KR20230033740A - 세포 분석을 위한 자동화된 샘플 제조 플랫폼 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은, 무엇보다도, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 자동화된 유동 세포계측 방법 및 시스템에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 7월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 63/050,637의 이익을 주장하며, 이는 본원에 완전히 제시된 바와 같이 참조로 포함된다.
유동 세포계측기를 사용하는 세포 분석 기구는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 완전히 제시된 바와 같이 참조로 포함된, 공개된 미국 특허 출원 번호 2008/0010019를 참조한다. 유동 세포계측기는 입자가 광 빔에 의해 여기될 수 있는 감지 구역을 통해 입자의 흐름을 유도한다. 광 빔은 입자가 형광을 발하게 하고/거나 광을 산란시키고, 방출된 광은 여과기에 의해 전자기 (EM) 스펙트럼의 일부로 분리된다. 여과된 EM 스펙트럼을 연구함으로써, 세포 함량의 분석이 수행될 수 있고 특정 특징 및 값이 보고될 수 있다.
그러나, 지금까지, (i) 예를 들어, 최적 인큐베이션 및 부피 세부 사항이 사전 프로그래밍된, 조혈 줄기 세포, 전구 세포 또는 T-세포 샘플을 포함하는 혈액 샘플 (예를 들어, 제대혈 샘플)의 자동화된 제조; 및 (ii) 샘플이 제조되는 동일한 기구에서의 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, T-세포, 및 심지어 백혈구 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 허용하는 유동 세포계측기는 존재하지 않는다. 추가적으로, (i) 및 (ii)에 더하여, 음성 대조군과 함께 또는 그 없이 단일 샘플에 대한 분석을 수행하는 것을 허용하거나; 또는 음성 대조군과 함께 또는 그 없이 샘플을 복사하는 (예를 들어, 샘플을 복제하는) 유동 세포계측기는 없다. 본 개시내용은 이러한 기구를 기재한다. 본 개시내용은 또한 기구의 성능이, 적어도 부분적으로, 입자를 정확하게 계수하기 위해 현탁된 고체 (예를 들어, 세포)를 갖는 다양한 액체 (예를 들어, 표본 유형)를 정확하고 정밀하게 이동시키는 능력에 의해 개선되는 고성능 기구를 제공한다.
CD34+ 줄기 및 전구 세포의 계수는 임상 유동 세포계측 실험실에서 가장 고도로 규제된 시험 중 하나이다. 이 시험의 임계성에 기여하는 4가지 주요 인자가 있다:
(1) 이식 전에, 공여자는 통상적으로 환자의 혈액 형성 시스템을 제거하는 화학요법 및/또는 방사선요법을 받으므로, 환자의 회복은 조혈을 재구성하기 위한 충분히 많은 수의 줄기 세포의 이식에 의존한다. 따라서 CD34+ 세포의 정확한 계수는 필수적이다.
(2) CD34+ 계수를 위한 규제 프레임워크는 지리에 따라 상이하나, IVD를 위해 승인된 현재 이용가능한 정량화 방법은 이들 차이를 수용하는데 필요한 유연성을 제공하지 않으며, 이는 실험실로 하여금 이들의 지방 자치 단체의 요건을 만족시키기 위해 희귀하고 귀중한 샘플 유형에 대한 실험실-개발된 시험을 자기-검증하도록 한다.
(3) 동종이계 (비-자기) 이식은 줄기 세포 이식 요법에서 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증인 이식편-대 숙주 질환 (GvHD)을 초래할 가능성을 갖는 잔류 면역 적격 CD3+ T 세포를 함유한다. 따라서 이들 샘플에서 CD3+ T 세포의 수를 계수하는 것이 필수적이나, 현재 샘플에서 CD34+ 줄기 세포 및 CD3+ T 세포의 병렬 계수를 허용하는 IVD 키트는 시중에 없으며, 이는 다시 실험실로 하여금 사용자-정의 시험으로 작업하게 한다.
(4) 현재 이용가능한 CD34+ 계수 절차는 고도로 수동이며, 이는 인간 오류에 대한 잠재적인 여지 및 따라서 샘플 재-실행에 대한 필요를 초래하고, 결과의 지연된 보고 또는 추가적인 샘플이 추출될 필요가 있는 경우 환자/공여자 불편을 야기한다. 추가적으로, 이들 샘플은 흔히 긴급 (STAT) 샘플로서 실험실에 도착하며, 이는 실험실 작업 흐름을 파괴하고 실험실 직원으로 하여금 다른 샘플의 분석의 우선순위를 낮추게 한다. 두 인자는 CD34+ 계수를 위한 자동화된 솔루션에 대한 요구를 야기하였다.
본원에 기재된 새로 개발된 아퀴오스 스템(AQUIOS STEM) 시스템 및 방법은 이들 임계적 측면을 다루는 CD34+ 계수를 위한 첫 번째 시험관내 진단 (IVD) 솔루션이다. 본원에 기재된 자동화된 아퀴오스 유동 세포계측 시스템 및 방법에 기반하여, 샘플에서의 자동화된 CD34+ 계수 및 임의적인 CD3+ 계수를 위한 완전한 솔루션을 제공하며, 이는 인간 개입에 대한 필요를 최소화하는 작업 흐름을 초래한다. 샘플은 작동자에 의해 시스템 상에 로딩되고, 샘플 제조 및 데이터 분석은 분석기에 의해 자동적으로 수행된다. 핸즈-온 시간의 이 감소는 실험실에 매끄러운 작업 흐름을 제공하고 수동 및 따라서 잠재적으로 오류-유발 단계의 수를 최소화한다. 이는 또한 CD34+ 계수가 비-유동 세포계측 전문가에 의해 수행될 수 있다는 것을 의미하며, 이는 실험실이 규제 실험실 근무 시간 외에, 예컨대 야간 근무 동안 또는 주말에 걸쳐 CD34+ 계수를 제공하는 것을 가능하게 한다. 두 측면은 환자 관리의 수준을 증가시키고 이 시간-임계적 애플리케이션에 대한 결과 도출 시간을 감소시킨다.
추가적으로, 본원에 기재된 아퀴오스 스템 시스템 및 방법은 개별 규제 요건, 예컨대 중복 실행 및 음성 대조군의 사용에 대한 이들의 요청에서 상이한, CD34+ 계수에 대한 국제 혈액요법 및 이식편 조작 학회 (ISHAGE) 가이드라인 및 유럽 약전에 맞게 조정된 분석 옵션을 제공한다. 이 유연성은 또한 아퀴오스 스템 시스템이 IVD 솔루션의 일부로서 선택하기 위한 총 6가지 분석 옵션을 제공한다는 점에서 CD34+ 줄기 및 전구 세포 집단과 함께 CD3+ T 세포의 병렬 계수를 고려한다. 이는 시장에 고유하고 실험실-개발된 시험의 시간이 걸리는 자기-검증에 대한 필요를 제거한다.
아퀴오스 스템 시스템에 의해 제공된 자동화의 수준은 데이터 추적가능성의 가장 높은 수준을 보장하면서 자동화에 맞게 조정된 사전-혼합된 및 즉시 사용가능한 시약 조합물을 사용함으로써 달성된다. 현재 이용가능한 수동 시험 키트는 농축물로부터의 수동 매일 제조를 필요로 하고, 세포 생존율에 부정적으로 영향을 미치는 적혈구 용해 (샘플 제조에서 필수적인 단계)를 위한 용액을 사용하므로 샘플은 실제 분석 전에 얼음 상에 저장될 필요가 있다. 대조적으로, 아퀴오스 스템 시스템은 즉시 사용가능하고 실온에서 사용될 수 있는 보다 순한 적혈구 용해 시약을 사용하며, 이는 다른 자동화된 유동 세포계측 애플리케이션에 대해 공지되어 있으나, 줄기 세포 계수에 대해 공지되지 않은 방식으로 CD34+ 및 CD3+ 카운트의 자동화를 허용한다. 시험에 임계적인 모든 시약 바이알은 개별 식별자 및 필수적인 품질 관리 파라미터, 예컨대 시약 유형, 시약 로트, 최초 사용일, 유효 기간 등으로 바코드가 부착되고, 샘플 정보와 함께 하나의 데이터베이스로 저장되며, 이는 오늘날 인증 기관에 의해 요구된 데이터 추적가능성의 수준을 제공한다.
아퀴오스 스템 시스템은 임상 연구에서 그의 전제 방법, 임상 CD34+ 계수에 대한 시장에서 "최적 표준"으로 여겨지고 또한 다른 제조업체의 수동 CD34+ 계수 솔루션에 대한 참조로서 사용된 FC500 유동 세포계측기를 위한 스템-키트에 대해 검증된다. 아퀴오스 스템 시스템을 사용하여, 임상 실험실로부터 줄기 세포 계수의 부담을 없애는 CD34+ 줄기 및 전구 세포의 계수를 위한 고유한 새로운 솔루션을 제공함으로써 "최적 표준"은 다음 수준에 이르게 된다.
본 기술의 이들 및 다른 특색, 측면, 및 이점은 하기 도면과 관련하여 보다 잘 이해될 것이다:
도 1a는 임상 실험실의 요건을 다루는 CD34+ 조혈 전구 세포의 식별 및 정량화를 위한 솔루션의 특징의 체크리스트이다.
도 1b는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 본원에 기재된 방법의 흐름도이다.
도 2는 진단 기구의 하나의 예의 투시도이며, 여기서 기구는 표본 오토로더와 커플링된 것으로 제시되고 유동 세포계측기를 포함한다.
도 3은 도 2에 제시된 진단 기구의 일부의 확대된 투시도이다.
도 4는 작동 동안 기구를 나타내는, 도 2-3의 진단 기구의 정면 투시도이다.
도 5는 한 번에 단일 표본 튜브를 샘플링할 수 있는 진단 기구의 일부의 확대도이다.
도 6은 도 2-5에 제시된 제안된 진단 기구의 외부 하우징의 정면 투시도이다.
도 7은 또 다른 예의 외부 하우징의 정면 투시도이며, 여기서 표본 오토로더는 제거되고 표본 튜브는 정면 도어를 통해 삽입된다.
도 8은 본원에 기재된 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 소프트웨어 구성요소 시스템의 예이다.
도 9는, 잔류 T 세포의 분석과 함께 또는 그 없는, CD34+ HPC의 임상 정량화에 대한 패널 옵션을 나타내는 표이다.
도 10a-10c는 CD34+ 절대 카운트(세포/μL)에 대한 3가지 CD34+ 분석 옵션 스템 패널 (중복 시험 플러스 음성 대조군), 스템 중복 (중복 시험, 음성 대조군 없음) 및 스템 단일 (단일 시험)의 등가를 나타내는 플롯이다. 이들 3가지 분석 옵션은 CD3을 포함하지 않는 시험에 대한 것이다.
도 11a-11c는 CD34+ 절대 카운트 (세포/μL)에 대한 3가지 CD34+ 플러스 CD3+ 분석 옵션 스템 알로(STEM ALLO) 패널 (중복 시험 플러스 음성 대조군), 스템 알로 중복 (중복 시험, 음성 대조군 없음) 및 스템 알로 단일 (단일 시험)의 등가를 나타내는 플롯이다. 이들 3가지 분석 옵션은 CD3을 포함하는 시험에 대한 것이다.
도 12a-12c는 CD3+ 절대 카운트 (세포/μL)에 대한 3가지 CD34+ 플러스 CD3+ 분석 옵션 스템 알로 패널 (중복 시험 플러스 음성 대조군), 스템 알로 중복 (중복 시험, 음성 대조군 없음) 및 스템 알로 단일 (단일 시험)의 등가를 나타내는 플롯이다. 이들 3가지 분석 옵션은 CD3을 포함하는 시험에 대한 것이다.
도 13은 실시예 2에 기재된 바와 같은 대표적인 수동 유동 세포계측 작업 흐름이다.
도 14는 실시예 2에 기재된 바와 같은 대표적인 아퀴오스 CL 유동 세포계측 시스템 작업 흐름이다.
