CN116601479A - 用于细胞分析的自动化样本制备平台 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及用于对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数的自动化流式细胞计数方法和系统等。

Description

用于细胞分析的自动化样本制备平台

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年7月10日提交的美国临时申请第63/050,637号的权益，该申请通过引用并入，如同在本文中完全阐述的那样。

背景技术

使用流式细胞仪的细胞分析仪器在本领域中是已知的。参见例如公开的美国专利申请第2008/0010019号，其通过引用并入，如同在本文中完全阐述的那样。流式细胞仪引导粒子流通过感测区，在感测区中，粒子可以被光束激发。光束使粒子发出荧光和/或散射光，并且发射的光被滤光器分离成电磁(EM)光谱的各部分。通过研究经过滤的EM光谱，可以执行细胞内容物的分析，并且可以报告某些特征和值。

发明内容

然而，迄今为止，不存在允许以下项的流式细胞仪：(i)包括造血干细胞、祖细胞或T细胞样本的血液样本(例如，脐带血样本)的自动化制备(其中，例如最佳培育和体积细节)被预编程；以及(ii)在制备样本的同一仪器中对造血干细胞、造血祖细胞、T细胞以及甚至白细胞中的至少一种进行分析和计数。此外，不存在如下流式细胞仪：除了(i)和(ii)之外，允许在具有或不具有阴性对照的情况下对单个样本进行分析；或者在具有或不具有阴性对照的情况下对复制样本(例如，双份样本)进行分析。本公开内容描述了这样的仪器。本公开内容还提供了高性能的仪器，其中通过准确和精确地移动具有悬浮固体(例如细胞)的各种液体(例如标本类型)以便正确计数粒子的能力至少部分地改进了仪器的性能。

CD34+干细胞和祖细胞的计数是临床流式细胞术实验室中被最高监管的测试之一。存在四个主要因素促成了该测试的关键性：

(1)在移植前，供体通常经历消除患者的造血系统的化疗和/或放疗，因此患者的恢复取决于足够大量的干细胞的移植以重建造血功能。因此，CD34+细胞的正确计数是强制性的。

(2)针对CD34+计数的监管框架因地理位置而异，然而，针对IVD使用批准的目前可用的定量方法不提供适应这些差异的必要灵活性，从而迫使实验室对实验室开发的关于稀缺和珍贵样本类型的测试进行自我验证，以满足其当地管理机构的要求。

(3)同种异体(非自身)移植包含残留的免疫活性CD3+T细胞，所述残留的免疫活性CD3+T细胞有可能导致移植物抗宿主病(GvHD)，移植物抗宿主病是干细胞移植方案中的潜在的威胁生命的并发症。因此，强制对这些样本中的CD3+T细胞的数量进行计数，但是目前市场上没有允许对样本中的CD34+干细胞和CD3+T细胞进行并行计数的IVD试剂盒，这再次迫使实验室进行用户定义的测试。

(4)目前可用的CD34+计数过程是高度手动的，这导致潜在的人为错误空间并因此需要重新运行样本，从而导致结果的延迟报告或在需要抽取另外的样本的情况下患者/供体的不适。此外，这些样本通常作为紧急(STAT)样本到达实验室，从而扰乱实验室工作流程并迫使实验室工作人员降低其他样本的分析的优先级。这两个因素导致了针对CD34+计数的自动化解决方案的需求。

本文描述的新开发的AQUIOS STEM系统和方法是解决了这些关键方面的首个针对CD34+计数的体外诊断(IVD)解决方案。基于本文描述的自动化AQUIOS流式细胞术系统和方法，提供了用于样本中的自动化CD34+计数和可选的CD3+计数的完整的解决方案，从而形成使人工干预的需求最小化的工作流程。由操作员将样本装载到系统上，并且由分析仪自动执行样本制备和数据分析。这种动手时间的减少在实验室中提供了无缝的工作流程，并使手动操作的数量最小化，并因此使潜在的容易出错的步骤最少化。这也意味着CD34+计数可以由非流式细胞术专家执行，从而使实验室能够在监管实验室办公时间之外(例如在夜班期间或在整个周末)提供CD34+计数。这两个方面都提高了患者护理水平，并缩短了该时间关键的应用的产生结果的时间。

此外，本文描述的AQUIOS STEM系统和方法提供了适应各个监管要求(例如针对CD34+计数的国际血液治疗和移植工程协会(ISHAGE)指南和欧洲药典)的分析选项，各个监管要求在其针对双份运行和阴性对照的使用的要求方面有所不同。这种灵活性还考虑了CD3+T细胞和CD34+干细胞以及祖细胞群的并行计数，这是因为AQUIOS STEM系统提供了总共六(6)种用以选择的分析选项以作为IVD解决方案的一部分。这在市场上是独有的，并消除了对实验室开发的测试进行时间消耗的自我验证的需要。

由AQUIOS STEM系统提供的自动化水平通过使用适合于自动化同时确保数据可追溯性的最高水平的预混合和即用型试剂组合来实现。目前可用的手动测试试剂盒使用用于红细胞裂解(样本制备中的基本步骤)的溶液，所述溶液需要每天从浓缩物中手动制备并且对细胞存活力有负面影响，因此样本需要在实际分析前储存在冰上。相比之下，AQUIOSSTEM系统使用准备好使用并且可以在室温下使用的较温和的红细胞裂解试剂，这使得以对于其他自动化流式细胞术应用已知的方式对CD34+和CD3+计数进行自动化，但不用于干细胞计数。对测试至关重要的所有试剂瓶都编有条形码，具有各自的标识符和基本的质量控制参数(例如试剂类型、试剂批次、首次使用日期、有效期等)，并且所述标识符和基本的质量控制参数与样本信息一起存储在一个数据库中，从而提供当今认证机构强制要求的数据可追溯性水平。

AQUIOS STEM系统在临床研究中对照其断定方法(用于FC500流式细胞仪的干细胞试剂盒)进行了验证，该断定方法被视为市场中针对临床CD34+计数的“黄金标准”并且也被用作其他制造商的手动CD34+计数解决方案的参考。使用AQUIOS STEM系统，通过为CD34+干细胞和祖细胞的计数提供独特的新的解决方案而将“黄金标准”推向了下一个水平，所述新的解决方案减轻了临床实验室的干细胞计数的负担。

附图说明

关于以下附图，将更好地理解本技术的这些和其他特征、方面和优势：

图1A是解决临床实验室的要求的用于CD34+造血祖细胞的鉴定和定量的解决方案的特征清单。

图1B是本文描述的用于对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数的方法的流程图。

图2是诊断仪器的一个示例的透视图，其中，该仪器被示出为与标本自动装载器耦接并包括流式细胞仪。

图3是图2所示的诊断仪器的一部分的放大透视图。

图4是图2至图3的诊断仪器的正面透视图，其示出了操作期间的仪器。

图5是诊断仪器的能够每次对单个标本管进行采样的部分的放大视图。

图6是图2至图5示出的所提出的诊断仪器的外部壳体的正面透视图。

图7是另一示例的外部壳体的正面透视图，其中移除了标本自动装载器，并通过前门插入标本管。

图8是可以在本文描述的方法和系统中使用的软件组件系统的示例。

图9是示出用于CD34+HPC的临床定量的方案组选项的表格，所述方案组选项具有或不具有残留T细胞的分析。

图10A至图10C是示出用于CD34+绝对计数(细胞/μL)的三个CD34+分析选项STEM方案组(双份测试加阴性对照)、STEM双份(双份测试，无阴性对照)和STEM单份(单份测试)的等效性的图表。这三个分析选项针对不包括CD3的测试。

图11A至图11C是示出用于CD34+绝对计数(细胞/μL)的三种CD34+加CD3+分析选项STEM ALLO方案组(双份测试加阴性对照)、STEM ALLO双份(双份测试，无阴性对照)和STEMALLO单份(单份测试)的等效性的图表。这三个分析选项针对确实包括CD3的测试。

图12A至图12C是示出用于CD3+绝对计数(细胞/μL)的三个CD34+加CD3+分析选项STEM ALLO方案组(双份测试加阴性对照)、STEM ALLO双份(双份测试，无阴性对照)和STEMALLO单份(单份测试)的等效性的图表。这三个分析选项针对确实包括CD3的测试。

