KR20240035628A - 분석 또는 진단 목적을 위한 생물학적 샘플의 제조 장치 및 방법(apparatus and method for preparation of a biological sample for analytical or diagnostic purposes) - Google Patents

Abstract

본 발명은 체액 샘플의 서로 분리되고 구별되는 하나 이상의 유익한 성분을 수득하도록 구성된, 바람직하게는 액체 생검의 분석을 위한, 체액 샘플의 자동화 처리 장치에 관한 것으로, 상기 제1 성분은 평면형 지지체 상에 고정되는 세포 요소를 포함하고, 상기 제2 성분은 현탁 샘플 세포를 포함하고, 상기 제3 성분은 상기 샘플 액체 단편을 포함하고, 이는 바람직하게는 시험관에 함유된다. 본 발명은 추가로 상기 장치에 의해 구현되는 상기 성분의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

분석 또는 진단 목적을 위한 생물학적 샘플의 제조 장치 및 방법(APPARATUS AND METHOD FOR PREPARATION OF A BIOLOGICAL SAMPLE FOR ANALYTICAL OR DIAGNOSTIC PURPOSES)

본 발명의 기술분야는 후속 분석 또는 진단 목적을 위한 생물학적 샘플의 제조 장치 및 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은, 출발 샘플을 수집하기 위한 지점 근처에서, 바람직하게는 액체 생검에 기반한 분석 또는 진단을 위해, 체액 샘플의 자동화 및 표준화 처리를 허용하고, 특히 다중 병태, 그 중에서도 종양 또는 퇴행성 또는 감염성 병리학, 또는 출생전 환경에서 발견될 수 있는 병리학과 관련된 생물학적 내용물의 분석에 적합한, 상기 샘플의 유익하고 안정적인 성분을 제공하도록 구성되는, 장치에 관한 것이다.

임상 환경에서, 사전 분석 단계(preanalytical phase)는, 다양한 변수의 발생이 샘플 그 자체의 품질, 후속 분석 결과 및 그 유용성에 영향을 끼칠 수 있는 다양한 절차 과정을 포함하므로, 생물학적 샘플을 분석하기 위한 활동에서 중요한 시점을 나타내는 것으로 알려져 있다. 샘플의 적합성 및 허용성은 사전 분석 단계의 기본 구성요소이며, 그에 대한 실험실 연구 결과의 가변성은 매개변수화되어야 한다.

몇 가지 사전 분석 변수가 존재하며, 여기에는 흔히 불확실성, 오류, 및 때로는 실험실에서 관리를 위한 원치 않은 비용 항목을 결정하는 샘플의 수집, 제조, 보존 및 운송과 관련된 생물학적, 생리학적 사건 및 기술적 방식이 포함된다.

상기 언급된 변수는 수득 가능한 결과에 대해 추가적인 불확실성 인자를 추가함으로써 실험실 테스트 결과에 중요한 방식으로 영향을 끼칠 수 있거나, 특히 소위 액체 생검에 기반한 진단에서, 환자의 실제 생물학적 상황에 해당하지 않는 반응을 유발할 수 있다.

액체 생검은, 체액, 예를 들어 말초 혈액의 샘플, 특히 예를 들어 혈액 순환에서 방출되는 종양이 있는 병리학과 관련된 요소의 분석을 통해 생물학적 성분을 식별하고/하거나 특성화하는 것을 목표로 하는 진단 분야, 주로 종양학 진단과 관련된다. 액체 생검의 분석은, 출생전 진단의 경우, 또는 세포 성분을 제거한 후 샘플의 (주로 무세포) 액체 성분으로부터 추출되는 다른 세포-비함유 요소(예를 들어, 핵산, 단백질, 엑소좀)의 경우, 순환 종양 세포(CTC) 또는 태아 세포를 식별하고 특성화하는 것을 목표로 할 수 있으며; 현탁 세포 성분은, 게놈 DNA의 돌연변이 상태를 특성화하고 이를 액체 성분에 존재하는 세포-비함유 DNA의 단편에서 식별되는 돌연변이 특징과 비교하는 매우 유익한 유전적 분석을 위해 사용될 수 있다. 현탁 세포 단편에서, 병리학적 의미가 없는 유전적 돌연변이를 발견할 수 있으며 따라서 이를 확인하는 것은 위양성을 방지하는 기초이며: 개체의 연령에 따라 빈도가 증가하는 이 현상은 CHIP(불확정 잠재성의 클론성 조혈증(Clonal Haematopoiesis of Indeterminate Potential))로 알려져 있고 잘못된 진단의 주요 원인 중 하나를 나타낸다. 현탁 세포 성분은 추가로 면역 세포의 단백질체학 및 전사체학 분석에 사용될 수 있다. 그러나, 세 가지 성분은 서로 상이한 샘플 제조 요건 및 분석 방식을 가지며, 이는 다회 수집에 의존하지 않으면서 이들 전부로부터 임상 정보를 얻을 가능성을 제한한다.

샘플의 완전성 및 조성을 유지하기 위하여, 샘플 제조 사전 분석 활동에서 사용되는 공지된 장치 및 방법은 일반적으로 서로 매우 다른 원인, 예를 들어 보존 온도, 보존제의 존재 가능성, 원심분리, 여과, 동결, 운송 및 사용되는 시험관/용기의 유형으로 인한 기계적/물리적 스트레스로 인해 문제에 직면한다.

체액은, 수집하는 바로 그 순간으로부터 변질되기 시작하고, 몇 가지 분해(degradation) 현상이 관찰될 수 있다. 세포는 그 내부에 함유된 유전적 물질을 방출함으로써 그 형태를 변형하고 분열되며, 이는 액체 성분에서 순환하는 것과 혼합된다. 액체 성분, 예를 들어 채혈의 경우 혈장에 존재하는 비-세포 물질(엑소좀, 단백질, 소포, 유리 핵산)은 손상되기 시작하고, 결과적으로 정보를 손실하며, 따라서 보존제를 사용하여 그 과정을 중단하거나 적어도 늦추는 것이 필요하다. 그러나, 이러한 물질은, 예를 들어 형태를 변경시키거나 단백질 발현을 방해함으로써 세포 생물학을 방해할 수 있다. 예를 들어, 몇 가지 유형의 보존제는 기질에 대한 부착 또는 마커(marker), 예를 들어 항체에 대한 반응과 같이 세포 반응성을 요구하는 테스트를 수행하고자 하는 경우에 사용 금지된다. 또한, 예를 들어 냉동은 혈장에 대한 분해 현상을 감소시키는 것으로 알려진 기술이지만, 이는 제어되기 어려운 중요한 보존 방식을 나타낸다.

또한, 혈액 샘플의 경우, 샘플 그 자체의 대기 시간 및 운송 방식으로 인해, 전형적으로 혈괴 형성이 관찰되며, 이러한 형성을 방지하기 위한 일반적인 관행은 채혈된 혈액에 항응고제를 첨가하는 것이다. 문제는, 특히 세포학, 혈액학 및 종양학에서, 특히 액체 생검 프로토콜에서 감지되며, 여기서 과도한 응고가 샘플의 비-허용성의 원인 중 하나이다.

다른 예는 혈액학 샘플의 수집과 분석 사이의 경과 시간이며, 이는 신뢰성 있는 결과를 얻기 위한 결정적 인자이다. 실제로, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 항응고제를 사용하는 절차에서, 이것의 혈액 샘플과의 장기간 접촉은 세포 변형을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 절차가 상기 기재된 바와 같이 상기 언급한 분해 과정을 지연시키기 위해 EDTA와 상이한 물질인 보존제를 사용해야 하는 경우, 혈액의 특징 및 그 세포 성분의 반응성은 변할 것이고, 따라서 특히 순환 종양 세포(CTC)와 관련된 분석의 경우, 하류 테스트는(downstream tests) 손상될 것이다.

따라서, 특히 액체 생검의 프로토콜에서, 그 분리 후 그리고 그 유효성을 손상시키지 않는 목적으로, 체액 샘플에 대한 분석을 수행해야 하는 시간과 관련된 공지된 기술의 단점을 극복하려는 해결책에 대한 필요성이 존재한다.

상기와 같은 점을 고려하여, 특히 분해 과정을 늦추기 위한 목적으로 체액 샘플의 여러 성분을 처리하기 위한 여러 가지 요건에 대하여, 상기 방법 및 공지된 장치는 전형적으로 복수개의 샘플을 수집하며, 이어서 이를 분석 유형에 따라 상이한 시간 및 방식으로 처리하고 분석하는데, 이는 해당 순간에 검색/검출이 가능하지만 그럼에도 불구하고 동일한 진단 연구에 우려가 될 수 있다. 이러한 상황은 샘플의 유익한 내용의 균일성 및 분석 실험실에 대한 관리 비용 측면에서 추가 단점을 나타낸다.

공지된 해결책의 추가 단점은, 분석 및 테스트의 임상 유효성이 필연적으로 감소하여, 분석될 샘플의 제조 동안에 작동자에 의해 상당한 조작 활동이 제공된다는 사실과, 여러 진단 환경에서도 샘플을 제조하기 위해 동일한 반복 절차를 적용할 가능성에 기인한다.