도 15a-15b는 스템-키트 (대안적 방법, 빈 막대) 및 아퀴오스 스템 시스템 (아퀴오스, 해시형 막대)을 갖는 FC500 상의 1개의 CD34+ 샘플 또는 10개의 CD34+ 샘플의 배치에 대한 샘플 프로세싱 턴어라운드 시간 및 작동자 핸즈-온 시간의 플롯이다.
도 16a-16b는 근무일 (도 16a) 및 주 5일 근무 (도 16b)당 스템-키트 (대안적 방법, 회색 막대) 및 아퀴오스 스템 시스템 (아퀴오스, 적색 막대)을 갖는 FC500 상의 품질 관리 (QC) 절차에 대한 프로세스 시간 및 작동자 핸즈-온 시간의 플롯이다.
도 1a는 임상 실험실의 요건을 다루는 CD34+ 조혈 전구 세포의 식별 및 정량화를 위한 솔루션의 특징의 체크리스트이다.
도 1b는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 본원에 기재된 방법의 흐름도이다.
도 2는 진단 기구의 하나의 예의 투시도이며, 여기서 기구는 표본 오토로더와 커플링된 것으로 제시되고 유동 세포계측기를 포함한다.
도 3은 도 2에 제시된 진단 기구의 일부의 확대된 투시도이다.
도 4는 작동 동안 기구를 나타내는, 도 2-3의 진단 기구의 정면 투시도이다.
도 5는 한 번에 단일 표본 튜브를 샘플링할 수 있는 진단 기구의 일부의 확대도이다.
도 6은 도 2-5에 제시된 제안된 진단 기구의 외부 하우징의 정면 투시도이다.
도 7은 또 다른 예의 외부 하우징의 정면 투시도이며, 여기서 표본 오토로더는 제거되고 표본 튜브는 정면 도어를 통해 삽입된다.
도 8은 본원에 기재된 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 소프트웨어 구성요소 시스템의 예이다.
도 9는, 잔류 T 세포의 분석과 함께 또는 그 없는, CD34+ HPC의 임상 정량화에 대한 패널 옵션을 나타내는 표이다.
도 10a-10c는 CD34+ 절대 카운트(세포/μL)에 대한 3가지 CD34+ 분석 옵션 스템 패널 (중복 시험 플러스 음성 대조군), 스템 중복 (중복 시험, 음성 대조군 없음) 및 스템 단일 (단일 시험)의 등가를 나타내는 플롯이다. 이들 3가지 분석 옵션은 CD3을 포함하지 않는 시험에 대한 것이다.
도 11a-11c는 CD34+ 절대 카운트 (세포/μL)에 대한 3가지 CD34+ 플러스 CD3+ 분석 옵션 스템 알로(STEM ALLO) 패널 (중복 시험 플러스 음성 대조군), 스템 알로 중복 (중복 시험, 음성 대조군 없음) 및 스템 알로 단일 (단일 시험)의 등가를 나타내는 플롯이다. 이들 3가지 분석 옵션은 CD3을 포함하는 시험에 대한 것이다.
도 12a-12c는 CD3+ 절대 카운트 (세포/μL)에 대한 3가지 CD34+ 플러스 CD3+ 분석 옵션 스템 알로 패널 (중복 시험 플러스 음성 대조군), 스템 알로 중복 (중복 시험, 음성 대조군 없음) 및 스템 알로 단일 (단일 시험)의 등가를 나타내는 플롯이다. 이들 3가지 분석 옵션은 CD3을 포함하는 시험에 대한 것이다.
도 13은 실시예 2에 기재된 바와 같은 대표적인 수동 유동 세포계측 작업 흐름이다.
도 14는 실시예 2에 기재된 바와 같은 대표적인 아퀴오스 CL 유동 세포계측 시스템 작업 흐름이다.
도 15a-15b는 스템-키트 (대안적 방법, 빈 막대) 및 아퀴오스 스템 시스템 (아퀴오스, 해시형 막대)을 갖는 FC500 상의 1개의 CD34+ 샘플 또는 10개의 CD34+ 샘플의 배치에 대한 샘플 프로세싱 턴어라운드 시간 및 작동자 핸즈-온 시간의 플롯이다.
도 16a-16b는 근무일 (도 16a) 및 주 5일 근무 (도 16b)당 스템-키트 (대안적 방법, 회색 막대) 및 아퀴오스 스템 시스템 (아퀴오스, 적색 막대)을 갖는 FC500 상의 품질 관리 (QC) 절차에 대한 프로세스 시간 및 작동자 핸즈-온 시간의 플롯이다.
이제 개시된 주제의 특정 실시양태에 대한 언급이 상세하게 이루어질 것이다. 개시된 주제가 열거된 청구항과 함께 기재될 것이지만, 예시된 주제가 청구항을 개시된 주제로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
이식 목적을 위한 동원된, 말초 줄기 및 전구 세포 (PBSC)의 증가된 사용으로, 연구자들은, 국제 혈액요법 및 이식편 조작 학회 (ISHAGE)와 협력하여, 1996년에 고도의 정확도 및 실험실간 재현성을 허용하는 단순하고, 민감한 방법을 제공하려는 의도로 CD34+ 계수에 대한 표준의 세트를 기재하였다. 생성된 "ISHAGE 가이드라인"은 곧 유동 세포계측에 의한 조혈 CD34+ 전구 세포의 계수에 대한 최적 표준이 되었다. 1998년에, 연구단은 절대 카운팅을 위한 비드를 도입하고, 죽은 세포를 배제하기 위한 생존율 염료로서 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD), 및 고정액, 예컨대 포름알데히드가 결여된 용해 시약을 첨가함으로써 1996년 가이드라인의 변형된 버전을 공개하였다. 이들 변형은 기본 프로토콜을 단일-플랫폼 방법으로 전환시켰고, 생성된 "생존율 염료를 사용한 단일 플랫폼 ISHAGE 가이드라인"은 20여년이 지난 지금도 대부분 그대로이다.
ISHAGE 가이드라인의 특징은 생존가능한 백혈구로부터 CD34+ 세포의 수를 얻는 순차적 게이팅 전략이다. 가이드라인은 또한 시험이 시험 가변성 및 비특이적 세포 및 형광색소 결합에 대해 보정하기 위해 음성 대조군과 함께 중복으로 실행될 것을 필요로 한다.
순차적 게이팅의 선택성으로 인해, ISHAGE 가이드라인은 음성 대조군의 사용을 임의적으로 만들었다. 대조적으로, 유럽 약전 (Ph. Eur.)은 대조군의 사용을 요구한다. ISHAGE 가이드라인과 대조적으로, Ph. Eur.에 기재된 표준은 유럽 약전의 정교화에 대한 유럽 평의회 협약 및 EU 및 국내 제약법에 규정된 바와 같이, 법적 구속력이 있다.
시험관내 진단 (IVD) 시스템의 일부인 현재 이용가능한 소프트웨어 솔루션은 IVD 상태를 유지하면서 음성 대조군과 함께 또는 그 없이 CD34+ 계수를 위한 패널을 실행하기 위한 유연성을 제공하지 않는다. 추가적으로, 모든 CD34+ 계수 시약 키트가 음성 대조군 시약을 함유하는 것은 아니다.
순차적 ISHAGE 게이팅 전략의 시작 지점이 드문 CD34+ 세포 집단의 정확한 정량화를 굉장히 용이하게 하지만, 이는 종점으로서 모든 계수된 CD34+ 세포가 자동적으로 생존가능하다는 사실을 야기하고, 모든 CD34+ 세포 중에서 생존가능한 CD34+ 세포의 백분율을 직접적으로 계산하는 것을 어려울 수 있다. 추가적으로, 전체 표본 생존율을 평가하기 위해 적용된 게이팅 전략으로부터 CD45+ 백혈구의 총 수를 검색하는 것은 힘들 수 있다.
제대혈로부터 유래된 CD34+ 세포의 경우, 최근 발간된 문헌 ["NetCord - FACT International Standards for Cord Blood Collection, Banking, and Release for Administration"]의 제7판은 동결보존 전에 포스트-프로세싱 제대혈 샘플에 대한 총 CD34+ 카운트 뿐만 아니라 총 생존가능한 CD34+ 카운트 둘 다의 결정, 및 임상 프로그램에의 제대혈 단위의 방출 전에 CD34의 퍼센트 생존율의 평가를 필요로 한다.
CD34+ 정량화가 품질 관리 목적을 위해 수행되는 경우에, 실험실은 특히 오직 작은 표본 부피만이 분석을 위해 이용가능할 때, 중복 시험 플러스 음성 대조군으로 이루어진 "완전한" ISHAGE 패널이 아니라, 단일 시험을 실행하는 능력을 추구한다. 현재 획득 소프트웨어는 IVD 솔루션의 일부로서 패널을 적절히 조정하는 유연성을 제공하지 않는다. QC 목적을 위해 IVD 시스템이 반드시 요구되는 것은 아니지만, 이들 시험을 수행하는 대부분의 실험실은 고도로 규제되고 따라서 오직 이 목적만을 위해 별개의 사용자 정의 시험을 검증하는 것을 삼간다.
혈액 질환 또는 조혈 시스템의 비-악성 기능장애의 경우, CD34+ 세포는 비-자기 (동종이계) 공여자의 말초 혈액 (PB), 골수 (BM) 또는 제대혈 (CB)로부터 수집된다. 공여자 및 수용자가 동일한 사람인 자가 설정에서와 같이, 동원된 PB는 오늘날 동종이계 이식 계획에서 CD34+ 줄기 및 전구 세포에 대한 가장 통상적으로 사용되는 공급원이다.
동종이계 조혈 전구 세포 (HPC) 이식의 성공은 다양한 인자, 예컨대 적합한 공여자의 이용가능성, 인간 백혈구 항원 (HLA) 적합성, 이식의 이식편 대 백혈병/종양 효과를 유지하면서 환자의 면역 반응의 성공적인 균형 등에 의존한다. 동원된 말초 혈액으로부터의 CD34+ 세포의 사용은 이식 후 조혈의 비교적 신속한 회복의 이점을 갖지만 보다 높은 수의 순환 T-세포로 인해 급성 이식편 대 숙주 질환 (aGvHD)의 증가된 위험이 함께 따른다. 급성 및 만성 GvHD가 대략 30-40%의 동종이계 이식을 받은 환자에 영향을 미치고, 공여자 T 세포가 aGvDH를 매개하는데 중심 역할을 하는 것으로 인식되기 때문에, 이식편에서의 CD34+ 세포와 함께 CD3+ T-세포의 계수는 많은 실험실에서 표준 관행이 되어왔다. 현재 하나의 시험에서 CD34 및 CD3의 IVD 분석을 허용하는 상업적으로 입수가능한 키트가 없기 때문에, 실험실은 다시 본 출원을 위한 사용자 정의 시험의 검증에 의존할 필요가 있다.
CD34+ HPC 계수를 수행하는 실험실은 데이터 추적가능성의 측면에서 고도로 규제되고 특히 인증을 받을 때, 광범위한 QC 시스템을 확립할 필요가 있다. 이들 관리 메커니즘의 일부 주요 측면은 (a) 모든 샘플의 적합한 식별에 의한 프로세스 전반에 걸친 샘플 식별오류의 방지; (b) 시험 절차 및 기구의 신뢰도, 정확도, 정밀도, 및 성능을 모니터링하기 위한 적합한 제공; (c) 기구 및 시약에 대한 기능적 체크; (d) 적절한 참조 자료의 사용 및 진행 중인 능력 시험의 문서화; (e) 만료된 시약 및 공급품의 사용을 방지하는 프로세스; 및 (f) 공급품 및 시약의 로트 번호, 유효 기간, 및 제조업체를 각각의 표본에 연결시키는 것을 허용하는 메커니즘을 포함한다.
특히 측면 (e) 및 (f)는 시약 및 표본의 문서화가 흔히 연결되지 않고 데이터 획득 및 분석에 사용된 플랫폼과 같은 것 상이 아닌 "오프라인"으로 발생하기 때문에 힘들 수 있다.