图13是如示例2中描述的代表性的手动流式细胞术工作流程。

图14是如示例2中描述的代表性的AQUIOS CL流式细胞术系统工作流程。

图15A至图15B是在带有干细胞试剂盒的FC500(替选方法，空白条)和AQUIOS STEM系统(AQUIOS，散列条)的情况下的一个CD34+样本或一批10个CD34+样本的样本处理周转时间和操作员动手时间的图表。

图16A至图16B是每个工作日(图16A)和五天工作周(图16B)的在带有干细胞试剂盒的FC500(替选方法，灰色条)和AQUIOS STEM系统(AQUIOS，红色条)的情况下的质量控制(QC)过程的处理时间和操作员动手时间的图表。

具体实施方式

现在将详细参照所公开的主题的一些实施方式。虽然将结合所列举的权利要求来描述所公开的主题，但是应当理解，所例示的主题并不旨在将权利要求限制于所公开的主题。

随着动员的外周干细胞和祖细胞(PBSC)越来越多地用于移植目的，研究人员与国际血液治疗和移植工程协会(ISHAGE)合作，于1996年描述了一套CD34+计数标准，旨在提供允许高准确度和实验室间再现性的简单、灵敏的方法。所产生的“ISHAGE指南”很快成为了通过流式细胞术对造血CD34+祖细胞计数的黄金标准。1998年，研究小组发布了1996年指南的修改版本，该修改版本通过引入珠以进行绝对计数、添加7-氨基放线菌素D(7-AAD)作为活性染料以排除死亡细胞以及添加缺乏固定剂的裂解试剂例如甲醛。这些修改将基本协议转换为单平台方法，由此产生的“具有活性染料的单平台ISHAGE指南”在20多年后仍然大部分未改变。

ISHAGE指南的标志是从存活的白细胞中得出CD34+细胞的数量的顺序门控策略。该指南还要求双份运行测试以及阴性对照，以便纠正测试变化性以及非特异性细胞和荧光色素结合。

由于顺序门控的选择性，ISHAGE指南使得阴性对照的使用是可选的。相比之下，欧洲药典(Ph.Eur.)要求使用对照物。与ISHAGE指南相比，Ph.Eur.中描述的标准具有法律约束力，如欧洲委员会关于制定欧洲药典的公约以及欧盟和国家药物立法所规定的那样。

作为体外诊断(IVD)系统的一部分的当前可用的软件解决方案不提供在维持IVD状态的同时在具有或不具有阴性对照的情况下运行用于CD34+计数的方案组的灵活性。此外，并非所有CD34+计数试剂盒都包含阴性对照试剂。

尽管顺序ISHAGE门控策略的起点极大地促进了稀有CD34+细胞群的正确定量，但其导致了以下事实：作为终点，所有计数的CD34+细胞都是自动存活的，并且可能难以直接计算所有CD34+细胞中存活的CD34+细胞的百分比。此外，从所应用的门控策略中检索CD45+白细胞的总数以评估总体标本存活力可能具有挑战性。

对于源自脐带血的CD34+细胞，最近发布的第7版“NetCord-FACT脐带血采集、储存、放行和发放国际标准”要求在低温保存前测定脐带血样本后处理的总CD34+计数和总活CD34+计数，并在将脐带血单位发放至临床计划前评估CD34的百分比存活率。

在出于质量控制目的执行CD34+定量的情况下，实验室寻求如下能力：不运行由双份测试和阴性对照组成的“完整”ISHAGE方案组，而是运行单份测试，尤其是当只有少量样本可用于分析时。当前的采集软件没有提供相应地调整方案组以作为IVD解决方案的一部分的灵活性。尽管出于质量控制目的，不一定需要IVD系统，但执行这些测试的大多数实验室都受到高度监管，并因此避免仅为了该目的而验证单独的用户定义的测试。

在血液疾病或非恶性造血系统功能障碍的情况下，从非自体(同种异体)供体的外周血(PB)、骨髓(BM)或脐带血(CB)中收集CD34+细胞。与其中供体和受体是同一个人的自体环境一样，目前动员的PB是同种异体移植方案中CD34+干细胞和祖细胞的最常用的来源。

同种异体造血祖细胞(HPC)移植的成功取决于多种因素，例如合适供体的可用性、人类白细胞抗原(HLA)兼容性、在维持移植的移植物抗白血病/肿瘤效果的同时成功地平衡患者的免疫反应以及其他因素。使用来自动员的外周血的CD34+细胞具有移植后造血功能的恢复相对快的优点，但由于循环T细胞的数量较高而伴随有急性移植物抗宿主病(aGvHD)的增加的风险。由于急性和慢性GvHD影响大约30％至40％经历同种异体移植的患者，并且供体T细胞被认为在介导aGvDH中起着核心作用，因此在许多实验室中，对移植物中的CD3+T细胞和CD34+细胞进行计数已经成为标准做法。由于目前还没有允许在一次测试中对CD34和CD3进行IVD分析的市售试剂盒，因此实验室再次需要依赖于针对该应用验证用户定义的测试。

执行CD34+HPC计数的实验室在数据可追溯性方面受到高度监管，并且需要建立广泛的QC系统，尤其是在进行认证时。这些控制机制的一些关键方面包括：(a)通过充分识别所有样本，避免整个过程中的样本错误识别；(b)用于监视测试过程和仪器的可靠性、准确性、精确度和性能的适当的规定；(c)针对仪器和试剂的功能检查；(d)使用适当的参考材料并记录正在进行的熟练测试；(e)防止使用过期试剂和供应品的过程；以及(f)允许将供应品和试剂的批号、有效期以及制造商与每个标本关联的机制。

特别是方面(e)和(f)可能具有挑战性，这是因为试剂和标本的文件通常并不相互关联，而是“离线”发生，例如不在用于数据获取和分析的平台上发生。

在血液肿瘤学实验室中，HPC样本通常作为紧急(STAT)样本到达实验室并需要立即关注，从而扰乱常规工作流程。关于这些样本的任何问题都会使工作加倍，并因此增加人为错误的可能性。对于这些实验室来说，期望理想地以使采样错误或其他问题的风险最小化的方式将HPC样本整合到正常工作流程中，这是因为CD34+HPC的分析是时间关键的。对于专门从事CD34+计数的实验室，例如脐带血设施，更高程度的自动化将有助于管理数量增加的要分析的样本，同时提供本文所概述的高标准的可追溯性。

目前用于通过流式细胞术进行的CD34+计数的IVD解决方案缺乏自动化能力，主要是由于使用了对细胞存活能力具有负面影响的红细胞裂解试剂，使得制备的样本需要在分析前保存在冰上。ISHAGE指南建议使用氯化铵，这是因为氯化铵基本上是当时唯一可获得的在不需要另外的固定剂并且不会改变感兴趣的细胞群的散射特性的情况下适用于裂解/免洗方法的裂解试剂。虽然氯化铵的使用在基本上所有用于流式细胞术的商用CD34+计数试剂盒中得到良好的确立，但是由于氯化铵对细胞存活能力的影响以及因为工作稀释液需要每天新鲜制备，因此氯化铵的使用阻碍了CD34+测试在自动化样本制备和流式细胞术平台上的实现。

目前，能够获得无需固定剂的即用型红细胞裂解试剂，其在样本制备期间专门裂解红细胞，而对白细胞存活能力无明显影响，从而允许在自动化流式细胞术系统上执行CD34+计数。

用于流式细胞术的理想的CD34+定量试剂盒结合了已建立的标准和方案的益处以及足够的灵活性，以使试剂和软件工具适应临床实验室的需求。这包括：用于不同样本类型的采集和分析板，其不需要设置与IVD解决方案并行的用户定义的测试；满足高度监管的工作环境的要求的质量控制机制；以及高度自动化。参见图1A。

本文所述的用于对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数的方法被设计成具有将所谓的黄金标准提升至“下一水平”的目标。本文所述的方法体现了用于CD34+造血干细胞和祖细胞等的自动化分析的模块化方法。在一个示例中，本文描述的方法包括：用于CD34+计数的软件和试剂盒；用于对来自同种异体供体的样本材料中的CD3+T细胞和CD34+细胞进行同时计数的软件和试剂盒；以及CD34对照细胞(2个水平)，如本文的表1和表2中所述。