공지된 기술의 또 다른 문제는, 다른 샘플 성분으로부터 관심 있는 생물학적 물질을 분리할 수 있도록 하기 위해, 샘플 그 자체에 대한 스트레스 원인을 나타내고/나타내거나 그의 부분적 손실을 유발하는 기술을 사용할 필요가 있다는 사실이다. 예를 들어, 필터 또는 미세유동 시스템에 의한 여과, 자기 비드의 사용 및 세포원심분리가 언급될 수 있다. 예를 들어, 구체적으로 혈액과 같은 세포를 함유하는 액체 샘플의 관리에 대하여, 가장 널리 사용되는 기술적 해결책 중 하나는 세포원심분리 유닛의 사용인데, 실제로 원심분리에 의해 상기 세포는 지지체, 전형적으로 슬라이드 상에서 직접적으로 압착되어 수집된다.

그러나, 실험실에서 현재 사용되고 매우 일반적인 그러한 방식은, 일반적으로 지지체로부터 탈착되는 세포의 경향으로 인한 샘플의 세포 손실뿐만 아니라, 심지어, 세포 내용물을 부분적으로 마스킹함으로써 현미경 아래에서 그의 적절하고 완전한 분석을 손상시키는 균일하지 않은 방식의 그리고 중첩된 평면에서의 세포의 부착 및 형태 손실을 수반한다. 세포 손실 및 형태 손상의 그러한 부정적인 효과를 완화하기 위한 시도가 제안되었지만, 그러한 시도는 실제로 각 실험실에 특정한 수동적 또는 경험적 해결책 내에 국한되거나, 그 효과는 작동자-의존적이다. 그러한 문제는, 이미 세포학적 분석과 관련된 경우, 체액 샘플 내의 희소성을 고려하여 순환 종양 세포의 맥락에서 점점 더 중요해지고 있다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 상기 설명된 문제를 극복하고, 특히 청구범위 제1항에 정의된 바와 같은 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 특징은 상응하는 종속항에 정의되어 있다.

또한, 본 발명은 청구범위 제10항에 정의된 바와 같이, 특히 액체 생검의 화학 분석을 위한, 체액 샘플의 유익한 성분, 특히

- 바람직하게는 평면형 지지체 상에서 안정화된, 제1 고정된 세포 성분,

- 바람직하게는 시험관 내부에서 안정화된, 제2 현탁 세포 성분,

- 시험관 내부에서 안정화된, 제3 액체, 안정성 성분

을 조합하거나 또는 대안적으로 하나 이상, 바람직하게는 복수개를 수득하도록 처리된, 상기 샘플의 자동화 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 장치는, 특히 액체 생검의 화학 분석을 위한, 생물학적 샘플의 자동화 처리 장치이며, 이는 출발 물질로서 체액 샘플을 사용한다. 바람직한 실시형태에서, 장치에 의해 처리되는 체액 샘플은 전혈 샘플이다.

장치는 내부 챔버 및 상기 챔버에 접근하기 위한 개구부를 포함하는 박스형 본체를 제공한다. 내부 챔버는 제1, 제2 및 제3 하우징 수단을 가지며, 이들은 각각 체액 샘플, 시약 요소, 및 샘플의 세포를 고정하기에 적합한 평면형 지지체를 수용하도록 구성된다. 장치는 액체 및 고체 폐기물을 수집하기 위한 수단도 포함한다. 장치는 내부 챔버에서 샘플 및/또는 시약 및/또는 샘플의 중간 제제를 수집하고 분배하기 위한 수단을 더 포함한다.

장치는 상기 수집 및 분배 수단과 작동적으로 결합된 원심분리 수단 및 제어 유닛을 더 포함한다. 제어 유닛은 자동화 프로토콜에 따라 수집 및 분배 수단, 및 원심분리 수단을 제어하도록 구성된다.

상기 장치의 전체 구성은, 상기 자동화 프로토콜에 따라, 상기 장치에 의해, 내부 챔버로 들어가는 생물학적 체액 샘플로부터 샘플의 제1 성분 및/또는 샘플의 제2 성분 및/또는 샘플의 제3 성분 및 프로세스 폐기물 성분을 수득하게 하며, 여기서 상기 성분 각각은 서로 분리되고 구별된다.

제1 성분은 상기 평면형 지지체 상에 고정된 샘플의 세포를 포함하며, 제2 성분은, 바람직하게는 시험관에서 이용가능하도록 제조된, 액체 현탁액 중의 샘플의 세포를 포함하며, 제3 성분은, 바람직하게는 시험관에서 이용가능하도록 제조된, 샘플 액체 단편, 예를 들어 혈장을 포함하며, 제4 성분은 프로세스 액체 폐기물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 장치에 의해, 프로세스 액체 폐기물 외에도, 상기 언급한 세 가지 유익한 성분 중 적어도 두 가지 성분이 동시에 수득된다.

유리하게는, 본 발명의 장치는, 오직 항응고제, 바람직하게는 EDTA만을 함유하는 시험관에서 수집한, 평면형 지지체 상의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 샘플을, 상기 장치에 의해 수행되는 빠른 처리 및 안정화로 인해, 시간이 지나도, 예를 들어 최대 1년까지 안정적으로 유지함으로써, 이들의 분석을 제조하게 한다. 따라서, 분석 활동을 관리하는 방식을 상당히 개선시킴으로써 실험실 작업 흐름을 중단할 수 있고, 수득된 샘플의 성분을, 예를 들면 동결시킬 수 있다(실험실 실용성). 다시 말해서, 생물학적 관점에서, 본 발명의 장치는 샘플 수집 후 즉각적인 처리로 인해, 변경되지 않는 분석 결과의 유효성을 보장하는 한편, 샘플 관리 관점에서, 본 발명의 장치는 작동자에게 연속적으로 작업을 강요하지 않는 실험실 분석 흐름을 쉽게 구현하게 한다. 특히, 혈액 샘플의 경우, 본 발명의 장치는 심지어 오직 항응고제, 바람직하게는 EDTA만을 함유하는 시험관에서 수집을 수행하여도, 이에 따라 보존제에 의해 전형적으로 유발되는 샘플 변경을 최소화함으로써 그러한 장점을 얻을 수 있게 한다.

또한, 본 발명의 장치는 하나의 단일 샘플을 처리할 가능성을 허용하여, 이로부터 상기 언급한 세 가지 모든 유익한 성분을 수득할 수 있다. 실제로, 장치로 들어가는 하나의 단일 샘플로부터, 각각 지지체 상에 침착되거나 현탁되어 있는, 샘플의 세포 요소를 포함하는 제1 및 제2 성분, 액체 성분을 포함하는 제3 성분 및 액체 폐기물을 포함하는 추가 성분을 수득할 수 있다. 유리하게는, 그런 다음, 시간이 지남에 따른 보존성 및 안정성을 보장하기 위해, 세 가지 성분의 상이한 요건에 의해 놓인 한계를 극복함으로써, 장치로 들어가는 하나의 단일 샘플로부터 매우 유익하고 임상적으로 유효한 내용을 갖는 세 가지 구별되는 성분을 동시에 수득할 수 있다.

이어서, 본 발명의 특히 유리한 양태는, 상이한 시간/시기에 샘플을 수집하여 필요한 분석 세트를 수행할 필요 없이 그리고 수집하는 동안 체액으로부터 수득하고자 하는 여러 유익한 성분에 대한 특정 보존제 또는 시약이 있는 복수개의 용기를 사용할 필요 없이, 하나의 단일 입장 샘플로부터 여러 성분으로부터의 복수의 정보를 얻을 수 있다는 사실로 나타내어진다.

유리하게는, 본 발명의 장치는 하나의 단일 생물학적 샘플로부터 다음을 수득하게 한다:

- 순환 종양 세포(CTC)를 식별하기에 특히 적합한 입장 샘플의 제1 세포 성분,

- 구체적으로는 예를 들어 액체 단편에 존재하는 유리 핵산에 존재하는 경우 돌연변이 분석의 대조군으로서, 또는 면역 세포의 함량에 대한 특정 분석에 있어서, 특히 그 안에 함유된 백혈구 세포의 핵산 및 단백질 함량의 분석에 적합한, 주로 백혈구 세포로 이루어진 제2 현탁 세포 성분,

- 예를 들어 유리 핵산(세포-비함유 DNA, 세포-비함유 RAN), 단백질, 소포 및 엑소좀과 같은 복수개의 피분석물을 분석하기 위한, 임상 실습에서도 광범위하게 사용되는, 액체 단편, 예를 들어 혈장을 포함하는 제3 성분.

본 발명의 추가의 유리한 양태는, 샘플을 제조하는 프로세스에 거의 완전한 표준화를 제공함으로써, 상기 장치가 분석될 생물학적 샘플을 자동화 방식으로 제조하게 되고, 따라서 후속 분석은 다양한 임상 환경에서 수행될 수 있고 그 결과 효과적인 임상 유용성을 갖게 된다는 사실에 관한 것이다.

바람직한 실시형태에 따라, 상기 장치는 수득된 성분을 지지하기 위한 수단, 특히 평면형 지지 수단을 사용하여 작동하도록 구성되며, 이는 나노물질의 표면 침착을 통해 작용화된다. 특히 슬라이드 형태의, 상기 지지 수단은 임의의 살아 있는 세포의 즉각적이며, 섬세하고 효과적인 부착을 허용하여, 유리하게는 액체 생검의 프로토콜에서 전체 캡쳐 방식을 허용한다.