혈액-종양학 실험실에서, HPC 샘플은 흔히 긴급 (STAT) 샘플로서 실험실에 도착하고 즉각적인 주의를 필요로 하며, 이는 일상적인 작업 흐름을 파괴한다. 이들 샘플과의 임의의 이슈는 노력이 중복되고 따라서 인간 오류에 대한 가능성을 증가시킨다. 이들 실험실의 경우, CD34+ HPC의 분석은 시간 임계적이기 때문에, HPC 샘플을, 이상적으로는 샘플링 실수 또는 다른 이슈에 대한 위험을 최소화하는 방식으로, 일반적인 작업 흐름으로 통합하는 것이 바람직할 것이다. CD34+ 계수에 특화된 실험실, 예컨대 제대혈 시설의 경우, 보다 고도의 자동화는 본원에 약술된 바와 같은 추적가능성의 높은 표준을 제공하면서, 증가하는 수의 분석될 샘플을 관리하는데 도움이 될 것이다.
유동 세포계측에 의한 CD34+ 계수를 위한 현재 IVD 솔루션은 주로 세포 생존율에 부정적으로 영향을 미치는 적혈구 용해 시약의 사용으로 인해 자동화 능력이 결여되므로, 제조된 샘플은 분석 전에 얼음 상에 보관될 필요가 있다. 그가 근본적으로 추가적인 고정액에 대한 필요가 없고, 관심 세포 집단의 산란 특성을 변경하지 않으면서 용해/무세척 접근법에 적합한 시기에 이용가능한 유일한 용해 시약이기 때문에, ISHAGE 가이드라인은 염화암모늄의 사용을 시사하였다. 염화암모늄의 사용은 유동 세포계측을 위한 근본적으로 모든 상업적 CD34+ 계수 키트에서 널리 확립되어 있지만, 그는 세포 생존율에 대한 그의 효과로 인해 및 작업 희석액이 매일 신선하게 제조될 필요가 있기 때문에 자동화된 샘플 제조 및 유동 세포계측 플랫폼 상 CD34+ 시험의 시행을 방지한다.
오늘날, 샘플 제조 동안 백혈구 생존율에 대한 현저한 영향 없이 적혈구를 특이적으로 용해시키는 즉시 사용가능한 고정액-무함유 적혈구 용해 시약이 이용가능하며, 이는 자동화된 유동 세포계측 시스템 상에서 CD34+ 계수를 수행하는 것을 허용한다.
유동 세포계측을 위한 이상적인 CD34+ 정량화 키트는 확립된 표준 및 프로토콜의 이익을 시약 및 소프트웨어 툴을 임상 실험실의 필요에 맞게 조정하는데 충분한 유연성과 조합한다. 이는 IVD 솔루션과 병렬로 사용자 정의 시험을 설정할 필요가 없는 상이한 샘플 유형에 대한 획득 및 분석 패널, 고도로 규제된 작업 환경의 요건을 만족시키는 품질 관리 메커니즘, 및 고도의 자동화를 포함한다. 도 1a를 참조한다.
조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 본원에 기재된 방법은 소위 최적 표준을 "다음 수준"으로 이끌 목표로 설계되었다. 본원에 기재된 방법은, 무엇보다도, CD34+ 조혈 줄기 및 전구의 자동화된 분석을 위한 모듈식 접근법을 구현한다. 한 예에서, 본원에 기재된 방법은 본원 표 1 및 2에 기재된 바와 같이 CD34+ 계수를 위한 소프트웨어 및 시약 키트; 동종이계 공여자로부터의 샘플 물질에서의 CD3+ T 세포 및 CD34+ 세포의 동시 계수를 위한 소프트웨어 및 시약 키트; 및 CD34 대조군 세포 (2개의 수준)를 포함한다.
표 1
표 2
여기서 "CD45-FITC"는 일반적으로 프랑스 마르세유 소재의 이뮤노테크 SAS(Immunotech SAS (베크만 컬터(Beckman Coulter) 회사)에 의해 제조된, 유동 세포계측을 사용하여 인간 생물학적 샘플에 존재하는 CD45 항원을 발현하는 세포 집단의 분석 및 계수를 가능하게 하는, 플루오레세인-접합된 항체를 지칭하고; "CD34-PE"는 일반적으로 프랑스 마르세유 소재의 이뮤노테크 SAS (베크만 컬터 회사)에 의해 제조된, 유동 세포계측을 사용하여 인간 생물학적 샘플에 존재하는 CD34 항원을 발현하는 세포 집단의 분석 및 계수를 가능하게 하는, 피코에리트린-접합된 항체를 지칭하고; "CD3-PC7"은 일반적으로 유동 세포계측을 사용하여 인간 생물학적 샘플에 존재하는 CD3 항원을 발현하는 세포 집단의 분석 및 계수를 가능하게 하는, 피코에리트린 시아닌 7-접합된 항체를 지칭한다. 형광단, 예컨대 FITC, PE, 및 PC7이 본원에 명시되었지만, 형광단이 기구의 검출 능력 내에서 검출될 수 있는 한, CD45, CD34 항원, 및 CD3 항원을 발현하는 세포 집단의 분석 및 계수를 가능하게 하는 임의의 적합한 형광단-접합된 항체를 사용할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 시스템의 일부로서 파라미터 CD34, CD45 및 CD3의 확인을 위해 안정화된 인간 백혈구의 액체 제제인 CD34 대조군 세포를 사용할 수 있다. 한 예에서, 키트는 대략 10개의 CD34+ 세포/μL (수준 1) 및 대략 30개의 CD34+ 세포/μL (수준 2)로 CD34의 2개의 수준을 함유한다. 검정 값은 대조군 세포 검정 시트의 바코드를 스캔함으로써 시스템으로 입력될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 일반적으로 이들로 하여금 기능적 성숙 세포, 예컨대 과립구 (예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염구), 적혈구 (예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판 (예를 들어, 거핵모세포, 혈소판 생산 거핵세포, 혈소판), 및 단핵구 (예를 들어, 단핵구, 대식세포)로 분화하게 하는 다능성, 및 이들의 다능성을 유지하면서 재생하는 능력 (자기-재생) 둘 다를 갖는 세포를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조혈 전구 세포" 또는 "HPC"는 일반적으로 기능적 성숙 세포, 예컨대 과립구 (예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염구), 적혈구 (예를 들어, 망상적혈구, 적혈구), 혈소판 (예를 들어, 거핵모세포, 혈소판 생산 거핵세포, 혈소판), 및 단핵구 (예를 들어, 단핵구, 대식세포)로 분화할 수 있는 가능성을 갖는 세포를 의미한다.
HSC 및/또는 HPC는 임의로 조혈 기원의 세포를 함유하는 신체 또는 신체의 기관으로부터 수득된다. 이러한 공급원은 비-분획화된 골수, 제대, 및 말초 혈액을 포함한다. 모든 상기 언급된 조 또는 비-분획화된 혈액 산물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방식으로 조혈 줄기 세포 특징을 갖는 세포에 대해 풍부화될 수 있다.
조혈 동안, HSC는 먼저 전구 단계에서 골수성 계통 및 림프구성 계통으로 분기하고, 이어서 각각 골수성 줄기 세포 (혼합된 콜로니 형성 세포, CFU-GEMM) 및 림프구성 줄기 세포로 분화한다. 추가로, 골수성 줄기 세포는 적아구군 형성 세포 (BFU-E) 및 적아구 콜로니 형성 세포 (CFU-E)를 통해 적혈구로, 거핵세포 콜로니 형성 세포 (CFU-MEG)를 통해 혈소판으로, 과립구-대식세포 콜로니 형성 세포 (CFU-GM)를 통해 단핵구, 호중구 및 호염구로, 및 호산구 콜로니 형성 세포 (CFU-Eo)를 통해 호산구로 분화하지만, 림프구성 줄기 세포는 T 림프구성 전구 세포를 통해 T-세포로 및 B 림프구성 전구 세포를 통해 B 세포로 분화한다. 이들 골수성 줄기 세포 및 이들로부터 유래된 다양한 조혈 전구 세포는 이들이 다양한 시토카인의 존재 하에 소프트 아가, 반고체 메틸셀룰로스 배지 등 상에서 형성하는 콜로니의 특성에 의해 식별된다.
표 2에 제시된 예에서, 동종이계 기원의 샘플에서의 잔류 CD3+ T-세포의 분석의 경우, 임의적인 동종이계-CD3 키트는 표 1에 기재된 기본 키트와 조합될 수 있다. 두 키트의 조합은 본원에 기재된 3가지 패널 옵션 사이에서 선택하는 능력과 함께, 1회의 실행에서의 CD34 및 CD3의 조합된 정량화를 위한 검증된 솔루션을 제공한다.
이 프레임워크를 염두에 두면, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 자동화된 유동 세포계측 방법, 예컨대 도 1b에 제시된 것에 관한 것이다:
정밀한 부피의 1개 이상의 혈액 샘플 (예를 들어, 동일한 환자 혈액 샘플로부터의 혈액 분취량)을 유동 세포계측기의 샘플 제조 영역에 위치된 샘플 플레이트의 1개 이상의 리셉터클 내로 배치하는 단계;
1개 이상의 리셉터클을 적어도 1종의 시약으로 처리하여 적어도 1종의 제1 조성물을 수득하는 단계로서, 적어도 1종의 시약 중 적어도 하나는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약인 단계;
조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약의 결합에 충분한 기간 동안 적어도 1종의 제1 조성물을 인큐베이션하여 적어도 1종의 제2 조성물을 제공하는 단계;
적어도 1종의 제2 조성물을 용해 시약으로 처리하여 적어도 1종의 제3 조성물을 제공하는 단계; 및
유동 세포계측에 의해 적어도 1종의 제3 조성물을 분석하여 1개 이상의 혈액 샘플 중에서 생존가능한 총 조혈 줄기 세포 카운트, 생존가능한 총 전구 세포 카운트, 및 생존가능한 총 T-세포 카운트 중 적어도 하나를 수득하는 단계. 방법은 카운팅 비드의 정밀한 첨가를 수행하는 단계, 이어서 유동 세포계측에 의해 적어도 1종의 제3 조성물을 분석하여 1개 이상의 혈액 샘플 중에서 생존가능한 총 조혈 줄기 세포 카운트, 생존가능한 총 전구 세포 카운트, 및 생존가능한 총 T-세포 카운트 중 적어도 하나를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 제1 조성물은 적어도 1종의 시약의 예로서 생존율 염료를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 생존율 염료의 하나의 예는 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD)이다.
본원에 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 다양한 공급원으로부터의 중복 혈액 분취량으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 기재된 방법은 음성 대조군과 함께 (또는 그 없이) 수행될 수 있다. 예를 들어, 표 1 및 표 2 시험 패널을 참조한다. 음성 대조군은 CD34에 대한 것일 수 있다. 대안적으로, 음성 대조군은 CD3에 대한 것이다. 그리고 본원에 기재된 바와 같이, 마커는 CD45 (예를 들어, 조혈 줄기 세포를 포함하는 특정 세포 집단 상에 발현된 CD45 항원), CD3 (예를 들어, T-세포를 포함하는 특정 세포 집단 상에 발현된 CD3 항원), 및 CD34 (예를 들어, 조혈 줄기 세포를 포함하는 특정 세포 집단 상에 발현된 CD34 항원) 중 적어도 하나이다. 음성 대조군은 이소형 대조군 또는 이소클론 대조군일 수 있다. 이소클론 대조군에서, 세포는 과량의 동일한 비표지된 항체의 존재 하에 염색된다. 비표지된 항체는 모든 결합 부위를 차지하며, 이는 표지된 항체가 특이적으로 결합하는 것을 방지한다. 따라서, 검출되는 임의의 신호는 비-특이적 결합으로부터 비롯해야 한다.
