo comprende le fasi di:

a) fornire ed introdurre il campione di fluido in primi mezzi di alloggiamento presenti nella camera interna (20) di detto apparato (1),

b) prelevare il campione da detti primi mezzi di alloggiamento (31) e dispensarlo in mezzi di centrifugazione (40),

c) centrifugare il campione per ottenere una prima componente comprendente cellule e una seconda componente comprendente la frazione liquida, d) prelevare la seconda componente dai mezzi di centrifugazione (40) e dispensarla in un recipiente, in particolare una provetta, ospitato da mezzi di alloggiamento (31p) presenti nella camera interna (20),

e) prelevare la prima componente dai mezzi di centrifugazione (40) e dispensarla su un supporto planare ospitato da ulteriori mezzi di alloggiamento (32) presenti nella camera interna (20),

f) immobilizzare dette cellule su detto supporto planare.

11. Metodo secondo la rivendicazione precedente, ulteriormente comprendente una fase di fornire elementi reagenti, in particolare una soluzione di fissaggio, in terzi mezzi di alloggiamento (33) di detta camera interna (20) e una fase g) di somministrare la soluzione di fissaggio a detta prima componente e/o a detta seconda componente per ottenere una loro stabilizzazione.

12. Metodo secondo la rivendicazione 10 o 11, ulteriormente comprendente una fase di contare le cellule presenti nel campione di fluido per ottenere un valore di riferimento e di dispensare un numero di cellule su detto supporto planare in funzione di detto valore di riferimento.

13. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 12 in cui il campione di fluido corporeo ? un campione di sangue intero e detta seconda componente comprende plasma.

14. Metodo secondo la rivendicazione precedente in cui la fase di centrifugazione c) permette di ottenere un preparato intermedio comprendente cellule e una seconda componente comprendente plasma, in cui a valle di detta fase d) il metodo prevede ulteriormente di

d?) prelevare elementi reagenti e dispensarli in detto preparato intermedio,

d??) centrifugare il preparato intermedio per ottenere una prima componente comprendente sostanzialmente globuli bianchi,

e in cui la fase e) comprende prelevare i globuli bianchi dai mezzi di centrifugazione (40) e dispensare su detto supporto planare un singolo strato uniforme di globuli bianchi sostanzialmente non sovrapposti.

15. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 14, in cui gli elementi reagenti comprendono Phosphate Buffer Saline, Red Blood Lysis Buffer, soluzione contenente formaldeide.