表1

表2

其中，“CD45-FITC”通常指由法国Marseille的Immunotech SAS(Beckman Coulter公司)制造的荧光素缀合的抗体，该抗体允许使用流式细胞术对存在于人类生物样本中的表达CD45抗原的细胞群进行分析和计数；“CD34-PE”通常指由法国Marseille的ImmunotechSAS(Beckman Coulter公司)制造的藻红蛋白缀合的抗体，该抗体允许使用流式细胞术对存在于人类生物样本中的表达CD34抗原的细胞群进行分析和计数；“CD3-PC7”通常指藻红蛋白蓝蛋白7缀合的抗体，该抗体允许使用流式细胞术对存在于人类生物样本中的表达CD3抗原的细胞群进行分析和计数。尽管本文中已经指定了诸如FITC、PE和PC7的荧光团，但是可以使用任何合适的荧光团缀合的抗体以允许对表达CD45、CD34抗原和CD3抗原的细胞群进行分析和计数，只要荧光团能够在仪器的检测能力内被检测到。

本文所述的方法可以使用CD34对照细胞，其是稳定的人类白细胞的液体制剂，用于验证作为本文所述的系统的一部分的参数CD34、CD45和CD3。在一个示例中，试剂盒包含两个水平的CD34，约10个CD34+细胞/μL(水平1)和约30个CD34+细胞/μL(水平2)。可以通过扫描对照细胞化验单的条形码来将化验值输入到系统中。

如本文中所使用的，术语“造血干细胞”或“HSC”通常意指具有多能性和在保持其多能性的同时进行再生(自我更新)的能力的细胞，所述多能性允许细胞分化成功能性成熟细胞，例如粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)以及单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)。

如本文中所使用的，术语“造血祖细胞”或“HPC”通常指具有分化成功能性成熟细胞的潜力的细胞，功能性成熟细胞例如粒细胞(例如，早幼粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如，巨核细胞、产生血小板的巨核细胞、血小板)以及单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)。

可选地，HSC和/或HPC从含有造血来源的细胞的身体或身体的器官获得。这样的来源包括未分馏的骨髓、脐带和外周血。可以以本领域技术人员已知的方式针对具有造血干细胞特征的细胞富集所有上述粗制或未分馏的血液产物。

在造血期间，HSC首先分化为祖细胞阶段以进入髓系和淋巴系，然后分别分化为髓干细胞(混合集落形成细胞，CFU-GEMM)并分化为淋巴干细胞。此外，髓干细胞通过红系爆发形成细胞(BFU-E)和红系集落形成细胞(CFU-E)分化成红细胞，通过巨核细胞集落形成细胞(CFU-MEG)分化成凝血细胞，通过粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞(CFU-GM)分化成单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，以及通过嗜酸性粒细胞集落形成细胞(CFU-Eo)分化成嗜酸性粒细胞，而淋巴干细胞通过T淋巴祖细胞分化成T细胞，并通过B淋巴祖细胞分化成B细胞。这些髓干细胞和源自这些髓干细胞的各种造血祖细胞通过它们在各种细胞因子存在下在软琼脂、半固体甲基纤维素培养基等上形成的集落的特性来识别。

在表2所示的示例中，为了分析同种异体来源的样本中的残留CD3+T细胞，可以将可选的同种异体CD3试剂盒与表1中所述的基础试剂盒组合。这两种试剂盒的组合为在一次运行中对CD34和CD3进行联合定量提供了经验证的解决方案，具有在本文所述的三个方案组选项之间进行选择的能力。

考虑到该框架，本公开内容涉及如图1B所示的用于对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数的自动化流式细胞计数方法的自动化流式细胞计数方法，该方法包括：

将一种或更多种血液样本的精确体积(例如，来自同一患者血液样本的血液等分试样)放入位于流式细胞仪的样本制备区域中的样本板的一个或更多个容器中；

使用至少一种试剂来处理所述一个或更多个容器以获得至少一种第一组合物，所述至少一种试剂中的至少一种是至少一种成像试剂，该至少一种成像试剂包含专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素；

将该至少一种第一组合物培育一个时间段以得到至少一种第二组合物，该时间段足以使包含专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素的至少一种成像试剂结合；

使用裂解试剂处理至少一种第二组合物以得到至少一种第三组合物；以及

通过流式细胞术分析至少一种第三组合物，以获得一种或更多种血液样本中的总活造血干细胞计数、总活祖细胞计数以及总活T细胞计数中的至少一个。该方法还可以包括：执行计数珠的精确添加，然后通过流式细胞术分析至少一种第三组合物，以获得一种或更多种血液样本中的总活造血干细胞计数、总活祖细胞计数以及总活T细胞计数中的至少一个。第一组合物还可以包含作为至少一种试剂的示例的活性染料。如本文所讨论的，活性染料的一个示例是7-氨基放线菌素D(7-AAD)。

如本文所讨论的，本文所述的方法可以使用来自本文所述的各种来源的双份血液等分试样来进行。可替选地或另外地，本文所述的方法可以使用阴性对照(或不使用阴性对照)进行。参见例如表1和表2测试方案组。阴性对照可以用于CD34。可替选地，阴性对照用于CD3。并且如本文所述，标记物是CD45(例如，在某些细胞群(包括造血干细胞)上表达的CD45抗原)、CD3(例如，在某些细胞群(包括T细胞)上表达的CD3抗原)和CD34(例如，在某些细胞群(包括造血干细胞)上表达的CD34抗原)中的至少一种。阴性对照可以是同型对照或同抗(isoclonic)对照。在同抗对照中，细胞在过量的相同的未标记的抗体存在下被染色。未标记的抗体占据所有结合位点，从而阻止被标记的抗体特异性结合。因此，检测到的任何信号必须来自于非特异性结合。

至少一种成像试剂可以是任何合适的成像试剂，包括包含荧光报告物的成像试剂。因此，例如，本文预期的成像试剂可以是与荧光报告物缀合的抗体，包括但不限于FITC、PE、PC7等。

本文所述的方法可以提供总活造血干细胞计数、总活祖细胞计数以及总活T细胞计数中的至少一个。

本文所述的方法还包括用于对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数的自动化流式细胞计数方法，该方法包括：

将第一血液样本放入到样本板的第一容器中；

使用至少一种试剂处理第一容器以获得第一组合物f1，并培育第一组合物f1以获得第二组合物s1，至少一种试剂中的至少一种是至少一种成像试剂，该至少一种成像试剂包含专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素；

在培育第一组合物f1的同时，将第二血液样本放入到样本板的第二容器中，并使用至少一种试剂处理该第二容器以获得第一组合物f2，并培育该第一组合物f2以获得第二组合物s2，所述至少一种试剂中的至少一种是至少一种成像试剂，该至少一种成像试剂包含专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素；

使用裂解试剂处理第二组合物s1和s2以得到第三组合物t1和t2；以及

通过流式细胞术分析第三组合物t1和t2，以获得总活造血干细胞计数、总活祖细胞计数以及总活T细胞计数中的至少一个。

在一些情况下，如本文所述，该方法还可以包括进一步制备阴性对照。阴性对照可以在第一组合物f1之前制备；阴性对照可以在第一组合物f1之后制备；或者阴性对照可以在第一组合物f2之后制备。

本文所述的系统和方法具有多种优势。例如，本文所述的系统和方法通过将自动装载、样本制备、试剂管理和条形码扫描和患者跟踪以及数据分析和双向LIS连接整合在一个平台中来简化操作。此外，本文描述的系统和方法允许将CD34+计数添加到现有软件中，使得本文描述的方法的大多数步骤可以自动化。这是通过使用红细胞裂解试剂来实现的，该红细胞裂解试剂符合ISHAGE指南的标准(例如，不洗涤、不添加固定剂、不改变目标群的散射特性)，但可以在室温下储存和处理，即时可用而无需每天从储备溶液中制备工作稀释液，并且对感兴趣的群温和。合适的裂解试剂的示例包括但不限于由法国Marseille的Immunotech SAS(Beckman Coulter公司)制造的VersaLyse裂解溶液。参见例如美国专利第7,30,797号，其广泛描述了裂解试剂并通过引用并入，如在本文中完全阐述一样。

用于绝对计数的珠溶液(参见表1和表2)具有仔细平衡的浮力，不需要在每次移液步骤前单独混合。此外，容纳珠的瓶具有避免蒸发的特殊的盖。

使用用于STAT样本的盒式自动装载器或单管装载器来装载样本，然后使其优先于队列中的其他样本。这确保了无缝的工作流程，而无需中断正在进行的处理。样本制备可以在96孔深孔板或任何合适的样本板中进行，不仅在96孔深孔板或任何合适的样本板中制备样本，而且在其中在处理步骤中处理样本，该处理步骤由被配置成递送至少一种试剂的预定体积的自动化移液器执行。样本制备可以使用用于样本制备和分析的单个探针进行，使得样本制备和分析这两个步骤并行进行，并且在样本制备完成后立即对样本进行分析。