적어도 1종의 영상화 시약은 형광 리포터를 포함하는 영상화제를 포함하는 임의의 적합한 영상화제일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 고려된 영상화제는 FITC, PE, PC7 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 형광 리포터와 접합된 항체일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 생존가능한 총 조혈 줄기 세포 카운트, 생존가능한 총 전구 세포 카운트, 및 생존가능한 총 T-세포 카운트 중 적어도 하나를 제공할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 또한 하기 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 자동화된 유동 세포계측 방법을 포함한다:
제1 혈액 샘플을 샘플 플레이트의 제1 리셉터클 내로 배치하는 단계;
제1 리셉터클을 적어도 1종의 시약으로 처리하여 제1 조성물 f1을 수득하고 제1 조성물 f1을 인큐베이션하여 제2 조성물 s1을 제공하는 단계로서, 적어도 1종의 시약 중 적어도 하나는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약인 단계;
제1 조성물 f1을 인큐베이션하는 동안에, 제2 혈액 샘플을 샘플 플레이트의 제2 리셉터클 내로 배치하고 제2 리셉터클을 적어도 1종의 시약으로 처리하여 제1 조성물 f2를 수득하고 제1 조성물 f2를 인큐베이션하여 제2 조성물 s2를 제공하는 단계로서, 적어도 1종의 시약 중 적어도 하나는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약인 단계;
제2 조성물 s1 및 s2를 용해 시약으로 처리하여 제3 조성물 t1 및 t2를 제공하는 단계; 및
유동 세포계측에 의해 제3 조성물 t1 및 t2를 분석하여 생존가능한 총 조혈 줄기 세포 카운트, 생존가능한 총 전구 세포 카운트, 및 생존가능한 총 T-세포 카운트 중 적어도 하나를 수득하는 단계.
일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이, 방법은 추가로 음성 대조군을 제조하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 음성 대조군은 제1 조성물 f1 전에 제조될 수 있거나; 음성 대조군은 제1 조성물 f1 후에 제조될 수 있거나; 또는 음성 대조군은 제1 조성물 f2 후에 제조될 수 있다.
본원에 기재된 시스템 및 방법은 다양한 이점을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 자동화된 로딩, 샘플 제조, 시약 관리, 및 바코드 스캔 및 환자 추적 뿐만 아니라 데이터 분석 및 양방향 LIS 연결을 하나의 플랫폼으로 통합함으로써 작동을 간소화한다. 추가로, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 본원에 기재된 방법의 대부분의 단계가 자동화될 수 있도록 기존 소프트웨어에의 CD34+ 계수의 추가를 허용한다. 이는 ISHAGE 가이드라인의 기준 (예를 들어, 무세척, 고정액의 첨가 없음, 표적 집단의 산란 특징의 변경 없음)을 만족시키나, 실온에서 저장되고 취급될 수 있고, 원액으로부터의 작업 희석액의 매일 제조에 대한 필요 없이 즉시 사용가능하고, 관심 집단에 대해 순한 적혈구 용해 시약의 사용에 의해 달성된다. 적합한 용해 시약의 예는 프랑스 마르세유 소재의 이뮤노테크 SAS (베크만 컬터 회사)에 의해 제조된, 베르사라이즈(VersaLyse) 용해 용액을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 광범위하게 용해 시약을 기재하고 본원에 완전히 제시된 바와 같이 참조로 포함된, 미국 특허 번호 7,30,797을 참조한다.
절대 카운팅에 사용된 비드 솔루션 (표 1 및 2 참조)은 각각의 피펫팅 단계 전에 개별 혼합을 필요로 하지 않는 면밀하게 균형 잡힌 부력을 갖는다. 또한, 비드를 함유하는 병은 증발을 피하는 특수 캡을 수반한다.
샘플은 카세트 오토로더 또는 대기열의 다른 샘플보다 우선되는 STAT 샘플의 경우 단일 튜브 로더를 사용하여 적재된다. 이는 진행 중인 프로세스를 방해할 필요 없이 매끄러운 작업 흐름을 보장한다. 샘플 제조는 96 웰 딥-웰 플레이트, 또는 임의의 적합한 샘플 플레이트에서 일어날 수 있으며, 여기서 샘플은 제조될 뿐만 아니라, 샘플은 또한 미리 결정된 부피의 적어도 1종의 시약을 전달하도록 구성된 자동화된 피펫에 의해 수행되는 처리 단계에서 처리된다. 샘플 제조는 두 단계가 병렬로 발생하고 샘플 제조이 완료되자마자 샘플이 분석되도록 샘플 제조 및 분석을 위한 개별 프로브와 함께 일어날 수 있다.
본원에 기재된 시스템 및 방법에 사용된 시약은 유효 기간, 탑재 만료, 로트, 및 용기 번호를 추적하기 위한 고유한 바코드 아이덴티티를 포함한다. 시약 소모량 및 플레이트 사용량은 샘플이 프로세싱되는 바와 같이 본원에 기재된 시스템에 의해 모니터링된다. 바코드 리더는 처음 사용 시 시약 또는 플레이트를 스캔하며, 이는 "소모성" 정보가 무오류 또는 적어도 실질적으로 무오류인 것을 보장한다. 본원에 기재된 시스템은 시약 용기 또는 플레이트가 이들이 시스템에 의해 처음 "보여질" 시점에 전체 용량인 것으로 간주한다. 본원에 기재된 시스템은 시약 추적 시스템, 예컨대 아퀴오스 CL 유동 세포계측기 (베크만 컬터 라이프 사이언시스(Beckman Coulter Life Sciences), 인디애나주 인디애나폴리스)에 존재하는 아퀴오스 스마트 트랙 시약 추적 시스템을 포함할 수 있고, 실시간 소모성 추적을 제공하여 적절한 데이팅을 사용한 시약이 사용되고, 각각의 샘플에 대한 충분한 시약이 있다는 것을 보장하고; 이는 불충분한 시약 수준 또는 누락 시약 때문에 샘플을 재-실행해야할 위험을 제거한다. 예를 들어, 본원에 기재된 시스템은 그가 필요한 항체 바이알을 발견하지 않는 한 시험을 실행하지 않을 것이다.
본원에 기재된 시스템은 추가적인 이점을 갖는다. 예를 들어, 본원에 기재된 시스템은 핸드헬드 바코드 스캐너의 사용 없이 표본 바코드를 자동적으로 판독할 수 있는 튜브 바코드 리더를 가질 수 있다. 시스템은 튜브 상의 바코드를 LIS 요청에 매치한다. 표본 ID는 식별오류를 방지하기 위해 표본 흡인 전에 기록되고, 표본 ID는 실행 전반에 걸쳐 자동적으로 추적된다.
본원에 기재된 방법을 수행할 수 있는 시스템의 예는 진단 기구 (10)의 형태로 도 2-7에 제시된 시스템을 포함한다. 예시된 예에서, 오토로더 부분 (12)은 그 상에 로딩된 다수의 표본 카세트 (14)를 갖는 것으로 보여질 수 있다. 이러한 예에서, 카세트 (14)는 복수의 동일한 표본 튜브 또는 바이알 (이하 "튜브"로 지칭됨) (16), 다양한 표본 튜브 (16), 또는 단지 단일 표본 튜브 (16)가 로딩될 수 있다. 카세트는 이어서 오토로더 부분 (12) 내로 상단-로딩되고 수신된 순서대로 프로세싱된다. 대안에서, 예를 들어, 보다 빠른, 단일-샘플 프로세싱이 목적될 때, 표본 튜브는 대안적 표본 진입 지점, 예를 들어, 도어 (18) (도 5에 가시적임) 내로 직접적으로 삽입되고 도 4에 제시된 바와 같이 임의의 대기 카세트 (14)에 앞서 프로세싱될 수 있다. 이는 즉시 시험을 실행하며, 이로써 임상의에 의해 목적할 때 다른 표본 튜브의 시험을 방해하는 (하지만 부정적으로 영향을 미치지는 않음) 능력을 갖는, 임상의에 의한 시험에 대한 STAT 접근을 제공한다. 추가적으로, 손상되었거나 또는 바코드가 없는 (아래 논의됨) 표본 튜브는 수동적으로 삽입될 수 있다.
본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 진단 기구 (10)는 예시적으로 표본 튜브 (16) (또는 표본 튜브 카세트 (14))가 수신되면 하기 단계를 수행한다. 이러한 단계가 임상의에 의한 개입 없이 기구 (10)에 의해 수행되고, 단계가 수행될 특정한 시험(들)에 따라 변형되거나, 추가되거나, 또는 제거될 수 있다는 것이 고려된다. 혈액 튜브가 본 개시내용 전반에 걸쳐 논의되지만, 다른 유형의 체액 및 샘플이 본 개시내용의 범주 내에 있고, 제안된 기구 (10)에서 분석될 수 있다는 것이 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 골수, 혈청, 소변, 활막, 척수, 복막, 복수, 및 다른 유형의 유체 또는 샘플이 하기 기재된 바와 같이 실질적으로 시험되고 분석될 수 있다.
기구 (10)에 의해 수행될 수 있는 단계는 하기를 포함한다: 아직 표본 튜브 (16) (예를 들어, 오토로더)에 있는 동안 샘플을 혼합하는 것 (예를 들어, 흔드는 것); 표본 튜브 (16)의 캡을 뚫고 필요한 양의 표본을 샘플링하는 것; 바코드 (또는 임의의 다른 형태의 마킹/식별)를 판독하여 샘플/환자 ID를 확증하고/거나 튜브의 유형/크기를 확증하는 것; ID, 수행될 시험(들), 및 요구되는 시약을 매치하고, 컴퓨터에 의한 추적을 위한 일련 번호를 지정하는 것; 추가 프로세싱을 위해, 표본/샘플을 격납 영역 (20) (예를 들어, 도 2-4에 마이크로타이터 플레이트로 제시됨)의 선택된 빈 튜브 또는 웰에 배치하는 것; 적절한 순서로 적절한 시약을 첨가하고 (첨가되면 시약의 혼합을 포함함), 수행될 시험을 위한 샘플을 적절히 제조하기 위한 시기를 택하는 것; 샘플로 하여금 규정된 인큐베이션 시간 (시약에 기반하여 가변적임) 동안 시약과 반응하게 하는 것; (시험에 의해 목적하거나 또는 요구되는 경우) 샘플을 격납 영역 (20)의 복수의 튜브/웰로 나누는 것; 바코드 또는 다른 유형의 추적 장치 (예를 들어, RFID)를 통해 모든 샘플, 카세트, 시약 및 관련이 있는 위치를 추적하는 것; (후속 샘플을 제조하면서) 적시에 격납 영역으로부터 제조된 샘플/시약 조합을 흡인하고 유동 세포계측기를 통해 그를 분석하는 것; 임상의-개시된 결정 규칙에 따라, 결과를 자가-확인하거나 또는 검토를 위해 결과를 보유하는 것.
기구 (10)는, 무엇보다도 자동화된 및 통합된 표본 샘플링을 제공하며, 이는 각각의 상기 단계 (특정한 시험에 의해 요구되는 경우)가 추가적인 진단 장비의 사용 없이 기구 (10) 내에서 및 그에 의해 수행될 수 있다는 것을 의미한다. 게다가, 임상의에 의해 목적하는 경우, 이러한 단계는 임상의로부터의 임의의 상호작용 없이 수행될 수 있다. 그러나, 기구 (10)가 결함 또는 다른 문제가 있는 경우 임상의에게 경고하도록 구성될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
예시된 예에서, 기구 (10)는 프로브 캐리어 (22)가 단일-축 트랙 (24)을 따라 이동되는 동안 다양한 기능이 수행되게 하는 단일-축 프로브 캐리어 (22)를 사용한다. 예를 들어, 프로브 캐리어 (22) (및 따라서 프로브 (26))는 프로브 캐리어 (22)가 위치 A에 있을 때 튜브 (16)로부터 샘플을 추출하도록 위치될 수 있고, 위치 B에서 샘플을 격납 영역 (20)에 놓을 수 있고, 위치 C에서 시약을 샘플링할 수 있다. 샘플이 (예를 들어, 샘플의 STAT 프로세싱을 위해) 임의의 지점에서 회전가능한 트레이 (36)에 배치되는 경우에, 기구 (10)는 샘플의 존재를 감지하고 그를 오토로더 (12)에서 프로세싱을 대기하는 임의의 샘플 앞에 삽입할 수 있다. 프로브 캐리어 (22)는 이어서 프로브 (26)가 회전가능한 트레이 (36)에 배치된 튜브로부터 샘플링할 수 있도록 위치 D로 이동할 수 있다. 시약은 수행될 특정한 시험(들)에 의해 요구되는 바와 같이 샘플과의 반응을 위해 샘플이 놓여지기 전 또는 후에 (또는 전 및 후 둘 다) 격납 영역 (20)에 놓여지고 본원에 논의된 바와 같이 자체적으로 추적될 수 있다.