이렇게 구성된 장치는 시약을 분배하고 완전 평면 방식으로 후속 세척을 수행하게 하여, 이에 따라 많은 양의 시약으로 채워진 용기에 기질을 침지시키는 용액에 대한 필요성이 방지된다.

상기 장치는 흡입 및 분배 속도, 이동된 부피 및 암(arm) 배치 정확성에 의해 유익한 성분 각각의 프로세스 요건이 조정되도록 구성된다.

따라서, 상기는 액체 생검의 프로토콜에서 특히 유리하게 되는데, 그 이유는 샘플의 즉각적인, 자동화 및 표준화 제조로 인하여, 상기 장치는 신선한 샘플(예를 들어, CTC)로부터 실제로 임상적으로 유익한 세포의 실질적으로 온전한 레퍼토리를 갖는 적어도 하나의 성분을 회수하고, 초기 단계의 질병 환경에서도 최대 감도를 얻게 하기 때문이다.

유리하게는, 따라서, 본 발명의 장치는 정착된 또는 현탁된, 또는 액체 단편에 함유된 세포-비함유 성분(샘플로부터 수득한 제3 성분) 상에서, 단일 세포 수준에서 형태학적, 단백질체학적 및 유전적 특징의 후속적인 완전한 분석적 평가를 허용하며; 감지될 수 있는 임상적 분석 정보의 완성 및 여러 유익한 내용의 특징들 간의 비교 둘 모두를 추가로 허용한다.

상기 장치를 사용하여 수득한 제1 성분은 세포학, 면역세포화학, 면역형광, FISH 및 분자 분석과 같은 병리학적 해부학의 전통적인 기술로 분석되기에 적합하다.

현탁 세포 단편으로 이루어진 제2 성분은 FACS 기술, 질량 분광법, ELISA에 의한 단백질체학적 분석, 및 서열 분석에 의한 유전적 연구(NGS, RNAseq, Sanger, 디지털 PCR)에 적합하며, 둘 다에 의해 그 안에 함유된 백혈구 세포에 대한 특정 정보를 얻고, 제3 액체 성분에 존재하는 세포 비함유 DNA에서 식별되는 돌연변이를, 제2 성분에 존재하는 현탁 세포로부터 추출된 세포 게놈 DNA에 존재하는 가능한 돌연변이와 비교하며; 그러한 비교는 제3 성분의 세포 비함유 DNA에 대해 식별되는 돌연변이 결과를 검증하고 이어서 분석 결과를 무효로 하는 가양성 존재를 제외하는 데 필수적이다.

반면에, 제3 성분은 유리 핵산에 대한 유전적 및 후성유전학적 분석(NGS, Sanger, 디지털 PCR) 및 다른 피분석물(예를 들어, 순환 단백질 및 엑소좀)에 대한 다른 분석에 적합하다.

평면형 지지체 상의 세포 성분에 대한 인공 지능으로 가이드된 이미징 분석과, 동일한 세포에 대한 진보된 유전적 서열분석 및 샘플의 액체 성분(무세포 성분)으로부터 그리고 본 발명의 장치로 제조된 현탁 세포 성분으로부터 추출된 요소에 대한 분석의 조합은 임의의 임상 환경에서 액체 생검 테스트의 최대 감도 및 특이성을 허용한다. 수집 동안에 보존제의 부재와, 상당한 성분을 분리하는 데 가장 흔한 방법으로 유도되는 스트레스의 감소의 조합은 유리하게는 샘플로부터 얻을 수 있는 정보의 손실을 감소시킨다.

실질적으로, 본 발명은, 액체 생검의 주요 프로토콜을 구현하는 데 적합한 신선한 체액 샘플의 표준화 및 자동화 제조를 보장하고, 바람직하게는, 세포 성분을 식별하기에 적합한 상기 샘플의 제1 성분을 제공하는 목적으로 세포의 형태학적 특징을 보존하도록 작용화되고 구성된, 특정 지지체, 예를 들어 슬라이드를 사용하는, 이용가능한 사전 분석 장치를 만든다. 표준 현미경 슬라이드 외에도, 대안의 지지체는 커버슬립, 단일- 또는 다중-웰 플레이트일 수 있다.

동시에 본 발명의 장치는, 혈액을 수집하기 위한 테스트-특이적 시험관을 사용하거나 전문 기술자의 도움을 필요로 하지 않으면서, 제1 성분과 함께, 현탁 세포의 분석을 위한 상기 샘플의 제2 성분, 및 상기 샘플의 제3 성분, 특히 세포가 제거된 내용물의 분석을 위한 액체 단편을 포함하는 성분을 제공하도록 구성된다.

본 발명은 그 결과 종양학적 관점에서, 특히 세포 및 희귀한 내용물, 예를 들어 제1 성분에서 CTC, 및 제3 성분에서 순환 핵산 또는 다른 종양 마커를 검색하는 데 있어서, 그리고 제2 성분에 존재하는 현탁 백혈구 세포의 핵산과의 비교에서 특히 유리해진다. 특히, 유리하게는, 제1 성분과 제3 성분 중 하나(또는 둘 모두)의 게놈 함량과, 현탁 세포를 함유하는 성분의 게놈 함량의 가능한 변칙을 비교하여 병리학적 의미를 가지지 않는 백혈구 세포에 존재하는 돌연변이를 구별하는 것이 가능하다. 더 나아가, 예를 들어, 면역치료 관점에서, 전사체학 분석에 의해 현탁 백혈구 세포의 특이적 특징을 분석할 수 있다는 것이 특히 유리하다.

마지막으로, 시스템은, 상이한 양의 샘플을 분석해야 할 수 있는 진단 환경에 대해 유연하게 만들어, 각각의 샘플에 대해 다양한 수, 바람직하게는 1 내지 80개의 슬라이드를 사용함으로써, 하나 이상의 상이한 대상체로부터 유래한 다양한 수, 바람직하게는 1 내지 8개의 샘플을 동시에 관리하도록 프로그래밍될 수 있다.

본 발명의 특징 및 사용 양태와 함께 다른 장점은, 제한적인 목적이 아닌 예시적인 것으로 제시된, 바람직한 실시형태에 대한 하기의 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다.

첨부된 도면에 나타낸 그림을 참조할 것이다:
도 1은 본 발명에 따른 장치의 바람직한 실시형태를 예시하는 전체적인 모습을 나타낸다.
도 2는 도 1에 예시된 장치의 내부의 개략적인 상면도를 나타낸다.
도 3은 도 1의 장치에서 구현되는 처리될 체액 샘플을 수용하기 위한 수단의 바람직한 실시형태를 나타낸다.
도 4는 도 1의 장치에서 구현되는 시약 및 폐기물을 수용하기 위한 수단의 바람직한 실시형태를 나타낸다.
도 5는, 처리될 체액 샘플의 고정된 세포를 보관하도록 의도되고, 바람직하게는 도 1의 장치와 함께 사용되는, 평면형 지지체를 수용하기 위한 수단의 바람직한 실시형태를 나타낸다.
도 6은 도 1의 장치에 포함된 수집 및 분배 수단의 교체가능한 구성요소, 특히 팁(tip)을 수용하기 위한 수단의 바람직한 실시형태를 나타낸다.
도 7은 도 1의 장치에 포함된 원심분리 수단의 바람직한 실시형태를 나타낸다.

상기 언급된 도면을 참조로 하여 이하에 본 발명을 설명할 것이다.

먼저 도 1을 참조하면, 분석 또는 진단 목적으로 생물학적 체액, 특히 혈액의 샘플을 자동화 처리하는 장치의 전체적인 모습이 개략적으로 나타나 있다. 장치는 그 전체가 참조 번호(1)로 표시된다.

장치는 바람직하게는, 특히 액체 생검의, 임상 분석 절차에서 혈액 샘플 제조 시에 응용된다. 그러나, 흡인 바늘을 통해 다른 유형의 체액, 예컨대 소변, 뇌척수액, 흉막액, 기관지 세척액, 가래, 세포학적 수집물을 사용하는 것으로 액체 생검의 다른 응용이 배제되지 않으며, 그 샘플은 일반적으로 몇 가지 유익한 생물학적 단편으로 구성된다(무세포 성분 및 세포 성분). 또한, 세포학, 면역학, 병원체 검색과 같은 다른 분야에서 그리고 모든 세포원심분리 응용에 대한 대안으로서의 유리한 응용이 배제되지 않는다.

장치는 바람직하게는 벤치 툴이며, 내부 챔버(20), 및 상기 내부 챔버(20)에 접근하기 위한 개구부(12)를 갖는 박스형 본체(10)를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 하기 기재되는 구성요소는 내부 챔버(20)에 포함되며, 여기서 생물학적 샘플을 제조한다.

하기 기재되는 바와 같이, 장치(1)는 바람직하게는 상기 내부 챔버(20)에 존재하는 공기 및/또는 증기를 여과하기 위한 시스템을 구비한다. 그러한 시스템은 그 전체가 참조 번호(50)로 표시된다.