本文所述的系统和方法中使用的试剂包含用于跟踪有效期、机载截止日期、批号和容器号的唯一条形码标识。当样本被处理时，试剂消耗和板使用由本文描述的系统监测。条形码读取器在首次使用时扫描试剂或板，确保“消耗品”信息没有错误或至少基本上没有错误。本文描述的系统认为试剂容器或板在其第一次被系统“看到”时是满容量的。本文所述的系统可以包括试剂跟踪系统，例如存在于AQUIOS CL流式细胞仪(Beckman CoulterLife Sciences,Indianapolis,IN)中的AQUIOS Smart Track试剂跟踪系统，所述试剂跟踪系统提供实时消耗品跟踪，以确保使用了具有正确日期的试剂，并且确保每个样本都有足够的试剂；这消除了因试剂水平不足或试剂缺失而不得不重新运行样本的风险。例如，本文描述的系统将不会运行测试，除非其找到必要的抗体瓶。

本文所述的系统具有另外的优势。例如，本文描述的系统可以具有管条形码读取器，该管条形码读取器能够在不使用手持式条形码扫描器的情况下自动读取标本条形码。系统将管上的条形码与LIS请求进行匹配。标本ID在标本抽吸之前被记录以防止错误识别，并且标本ID在整个运行中被自动跟踪。

可以执行本文所述的方法的系统的示例包括图2至图7所示的诊断仪器10形式的系统。在所示示例中，可以看到自动装载器部分12具有装载在其上的多个标本盒14。在这样的示例中，盒14可以装载有多个相同的标本管或瓶(下文中称为“管”)16、多个标本管16或仅单个标本管16。然后，这些盒按顶装方式装载到自动装载器部分12中，并按照接收的顺序进行处理。在替选方案中，如图4所示，例如，当需要较快的单个样本处理时，标本管可以被直接插入到替选的标本进入点例如门18(在图5中可见)中，并且在任何等待的盒14之前被处理。这提供了由临床医生进行对测试的STAT访问，具有立即运行测试的能力，从而在临床医生需要时中断(但不会负面影响)其他标本管的测试。此外，可以手动插入已经损坏或没有条形码(如下所讨论的)的标本管。

如本文中详细描述的，诊断仪器10一旦接收到标本管16(或标本管盒14)就说明性地执行以下步骤。可以设想，这样的步骤由仪器10执行，而不需要通过临床医生进行干预，并且这些步骤可以根据要执行的特定测试进行修改、添加或删除。应当理解的是，尽管在整个本公开内容中讨论了血液管，但是可以设想，其他类型的体液和样本也在本公开内容的范围内，并且能够在所提出的仪器10中进行分析。例如，骨髓、血清、尿液、滑液、脊髓、腹膜、多种和其他类型的流体或样本可以基本上如以下所描述的进行测试和分析。

可以由仪器10执行的步骤包括：混合(例如，摇动)仍在标本管16中(例如，在自动装载器中)的样本；刺穿标本管16的盖并对所需量的标本进行采样；读取条形码(或任何其他形式的标记/标识)以确认样本/患者ID和/或确认管的类型/尺寸；匹配ID、要执行的测试和所需的试剂，并分配序列号以供计算机跟踪；将标本/样本放置在容纳区域20(例如，在图2至图4中示出为微量滴定板)中的选定的空管或孔中以用于进一步处理；以适当的顺序添加适当的试剂，包括试剂一旦添加就混合，以及进行定时以便适当地制备用于要执行的测试的样本；允许样本与试剂反应规定的培育时间(基于试剂可变)；将样本分到容纳区域20中的多个管/孔中(如果测试需要或要求的话)；通过条形码或其他类型的跟踪设备(例如，RFID)跟踪所有样本、盒、试剂和相关位置；及时从容纳区域吸取制备的样本/试剂组合，并通过流式细胞仪对其进行分析(同时制备后续样本)；根据临床医生启动的决策规则，自动验证结果或保留结果以供查看。

仪器10提供了自动化的和集成的标本采样等，这意味着上述步骤中的每一个(如果特定测试需要的话)可以在仪器10内并且通过仪器10执行，而无需使用另外的诊断装备。此外，如果临床医生需要，这样的步骤可以在没有来自临床医生的任何干预的情况下完成。然而，应当理解，仪器10可以被配置成在出现故障或其他问题的情况下警告临床医生。

在所示示例中，仪器10使用单轴探针载体22，该单轴探针载体22允许在探针载体22沿单轴轨道24移动时执行各种功能。例如，探针载体22(以及因此探针26)可以被定位成当探针载体22处于位置A时从管16中抽采样本，可以在位置B处将样本沉积在容纳区域20中，以及可以在位置C处对试剂进行采样。如果样本在任何时候被放置在可枢转托盘36中(例如，用于对样本进行STAT处理)，则仪器10可以感测到样本的存在，并将其插入到自动装载器12中等待处理的任何样本之前。探针载体22然后可以移动到位置D，使得探针26可以从放置在可枢转托盘36中的管中进行采样。试剂在样本沉积之前或之后(或之前和之后二者)被沉积在容纳区域20中以按照要执行的特定测试所要求的与样本进行反应，并且可以如本文所讨论的那样对其本身进行跟踪。

可以按以下顺序执行步骤。然而，可以设想，某些测试可以跳过一个或更多个步骤，或者可以修改步骤，以便获得期望的血液测试的最佳测试结果。

首先，可以将标本管16装载到预配置的盒14中，盒14适用于要使用的特定标本管16。例如，标本管16可以是常见尺寸的13mmx75 mm标本管，在这种情况下，可以使用图2和图4所示的五管盒14。然而，应当理解，可以使用多种尺寸和类型的标本管16，并且可以相应地设计盒14。盒14甚至可以被配置成保持各种标本管16。如本文所述，如图6所示，各种尺寸的标本管16也可以单独通过门18被插入。

如果标本管16具有盖32，则可以摇动标本管(由盒14保持)，使得血液在管内被搅拌并使血液更加均匀(以用于更准确的采样)。这样的摇动可以发生在站点A处，并且在图4中可以看到盒14处于其摇动位置。

在盒14的摇动期间，探针载体22可以被引导成移动至站点C，并开始对试剂34的适当部分进行采样以用于要执行的测试。然而，如果测试没有考虑在血液采样之前将试剂34放置在容纳区域20上，那么探针载体22可以在从管16中采样血液之后执行这样的步骤。

试剂34(例如，表1和表2中所述的试剂)可以保持在瓶中，如位置C处可以看到的。然而，可替选地或另外地，试剂可以保持在位于其他位置的储存器中，例如，在板基底30上(如图2和图3所示)，或者在可以例如直接与探针26垂直的其他区域(不可见)中。

如本文所述，诊断仪器10还考虑了临床医生可以通过外门18插入标本管16。为了适应这种情况，在示出的仪器10中设置了管接收器38，并且这样的管接收器可以适应多种类型的标本管16(包括小儿管)，如图3至图5中可以看到的。在示出的示例中，标本管16可以由可枢转托盘36保持，该可枢转托盘允许容易地接近和取回标本管16。可替选地，如图4中所示，标本管16可以由可旋转盒40保持。

在对样本和/或试剂34进行采样之间和之后，探针载体22可以移动至探针清洗站28，使得可以清洗探针26。清洗探针26防止了交叉污染，并且因此防止了不准确的测试结果。

在管内(例如，在站点A处)对标本进行充分混合之后，标本通过探针26被采样并被沉积在容纳区域20中的预定孔或管中。根据要执行的测试，例如使用本文所述的方法对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数，可以将标本样本放置在多于一个的孔或管中，并且可以预先吸取相应量的标本(例如血液)。然后，如本文所描述的，在清洗站28处清洗探针26。

根据在将标本样本沉积在容纳区域20之后是否向标本样本中添加试剂，可以将探针载体22移动至站点C以对适当的试剂34进行采样。同样，如果需要多于一种的试剂，则可以在每次试剂34采样之间以及在最后试剂34采样之后，在清洗站28处清洗探针26。