단계는 하기 순서로 수행될 수 있다. 그러나, 특정 시험이 1개 이상의 단계를 건너뛸 수 있거나, 또는 목적하는 혈액 시험(들)에 대한 최고의 시험 결과를 달성하기 위해 단계를 변형시킬 수 있다는 것이 고려된다.
먼저, 표본 튜브 (16)는 사용될 특정한 표본 튜브 (16)에 적절한 사전-구성된 카세트 (14) 내로 로딩될 수 있다. 예를 들어, 표본 튜브 (16)는 13 mm x 75 mm 표본 튜브의 통상적으로 발견되는 크기일 수 있으며, 이 경우에 도 2 및 4에 제시된 5개의 튜브 카세트 (14)가 사용될 수 있다. 그러나, 다양한 크기 및 유형의 표본 튜브 (16)가 사용될 수 있고, 카세트 (14)가 적절히 설계될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 카세트 (14)는 심지어 다양한 표본 튜브 (16)를 보유하도록 구성될 수 있다. 본원에 명시된 바와 같이, 다양한 크기의 표본 튜브 (16)는 또한 도 6에 제시된 도어 (18)를 통해 개별적으로 삽입될 수 있다.
표본 튜브 (16)가 캡 (32)을 갖는 경우에, 표본 튜브 (카세트 (14)에 의해 보유됨)는 혈액이 튜브 내부에서 교반되고 (보다 정확한 샘플링을 위해) 보다 균질하게 만들어지도록 흔들어질 수 있다. 이러한 흔들기는 스테이션 A에서 발생할 수 있고, 카세트 (14)는 도 4에서 그의 흔들어진 위치에서 보여질 수 있다.
카세트 (14)의 흔들기 동안, 프로브 캐리어 (22)는 스테이션 C로 이동하고 수행될 시험을 위해 시약 (34)의 적절한 부분을 샘플링하는 것을 시작하도록 지시될 수 있다. 그러나, 시험이 시약 (34)이 혈액 샘플링 전에 격납 영역 (20) 상에 배치되는 것을 고려하지 않을 경우에, 프로브 캐리어 (22)는 튜브 (16)로부터 혈액을 샘플링한 후 이러한 단계를 수행할 수 있다.
시약 (34) (예를 들어, 표 1 및 2에 기재된 시약)은 위치 C에서 볼 수 있는 바와 같이 바이알에 보유될 수 있다. 그러나, 시약은 대안적으로 또는 추가적으로 다른 곳에, 예컨대 플레이트 베이스 (30) (도 2 및 3에 제시됨) 상에, 또는, 예를 들어, 프로브 (26)에 직접적으로 연결될 수 있는 다른 영역 (가시적이지 않음)에 위치된 저장소에 보유될 수 있다.
본원에 제시된 바와 같이, 진단 기구 (10)는 또한 임상의가 외부 도어 (18)를 통해 표본 튜브 (16)를 삽입할 수 있다는 것을 고려한다. 이를 수용하기 위해, 튜브 수신기 (38)가 예시된 기구 (10)에 제공되고, 이러한 튜브 수신기는 도 3-5에서 볼 수 있는 바와 같이 소아용 튜브를 포함하는 다양한 유형의 표본 튜브 (16)를 수용할 수 있다. 예시된 예에서, 표본 튜브 (16)는 표본 튜브 (16)의 쉬운 접근 및 검색을 가능하게 하는 회전가능한 트레이 (36)에 의해 보유될 수 있다. 대안적으로, 도 4에 제시된 바와 같이, 표본 튜브 (16)는 회전가능한 카세트 (40)에 의해 보유될 수 있다.
표본 및/또는 시약 (34)의 샘플링 사이 및 그 후에, 프로브 캐리어 (22)는 프로브 (26)가 세척될 수 있도록 프로브 와셔 스테이션 (28)으로 이동할 수 있다. 프로브 (26)를 세척하는 것은 교차-오염을 방지하고 따라서 부정확한 시험 결과를 방지한다.
튜브 내에서 (예를 들어, 스테이션 A에서) 표본의 충분한 혼합이 수행된 후에, 표본은 프로브 (26)에 의해 샘플링되고 격납 영역 (20)의 미리 결정된 웰 또는 튜브에 놓여진다. 수행될 시험(들), 예컨대 본원에 기재된 방법을 사용하는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수에 따라, 표본 샘플은 1개 초과의 웰 또는 튜브에 배치될 수 있고, 상응하는 양의 표본 (예컨대 혈액)은 미리 흡인될 수 있다. 프로브 (26)는 이어서 본원에 기재된 바와 같은 와셔 스테이션 (28)에서 세척된다.
시약이 이들을 격납 영역 (20)에 놓은 후에 표본 샘플에 첨가되는지 여부에 따라, 프로브 캐리어 (22)는 적절한 시약(들) (34)의 샘플링을 위해 스테이션 C로 이동될 수 있다. 다시, 1개 초과의 시약이 필요한 경우에, 프로브 (26)는 각각의 시약 (34) 샘플링 사이 및 최종 시약 (34) 샘플링 후에 와셔 스테이션 (28)에서 세척될 수 있다.
표본 샘플 및 시약을 격납 영역 (20)의 각각의 웰 또는 튜브에 놓기 위해, 플레이트 베이스 (30)는 각각의 웰 또는 튜브가 플레이트 베이스 (30)의 회전 지점에 따라 프로브 (26)에 제시될 수 있도록 회전 축 상에 위치될 수 있다. 플레이트 베이스 (30)의 이러한 배열 및 회전 이동은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 7,832,292에 개시되어 있다.
비록 다중-축 프로브 캐리어가 또한 이들 목표를 달성할 수 있지만, 특정 이점은 단일-축 장치에 대해 존재한다. 예를 들어, 단일 축 장치는 보다 적은 부품 및 보다 적은 프로그래밍을 필요로 하고, 보다 작은 기구 (10) 풋프린트를 생성하고, 정렬하기에 보다 쉽고, 보다 신뢰성이 높고 보다 안정하고, 궁극적으로 스테이션 사이의 그의 이동이 보다 빠르다.
웰 또는 튜브에서의 배치 후, 표본 샘플은 특정 양의 시간 (시약 및 수행될 시험에 따름) 동안 시약과 반응하도록 남겨지고 이어서 분석을 위해 유동 세포계측기를 통해 프로세싱된다. 다른 시험 장비, 예컨대 세포 사이징 및 분화를 위해 전자 부피를 사용하는 장비, 또는 흡광도를 사용하는 헤모글로빈 측정이 또한 포함될 수 있다는 것이 고려된다.
편리하게는, 격납 영역 (20)은 샘플 제조와 분석 사이의 공통 인터페이스로서 역할을 한다. 게다가, 격납 영역 (20)은 고정된 또는 분리가능한, 및/또는 일회용 또는 재사용가능한 구성요소를 포함할 수 있으며, 이는 임상의로 하여금 사용 후 전체 인터페이스 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트)를 버리기로 선택하게 한다. 제조 아암과 분석 아암 사이의 공통 인터페이스로서 역할을 함으로써, 격납 영역 (20)은 실수 및 외부 또는 환경적인 영향에 대한 보다 적은 노출을 갖는 시스템을 제공한다.
프로세서 및 프로세서 상에서 실행하도록 구성된 소프트웨어 스케줄러 (제시되지 않음)가 또한 개시된 시스템에 포함된다. 소프트웨어 스케줄러는, 예를 들어, 고정된 반응 속도론에 대한 이용가능한 윈도우를 재계산하도록 프로그래밍될 수 있다 (재현가능한 반응 속도론을 유지하면서 처리량을 최적화함) (예를 들어, 항체 인큐베이션, RBC 용해 시간, 반응 켄치 시간 등). 본원에 기재된 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 소프트웨어 구성요소 시스템의 예는 도 8에 제시된다.
또한, 본원에 논의된 바와 같이, 수많은 항목이 바코드가 부착되고 작동 동안 추적될 수 있다. 이러한 바코딩 및 추적은 소프트웨어 스케줄러에 의해 등록될 수 있다. 예를 들어, 바코드는 시약 바이알 (34), 표본 튜브 (16) (상이한 환자 및/또는 크기에 대해 상이한 바코드임), 시스 유체, 공통 인터페이스 (예를 들어, 격납 영역 (20)), 제조 시약, 비드 시약, 카세트 (14) 등에 지정될 수 있다. 이들 다양한 항목에 바코드를 부착함으로써, 다양한 유의한 정보, 예컨대 시약 사용량/소모량, 각각의 시약 병에 남아있는 시험의 수, 열린 용기 만료, 닫힌 용기 만료, 검정 값 등은 추적될 수 있다.
소프트웨어 스케줄러는 도 8에 기재된 단계 및/또는 하기 단계를 수행하도록 구성될 수 있다: 이 시점에 새로운 샘플을 첨가해도 되는지 여부를 결정하고, 또 다른 활동이 우선할 필요가 있는 경우 도어 또는 다중-로더 (무작위 접근)를 연기하는 단계; 존재하는 경우 비-동적 반응, 또는 보다 넓은 허용되는 윈도우를 갖는 동적 반응을 조정함으로써 샘플 도어 (18) 이용할 수 없는 효과를 최소화하는 단계; 충돌 효과를 최소화하고, 각각의 동적 반응에 대해 허용되는 윈도우를 한정함으로써 처리량을 최적화하는 단계; 분석이 미리 결정된 양의 시간이 걸리게 하는 단계 (정시에 정지/고정된 부피의 샘플); 모든 활동이 적절히 계획될 수 있도록 각각의 사이클에 대해 미리 결정된 시간을 사용하는 단계 (혈액의 획득, 혼합을 포함하는 시약의 첨가, 분석); 새로운 샘플을 계획에 첨가하는 것이 허용되는지 여부를 결정하는데 모든 계획된 샘플 시간 윈도우를 실행하고, 모든 그의 활동이 미리 결정된 시간에 일어나도록 이러한 새로운 샘플을 계획하는 단계; 및 계획이 달성될 수 있는지 여부를 결정하는데 하드웨어 자원 및 물리적 하드웨어 충돌을 실행하는 단계.
본원에 개시된 소프트웨어 스케줄러와 조합된 기구 (10)를 사용하여, 첫 번째 결과 도출 시간 (TFR)은 1시간 미만일 수 있으며, 후속 결과는 약 30분 이하마다 보고된다. 처리량은 하루에 5개 초과, 10개 초과, 20개 초과, 30개 초과, 40개 초과, 50개 초과, 60개 초과, 70개 초과, 80개 초과, 90개 초과 또는 100개 초과의 샘플일 수 있고, 결과는 훨씬 더 빠르고 하루 중에 더 일찍 보고될 수 있으므로, 실험실의 용량은 유의하게 증가될 수 있다.
예시된 예에서, 보고할 수 있는 결과를 수득하기 위한 데이터의 분석은 자동화된다 (예를 들어, 게이트, 영역, 및 커서의 설정 뿐만 아니라 의심스러운 결과의 플래깅 또는 통지). 플래깅/통지 측면은 시스템에서 자가-확인 특색으로 지칭될 수 있다.
모든 샘플 제조 및 분석이 하나의 기구 (10)로 완전히 통합되어, 진료소는 느리고 지루한 "배치 프로세싱"을 수행할 필요가 없으며, 여기서 샘플은 수집되고 프로세싱은 충분한 수가 수집되면 시작된다--혈액 프로세싱의 각각의 단계를 통해 샘플의 전체 그룹으로 진행한다. 대조적으로, 기구 (10)는 격납 영역 (20)에서 환자 샘플을 자동적으로 제조하도록 구성되므로, 표지하고 기록할 딸 튜브가 없고, 유의하게 더 적은 혈액 및 시약이 필요하다. 샘플은 임의의 시간에 시스템 상으로 로딩될 수 있고, 한 예에서, 각각은 자동적으로 프로세싱되고 1시간 미만 내에, 예컨대 30분 미만, 20분 미만 또는 15분 미만 내에 시스템 파이프라인을 나갈 것이다. 비록 정확한 시간이 수행될 시험 및 요구되는 샘플 제조 시간에 따라 달라질 것이지만, 후속 샘플은 대략 30분 이하의 간격으로 시스템 파이프라인을 나갈 수 있다.