내부 챔버(20)는 체액 샘플, 그 중간 제제, 시약, 폐기물, 및 장치(1)로 수득된 상기 샘플의 유익한 성분을 수용하도록 구성된 하우징 수단을 수용하기 위한 복수개의 영역 또는 구역으로 나뉜다.

하우징 수단은 바람직하게는 이동가능하고, 박스형 본체(10)의 개구부(12)를 통해 삽입하고/꺼내어, 그 내용물을 삽입하고/회수하고/교체할 수 있다.

도 2는 장치(1)의 내부의 개략적인 상면도를 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, 내부 챔버(20)는 하우징 수단을 장치로부터/장치로 꺼내고 삽입하는 것을 용이하게 하고 그의 정확한 배치를 보장하기 위해 하우징 수단과 결합되도록 구성된 가이드 수단(21)을 포함한다. 도 2에서, 가이드 수단은, 예로서, 받침대로서 수용하고 하우징 수단을 슬라이딩하도록 구성된 내부 챔버(20)의 지지체 평면(20a)에 의해 운반되는 트랙으로서 예시된다.

장치(1)는 바람직하게는 예를 들어 1 밀리미터 또는 5 밀리미터의 교체가능한 팁을 사용하여 작동되도록 구성된 수집 및 분배 수단을 포함하는 (샘플, 시약 및 그 중간 제제의) 이동 시스템을 추가로 구비한다.

액체를 수집하고 분배하기 위한 활동은 바람직하게는, 예를 들어 서로 직교하는 세 개의 축을 따라, 이동가능한 암을 통해 수행되며, 이는 유리하게는 서로 독립적인 2개의 수집/분배 채널을 포함한다.

상기 암은 내부 챔버(20)의 관심 있는 지점에서, 특히 하우징 수단에서의 배치를 위해 팁의 공간 내에서 움직임을 허용한다. 상기 암은 내부 챔버(20)의 복수의 샘플 제조 중간 위치에서 액체를 이동시킨다.

예를 들어, 암 움직임은 xy 평면 상에서 팁을 배치하는 한편, 이동가능한 암에 대한 상기 채널의 상대적인 움직임은 평면 xy에 직교하는 z 방향을 따라 팁을 배치시킨다. 상기 채널은 z 방향을 따라 움직임을 구현하도록 이동가능한 암과 일체형인 가이드에 의해 이동가능한 암에 슬라이딩 방식으로 결합될 수 있다. 두 채널 간의 거리(축 사이)는 바람직하게는 고정된다.

이동 시스템은 바람직하게는 10분의 1 밀리미터 정도의 배치 정확성 및 분해능을 갖는다. 이동 시스템, 특히 수집 및 분배 수단은, 예를 들어 하우징 수단에 수용될 수 있는 용기, 병, 시험관 또는 슬라이드가 아닌, 오직 액체만을 이동시킨다.

상기 수집 및 분배 수단은 수행된 절차의 유형에 따라 상이한 속도로 절차를 수행하도록 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 수집 및 분배 수단은, 이상적으로 1 ul(마이크로리터) 미만, 바람직하게는 0.3 ul의 정확도로, 소량의 체액 이동이 제어되게 하고 3 ul/s(마이크로리터/초), 바람직하게는 1 ul/s의 속도 한계에서 정확성을 얻기 위해 스테핑 모터(stepping motor)를 구비한다. 이는 유리하게는 느리고, 일정하며, 균일한 흡입 및 분배를 얻게 하는데, 그 특징은 샘플의 수동 처리에서는 보장되지 않고 그 안정성에 영향을 미친다.

장치(1)의 바람직한 실시형태에서, 심지어 상기 팁은, 예로서 도 6에 나타내고 참조 번호(34)로 표시한 하우징 수단에서 장착될 수 있다. 유리하게는, 수집 및 분배 채널에 의해 사용된 팁을 교체하여 시약 및 샘플의 오염을 방지할 수 있다.

장치는 수집 및 분배 수단과 작동적으로 결합된 원심분리 수단(40), 및 제어 유닛을 더 포함한다. 후자는 이하에서 보다 상세하게 기재되는 자동화 샘플 제조 프로토콜에 따라 원심분리 수단(40), 및 수집 및 분배 수단을 제어하도록 구성된다. 제어 유닛은 바람직하게는 상기 내부 챔버(20) 외부에 배치된다.

장치의 전체 구성은, 자동화 프로토콜에 의해, 내부 챔버(20)로 들어가는 샘플로부터 하나 이상, 바람직하게는 복수개의 서로 분리되고 구별되는 샘플의 유익한 성분, 즉 프로세스 폐기물 성분 외의, 샘플의 제1 성분 및/또는 샘플의 제2 성분 및/또는 샘플의 제3 성분을 포함하는 최종 제제를 수득하게 한다.

특히, 제1 성분은 세포를 포함하거나 그것으로 이루어지며, 이는 하우징 수단에 의해 수용되도록 의도된 액체 생검의 분석을 위한 평면형 지지체 상에서 고정된다. 제2 성분은 체액에 현탁된 세포를 포함하며, 이는 전용 수집 수단에 함유된다. 제3 성분은 샘플 액체 단편, 예를 들어 혈장을 포함하거나, 그것으로 이루어지며, 이는 전용 하우징 수단에 또한 함유된다. 폐기물 성분은 샘플 처리의 폐기물, 바람직하게는 액체 폐기물을 수집하며, 이는 전용 수집 수단에 함유된다.

도 3 내지 6의 실시형태를 더욱 참조하여, 내부 챔버(20)에 수용된 하우징 수단의 예를 이하에서 설명한다.

예를 들어, 도 3은 장치(1)로 들어가는 생물학적 체액 샘플을 수용하도록 구성된 제1 하우징 수단(31)의 바람직한 실시형태를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 그러한 하우징 수단은 샘플을 함유하는 시험관을 수용하도록 형상화된, 예를 들어 랙(rack)을 형성하기 위한 복수개의 시트(seat)(31a)를 포함한다. 예를 들어, 각각의 샘플은 10 ml 시험관에 함유될 수 있다. 특히, 혈액 샘플은 Vacutainer®-유형 10 ml 시험관에 함유될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 장치는, 바람직하게는 하나 이상의 상이한 대상체로부터 유래한, 다양한 수의 샘플, 바람직하게는 1 내지 8개의 샘플을, 바람직하게는 각각의 샘플당 2개의 동일한 바이알로, 수용할 수 있다. 상기 시트(31a)는 판독 수단에 의해 시험관에 존재하는 식별 및/또는 추적성 코드의 판독을 수행하게 하는 측면 개구부(31b)를 가질 수 있다.

도 4는 시약을 수용하고 폐기물 성분의 수집 수단을 함유하도록 구성된 제2 하우징 수단(33)의 바람직한 실시형태를 나타낸다. 특히, 제2 하우징 수단(33)은 복수개의 시트(33a)를 포함하며, 각각은 상기 시약 또는 폐기물을 함유하는 각각의 병(33b)을 수용하도록 형상화된다. 본 발명의 장치(1)에 의해 구현되는 절차와 관련하여 사용되는 시약의 예는 PBS(인산염 완충 식염수), RBL(적혈구 용해 완충제), 및 바람직하게는 2% 내지 4%로 포함되는 바람직하게는 포름알데하이드를 포함하는 정착액이다. 완전 로딩된 장치(1)는, 예를 들어 400 ml의 PBS, 300 ml의 RBL, 45 ml의 상기 정착액 및 500 ml의 폐기물을 함유할 수 있다.

도 5는 도 1의 장치로 수득되고 세포를 포함하는 샘플의 제1 성분을 지지하기 위한 수단을 수용하도록 구성된 제3 하우징 수단의 바람직한 실시형태를 나타낸다.

제1 하우징 수단과 관련하여 상기 기재된 것과 유사하게, 제3 하우징 수단은 바람직하게는 예를 들어 랙을 형성하기 위한 복수개의 시트(32a)를 포함하며, 각각은 바람직하게는 평면형 지지체, 특히 슬라이드를 수용하도록 형상화된다. 바람직한 실시형태에서, 장치(1)는 8개의 랙을 수용할 수 있으며, 각각의 랙은 10개 이하의 슬라이드를 수용할 수 있다.

이동 시스템은 평면형 지지체 상에 세포를 분배하는 프로세스를 수행할 것이고, 자동화 프로토콜의 산출물은 바람직하게는 세포, 예를 들어 백혈구 세포의 균질 층을 포함하는 평면형 지지체를 포함한다. 바람직하게는, 제3 하우징 수단(32), 즉 각각의 시트(32a) 및/또는 이에 의해 수용된 각각의 슬라이드는 장치(1)가 추적성 리포트를 생성하는 데 적합한 식별 코드를 갖는다.

구현된 프로토콜의 형태 중 하나에 의해 수득된 샘플의 제2 성분은 용기, 바람직하게는 시험관에서 수집되고, 이는 제4 하우징 수단에 의해 또는 원심분리 수단(40)의 적합한 시트(도 7에서 참조 번호(42)로 표시됨)에 의해 보관되며, 상기 시트에 대해서는 이제 설명할 것이다.