为了将标本样本和试剂沉积在容纳区域20的每个孔或管中，可以将板基底30定位在旋转轴上，使得可以根据板基底30的旋转点而将每个孔或管呈现给探针26。板基底30的这样的构造和旋转移动在美国专利第7,832,292号中公开，该专利通过引用并入本文。

尽管多轴探针载体也可以实现这些目标，但对于单轴装置存在某些优势。例如，单轴装置需要较少的部件和更少的编程，产生较小的仪器10占地面积，更容易对准，更可靠和更稳定，并且最终使其在站点之间的移动更快。

在将标本样本放置在孔或管中之后，使标本样本与试剂反应特定的时间量(取决于要执行的测试和试剂)，然后通过流式细胞仪进行处理以用于分析。可以设想，也可以结合其他测试装备，例如使用电子体积进行细胞大小确定和分化的装备，或者使用吸光度进行血红蛋白测量的装备。

方便地，将容纳区域20用作样本制备与分析之间的公共接口。此外，容纳区域20可以包括固定的或可拆卸的和/或一次性的或可重复使用的部件，从而允许临床医生在使用后选择扔掉整个接口(例如，微量滴定板)。通过将容纳区域20用作制备臂与分析臂之间的公共接口，容纳区域20提供了较少暴露于错误和外部或环境影响的系统。

处理器和被配置成在处理器上运行的软件调度器(未示出)也包含在所公开的系统中。软件调度器可以被编程为例如重新计算固定反应动力学的可用窗口(优化吞吐量，同时保持可再现的反应动力学)(例如，抗体培育、RBC裂解时间、反应淬灭时间等)。图8中示出了可以在本文描述的方法和系统中使用的软件组件系统的示例。

此外，如本文所讨论的，可以在操作期间对多个项编条形码并进行跟踪。这样的编条形码和跟踪可以由软件调度器登记。例如，条形码可以被分配给试剂瓶34、标本管16(对于不同的患者和/或尺寸具有不同的条形码)、鞘液、公共接口(例如，容纳区域20)、制备试剂、珠试剂、盒14等。通过对这些不同的项编条形码，可以跟踪各种重要的信息，例如试剂使用/消耗、每个试剂瓶剩余的测试次数、开放容器的有效期、封闭容器的有效期、化验值等。

软件调度器可以被配置成执行图8中所述的步骤和/或以下步骤：决定此时是否可以添加新的样本，如果另一活动需要优先进行，则推迟门或多装载器(随机访问)；通过调整非动力学反应(如果有的话)或具有更宽的可接受窗口的动力学反应来使样本门18不可用效应最小化；通过为每个动力学反应定义可接受的窗口来使碰撞效应最小化并优化吞吐量；迫使分析花费预定量的时间(按时间/固定体积的样本停止)；针对每个周期使用预定的时间(获取血液、添加试剂(包括混合、分析))，使得所有活动都可以被适当地安排；在确定是否能够接受向调度添加新的样本时使所有调度的样本时间窗口生效，并调度这样的新的样本使得其所有活动在预定时间发生；以及在确定是否可以完成调度时使硬件资源和物理硬件冲突生效。

将仪器10与本文公开的软件调度器结合使用，用以得到第一结果的时间(Time toFirst Result，TFR)可以少于一小时，后续结果约每30分钟或更短时间报告一次。吞吐量可以是每天多于5个样本、多于10个样本、多于20个样本、多于30个样本、多于40个样本、多于50个样本、多于60个样本、多于70个样本、多于80个样本、多于90个样本或多于100个样本，并且结果可以在当天被更快且更早地报告，因此实验室的能力可以显著增加。

在所示示例中，用于获得可报告结果的数据分析是自动化的(例如，门、区域和光标的设置以及可疑结果的标记或通知)。标记/通知方面可以被称为系统中的自动验证特征。

由于所有的样本制备和分析被完全集成在一个仪器10中，因此诊所不需要执行缓慢而冗长的“批量处理”，其中收集样本，并且一旦收集到足够数量的样本就开始进行处理——对整个样本组进行血液处理的每个步骤。相比之下，仪器10被配置成在容纳区域20中自动制备患者样本，因此没有子管需要标记和跟踪，并且需要明显更少的血液和试剂。可以在任何时候将样本装载到系统上，并且在一个示例中，每个样本将在少于一个小时内——例如在少于30分钟、少于20分钟或少于15分钟内——被自动处理并离开系统管道。随后的样本可以在大约30分钟或更短的时间间隔内离开系统管道，尽管确切的时间将根据要执行的测试和所需的样本制备时间而变化。

显著的优点是为实验室节省成本。通过使用一个系统，不仅可以在一天内处理更多的样本，还可以降低系统成本、降低试剂成本并减少手动劳动。因此，拥有和操作仪器10的总成本显著降低。

此外，现有技术工艺和系统及其多个模块和计算机屏幕占据了10至13英尺的宝贵工作台空间。相比之下，诊断仪器10是紧凑的，测量只有31英寸宽，包括自动装载器部分12。图6所示的不具有自动装载器部分的示例需要甚至更小的占地面积。触摸屏计算机/屏幕(未示出)也可以被方便地放置在系统顶部上，保持占地面积小并为实验室腾出宝贵的空间。

可以设想，所提出的系统也可以用于临床研究人员运行一个或更多个固定免疫监测方案组，以用于合同研究、制药药物开发以及大学医学中心和参考实验室的研究。还可以设想，除了所描述的用于干细胞和T细胞分析和计数的测试之外，现有的标准化免疫监测方案组可以用于监测免疫缺陷(HIV-AIDS)、自身免疫性疾病、器官移植反应、传染病、肿瘤学等。这两个应用可以在系统上并行运行。

通常，以下两个特征有助于性能：分辨率(测量具有相同荧光量的两个粒子并赋予它们相同的值的能力)；以及灵敏度(在暗粒子和稍亮粒子之间进行区分的能力)。为了测量这些特性，本文中可以使用“微球”或“珠”。这些微球可以由例如具有已知的荧光值的荧光团标记的材料制成。当这样的微球通过流式细胞仪时，执行了反映由流式细胞仪测量的分辨率和灵敏度值的某些测试。

珠测试后可以进行另一测试，以确保所用试剂执行恰当。受过流式细胞仪领域训练的用户很大程度上基于经验或他们自己的(可变的)洞察力来确定流式细胞仪是否被充分“优化”以使得可以在当天执行所需的诊断测试。

与行业中占主导地位的珠测试和试剂测试相比，要由流式细胞仪执行的诊断测试可以具有不同的最低分辨率和灵敏度需求。可能的情况是，珠测试和试剂测试将向临床医生指示流式细胞仪未被优化，而实际上，流式细胞仪的运行足以执行所需的诊断测试——流式细胞仪只是没有通过假设的珠测试和试剂测试。

因此，可能需要利用已知的患者样本，例如血液处理对照，以便可以将分辨率或灵敏度的任何缺陷缩小至试剂和仪器性能。当使用已知的患者样本(例如血液对照)时，只有试剂和仪器性能会影响测试的分辨率和灵敏度结果。

在某些情况下，已知的患者样本可以用作对照样本/初始测试样本。已知的患者样本的特征在于具有可区分的群体(例如至少两种类型的细胞)，所述可区分的群体与要通过该特定仪器诊断的群体相似或相同。在将执行标准化免疫监测方案组的诊断装置的示例(例如图2至图7所示的诊断装置)中，已知的样本将具有包括要由仪器10分析的细胞类型(例如，CD34+造血干细胞)的细胞内容物。

根据该示例，一旦已知的患者样本运行通过正在进行评估的仪器10，则结果应表明仪器10是否能够检测多种细胞群。如果仪器的分辨率和灵敏度被优化，则结果中应指示不同的细胞群。软件可以用于以本文描述的方式计算离光散射、ECV和/或荧光数据。

所公开的示例还可以用于得出用以衡量仪器10在特定测试上对特定参数的分辨率和灵敏度的统计，并根据运行测试的充分性对该统计进行定量。然后，这样的统计可以用于确定测试中使用的材料是否足够。例如，该统计可以用于定义来自细胞仪/试剂包的最低分辨率和灵敏度需求，然后分析细胞仪/试剂包的运行是否足以对任何患者进行测试。该统计还可以用于确定来自先前患者样本的数据是否应被认可为是准确的。最终结果也可能是证明测试性能合格的数字手段。