유의한 이점은 실험실에 대한 비용 절감이다. 하나의 시스템을 사용함으로써, 더 많은 샘플이 하루에 프로세싱될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 적은 시스템 비용, 보다 적은 시약 비용 및 감소된 핸즈-온 노력이 있다. 따라서, 기구 (10)를 소유하고 작동하기 위한 전체 비용은 유의하게 더 낮다.
추가적으로, 이들의 다수의 모듈 및 컴퓨터 스크린을 갖는 선행기술 프로세스 및 시스템은 10 내지 13 피트의 귀중한 벤치 공간을 차지한다. 대조적으로, 진단 기구 (10)는 오토로더 부분 (12)을 포함하여 31 인치 넓이에 불과한 소형이다. 오토로더 부분이 없는 도 6에 제시된 예는 더욱 더 작은 풋프린트를 필요로 한다. 터치-스크린 컴퓨터/스크린 (제시되지 않음)이 또한 편리하게 시스템의 상단에 배치될 수 있으며, 이는 풋프린트를 작게 유지하고 실험실을 위한 귀중한 공간을 확보한다.
제안된 시스템이 또한 계약 연구, 제약 약물 개발, 및 대학 의료 센터 및 참고 실험실에서의 연구를 위해 1개 이상의 고정된 면역 감시 패널을 실행하는 임상 연구자들에게 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 줄기 및 T-세포 분석 및 계수를 위한 기재된 시험에 더하여, 기존 표준화된 면역 모니터링 패널이 면역결핍 (HIV-AIDS), 자가면역 질환, 기관 이식 반응, 감염성 질환, 종양학 등을 모니터링하는데 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 두 애플리케이션이 시스템 상에서 병렬로 실행될 수 있다.
일반적으로, 2가지 특징이 성능에 기여한다: 분해능 (동일한 양의 형광을 갖는 2개의 입자를 측정하고 이들에게 동일한 값을 지정하는 능력); 및 감도 (흐릿한 입자와 약간 더 밝은 입자 사이를 구별하는 능력). 이들 특징을 측정하기 위해, "마이크로스피어" 또는 "비드"가 본원에서 사용될 수 있다. 이들 마이크로스피어는, 예를 들어, 공지된 형광 값을 갖는 형광단-표지된 물질로부터 제조될 수 있다. 이러한 마이크로스피어가 유동 세포계측기를 통해 통과될 때, 유동 세포계측기에 의해 측정되는 분해능 및 감도 값을 반영하는 특정 시험이 수행되었다.
비드 시험은 사용된 시약이 적절히 수행하고 있다는 것을 보장하기 위해 또 다른 시험이 이어질 수 있다. 유동 세포계측기의 기술분야의 훈련을 받은 사용자는-경험 또는 이들 자신의 (가변적임) 통찰력에 크게 기반하여-유동 세포계측기가 해당일에 요구되는 진단 시험을 수행할 수 있도록 충분히 "최적화"되었는지 여부를 결정한다.
유동 세포계측기에 의해 수행될 진단 시험은 산업에서 우세한 비드 및 시약 시험과 상이한 최소 분해능 및 감도 필요를 가질 수 있다. 비드 및 시약 시험이 임상의에게 유동 세포계측기가 최적화되지 않은 것을 나타낼 수 있으나, 실제로는, 유동 세포계측기는 요구되는 진단 시험을 수행하기에 충분히 작동 중이다-이는 단순히 가설적 비드 및 시약 시험을 통과시키지 않았다.
따라서, 분해능 또는 감도에서의 임의의 결핍이 시약 및 기구 성능으로 좁혀질 수 있도록, 공지된 환자 샘플, 예를 들어 혈액 프로세싱 대조군을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 공지된 환자 샘플, 예를 들어 혈액 대조군이 사용될 때, 오직 시약 및 기구 성능만이 시험의 분해능 및 감도 결과에 영향을 미칠 수 있다.
일부 경우에, 공지된 환자 샘플이 대조군 샘플/초기 시험 샘플로서 사용될 수 있다. 공지된 환자 샘플은 구별가능한 집단, 예를 들어, 해당 특정한 기구에 의해 진단될 집단과 유사하거나 또는 동일한 적어도 2가지 유형의 세포를 갖는 것을 특징으로 한다. 표준화된 면역 모니터링 패널을 수행하고 있을 진단 장치, 예컨대 도 2-7에 제시된 것의 예에서, 공지된 샘플은 기구 (10)에 의해 분석될 유형의 세포 (예를 들어,CD34+ 조혈 줄기 세포)를 포함하는 세포 함량을 가질 것이다.
이 예에 따라, 공지된 환자 샘플이 평가를 받은 기구 (10)를 통해 실행되면, 결과는 기구 (10)가 세포의 복수의 집단을 검출할 수 있었는지 여부를 나타내야 한다. 기구의 분해능 및 감도가 최적화된 경우에, 세포의 별개의 집단은 결과에 나타나야 한다. 소프트웨어는 본원에 기재된 방식으로 광 산란, ECV 및/또는 형광 데이터를 계산하는데 사용될 수 있다.
개시된 예는 또한 특정한 시험에 대한 특정한 파라미터에 대한 기구 (10)의 분해능 및 감도를 측정하기 위해 통계를 얻고 시험 실행에 대한 역량의 측면에서 이를 정량화하는데 사용될 수 있다. 이러한 통계는 이어서 시험에 사용된 물질이 적합한지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 통계는 세포계측기/시약 패키지로부터 최소 분해능 및 감도 필요를 정의하고, 이어서 세포계측기/시약 패키지가 임의의 환자에 대한 시험을 실행하기 위해 적합하게 수행하고 있는지 여부를 분석하는데 사용될 수 있다. 통계는 또한 이전 환자 샘플로부터의 데이터가 정확한 것으로 수용되어야 하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 최종 결과는 또한 시험에 대한 성능을 검증하는 수치적 수단일 수 있다.
실시예
실시예 1: 본원에 기재된 시스템을 사용한 CD34+ 조혈 전구 세포 및 잔류 CD3+ T 세포의 계수: 시험 프로토콜 등가의 확인
배경
이식 목적을 위한 동원된, 말초 줄기 및 전구 세포 (PBSC)의 증가된 사용으로, 문헌 [Sutherland et al.]은, 국제 혈액요법 및 이식편 조작 학회 (ISHAGE)와 협력하여, 1996년에 고도의 정확도 및 실험실간 재현성을 허용하는 단순하고, 민감한 방법을 제공하려는 의도로 CD34+ 계수에 대한 표준의 세트를 기재하였다. 생성된 "ISHAGE 가이드라인"은 곧 유동 세포계측에 의한 조혈 CD34+ 전구 세포의 계수에 대한 최적 표준이 되었다.
ISHAGE 가이드라인의 특징은 생존가능한 백혈구로부터 CD34+ 세포의 수를 얻는 순차적 게이팅 전략이다. 가이드라인은 또한 시험이 시험 가변성 및 비특이적 세포 및 형광색소 결합에 대해 보정하기 위해 음성 대조군과 함께 중복으로 실행될 것을 필요로 한다. 순차적 게이팅의 선택성으로 인해, 음성 대조군의 사용은 이후 몇 년 동안 ISHAGE 가이드라인의 저자에 의해 임의적으로 되었으나, 유럽 약전 (Ph. Eur.)은 그의 사용을 요구한다. ISHAGE 가이드라인과 대조적으로, Ph. Eur.에 기재된 표준은 유럽 약전의 정교화에 대한 유럽 평의회 협약 및 EU 및 국내 제약법에 규정된 바와 같이, 법적 구속력이 있다.
IVD 시스템의 일부인 현재 이용가능한 소프트웨어 솔루션은 IVD 상태를 유지하면서 음성 대조군과 함께 또는 그 없이 CD34+ 계수를 위한 패널을 실행하기 위한 유연성을 제공하지 않는다. 추가적으로, 모든 CD34+ 계수 시약 키트가 음성 대조군 시약을 함유하는 것은 아니다. 실험실은 따라서 이들 자신의 사용자-정의 시험을 검증할 것이 요구된다.
줄기 및 전구 세포가 동종이계 (비-자기) 설정에 이식되는 경우에, 잠재적인 이식편-대-숙주 질환을 예측하고 관리하기 위해 이식편에서 CD34+ 전구 세포의 수 뿐만 아니라, 면역 적격 CD3+ 잔류 T 세포의 수도 정량화하는 것이 권장된다. 오늘날, CD34+ 전구 세포 및 CD3+ 잔류 T 세포의 동시 분석을 허용하는 이용가능한 상업적 IVD 키트는 없으므로, 실험실은 다시 본 출원을 위한 사용자 정의 시험의 검증에 의존할 필요가 있다.
아퀴오스 스템 시스템
본원에 기재된 시스템은, 무엇보다도, 임상 CD34+ 계수를 위한 총 6개의 상이한 획득 패널을 제공함으로써 이들 한계를 극복하는 것으로 의도된다 (도 9). 모든 프로토콜은 ISHAGE 가이드라인의 순차적 게이팅 전략을 따르고, 패널은 ISHAGE에 의해 제안되고 Ph. Eur.에 의해 요구된 바와 같은 3가지 시험 (중복 플러스 음성 대조군)의 "완전한" 패널, 음성 대조군의 사용이 없는 임의적인 ISHAGE 패널, 또는 드문 표본 유형에 대한 QC 목적을 위해 사용될 수 있는 단일 시험을 실행하는 옵션을 제공한다. 모든 패널 조합은 사용자 정의 시험을 생성할 필요가 없는 IVD 솔루션의 일부이다.
동종이계 기원의 샘플에서의 잔류 CD3+ T 세포의 분석의 경우, 임의적인 아퀴오스 스템 알로-CD3 키트는 기본 아퀴오스 스템 키트와 조합될 수 있다. 두 키트의 조합은 다시 본원 도 9에 기재된 3가지 패널 옵션 사이에서 선택하는 능력과 함께, 1회의 실행에서의 CD34 및 CD3의 조합된 정량화를 위한 검증된 솔루션을 제공한다.
시험 방법
아퀴오스 CL 유동 세포계측기는 본원에 기재된 방법을 시행하는데 사용될 수 있는 하나의 시스템이고 "무세척" 샘플 제조 프로세스에서 스템 진단 애플리케이션을 수행하는 정량적 자동화된 분석기이다. 이 시스템이 표본 도입부터 결과 보고까지 샘플의 핸즈-오프 프로세싱을 사용한 자동화된 분석기인 것으로 의도되기 때문에, 이는 "로드 & 고(Load & Go)" 유동 세포계측기로 지칭된다. 아퀴오스 시스템 소프트웨어 및 아퀴오스 스템 시험 및 품질 관리 시약은 광 산란, 및 형광 강도의 표준화의 사용자 확인 또는 색 보정 설정의 확인을 필요로 하지 않는다.
자동 작동은 요청을 생성하고 오토로더에 표본 튜브를 함유하는 카세트를 또는 단일-튜브 로더에 표본 튜브를 로딩함으로써 개시된다. 샘플은 이들 요청에 따라 자동적으로 프로세싱된다. 샘플은 염색되고 인큐베이션되고, 적혈구는 아퀴오스 스템 용해 용액을 사용하여 용해된다. 백혈구는 아퀴오스 스템 시험을 사용한 아퀴오스 CL 유동 세포계측 시스템 상에서 분석된다. 스템 샘플 제조는 원뿔형의 딥 웰을 갖는 바코드가 부착된 96-딥 웰 플레이트를 사용하여 작동하도록 최적화된다. 각각의 웰은 최대 600 μL를 보유한다.
아퀴오스 스템 시스템은 최대 2개의 키트를 이용할 수 있다: 아퀴오스 스템 키트 단독 또는 아퀴오스 스템 알로-CD3 키트와의 조합. 아퀴오스 스템-키트 시약은 CD45-FITC/CD34-PE 뮤린 모노클로날 항체 시약, 상응하는 음성 대조군 (CD45-FITC/CD34-CTRL), 절대 카운트 시약 (아퀴오스 스템-카운트 플루오로스피어), 세포 생존율 시약 (7-AAD), 및 즉시 사용가능한 용해 시약으로 이루어진다. 아퀴오스 스템 알로-CD3 키트는 동종이계 공여자로부터의 샘플 물질에서의 CD3+ T 세포 및 CD34+ 세포의 동시 계수를 위한 임의적인 시약 키트이다. 키트는 CD3-PC7 뿐만 아니라 적절한 음성 대조군을 함유한다.