장치에 의해 구현되는 프로토콜에 의해 수득된 샘플, 예를 들어 혈장의 제3 성분은 용기, 바람직하게는 시험관에서 수집되고, 이는 상기 제4 하우징 수단(이는 도면에 도시되지 않았지만 제1 하우징 수단(31)에 대해 상기 기재된 것과 유사한 형상을 가짐)에 의해 보관된다. 제4 하우징 수단은 심지어 샘플의 중간 제제도 수용하도록 내부 챔버(20)에 제공된다. 본 발명의 대안의 실시형태에서, 제1 하우징 수단(31)의 랙의 부분(31p)은 비어 있는 시험관과 함께 내부 챔버(20)에 로딩되며, 이는 샘플을 처리함으로써 수득된 제2 및/또는 제3의 유익한 성분을 함유하는 시험관과 함께 꺼내진다.

상기 언급한 바와 같이, 도 6은 상기 언급된 팁을 수용하도록 구성된 하우징 수단(34)의 바람직한 실시형태를 나타낸다. 특히, 교체가능한 팁이 내부 챔버(20)에, 바람직하게는 분배 및/또는 수집 수단 근처에 보관된다.

액체 형태의 폐기물로 이루어진 성분을 수집하기 위한 수단 외에도, 장치는 샘플을 제조하는 동안 수득된 고체 형태의 폐기물을 수집하기 위한 수단도 포함할 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 장치(1)는 유리하게는, 바람직하게는 이동가능한 암과 일체형인, 판독 수단을 포함한다. 특히, 판독 수단은 유리하게는, 샘플의, 시약 원소의 그리고 샘플의 제조로부터 수득된 제1, 제2 또는 제3 성분에 대해 사용되는 지지체(시험관 또는 슬라이드)의, 독특한 식별 코드를 판독할 수 있는, 예를 들어 광학 유형의, 제1 및 제2 판독기를 포함한다. 이러한 방식으로, 그의 완전한 추적성이 보장된다. 판독 수단에 의한 코드 판독은, 예를 들어 추적성 리포트를 생성할 수 있는 제어 유닛으로 전송된다. 바람직하게는, 제1 판독기는 샘플의 시험관, 바이알, 및 시약을 함유하는 병과 관련된 코드를 판독하도록 구성된다. 바람직하게는, 제1 판독기의 광학 빔은 내부 챔버(20)의 지지체 평면(20a)에 실질적으로 평행한 평면에 포함된다. 제2 판독기의 광학 빔은 바람직하게는 내부 챔버(20)의 지지체 평면(20a)에 실질적으로 직교하는 평면에 포함되며, 바람직하게는 평면형 지지 수단 및/또는 각각의 시트(32a)와 관련될 수 있는 코드를 판독하도록 구성된다.

도 7을 더욱 참조하면, 원심분리 수단의 바람직한 실시형태가 나타나 있고(케이스는 도면에 나타내지 않음), 이는 그 전체가 참조 번호(40)로 표시된다. 원심분리 수단은 바람직하게는 회전가능한 드럼 또는 바스켓(41)을 포함하며, 이는 드럼(41)의 회전 축 α에 대해 방사상의 방향으로 주변에 배열된 복수개의 시트(42)를 구비한다. 상기 원심분리 수단을 움직이는 모터는 바람직하게는 스테퍼 모터이다. 상기 복수개의 각각의 시트(42)는 상기 회전 축 α에 대해 실질적으로 평행한 방향을 따라 전개되며, 이는 샘플, 그 중간체 제제, 또는 상기 언급된 샘플의 제2 유익한 성분을 함유하는 시험관을 수용하도록 형상화된다. 다수의 시트는, 예를 들어 각각 30 ml씩 8개 이하의 시험관을 함유하도록 제공될 수 있다. 본 발명의 대안의 실시형태에서, 각각의 시트(42)는 중간 제제의 샘플을 함유하는 상이한 크기의 몇몇 시험관을 수용하도록 형상화된다.

바람직하게는, 드럼(41) 및/또는 시트(42)는 기울어지고, 시트(42)의 받침대 또는 고정 위치는 자체 전개 방향과 내부 챔버(20)의 지지체 평면(20a) 사이의 올바른 각도를 결정한다. 드럼(41)은 400 g에 해당하는 회전 속도에 도달할 수 있다. 원심분리 프로세스 동안, 원심분리 자체에 의해 도달되는 속도에 따라, 시트(42)는 내부 챔버(20)의 지지체 평면(20a)에 평행한 위치에 도달할 때까지 기울어질 수 있다.

유리하게는, 원심분리 수단(40)은, 드럼(41) 및/또는 시트(42)가 장치(1)의 제어 유닛에 의해 미리 정해진 위치에서 멈추어, 이동가능한 암이 그에 의해 보관된 시험관에 자동화 방식으로 접근할 수 있도록 구성된다.

추가의 구조적 구성요소로서, 상기 원심분리 수단(40)의 움직임을 구현하는 것은 당업자의 이해 범위 내에 속하며, 이는 더 상세하게 설명하지 않을 것이다.

상기 언급한 바와 같이, 장치(1)는 바람직하게는 내부 챔버(20)에 존재하는 공기 및/또는 증기를 여과하기 위한 시스템(50)을 구비한다. 샘플을 제조하기 위한 자동화 프로토콜은 바람직하게는 정착액을 사용한다. 혈액 샘플의 경우, 그러한 용액은 예를 들어 4%의 포름알데하이드를 포함하며, 유리하게는, 상기 여과 시스템(50)은 추가의 외부 봉쇄 수단, 예컨대 화학적 후드를 필요로 하지 않으면서 장치(1)를 안전하게 사용할 수 있게 한다. 본 발명의 추가 실시형태는 다른 유기 화합물, 예컨대 알코올계 정착제를 사용할 수 있으며, 이 또한 여과 시스템(50)의 존재로 인해 추가 봉쇄 수단을 사용하지 않고도 유용하다.

다시 도 2로 돌아오면, 여과 시스템(50)은, 바람직하게는 박스형 본체(10)의 상단 부분에서 조립된 능동 시스템이다. 여과 시스템(50)은 적합한 능동 필터에 의해 시약의 증기를 여과함으로써 이를 장치의 내부에 가두는 강하부(depression)를 구현한다. 여과 시스템(50)은 내부 챔버(20)에서 생성된 증기를 함유하기 위한 강제식 기류를 생성하기 위해 팬 및 필터, 예를 들어 1 내지 3개의 필터를 포함한다(도시되지 않음).

팬의 속도는 자동화 프로토콜의 단계에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 팬에 의해 생성된 기류는 정착액이 여전히 병에 있는 경우 프로토콜의 제1 단계 동안에 최소(즉, 장치(1)로부터 증기 누출을 방지하기에 충분함)로 조정될 것이다. 정착액의 분배 동안에, 즉 증발 속도가 최대인 경우에, 팬은 반대로 정착제 증기의 농도를 감소시키기 위해 보다 큰 흐름을 보장할 것이다. 여과 시스템(50)은 적어도 6개월 간의 작업에 해당하는 작업 로드를 보장하도록 크기가 조정될 수 있다. 장치의 제어 유닛은 바람직하게는 필터를 교체하기 위한 관리 개입 필요성을 사용자에게 신호를 보내도록 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 팬은 자동화 프로토콜의 종료 시에 그의 최대 속도에서 작동하여 거기에 남아 있는 시약의 잔여물로부터 평면형 지지체의 건조 시간을 가속시키도록 제조될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 장치(1)는 생물학적 샘플에 존재하는 세포의 수를 계수하도록 구성된 디바이스에 작동적으로 결합된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 그러한 디바이스는 백혈구 세포의 수를 계수하도록 구성된다.

세포의 수를 계수하도록 구성된 그러한 디바이스는 장치(1)에 포함될 수 있거나, 이는 장치에 작동적으로 결합된 외부 디바이스일 수 있고, 실제로, 이는 샘플 제조에 적합한 희석을 결정하게 한다. 세포의 계수는 바람직하게는 내부 챔버(20)에서 샘플 로딩 동안 수행되는 단계에서 일어나며, 로딩 단계 동안 입장한 샘플을 평가하여 일어날 수 있다.

예를 들어, 전혈에 존재하는 백혈구 세포의 계수와 용해 과정으로 수득된 펠릿(시험관의 하단에 침전된 백혈구 세포)의 높이 간의 선형 상관관계가 실험적으로 검증되었다. 이러한 상관관계를 사용하여, 각각의 샘플에 대한 백혈구 세포의 농도를 알게 되고, 상청액에 대한 펠릿의 높이를 얻는다. 그런 다음, 유리하게는 용해 프로토콜에서 상청액 단편을 미리 결정된 방식으로 제거하는 것이 가능하다. 또한, 심지어 펠릿 부피 및 단일 바이알에 존재하는 백혈구 세포의 총 개수를 용이하게 계산할 수 있다. 상기 언급한 두 개의 매개변수에 따라 시험관에서 완충제 부피를 평가하여, 각각의 샘플에 대해 동일한 밀도를 갖는 세포 재현탁액을 수득할 수 있다. 이러한 프로세스에 의해, 각각의 샘플에 대한 각각의 평면형 지지체 상에 유사한 수의 세포를 분배하게 된다.

이어서 세포 계수 처리는 유리하게는 장치(1)에 의해 구현되는 자동화 프로토콜의 일부 작동 매개변수를 제공한다. 하기에서 상세히 기재되는 바와 같이, 바람직하게는 상기 매개변수에는 샘플 처리 동안 시험관에 침전된 세포 요소(또는 펠릿)의 높이, 및 평면형 지지체 상에 분배될 유사한 밀도의 세포를 수득하기 위한 재현탁 부피가 포함된다.