示例

示例1：使用本文描述的系统对CD34+造血祖细胞和残留的CD3+T细胞进行计数：验证测试协议等效性

背景

随着动员的外周干细胞和祖细胞(PBSC)越来越多地用于移植目的，Sutherland等人与国际血液治疗和移植工程协会(ISHAGE)合作，于1996年描述了一套CD34+计数标准，旨在提供允许高度的准确性和实验室间可再现性的简单灵敏的方法。所产生的“ISHAGE指南”很快成为针对通过流式细胞仪对造血CD34+祖细胞进行计数的黄金标准。

ISHAGE指南的标志是从存活的白细胞中得出CD34+细胞的数量的顺序门控策略。该指南还要求双份运行测试与阴性对照，以便纠正测试变化性以及非特异性细胞和荧光色素结合。由于顺序门控的选择性，在随后的几年中，ISHAGE指南的作者使阴性对照的使用成为可选的，然而欧洲药典(Ph.Eur.)强制其使用。与ISHAGE指南相比，欧洲药典中描述的标准具有法律约束力，如欧洲委员会关于制定欧洲药典的公约中以及欧盟和国家药物立法中所规定的。

作为IVD系统的一部分的当前可用的软件解决方案不提供在保持IVD状态的同时在具有或不具有阴性对照的情况下运行CD34+计数的方案组的灵活性。此外，并非所有的CD34+计数试剂盒都包含阴性对照试剂。因此，要求实验室验证他们自己的用户定义的测试。

在在同种异体(非自身)环境中移植干细胞和祖细胞的情况下，建议不仅对CD34+祖细胞的数量进行定量，还对移植物中免疫活性CD3+残留T细胞的数量进行定量，以便预测和管理潜在的移植物抗宿主疾病。到目前为止，还没有允许同时分析CD34+祖细胞和CD3+残留T细胞的市售IVD试剂盒，因此实验室再次需要依赖于针对该应用验证用户定义的测试。

AQUIOS STEM系统

此外，本文所述的系统旨在通过为临床CD34+计数提供总共六(6)个不同的采集方案组来克服这些限制(图9)。所有协议都遵循ISHAGE指南的顺序门控策略，并且方案组提供了如下选项：按照ISHAGE所建议的和欧洲药典所强制的运行三项测试的“完整”方案组(双份加阴性对照)；运行不使用阴性对照的可选的ISHAGE方案组；或运行可以用于稀有标本类型的QC目的的单份测试。所有的方案组组合都是IVD解决方案的一部分，无需创建用户定义的测试。

对于同种异体来源的样本中的残留CD3+T细胞的分析，可以将可选的AQUIOS STEMAllo-CD3试剂盒与基础AQUIOS STEM试剂盒相组合。这两种试剂盒的组合为在一次运行中对CD34和CD3进行联合定量提供了经验证的解决方案，同样具有在图9中的本文描述的三个方案组选项之间进行选择的能力。

测试方法

AQUIOS CL流式细胞仪是一种可以用于实现本文所述的方法的系统，并且是在“无清洗”样本制备过程中执行STEM诊断应用的定量自动化分析仪。由于该系统旨在是从标本引入到结果报告都无需对样本进行手动处理的自动化分析仪，因此该系统被称为“装载并运行”流式细胞仪。AQUIOS系统软件和AQUIOS STEM测试和质量控制试剂不需要对荧光强度和光散射的标准化进行用户验证或对颜色补偿设置进行验证。

通过创建请求并在自动装载器中装载包含标本管的盒或在单管装载器中装载标本管来启动自动操作。根据这些请求来自动处理样本。对样本进行染色和培育，使用AQUIOSSTEM裂解液溶来裂解红细胞。使用AQUIOS STEM测试在AQUIOS CL流式细胞仪系统上对白细胞进行分析。STEM样本制备被优化成使用带有锥形深孔的编有条形码的96深孔板进行操作。每个孔保持多至600μL。

AQUIOS STEM系统可以利用多达两个试剂盒：单独的AQUIOS STEM试剂盒或与AQUIOS STEM ALLO-CD3试剂盒相组合。AQUIOS STEM-试剂盒试剂包含CD45-FITC/CD34-PE鼠单克隆抗体试剂、相应的阴性对照(CD45-FITC/CD34-CTRL)、绝对计数试剂(AQUIOSSTEM-计数荧光球)、细胞活性试剂(7-AAD)和即用型裂解试剂。AQUIOS STEM Allo-CD3试剂盒是用于对来自同种异体供体的样本材料中的CD3+T细胞和CD34+细胞进行同时计数的可选的试剂盒。该试剂盒包含CD3-PC7以及适当的阴性对照。

AQUIOS STEM测试使用含有单克隆抗体的AQUIOS STEM试剂盒试剂，所述AQUIOSSTEM试剂盒试剂用于对CD34+HPC/μL的存活绝对计数、CD45+/μL的存活绝对计数和存活的CD34+HPC的百分比进行同时鉴定和计数。如下三个AQUIOS STEM测试作为AQUIOS STEM菜单(图9)的一部分可用：干细胞方案组：双份运行测试加阴性对照(3个孔)；干细胞双份：双份运行测试(无阴性对照；2个孔)；干细胞单份：单份测试(1个孔)。

AQUIOS STEM ALLO测试将AQUIOS STEM试剂盒试剂与AQUIOS STEM ALLO-CD3试剂盒试剂组合使用。这两种试剂盒的组合包含单克隆抗体，并允许对CD34+HPC/μL的存活绝对计数、CD45+/μL的存活绝对计数、存活的CD3+/μL的存活绝对计数和存活的CD34+HPC的百分比进行同时鉴定和计数。三个AQUIOS STEM ALLO测试可用(图9)：STEM ALLO方案组：双份运行测试加阴性对照(3个孔)；STEM ALLO双份：双份运行测试(无阴性对照；2个孔)；STEMALLO单份：单份测试(1个孔)。

所有测试使用43μL的样本，该43μL的样本使用13μL的每种试剂(单克隆抗体和活性染料)染色。培育15分钟后，使用430μL的裂解试剂来裂解样本，然后在裂解培育约15分钟后加入AQUIOS STEM计数。然后将样本混合并抽吸以进行分析。对于AQUIOS STEM/STEMALLO双份或AQUIOS STEM/STEM ALLO方案组，将分别使用2个孔或3个孔。

研究的目的和范围

作为产品表征的一部分，进行该研究以比较经过图9中总结的分析选项的存活的CD34+绝对计数和CD3+T细胞绝对计数的等效性能。

收集并分析了40份新鲜单采样本。为了评估CD34+计数的测试选项之间的等效性，分析选项“STEM方案组”(双份CD34加阴性对照)被用作两个附加分析选项“STEM双份”(双份CD34，无阴性对照)和“STEM单份”(单份测试)的参考。

通过使用分析协议“STEM ALLO方案组”(双份CD34和CD3加阴性对照)作为两个附加分析选项“STEM ALLO双份”(双份CD34和CD3，无阴性对照)和“STEM ALLO单份”(针对CD34和CD3的单份测试)的参考，利用可以包括CD3作为附加标记的分析选项对CD34+和CD3+计数执行相同的测试方案。

研究根据以下内容被执行：CLSI EP09c：使用患者样本进行测量过程比较和偏差估计，经批准的指南，第三版。使用配备有AQUIOS STEM软件和AQUIOS STEM系统试剂的AQUIOS CL流式细胞仪来分析样本。

测试设计

根据制造商的使用说明来执行研究中使用的AQUIOS CL仪器的日常启动和关闭。维护活动被记录在维护日志中。

使用流式检查荧光球和AQUIOS STEM CD34对照细胞来执行日常质量控制(QC)和过程控制运行，以确认仪器的对准并确保性能在指定的化验值内。

使用ACD-A作为抗凝剂来收集用于研究的单采样本，并在使用前将该单采样本储存在2至8℃下。如果白细胞计数低于30,000个细胞/μL，则样本被不加稀释地使用，或者另外，将样本在PBS/6％牛血清白蛋白(BSA)中稀释至白细胞浓度不超过30,000个细胞/μL。根据图1中总结的测试选项，每个单采样本的单个等分试样用于总共12次运行。不包括溶血的标本和含有可见凝块的标本。

通过使用加权戴明回归，根据CLSI EP09c来执行数据分析。估计的偏差的95％置信上限和95％置信下限基于偏差的标准误差进行计算，并与制造商的接受极限(规格)进行比较。