아퀴오스 스템 시험은 CD34+ HPC/μL의 생존가능한 절대 카운트, CD45+/μL의 생존가능한 절대 카운트, 및 생존가능한 CD34+ HPC의 백분율의 동시 식별 및 계수를 위한 모노클로날 항체를 함유하는 아퀴오스 스템 키트 시약을 사용하고 있다. 3가지 아퀴오스 스템 시험이 아퀴오스 스템 메뉴 (도 9)의 일부로서 이용가능하다: 스템 패널: 중복 시험 플러스 음성 대조군 실행 (3개의 웰); 스템 중복: 중복 시험 실행 (음성 대조군 없음; 2개의 웰); 스템 단일: 단일 시험 (1개의 웰).
아퀴오스 스템 알로 시험은 아퀴오스 스템 알로-CD3 키트 시약과 조합된 아퀴오스 스템 키트 시약을 사용하고 있다. 2개의 키트의 조합은 모노클로날 항체를 함유하고 CD34+HPC/μL의 생존가능한 절대 카운트, CD45+/μL의 생존가능한 절대 카운트, 생존가능한 CD3+/μL의 생존가능한 절대 카운트 및 생존가능한 CD34+HPC의 백분율의 동시 식별 및 계수를 허용한다. 3가지 아퀴오스 스템 알로 시험이 이용가능하다 (도 9): 스템 알로 패널: 중복 시험 플러스 음성 대조군 실행 (3개의 웰); 스템 알로 중복: 중복 시험 실행 (음성 대조군 없음; 2개의 웰); 스템 알로 단일: 단일 시험 (1개의 웰).
모든 시험은 13 μL의 각각의 시약 (모노클로날 항체 및 생존율 염료)으로 염색된 43 μL의 샘플을 사용한다. 인큐베이션 15분 후, 샘플은 430 μL 용해 시약을 사용하여 용해되고, 이어서 아퀴오스 스템-카운트가 대략 15분의 용해 인큐베이션 후 추가된다. 샘플은 이어서 분석을 위해 혼합되고 흡인된다. 아퀴오스 스템 / 스템 알로 중복 또는 아퀴오스 스템 / 스템 알로 패널의 경우, 2 또는 3개의 웰이 각각 사용될 것이다.
연구의 목적 및 범주
산물 특징규명의 일부로서, 이 연구는 도 9에 요약된 분석 옵션에 걸친 생존가능한 CD34+ 절대 카운트 및 CD3+ T 세포 절대 카운트의 동등한 성능을 비교하기 위해 수행되었다.
40개의 신선한 성분채집술 샘플이 수집되고 분석되었다. CD34+ 계수를 위한 시험 옵션 사이의 등가를 평가하기 위해, 분석 옵션 "스템 패널" (CD34 중복 플러스 음성 대조군)이 2가지 추가적인 분석 옵션 "스템 중복" (음성 대조군이 없는 CD34 중복) 및 "스템 단일" (단일 시험)에 대한 참조로서 사용되었다.
동일한 시험 계획이 분석 프로토콜 "스템 알로 패널" (CD34 및 CD3 중복 플러스 음성 대조군)을 2가지 추가적인 분석 옵션 "스템 알로 중복" (음성 대조군이 없는 CD34 및 CD3 중복) 및 "스템 알로 단일" (CD34 및 CD3에 대한 단일 시험)에 대한 참조로서 사용함으로써 추가적인 마커로서 CD3을 포함할 수 있는 분석 옵션을 사용한 CD34+ 및 CD3+ 계수에 대해 수행되었다.
연구가 문헌 [CLSI EP09c: Measurement Procedure Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guidelines - Third Edition]에 따라 수행되었다. 샘플은 아퀴오스 스템 소프트웨어 및 아퀴오스 스템 시스템 시약을 갖춘 아퀴오스 CL 유동 세포계측기를 사용하여 분석되었다.
시험 설계
연구에 사용된 아퀴오스 CL 기구의 매일 시작 및 정지는 제조업체의 사용 지침에 따라 수행되었다. 유지 활동은 유지 로그에 기록되었다.
매일 품질 관리 (QC) 및 프로세스 제어 실행은 기구의 정렬을 확증하고 지정된 검정 값 내의 성능을 보장하기 위해 플로우-체크(Flow-Check) 플루오로스피어 및 아퀴오스 스템 CD34 대조군 세포를 사용하여 수행되었다.
연구에 사용된 성분채집술 샘플은 항응고제로서 ACD-A를 사용하여 수집되고 사용까지 2-8℃에서 저장되었다. 샘플은 백혈구 카운트가 30,000개 세포/μL 미만인 경우에 희석되지 않은 상태로 사용되거나, 또는 그렇지 않으면 PBS/6% 소 혈청 알부민 (BSA) 중에서 30,000개 세포/μL를 초과하지 않는 백혈구 농도로 희석되었다. 각각의 성분채집술 샘플의 개별 분취량이 도 1에 요약된 시험 옵션에 따라 총 12회의 실행에 대해 사용되었다. 용혈된 표본 및 가시적인 혈병을 함유하는 표본은 배제되었다.
데이터 분석은 CLSI EP09c에 따라 가중 데밍 회귀를 사용함으로써 수행되었다. 추정된 편향의 95% 신뢰 상한 및 하한은 편향의 표준 오차에 기반하여 및 제조업체의 허용 한계 (사양)와 비교하여 계산되었다.
결과
CD34+ 절대 카운트에 대한 아퀴오스 스템 시스템 시험 옵션 등가
조혈 전구 세포 이식의 결과는 수용자에서 조혈을 재구성하기 위해 충분한 수의 살아있는 CD34+ 세포의 성공적인 주입에 의존하므로, 유동 세포계측에 의한 CD34+ 세포의 정확한 결정은 이식 절차 내 주요 구성요소이다.
CD34+ 계수를 위한 다른 솔루션과 대조적으로, 아퀴오스 스템 시스템은, CD3+ T 세포의 임의적인 분석과 함께 또는 그 없는, CD34+ 계수를 위한 총 6개의 상이한 프로토콜을 제공한다 (도 9). 이들 상이한 시험 옵션 사이의 등가를 입증하기 위해, 동일한 샘플로부터의 분취량이 상이한 옵션으로 실행되고 상관관계에 대해 분석되었다.
실험의 제1 세트에서, CD34+ 세포/μL의 절대 수가 이들 3가지 옵션 사이의 CD34 계수에 대한 등가를 입증하기 위해 CD3을 포함하지 않는 3가지 분석 프로토콜 옵션 (스템 패널, 스템 중복, 스템 단일)으로 성분채집술 샘플을 실행함으로써 평가되었다 (도 10a-10c). 시험이 중복으로 수행되는 분석 옵션의 비교를 위해 (스템 패널 vs. 스템 중복, 도 10a), 두 실행의 평균이 분석에 사용되었다. 중복 실행을 포함하는 시험 옵션을 단일 실행 시험 옵션에 대해 비교할 때 (스템 패널 vs. 스템 단일 (도 10b) 및 스템 중복 vs. 스템 단일 (도 10c)), 제1 실행의 결과가 참조로서 사용되었다. 분석된 모든 회귀 쌍에 대해, 분석 옵션에 걸친 생존가능한 CD34+ 세포 절대 카운트의 동등한 성능이 정의된 허용 기준 내에 있는 것으로 입증되었다.
실험의 제2 세트에서, CD34+ 세포의 수는 CD34+ 및 CD3+ 세포의 병렬 계수에 대해 의도되는 3가지 분석 프로토콜을 사용함으로써 분석되었고; 모든 다른 기준은 동일하게 유지되었다 (도 11a-11c). 다시, 분석된 모든 회귀 쌍에 대해, 분석 옵션에 걸친 생존가능한 CD34+ 세포 절대 카운트의 동등한 성능이 또한 CD3을 사용한 분석 프로토콜에 대해서도 정의된 허용 기준 내에 있는 것으로 입증되었다.
요약하면, CD3과 함께 또는 그 없는, CD34+ 계수를 위한 모든 6가지 분석 옵션은 분석된 상관관계 쌍에 대한 동등한 결과를 제공하였다.
잔류 CD3+ T 세포의 계수에 대한 아퀴오스 스템 시스템 시험 옵션 등가
혈액 질환 또는 조혈 시스템의 비-악성 기능장애의 경우, CD34+ 세포는 비-자기 (동종이계) 공여자의 말초 혈액 (PB), 골수 (BM) 또는 제대혈 (CB)로부터 수집된다. 공여자 및 수용자가 동일한 사람인 자가 설정에서와 같이, 동원된 PB는 오늘날 동종이계 이식 계획에서 CD34+ 줄기 및 전구 세포에 대한 가장 통상적으로 사용되는 공급원이다.
동원된 말초 혈액으로부터의 CD34+ 세포의 사용은 이식 후 조혈의 비교적 신속한 회복의 이점을 갖지만 보다 높은 수의 순환 T 세포로 인해 급성 이식편 대 숙주 질환 (aGvHD)의 증가된 위험이 함께 따른다. 급성 및 만성 GvHD가 대략 30-40%의 동종이계 이식을 받은 환자에 영향을 미치고, 공여자 T 세포가 aGvDH를 매개하는데 중심 역할을 하는 것으로 인식되기 때문에, 이식편에서의 CD34+ 세포와 함께 CD3+ T 세포의 계수는 많은 실험실에서 표준 관행이 되어왔다.
CD34+ 계수를 위한 표준 시험 프로토콜에 더하여, 아퀴오스 스템 시스템은 CD3+ T 세포를 CD34+ 세포와 함께 하나의 실행으로 분석하는 옵션을 제공한다. CD34+ 분석 뿐만 아니라 CD3+ 계수에 대한 시험 옵션 등가를 보장하기 위해, 본원에 기재된 3가지 분석 옵션에 대한 CD3+ 계수의 결과를 비교한 실험의 제3 세트가 수행되었다 (도 12a-12c). CD34+에 대해, 분석 옵션에 걸쳐 생존가능한 CD3+ 세포 절대 카운트의 동등한 성능이 분석된 모든 회귀 쌍에 대해 정의된 허용 기준 내에 있는 것으로 입증되었다.
결론
아퀴오스 스템 시스템은 아퀴오스 CL 유동 세포계측기 상 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 자동화된 분석을 위한 모듈식 접근법이고 패널 및 검정 유연성의 측면에서 현재 이용가능한 솔루션의 한계를 극복하는 것으로 의도된다.
본 연구는 다른 것보다 하나의 옵션을 선택함으로써 잠재적인 편향을 배제하기 위해, 시스템에 의해 제공된 시험 옵션이 CD34+ 및 CD3+ 절대 카운트에 대한 동등한 데이터를 초래하는 정도에 대한 질문을 다뤘다.
요약하면, 분석된 모든 회귀 쌍에 대해 데이터의 등가를 입증하는 것이 가능하였고, 분석 옵션에 걸친 생존가능한 CD34+ 세포 절대 카운트 및 생존가능한 CD3+ 절대 카운트의 동등한 성능이 정의된 허용 기준 내에 있는 것으로 입증되었다.
실시예 2: 아퀴오스 스템 시스템과 그의 전제 방법, FC500 스템-키트 사이의 작업 흐름 비교
배경
오늘날 50,000개 초과의 조혈 줄기 및 전구 세포 (HPC) 이식이 여러 혈액 악성종양 뿐만 아니라 비-혈액학적 적응증의 치료를 위해 매년 전 세계적으로 수행된다.