상기 언급된 바와 같이, 장치의 제어 유닛은, 산출물로서, 바람직하게는 액체, 폐기물을 수용하는 성분 외에도, 평면형 지지체 상에 고정된 세포를 포함하는 제1 성분, 및/또는 현탁 세포를 포함하는 제2 성분, 및/또는 바람직하게는 시험관에 수용된 액체 단편을 포함하는 제3 성분(상기 성분 각각은 서로 분리되며 구별됨)을 제공하게 하는 샘플 제조를 위한 자동화 프로토콜을 구현한다.

전혈로 구성된 생물학적 체액 샘플에 대하여 장치(1)에 의해 구현되는 자동화 프로토콜의 바람직한 실시형태가 하기에서 예로서 기재되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

먼저, 가능한 시약 외에도, 처리될 혈액 샘플이 있는 시험관을, 본 발명의 장치(1)에 로딩한다. 특히, 적합하게 표지한 시험관을 내부 챔버(20)로 도입하고, 이를 각각의 랙(31)에 수용한다. 지지체 영역(20a)의 해당 영역에서 랙(31)의 삽입은 샘플과 관련된 추적성 코드를 판독하기 위한 절차를 작동시킨다. 바람직하게는, 지지체 평면(20a)의 해당 영역에서 각각의 유형의 하우징 수단의 삽입은 하우징 수단 그 자체 및 그 안에 삽입된 지지체 상에 존재하는 추적성 코드 및 상대적 위치를 판독하기 위한 절차를 작동시킨다. 하우징 수단이 내부 챔버(20)에 아직 존재하지 않는다면, 평면형 지지체, 또는 슬라이드, 폐기물 액체의 수집을 위한 시약 및 플라스크, 교체가능한(폐기가능한) 팁, 혈장 및 현탁된 세포 성분의 수집을 위한 시험관, 원심분리 수단(40)의 바스켓(41)의 시트(42) 중의 시험관이 완비된, 하우징 수단이 또한 로딩된다. 혈액의 제1 분취량은 다중 피펫에 의해 수집 및 분배 수단으로부터 바스켓(41)에 존재하는 시험관에 전달된다. 혈액의 흡입 및 분배 속도는 바람직하게는 460 내지 650 ul/s로 구성되며, 각각의 피펫에 대한 전달 부피는 바람직하게는 3 내지 5 ml로 구성된다. 혈액 샘플의 전달 프로세스가 끝나면, 원심분리에 의해 혈액의 세포 부분으로부터 혈장의 분리가 시작된다. 원심분리 수단(40)이 레지미 속도(regime speed)에 도달하고, 이는 바람직하게는 10분 동안 지속되며, 이어서 시험관의 내용물의 재현탁을 방지하기 위해 단조롭고 제어된 방식으로 감속된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 원심분리 수단의 스테퍼 모터는 위치, 회전 속도, 가속 및 감속을 제어하게 한다. 혈액 샘플의 초기 두 가지 성분, 즉 세포 함유 성분 및 혈장 함유 성분이 이렇게 수득된다.

바스켓(41)은 미리 정해진 위치에서 멈추고, 이동가능한 암이 혈장 함유 샘플 성분을 수집하고 전용 봉쇄 요소에 전달한다. 혈장 흡입 속도는 바람직하게는 20 내지 150 ul/s로 구성되고, 보다 바람직하게는 90 내지 110 ul/s로 구성되고, 이는 시간이 지남에 따른 샘플의 자발적 분해로 인한 것과 유사한, 세포 내용물에 대한 손상을 유리하게는 감소시키기 위함이다. 분배 속도는 300 내지 400 ul/s로 구성된다. 각각의 피펫에 대해 전달된 부피는 바람직하게는 2 내지 3 ml로 구성된다.

본 발명의 제1 실시형태에서, 각각의 봉쇄 요소는 바람직하게는 내부 챔버(20)의 하우징 수단(31)의 분할에 의해, 특히 후속 보존 및 폐기를 위한 새로운 시험관에서 보관된다. 본 발명의 제2 실시형태에서, 상기 봉쇄 요소는 이전에 사용되지 않은 원심분리 수단(40)의 시트(42), 특히 새로운 시험관에서 보관되어 제2 원심분리를 수행한다.

전달 절차는 바람직하게는 일련의 피펫에 의해 수행된다. 각각의 혈액 시험관에 대해 바람직하게는 대략 3 ml에 해당하는 혈장 부피가 전달된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 이동가능한 암은 스테퍼 모터를 구비하며, 이는 10분의 1 밀리미터 정도로 z 축 상에서 정확한 배치를 허용한다. 그러한 정확성은 하부 층으로부터 세포 내용물을 가능한 한 흡입하지 않으면서 혈장 부피만큼 흡입 요건을 조절하게 한다.

이어서, 시약이 수집되고, 이들은 바람직하게는 고정량, 예를 들어 1:4의 희석비 또는 30 ml의 최대 최종 부피로, 적혈구 세포의 후속 용해를 위해, 혈액 샘플의 세포 부분(이로부터 혈장이 제거됨)을 함유하는 바스켓(41)의 시험관에 분배된다. 바람직하게는, 세포 부분만을 함유하는 상기 시험관의 내용물을 균질화하기 위해 심지어 재현탁 절차가 수행되고, 이어서 중간체 제제가 수득된다.

시약의 흡입, 분배 및 재현탁 속도는 바람직하게는 500 내지 2000 ul/s, 보다 바람직하게는 1400 내지 1600 ul/s로 구성된다. 각각의 피펫에 대해 전달된 부피는 바람직하게는 4 내지 5 ml로 구성된다. 본 발명의 대안의 실시형태에서, 재현탁은 원심분리 베이스에 회전을 가하는, 영구 자석을 갖는 지지체에 의해 생성된 회전 자기장에 의해 원심분리 시에 각각의 시험관의 하단에 놓인 작은 자석을 고속으로 원운동시킴으로써 수행될 수 있다.

이 후, 바람직하게는 자동화 프로토콜은 세포, 특히 백혈구 세포 함유 혈액 샘플의 성분을 수득할 때까지 순서대로 (상기 기재된) 희석, 재현탁, 원심분리, 및 상청액 제거 단계를 포함하는, 중간 제제에 대한 일련의 주기적 절차를 제공한다. 제2 원심분리가 제공된 경우, 그러한 원심분리는 중간 제제에 대한 절차의 첫 번째 주기와 동시에 발생한다.

상세하게, 희석 단계에서, 이동 수단은 시약을 수집하고, 이를 세포 단편을 함유하는 시험관에 분배하여(재현탁) 시험관의 내용물을 균질화한다. 빠르게 연속적으로, 마지막 절차는 바람직하게는 5회 반복된다.

대기 시간, 바람직하게는 5분의 대기 시간이 이어진다.

후속 원심분리 단계에서, 제어 유닛은 바람직하게는 회전 속도가 400 g에 해당될 때까지, 바람직하게는 5분에 해당하는 원심분리 시간 동안 원심분리 수단을 작동시킨 후 감속 단계를 수행한다. 감속은 기계적 제동을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 대안의 실시형태에서, 감속은 스테퍼 모터에 의해 제어될 수 있다. 바스켓(41)이 멈출 때, 이동가능한 암은 상청액을, 일반적으로 대략 29 ml 수집하도록 배치되고, 이를 폐기물을 위한 병에 분배한다. 상청액 흡입 속도는 450 내지 550 ul/s로 구성된다. 각각의 피펫에 대해 전달된 부피는 바람직하게는 2 내지 5 ml로 구성된다. 특히, 중간 제제에 함유된 세포 단편의 잔여 부피는 계수 디바이스에 의해 결정되는 백혈구 세포의 수에 따라 자동화 프로토콜에 의해 평가된다.

제2 원심분리가 제공된 경우, 제1 주기 종료 시에, 이동가능한 암은 시트(42) 중의 시험관으로부터 혈장을 흡입하고, 이를 이전에 사용되지 않은 하우징 수단(31)에 놓인 시험관에 분배한다. 혈장 흡입 속도는 바람직하게는 20 내지 150 ul/s로 구성되고, 보다 바람직하게는 90 내지 110 ul/s로 구성되는 한편, 분배 속도는 300 내지 400 ul/s로 구성된다. 각각의 피펫에 대해 전달된 부피는 바람직하게는 2 내지 3 ml로 구성된다.

상기 일련의 주기적 절차는 바람직하게는 원심분리 수단(40)에 수용된 시험관이 바람직하게는 대략 1 ml의 펠릿을 함유할 때까지 3회 동안 반복된다. 시약을 사용하여 중간 생성물을 희석하는 단계는 바람직하게는, 예를 들어 RBL 시약을 사용하여, 1:4 비율로 수행된다. 최종 현탁 단계는, 바람직하게는 PBS를 사용하여 바람직하게는 1:10 비율로 수행된다.

세포, 특히 백혈구 세포의 최적 농도를 지니는 샘플의 성분을 수득하면, 자동화 프로토콜은, 바람직하게는 5회의 재현탁 주기를 제공한다.