结果

针对CD34+绝对计数的AQUIOS STEM系统测试选项等效性

造血祖细胞移植的结果取决于成功注入足够数量的活CD34+细胞以便在受体中重建造血功能，因此通过流式细胞术准确测定CD34+细胞是移植过程中的关键组成部分。

与用于CD34+计数的其他解决方案相比，AQUIOS STEM系统提供了用于CD34+计数的总共6种不同的方案，所述6种不同的方案具有或不具有可选的对CD3+T细胞的分析(图9)。为了证明这些不同的测试选项之间的等效性，使用不同的选项运行来自相同样本的等分试样，并对这些等分试样进行相关性分析。

在第一组实验中，通过使用不包含CD3的三个分析方案选项(STEM方案组、STEM双份、STEM单份)运行单采样本来评估CD34+细胞/μL的绝对数量，以证明这三个选项之间CD34计数的等效性(图10A至图10C)。为了比较双份执行测试的分析选项(STEM方案组与STEM双份，图10A)，使用两次运行的平均值进行分析。当将包括双份运行的测试选项与单份运行测试选项进行比较时(STEM方案组与STEM单份(图10B)，以及STEM双份与STEM单份(图10C))，将第一次运行的结果用作参考。对于分析的所有回归对，跨分析选项的存活的CD34+细胞绝对计数的等效性能被证明在定义的接受标准内。

在第二组实验中，通过使用旨在用于对CD34+和CD3+细胞进行并行计数的三种分析方案来分析CD34+细胞的数量；所有其他标准保持不变(图11A至图11C)。同样，对于分析的所有回归对，跨分析选项的存活的CD34+细胞绝对计数的等效性能被证明也在具有CD3的分析方案的定义的接受标准内。

总之，用于CD34+计数的具有或不具有CD3的所有六个分析选项均为所分析的相关对提供了等效的结果。

针对残留CD3+T细胞的计数的AQUIOS STEM系统测试选项等效性

在血液疾病或非恶性造血系统功能障碍的情况下，从非自体(同种异体)供体的外周血(PB)、骨髓(BM)或脐带血(CB)中收集CD34+细胞。与其中供体和受体是同一个人的自体环境一样，目前动员的外周血是同种异体移植方案中CD34+干细胞和祖细胞的最常用的来源。

使用来自动员的外周血的CD34+细胞具有在移植后相对快速地恢复造血功能的优点，但是由于循环T细胞的数量较高而伴随有急性移植物抗宿主病(aGvHD)的增加的风险。由于急性和慢性GvHD影响了大约30％至40％的经历同种异体移植的患者，并且供体T细胞被认为在介导aGvDH中起着核心作用，因此在许多实验室中，对移植物中的CD3+T细胞和CD34+细胞进行计数已经成为标准做法。

除了用于CD34+计数的标准测试方案之外，AQUIOS STEM系统还提供了在一次运行中分析CD3+T细胞和CD34+细胞的选项。为了确保不仅针对CD34+分析而且针对CD3+计数的测试选项等效性，执行第三组实验，所述第三组实验对本文所述的3种分析选项的CD3+计数的结果进行比较(图12A至图12C)。对于CD34+，跨分析选项的存活的CD3+细胞绝对计数的等效性能被证明在分析的所有回归对的定义的接受标准内。

结论

AQUIOS STEM系统是用于在AQUIOS CL流式细胞仪上自动分析CD34+造血干细胞和祖细胞的模块化方法，并且旨在克服目前可用的解决方案在方案组和化验灵活性方面的限制。

本研究解决了由系统提供的测试选项在多大程度上导致CD34+和CD3+绝对计数的等效数据的问题，以便排除因选择一个选项而不是另一个选项而造成的潜在的偏差。

总之，可以证明分析的所有回归对的数据的等效性，并且跨分析选项的存活的CD34+细胞绝对计数和存活的CD3+绝对计数的等效性能被证明在定义的接受标准内。

示例2：AQUIOS STEM系统与其断定方法FC500干细胞试剂盒之间的工作流程比较

背景

目前，全球每年进行多于50,000例的造血干细胞和祖细胞(HPC)移植，用于治疗一些血液恶性肿瘤以及用于治疗非血液适应症。

临床实验室依赖市售IVD解决方案进行CD34+HPC计数，以便避免用户定义的测试的时间和资源消耗的验证。大多数试剂盒和软件包作为对1996年和1998年ISHAGE指南的回应被开发，但此后没有更新以满足诊断实验室的不断发展的需求，特别是在自动化能力方面。在血液肿瘤学实验室中，HPC样本通常作为紧急(STAT)样本到达实验室并且需要立即关注，从而中断了常规工作流程。关于这些样本的任何问题都会使工作加倍，并因此增加人为错误的可能性。对于这些实验室来说，期望理想地以使采样错误或其他问题的风险最小化的方式将HPC样本整合到正常工作流程中，因为CD34+HPC的分析是时间关键的。

该示例在周转时间和操作者动手时间方面，将新开发的用于自动CD34+计数的AQUIOS STEM系统的工作流程与其断定方法(用于FC500流式细胞仪的干细胞试剂盒(均为Beckman Coulter公司))进行比较。

传统流式细胞术工作流程的概述

许多用于CD34+计数的传统流式细胞术解决方案——例如用于FC500的BeckmanCoulter干细胞试剂盒——需要手动制备样本、手动创建工作列表、手动数据查看和手动制表数字数据。这种工作流程会导致较长的运行时间、较多的动手时间，并且需要更有经验的操作员。

为了使用断定方法(FC500上的干细胞试剂盒)执行CD34+计数测试，要求操作员手动检查仪器对准、制备对照以验证和调整荧光染料溢出(补偿)、制备并运行过程对照、以及最后制备并运行实际的患者/供体样本。所产生的数据需要被验证并被手动传输到实验室信息系统(LIS)。试剂和质量控制(QC)日志本通常手动保存。代表性的手动流式细胞术工作流程见图13。

AQUIOS CL流式细胞仪工作流程的概述

AQUIOS CL是执行导致测试结果的大部分准备性步骤的自动化系统，因此消除了大部分手动准备步骤。

对于用于在AQUIOS上进行CD34+计数的AQUIOS STEM系统，操作员需要在系统上装载试剂一次、启动仪器、运行QC样本、然后准备在整个剩余工作日内装载和分析患者样本(图14)。

比较方案

此外，本案例研究的目的是：评估用于CD34+计数的AQUIOS CL流式细胞仪设计，并通过与FC500上的Beckman Coulter干细胞试剂盒(断定方法)进行比较来对其产生的工作流程进行建模。本案例研究估计了以下工作流程参数：

周转时间——对于替选系统，持续时间以第一样本制备步骤开始，并以完成的测试结果结束。对于AQUIOS CL系统，持续时间以样本被放入到自动装载器中开始，并以最后一个样本的完成的测试结果被显示结束。对于这两个系统，时间不包括QC。

操作员动手时间——用户根据制造商的使用说明实际执行所提供的测试过程中列出的步骤所需的时间。

通过对样本制备和分析过程进行录像捕获时间点，并使用内部工作流程分析软件对时间点进行建模。

结果

样本处理周转时间和操作员动手时间。该测试案例包括具有动员的外周血的被双份制备加阴性对照的1个样本或一批10个样本的场景。将AQUIOS STEM系统与其断定方法(FC500上的干细胞试剂盒)进行直接比较。示出了包括双份运行加阴性对照的测试的数据。

对于1个标本样本，从样本制备到结果生成的用以得出结果的时间没有显示出大的差异(对于断定方法为56:19分钟，以及对于AQUIOS为53:54分钟；图15A)，这是因为过程步骤主要由与抗体和红细胞裂解试剂的培育时间确定。

然而，根据对于断定为6:23分钟以及对于AQUIOS为0:20分钟，操作员动手时间可以减少95％(图15A)。

对于一批10个标本样本(中型干细胞移植中心的平均每日工作量)，这些差异变得更加突出。从标本制备到结果生成的用以得出结果的时间从对于断定方法的2:40:29小时减少到对于AQUIOS的2:03:54小时(图15B)，操作员动手时间从对于断定方法的1:01:13小时减少到对于AQUIOS STEM系统的3:20分钟(图15B)。