이어서, 세포 성분의 부분이 수집되고, 내부 챔버(20)의 제2 하우징 수단(32)에 수용된 평면형 지지체 상에 분배된다. 흡입 속도는 450 내지 500 ul/s로 구성되는 한편, 분배 속도는 바람직하게는 100 내지 500 ul/s로 구성되고, 보다 바람직하게는 300 내지 380 ul/s로 구성된다. 각각의 피펫에 대해 전달된 부피는 바람직하게는 700 내지 900 ul로 구성된다.

슬라이드 상에 세포 성분을 분배하는 단계는, 유리하게는 각각의 평면형 지지체 상에, 백혈구 세포, 바람직하게는 약 2백만개의 백혈구 세포의 실질적으로 균일한 단일 층을 침착시키며, 따라서 이들은 실질적으로 중첩되지 않게 된다.

분배 단계는 유리하게는 하나의 연속적인 분배 팁의 단일 이동으로 발생한다. 특히, 팁은 슬라이드의 작용화 표면에 배치되고, 팁 그 자체가 슬라이드의 작용화 표면의 더 큰 크기, 특히 더 큰 축을 따라 이동하는 동안 연속 분배를 수행한다. 이러한 분배는 빠르다는 장점 및 실질적으로 균일한 부착을 보장한다는 장점을 갖는다.

다른 분배 방법이 가능하다. 예를 들어, 그러한 방식이 보다 긴 시간을 필요로 할지라도, 슬라이드의 작용화 표면에 배치된 2개의 고정 팁에 의해 세포 성분을 동시적으로 분배할 수 있다. 분배 단계는 바람직하게는 마지막으로 수행된 재현탁 주기로부터 20분 이내에 끝난다.

분배 단계 종료 시에, 세포 현탁의 부분은 원심분리 수단(40)의 바스켓(41)의 시트(42)의 시험관의 내부에 이용가능하게 남아 있다. 상기 부분은 본 발명의 장치에 의해 수득될 수 있는 제2 유익한 성분을 구성한다. 상기 부분은 이동가능한 암에 의해 흡입될 수 있고, 이전에 사용되지 않은 하우징 수단(31)에 놓인 시험관에 분배된다. 흡입 속도는 450 내지 500 ul/s로 구성되는 한편, 분배 속도는 300 내지 380 ul/s로 구성된다.

이어서, 프로토콜은 평면형 지지체 상에 세포 성분을 부착시키는 단계를 제공하며, 이는 유리하게는 세포의 형태학적 특징을 보존하도록 처리된다. 본원에 기재된 자동화 프로토콜에서 본 발명의 장치와 관련하여 사용되는 평면형 지지체는 특정한 표면 특징을 가지며, 바람직하게는 나노물질의 표면 침착으로 작용화된다. 세포 성분의 부착은 실온에서 수행되며, 대략 20분간 지속된다.

평면형 지지체로부터 상청액을 흡입하는 단계는 평면형 지지체 상에 액체 단편(예를 들어, 100 ul)만을 남기도록 바람직하게는 2개의 별개의 지점에서 2개의 팁을 사용하여 수행된다. 흡입 속도는 80 내지 120 ul/s로 구성되는 한편, 분배 속도는 1400 내지 1600 ul/s로 구성된다. 각각의 피펫에 대해 전달된 부피는 바람직하게는 600 내지 700 ul로 구성된다.

후속 단계는 평면형 지지체 상에/평면형 지지체로부터 (상청액을) 분배하고 흡입하기 위해, 먼저 PBS로, 이어서 정착액, 그리고 마지막으로 세척액을 번갈아 사용한다. 흡입 속도는 1400 내지 1600 ul/s로 구성되는 한편, 분배 속도는 300 내지 380 ul/s로 구성된다. 각각의 피펫에 대해 전달된 부피는 바람직하게는 500 내지 1000 ul로 구성된다. 그러한 절차는 항상 z 방향을 따라 계산된 지지체 그 자체로부터 동일한 거리에 있는 평면형 지지체의 미리 정해진 지점, 예를 들어 4개의 지점 또는 2개의 지점에서 그리고 이들 모두에서 수행된다.

특히, 시약 분배는 슬라이드의 작용화 표면에 배치된 2개의 고정 팁을 통해 동시에 발생한다. 팁은, 시약이 로딩되면, 슬라이드 표면으로부터 미리 결정된 거리에서 미리 정해진 지점 위에 배치되고, 원하는 부피의 시약을 방출한다. 슬라이드로부터의 최적 분배 및 흡입 거리는 실험적으로 얻은 값의 범위를 기준으로 정해진다. 상기 범위의 상한 임계값 초과에서(공차는 밀리미터 미만임), 슬라이드에 남은 시약 잔여물은 후속 시약과 유사한 부피를 가지며, 이는 연이어 분배되는 시약의 희석을 수반한다. 상기 범위의 하한 임계값 미만에서, 세포 성분의 부착은 팁의 존재에 의해 방해를 받아, 팁에 의해 추정되는 위치에서 세포가 부재하거나 실제로 부족한 슬라이드 영역이 결정된다. 슬라이드 상에 분배된 모든 액체(샘플의 세포 성분이 포함됨)에 대하여, 친수성 물질, 바람직하게는 친수성 나노물질로 작용화된 내부 표면 및 슬라이드의 외부 소수성 에지의 존재에 의해 액체는 제한 영역 내에서 전체 영역을 확장하고 커버하게 된다.

바람직하게는, 정착액의 분배 후, 정착 시간은 사용된 정착제의 유형에 따라 30초 내지 20분으로 구성된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 정착 시간은 대략 20분에 해당하며, 정착제는 4% 포름알데하이드를 함유한다. 본 발명의 대안의 실시형태에서, 정착 시간은 대략 30초에 해당하며, 정착제는 알코올성 용액을 함유한다.

유리하게는, 따라서 장치의 수집 및 분배 수단이 정착액의 수집 및 분배에 의해 혈액 샘플의 성분을 "일시적" 안정화하도록 추가로 구성되는 것으로 이해될 것이다.

특히, 고정된 세포 성분(제1 유익한 성분)에 대하여, 안정화 단계는 정착액의 투여에 의해 구현된다.

유리하게는, 현탁 세포 성분(제2 유익한 성분)은 정착액을 통한 안정화 단계를 필요로 하지 않고 후속 분석을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 대안의 실시형태에서, 상기 성분을 수집한 시험관에서, 후속 분석에서 이를 제조하기 위한 시약을 넣는다.

액체 성분(제3 유익한 성분)의 경우, 정착액의 투여 및/또는 동결을 통해 안정화 단계를 구현할 수 있다. 유리하게는, 그러한 경우, 액체 성분은 제2 원심분리되고, 안정화 단계에 대한 필요성은 존재하지 않는다.

그러한 바람직한 구성은, 시간(안정화) 및 공간(고정) 측면에서, 혈액 샘플 성분의 유익한 내용물의 품질을 더욱 개선시킬 수 있고, 산출물로서 수득된 성분의 후속 분석 단계로부터 입장한 혈액 샘플의 제조를 위한 사전 분석 단계를 최적화 방식으로 분리할 수 있는 이용가능한 단일 자동화 장치를 갖게 한다.

예를 들어, 안정화 단계가 필요한 경우, 알코올계 용액이며 혈장을 포함하는 혈액 샘플을 안정화하기 위해 세포의 세포자멸사를 억제하는 화합물을 함유하는 정착액인, 4% 이하의 농도로 포름알데하이드를 함유하는 정착액이 지지체에 부착된 세포를 포함하는 혈액 성분의 안정화에 사용될 수 있다.

알려진 용액이 무엇을 제공하고 그리고 장치 그 자체가 보장하는 관련 장점이 무엇인지에 대하여, 혈액 샘플의 성분에 대해 정착액을 사용할 때 실시예에 기재되고 본 발명의 장치에 의해 구현되는 자동화 프로토콜이 어떤 방식으로 구별되는지를 설명하는 것이 편리하다.

상기 언급된 바와 같이, 요즘에는 전형적으로 전혈 샘플에 보존제가 사용되며, 이는 CTC 분석의 경우 세포가 악화되어 사멸되는 것을 방지하는 데 유용하다. 그러나, 혈액 샘플의 액체 단편의 존재로 인하여, 그러한 보존 방식은 실제로 이러한 과정을 제한하는 데에만 성공한다. 혈장 분석의 경우, 대신에 상기 보존제는, 기존의 세포가 사멸하고 건강한 DNA를 방출하여 샘플을 오염시키는 것을 방지하는 데 유용하다. 따라서, 실제로, 한편으로는 분석될 샘플의 세포 성분을 보존하고 다른 한편으로는 분석될 혈장을 오염으로부터 방지하는 두 가지 보완적인 요건을 다룬다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 샘플이 장치(1)에서 삽입을 통해 즉시 처리될 수 있기 때문에, 장치 및 프로토콜은, 공지된 용액과 달리, 혈액 샘플을 수집하는 단계 동안 임의의 보존제를 사용하지 않고 샘플에 가능한 한 덜 영향을 끼치는 것으로 보증된 EDTA만을 사용하도록 구현된다.

실제로, 유리하게는, 정확하게는 슬라이드에 조직 절편을 정착시키는 경우 일어나는 것처럼 이미 분석을 위해 제조된 환경에서 안정적이고 분석가능하게 만들기 위한 목적을 갖는 명백한 방식으로, 산출물로서 수득되고 세포를 함유하는 제1 성분을 정착시키고, 이어서 이를 지지체 상에 고정할 수 있다. 이 경우, 정착제는 분석될 수 있는 세포의 상태를 필요한 경우 후속 단계에서 동결한다.

현탁 세포 성분과 관련하여, 단백질, 대사산물 식별을 위한, 그리고 분자 분석을 위한 분석 테스트에서, 특정한 시약(예컨대, 다양한 세포 성분의 추출에 의한 용해 용액)을 첨가한 후, 사용될 수 있는 현탁액에 정착되지 않은 정해진 양의 세포가 이용가능할 수 있게 된다.

혈장을 포함하는 유익한 성분과 관련하여, 이는 이미 세포로부터 분리되었기 때문에, 유의적으로 감소된 오염 위험성을 포함하여, 많아야 최소 함량의 세포를 가질 것이다. 유리하게는, 제2 원심분리 단계를 수행한다는 사실은 이러한 위험을 더욱 감소시킨다. 또한, 본 발명과 관련된, 장치에 의해 수득된 혈장은 대부분의 응용에서 보존액을 첨가하거나 동결할 필요가 없는 것으로 이해될 것이다.

실질적으로, 따라서 유리하게는, 스스로 지지체 상에 유리하게는 정착될 수 있기 때문에(그렇지 않으면 전혈에 의해 수득될 수 없는 상태) 세포 분해 과정을 차단할 수 있고, 잠재적으로 오염되는 세포 성분 대부분이 즉시 제거되기 때문에 혈장이 관련되는 한 보존제의 사용을 유의적으로 감소(또는 심지어 완전히 제거)할 수 있다.

이어서, 작동자는 내부 챔버(20)로부터 하우징 수단(31, 32)을 꺼내고, 장치(1)로 들어가는 혈액 샘플에서 제조되는 제1 성분 및/또는 제2 성분 및/또는 제3 성분을 회수할 수 있다.

지금까지 그 바람직한 실시형태를 참조하여 본 발명을 설명하였다. 예시로서 본원에 기술된 바람직한 실시형태에서 구현된 각각의 기술적 해결책은, 유리하게는 다양하게 결합되어, 동일한 발명의 핵심에 속하지만 모두 하기 보고된 청구범위의 보호 범위 내에 있는 다른 실시형태를 생성할 수 있는 것으로 이해된다.

Claims (15)

1. 액체 생검의 임상 분석을 위한, 체액 샘플의 자동화 처리 장치(1)로서,
   내부 챔버(20), 및 상기 내부 챔버(20)에 접근하기 위한 개구부(12)를 포함하는 박스형 본체(10);
   상기 내부 챔버(20)에 상기 샘플을 수용하도록 구성된 제1 하우징 수단(31);
   상기 내부 챔버(20)에 시약을 수용하도록 구성된 제2 하우징 수단(33);
   상기 샘플의 세포를 수용하기에 적합한 평면형 지지체를 수용하도록 구성된 제3 하우징 수단(32);
   상기 샘플의 액체 단편을 담기에 적합한 용기를 수용하도록 구성된 제4 하우징 수단(31p);
   상기 샘플 또는 상기 시약 또는 상기 샘플의 중간 제제 중 적어도 하나를 상기 내부 챔버(20)로 수집하고 분배하기 위한 수집 및 분배 수단;
   상기 수집 및 분배 수단과 작동적으로 결합된 원심분리 수단(40); 및
   자동화 프로토콜에 따라 상기 수집 및 분배 수단, 및 상기 원심분리 수단(40)을 제어하도록 구성된 제어 유닛
   을 포함하며,
   상기 장치의 전체 구성은, 상기 자동화 프로토콜에 의해, 상기 내부 챔버(20)로 들어가는 상기 체액 샘플로부터 상기 체액 샘플의 하나 이상의 유익한 성분 및 폐기물 성분이 수득되게 하고, 상기 하나 이상의 유익한 성분은 서로 분리되고 구별되는 상기 체액 샘플의 제1 성분, 제2 성분 또는 제3 성분 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 제1 성분은 상기 지지체 평면 상에 고정된 상기 샘플의 세포를 포함하고, 상기 제2 성분은 현탁 샘플 세포를 포함하고, 상기 제3 성분은 상기 용기에 함유된 상기 샘플 액체 단편을 포함하는,
   장치(1).
2. 제1항에 있어서,
   상기 수집 및 분배 수단은 정착액의 수집 및 분배에 의해 상기 제1 성분을 안정화하도록 추가로 구성되는,
   장치(1).
3. 제1항에 있어서,
   상기 수집 및 분배 수단은 정착액의 수집 및 분배에 의해 상기 제3 성분을 안정화하도록 추가로 구성되는,
   장치(1).
4. 제1항에 있어서,
   상기 체액 샘플에 존재하는 세포의 수를 계수하도록 구성된 디바이스에 작동적으로 결합되는,
   장치(1).
5. 제1항에 있어서,
   상기 분배 수단은 상기 평면형 지지체 상에 중첩되지 않는 방식으로 세포의 균일한 단일 층을 분배하도록 구성되는,
   장치(1).
6. 제1항에 있어서,
   상기 수집 및 분배 수단은 상기 체액 샘플, 상기 시약, 상기 제1 성분, 상기 제2 성분 또는 상기 제3 유익한 성분 중 적어도 하나를 식별하도록 구성된 판독 수단을 포함하는,
   장치(1).
7. 제1항에 있어서,
   상기 수집 및 분배 수단은 제5 하우징 수단(34)에서 장착(chargeable)될 수 있는 교체가능한 팁을 사용하여 작동하도록 구성되는,
   장치(1).
8. 제1항에 있어서,
   상기 내부 챔버(20)에서 상기 시약에 의해 발생된 증기를 가두고 여과하도록 구성된 여과 시스템(50)을 더 포함하는,
   장치(1).
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른, 액체 생검의 임상 분석을 위한, 체액 샘플의 자동화 처리 장치(1), 및 나노물질로 처리된, 세포 요소를 고정하기 위한 표면을 포함하고 상기 제1 성분을 수용하도록 의도된 평면형 지지체를 포함하는,
   시스템.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 장치를 통해, 체액 샘플로부터 출발하여, 평면형 지지체 상의 고정된 세포, 현탁 세포 및 액체 단편의 자동화 제조 방법으로서,
    a) 상기 장치(1)의 내부 챔버(20)에 존재하는 제1 하우징 수단에 상기 체액 샘플을 제공하고 도입하는 단계;
    b) 상기 제1 하우징 수단(31)으로부터 상기 샘플을 수집하고 이를 원심분리 수단(40)에 분배하는 단계;
    c) 상기 샘플을 원심분리하여 세포를 포함하는 성분 및 상기 액체 단편을 포함하는 성분을 수득하는 단계;
    d) 상기 원심분리 수단(40)으로부터 상기 액체 단편을 포함하는 성분을 수집하고, 이를 상기 내부 챔버(20)에 존재하는 추가 하우징 수단(31p)에 의해 수용된 용기에 분배하는 단계;
    e) 상기 원심분리 수단(40)으로부터 상기 세포를 포함하는 성분을 수집하거나 조합하는 것 중 적어도 하나를 수행하여, 이를
    상기 내부 챔버(20)에 존재하는 추가 하우징 수단(32)에 의해 수용된 평면형 지지체 상에,
    상기 추가 하우징 수단(31p)에 의해 수용된 추가 용기에
    분배하는 단계; 및
    f) 상기 세포를 상기 평면형 지지체 상에 고정시키는 단계
    를 포함하는,
    방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 내부 챔버(20)의 제3 하우징 수단(33)에 시약 요소를 제공하는 단계; 및
    상기 시약 요소를 상기 제1 성분 또는 상기 제3 성분 중 적어도 하나에 투여하여 안정화를 얻는 단계 g);
    를 더 포함하는,
    방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 체액 샘플에 존재하는 세포를 계수하여 참조 값을 얻고, 상기 참조 값에 따라 상기 평면형 지지체 상의 세포의 수를 분배하는 단계
    를 더 포함하는,
    방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 체액 샘플은 전혈 샘플이고, 상기 제3 성분은 혈장을 포함하는,
    방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 단계 c)에 의해, 세포를 포함하는 중간 제제 및 혈장을 포함하는 성분 형태로 두 가지 초기 성분을 수득하고, 상기 방법의 단계 d)의 하류는
    d') 시약 요소를 수집하고 이를 상기 중간 제제에 분배하는 단계;
    d'') 상기 중간 제제를 원심분리하여 백혈구 세포를 포함하는 중간 성분을 수득하는 단계;
    를 추가로 제공하고,
    상기 단계 e)는 상기 원심분리 수단(40)으로부터 상기 백혈구 세포를 수집하고 중첩되지 않은 백혈구 세포의 하나의 균일한 단일 층을 상기 평면형 지지체 상에 분배하는 것을 포함하는,
    방법.
15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 요소는 인산염 완충 식염수, 적혈구 용해 완충제, 포름알데하이드 함유 용액을 포함하는,
    방법.