同样对于手动过程，某些步骤可以被并行执行(在第一样本的培育时间期间移取下一个样本等)，10个样本的总时间比一个样本的10倍的总和短。

假设在一年的时段内每个工作日有10个样本，AQUIOS STEM系统每年为实验室节省数百小时的宝贵技术时间。此外，在每天运行平均10个样本的工作量的情况下的较快的用以得出结果的时间支持时间关键的化验例如CD34+计数。

质量控制(QC)过程的处理时间和操作员动手时间

在受管制的环境中，需要通过对仪器设置和要运行的测试二者进行适当的质量和过程控制来控制系统性能。对于FC500上的干细胞试剂盒和AQUIOS二者，流式细胞仪的光学对准和射流系统的日常验证使用流式检查荧光球来执行，所述流式检查荧光球是经化验的荧光球(荧光微球)的悬浮液。作为验证感兴趣的分析参数的过程控制，断定方法使用添加到正常血液样本中的冻干的CD34+细胞(Stem-Trol细胞)，而AQUIOS STEM系统使用稳定的人类白细胞(淋巴细胞、单核细胞和粒细胞)和红细胞的液体制剂，所述液体制剂具有裂解、光散射、抗原表达和抗体染色特性，这些特性代表了在人类全血标本(AQUIOS STEM CD34对照细胞)中发现的特性。

与CD34+计数相关的QC过程所需的总时间从对于断定方法的2:02:22小时减少到对于AQUIOS的1:09:44小时。值得注意的是，QC需要在可以运行患者/供体样本之前完成，这导致每天节省52:38分钟的时间(图16A)。对于5天的工作周，这仅针对QC过程而言就总计达到约4.5小时(图16B)。

用于QC过程的操作员动手时间从每天12:22分钟(断定)减少到1:51分钟(AQUIOS)(图16A)，导致QC过程的总动手时间节省为每周52分钟(图16B)。

结论

在所有测试案例场景中，与断定方法相比，AQUIOS STEM系统所需的动手时间少得多。对于每天10个标本样本的典型的5天工作周，AQUIOS STEM系统使手动工作量减少大约6小时，从而使实验室能够更有效地分配资源。此外，AQUIOS STEM减少了从样本制备到患者结果的总周转时间，这对于诸如CD34+计数的时间关键的测试是必要的。

AQUIOS STEM系统是在“无清洗”样本制备过程中执行对CD34+造血干细胞和祖细胞的计数的定量自动化解决方案。由于该系统旨在成为从标本引入到结果报告无需对样本进行手动处理的自动化分析仪，因此该系统被称为装载并运行流式细胞仪。自动化特征将AQUIOS STEM系统与替选方法(包括替选方法的断定方法，即带有干细胞试剂盒的FC500)区分开来，在替选方法中，许多过程步骤需要手动执行。AQUIOS STEM系统的一体化方法旨在帮助节省时间，并且旨在帮助提高现代实验室的工作流程效率。

以范围形式表示的值应当以灵活的方式解释为不仅包括作为范围界限明确陈述的数值，而且包括该范围内包含的所有单个数值或子范围，就如同明确陈述了每个数值和子范围。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应当被解释为不仅包括约0.1％至约5％，而且包括所指示的范围内的各个值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另外指明，否则陈述“约X至Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。同样，除非另外指明，否则陈述“约X、Y或约Z”与“约X、约Y或约Z”具有相同的含义。

在本文档中，术语“一”、“一个”或“该”用于包括一个或多于一个，除非上下文另外清楚地指明。除非另外指明，否则术语“或”用于指非排他性的“或”。另外，应当理解，本文中采用的且没有另外定义的措词或术语仅出于描述的目的而非限制性的。章节标题的任何使用旨在帮助阅读文档，而不应被解释为限制。此外，与章节标题相关的信息可以出现在该特定章节之内或之外。此外，本文档中提及的所有出版物、专利和专利文献都通过引用整体并入本文，就如通过引用单独地并入一样。如果在本文档与通过引用并入的那些文档之间存在不一致用法，则并入的参考文档中的用法应当被视为对本文档的用法的补充；对于矛盾的不一致之处，请以本文档中的用法为准。

在本文描述的方法中，在不背离本公开内容的原理的情况下，可以以任何顺序执行步骤，除非明确地陈述了时间或操作顺序。此外，指定的步骤可以同时执行，除非明确的权利要求语言陈述了它们是分开执行的。例如，要求保护的做X的步骤和要求保护的做Y的步骤可以在单个操作中同时进行，并且所得过程将落入要求保护的过程的字面范围内。

本文所用的术语“约”可以允许值或范围的一定程度的变化，例如在所描述的值或所描述的范围限制的10％之内、5％之内或1％之内。

本文所用的术语“基本上”是指大部分或大多数，例如至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％，或至少约99.999％或更多。

本文所用的术语“基本上没有”是指小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.001％，或小于约0.0005％或更少或约0％或0％。

本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对本文描述的实施方式进行多种修改。因此，本说明书并不旨在并且不应当被解释为限于给出的示例，而是应当被授予由所附权利要求及其等同物提供的全部保护范围。此外，可以使用本公开内容的一些特征，而不相应地使用其他特征。因此，前面对说明性实施方式的描述或说明性实施方式是为了说明本公开内容的原理而提供的，而不是为了限制本公开内容，并且可以包括对本公开内容的修改和其置换。

Claims (19)

1.一种用于对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数的自动化流式细胞计数方法，所述方法包括：

将一个或更多个血液样本放入位于流式细胞仪的样本制备区域的样本板的一个或更多个容器中；

使用至少一种试剂来处理所述一个或更多个容器以获得至少一种第一组合物，所述至少一种试剂中的至少一种是至少一种成像试剂，所述至少一种成像试剂包括专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素；

将所述至少一种第一组合物培育一个时间段以得到至少一种第二组合物，所述时间段足以使所述至少一种成像试剂结合，所述至少一种成像试剂包括专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素；

使用裂解试剂处理所述至少一种第二组合物，以得到至少一种第三组合物；以及

通过流式细胞术分析所述至少一种第三组合物，以获得所述一个或更多个血液样本中的总活造血干细胞计数、总活祖细胞计数以及总活T细胞计数中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法使用双份血液样本进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法使用阴性对照进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述阴性对照针对CD34。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述阴性对照针对CD3。

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，所述标记物是CD45、CD3和CD34中的至少一种。

7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，所述至少一种成像试剂包括荧光报告物。

8.根据权利要求1至7所述的方法，其中，所述至少一种成像试剂包括FITC、PE或PC7荧光报告物。

9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，所述第一组合物还包括活性染料。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述活性染料是7-氨基放线菌素D(7-AAD)。

11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，得到总活造血干细胞计数、总活祖细胞计数以及总活T细胞计数。

12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，所述样本板是96孔微量滴定板。

13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，通过自动化移液器来执行使用至少一种试剂对所述一个或更多个容器进行以获得至少一种第一组合物的所述处理，所述自动化移液器被配置成递送所述至少一种试剂的预定体积。

14.根据任一前述权利要求所述的方法，其中，所述培育被自动化成将所述至少一种第一组合物培育预定时间段以得到至少一种第二组合物，所述预定时间段足以使所述至少一种成像试剂结合，所述至少一种成像试剂包括专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种的识别元素。

15.一种用于对造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种进行分析和计数的自动化流式细胞计数方法，所述方法包括：

将第一血液样本放入样本板的第一容器中；

使用至少一种试剂来处理所述第一容器以获得第一组合物f¹，并对第一组合物f¹进行培育以得到第二组合物s¹，所述至少一种试剂中的至少一种是至少一种成像试剂，所述至少一种成像试剂包括专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素；

在培育第一组合物f¹的同时，将第二血液样本放入所述样本板的第二容器中，并使用至少一种试剂处理所述第二容器以获得第一组合物f²，并培育第一组合物f²以得到第二组合物s²，所述至少一种试剂中的至少一种是至少一种成像试剂，所述至少一种成像试剂包括专用于造血干细胞、造血祖细胞和T细胞中的至少一种上的标记物的识别元素；

使用裂解试剂处理第二组合物s¹和s²以得到第三组合物t¹和t²；以及

通过流式细胞术分析第三组合物t¹和t²，以获得总活造血干细胞计数、总活祖细胞计数以及总活T细胞计数中的至少一个。

16.根据权利要求14所述的方法，还包括制备阴性对照。

17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述阴性对照在所述第一组合物f¹之前被制备。

18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述阴性对照在所述第一组合物f¹之后被制备。

19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述阴性对照在所述第一组合物f²之后被制备。