임상 실험실은 사용자-정의 시험의 시간 및 자원 소모 검증을 피하기 위해 CD34+ HPC 계수를 위한 상업적으로 입수가능한 IVD 솔루션에 의존한다. 대부분의 시약 키트 및 소프트웨어 패키지는 1996년 및 1998년 ISHAGE 가이드라인에 대한 반응으로서 개발되었지만 특히 자동화 능력의 측면에서 진단 실험실의 발전하는 요구를 만족시키기 위해 업데이트되지 않았다. 혈액-종양학 실험실에서, HPC 샘플은 흔히 긴급 (STAT) 샘플로서 실험실에 도착하고 즉각적인 주의를 필요로 하며, 이는 일상적인 작업 흐름을 파괴한다. 이들 샘플과의 임의의 이슈는 노력이 중복되고 따라서 인간 오류에 대한 가능성을 증가시킨다. 이들 실험실의 경우, CD34+ HPC의 분석은 시간 임계적이기 때문에, HPC 샘플을, 이상적으로는 샘플링 실수 또는 다른 이슈에 대한 위험을 최소화하는 방식으로, 일반적인 작업 흐름으로 통합하는 것이 바람직할 것이다.
이 실시예는 턴어라운드 시간 및 작동자 핸즈-온 시간의 측면에서 자동화된 CD34+ 계수를 위한 새로 개발된 아퀴오스 스템 시스템의 작업 흐름을 그의 전제 방법, FC500 유동 세포계측기에 대한 스템-키트에 대해 비교한다 (둘 다 베크만 컬터, 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc.)).
전통적인 유동 세포계측 작업 흐름의 개요
CD34+ 계수를 위한 많은 전통적인 유동 세포계측 솔루션, 예컨대 FC500에 대한 베크만 컬터 스템-키트는 샘플의 수동 제조, 워크리스트의 수동 생성, 수동 데이터 검토, 및 수치 데이터의 수동 표 작성을 필요로 한다. 이 작업 흐름은 보다 긴 실행 시간, 보다 핸즈-온 시간을 초래할 수 있고, 보다 숙련된 작동자를 필요로 한다.
전제 방법 (FC500 상 스템-키트)을 사용한 CD34+ 계수 시험을 수행하기 위해, 작동자는 기구 정렬에 대해 수동적으로 체크하고, 형광색소 스필오버 (보정)를 확인하고 조정하기 위해 대조군을 제조하고, 프로세스 제어를 제조하고 실행하고, 마지막으로 실제 환자/공여자 샘플을 제조하고 실행하는 것이 요구된다. 생성된 데이터는 확인되고 수동적으로 실험실 정보 시스템 (LIS)으로 전달될 필요가 있다. 시약 및 품질 관리 (QC) 로그북은 전형적으로 수동적으로 유지된다. 대표적인 수동 유동 세포계측 작업 흐름에 대해 도 13을 참조한다.
아퀴오스 CL 유동 세포계측기 작업 흐름의 개요
아퀴오스 CL은 시험 결과를 야기하는 다수의 제조 단계를 수행하는 자동화된 시스템이므로, 대부분의 수동 제조 단계가 제거된다.
아퀴오스 상 CD34+ 계수를 위한 아퀴오스 스템 시스템의 경우, 작동자는 시스템 상에 시약을 한 번 로딩하고, 기구를 시작하고, QC 샘플을 실행할 필요가 있고, 이어서 남은 근무일 전반에 걸쳐 환자 샘플을 로딩하고 분석할 준비가 된다 (도 14).
비교 프로토콜
이 사례 연구의 목적은, 무엇보다도, CD34+ 계수를 위한 아퀴오스 CL 유동 세포계측기 설계를 평가하고, 그의 생성된 작업 흐름을 FC500 (전제 방법) 상 베크만 컬터 스템-키트와의 비교를 통해 모델링하는 것이었다. 이 사례 연구는 하기 작업 흐름 파라미터를 추정한다:
턴어라운드 시간 - 대체 시스템의 경우, 지속 시간은 제1 샘플 제조 단계로 시작하고 완료된 시험 결과로 종료한다. 아퀴오스 CL 시스템의 경우, 지속 시간은 오토로더에 배치된 샘플로 시작하고 디스플레이된 마지막 샘플에 대한 완료된 시험 결과로 종료한다. 두 시스템에 대해, 시간은 QC를 포함하지 않는다.
작동자 핸즈-온 시간 - 제조업체의 사용 지침에 따라 제공된 시험 절차에 열거된 단계를 물리적으로 수행하는데 사용자에 의해 요구되는 시간.
시점은 샘플 제조 및 분석 프로세스를 비디오테이핑함으로써 포획되고 인-하우스 작업 흐름 분석 소프트웨어를 사용하여 모델링되었다.
결과
샘플 프로세싱 턴어라운드 시간 및 작동자 핸즈-온 시간. 이 시험 사례는 동원된 말초 혈액의 1개의 샘플 또는 10개의 샘플의 배치를 사용한 시나리오로 이루어졌고, 중복 플러스 음성 대조군에서 제조되었다. 아퀴오스 스템 시스템은 그의 전제 방법, FC500 상 스템-키트에 대해 직접적으로 비교되었다. 데이터는 중복 실행 플러스 음성 대조군으로 이루어진 시험에 대해 제시된다.
1개의 표본 샘플에 대해, 샘플 제조부터 결과 생성까지의 결과 도출 시간은 프로세스 단계가 주로 항체 및 적혈구 용해 시약을 사용한 인큐베이션 시간에 의해 결정되기 때문에 큰 차이를 나타내지 않았다 (전제 방법에 대해 56:19분 vs. 아퀴오스에 대해 53:54분; 도 15a).
그러나, 작동자 핸즈-온 시간은 전제에 대해 6:23분 vs. 아퀴오스에 대해 0:20분으로 95%만큼 감소될 수 있다 (도 15a).
10개의 표본 샘플의 배치의 경우 (중간-크기의 줄기 세포 이식 센터에서의 평균 매일 작업량), 이들 차이는 보다 현저해진다. 표본 제조부터 결과 생성까지의 결과 도출 시간은 전제 방법에 대해 2:40:29시간에서 아퀴오스에 대해 2:03:54시간으로 내려갔으며 (도 15b), 작동자 핸즈-온 시간은 전제 방법에 대해 1:01:13시간에서 아퀴오스 스템 시스템에 대해 3:20분로 감소된다 (도 15b).
또한 수동 프로세스의 경우 특정 단계가 병렬로 (제1 샘플의 인큐베이션 시간 동안 다음 샘플을 피펫팅함 등) 수행될 수 있기 때문에, 10개의 샘플에 대한 전체 시간은 1개의 샘플의 10배 합계보다 더 짧다.
1년의 기간에 걸쳐 근무일당 10개의 샘플을 가정하면, 아퀴오스 스템 시스템은 실험실에서 매년 수백 시간의 귀중한 기술 시간을 절약한다. 추가적으로, 하루에 10개의 샘플의 평균 작업량을 실행할 때 보다 빠른 결과 도출 시간은 시간-임계적 검정, 예컨대 CD34+ 계수를 지원한다.
품질 관리 (QC) 절차에 대한 프로세스 시간 및 작동자 핸즈-온 시간
규제된 환경에서, 시스템 성능은 기구 설정 뿐만 아니라 실행될 시험 둘 다에 대해 적절한 품질 및 프로세스 제어로 제어될 필요가 있다. FC500 상 스템-키트 및 아퀴오스 둘 다에 대해, 유동 세포계측기의 광학 정렬 및 유체 시스템의 매일 확인은 플루오로스피어 (형광 마이크로스피어)의 검정된 현탁액인 플로우-체크 플루오로스피어로 수행된다. 관심 분석적 파라미터의 확인을 위한 프로세스 제어를 위해, 전제 방법은 정상 혈액 샘플에 첨가되는 동결건조된 CD34+ 세포 (스템-트롤(Stem-Trol) 세포)를 사용하지만, 아퀴오스 스템 시스템은 인간 전혈 표본에서 발견되는 것 중 대표적인 안정화된 인간 백혈구 (림프구, 단핵구 및 과립구) 및 용해, 광 산란, 항원 발현 및 항체 염색 특성을 갖는 적혈구 (아퀴오스 스템 CD34 대조군 세포)의 액체 제제를 사용한다.
CD34+ 계수와 관련된 QC 절차에 필요한 총 시간은 전제 방법에 대해 2:02:22시간에서 아퀴오스에 대해 1:09:44시간으로 감소되었다. 주목할 점은, QC는 환자/공여자 샘플이 실행될 수 있기 전에 완료될 필요가 있으며, 이는 하루에 52:38분의 시간 절약을 야기한다 (도 16a). 주 5일 근무의 경우, 이는 오직 QC 절차에 대해서만 합계가 최대 대략 4.5시간이 된다 (도 16b).
QC 절차에 대한 작동자 핸즈 온 시간은 하루에 12:22분 (전제)에서 1:51분 (아퀴오스)으로 감소되고 (도 16a), 이는 주당 52분의 QC 프로세스에 대한 총 핸즈-온 시간 절약을 초래한다 (도 16b).
결론
모든 시험 사례 시나리오에서, 아퀴오스 스템 시스템은 전제 방법보다 실질적으로 더 적은 핸즈-온 시간을 필요로 하였다. 하루에 10개의 표본 샘플을 사용한 전형적인 주 5일 근무의 경우, 아퀴오스 스템 시스템은 수동 작업량을 대략 6시간만큼 감소시켰으며, 이는 실험실로 하여금 자원을 보다 효율적으로 배당하게 한다. 추가적으로, 아퀴오스 스템은 샘플 제조부터 환자 결과까지의 전체 턴어라운드 시간을 감소시키며, 이는 시간-임계적 시험, 예컨대 CD34+ 계수에 필수적이다.
아퀴오스 스템 시스템은 "무세척" 샘플 제조 프로세스에서 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포의 계수를 수행하는 정량적 자동화된 솔루션이다. 이 시스템은 표본 도입부터 결과 보고까지 샘플의 핸즈-오프 프로세싱을 사용한 자동화된 분석기인 것으로 의도되기 때문에, 이는 로드 & 고 유동 세포계측기로 지칭된다. 자동화 특색은 아퀴오스 스템 시스템을 대안적 방법 (그의 전제 방법, 즉 스템-키트를 사용한 FC500을 포함함)으로부터 구별하며, 여기서 많은 프로세스 단계는 수동적으로 수행될 필요가 있다. 아퀴오스 스템 시스템의 올-인-원 접근법은 시간 절약을 돕고 현대 실험실의 작업 흐름 효율을 증가시키는 것을 돕는 것으로 의도된다.
범위 포맷으로 표현된 값은 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 값을 포함할 뿐만 아니라, 각각의 수치 값 및 하위-범위가 명시적으로 언급된 바와 같이 해당 범위 내에 포괄된 모든 개별 수치 값 또는 하위-범위를 포함하도록 유연한 방식으로 해석되어야 한다. 예를 들어, "약 0.1% 내지 약 5%" 또는 "약 0.1% 내지 5%"의 범위는 약 0.1% 내지 약 5% 뿐만 아니라 개별 값 (예를 들어, 1%, 2%, 3%, 및 4%) 및 표시된 범위 내의 하위-범위 (예를 들어, 0.1% 내지 0.5%, 1.1% 내지 2.2%, 3.3% 내지 4.4%)을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 서술 "약 X 내지 Y"는, 달리 지시되지 않는 한, "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다. 마찬가지로, 서술 "약 X, Y, 또는 약 Z"는, 달리 지시되지 않는 한, "약 X, 약 Y, 또는 약 Z"와 동일한 의미를 갖는다.
이 문헌에서, 단수 용어는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 포함하는데 사용된다. 용어 "또는"은 달리 지시되지 않는 한 비배타적인 "또는"을 지칭하는데 사용된다. 추가적으로, 본원에 이용되고, 달리 정의되지 않은 어법 또는 용어는 오직 설명의 목적만을 위한 것이고 제한을 위한 것이 아님이 이해되어야 한다. 섹션 제목의 임의의 사용은 문헌 읽기를 돕는 것으로 의도되고 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 추가로, 섹션 제목과 관련이 있는 정보는 해당 특정한 섹션 내부 또는 외부에서 발생할 수 있다. 더욱이, 본 문헌에 언급된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 문헌은 마치 개별적으로 참조로 포함되는 바와 같이, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 문헌과 참조로 포함된 이들 문헌 사이에 불일치한 사용의 경우, 포함된 참고문헌의 사용은 본 문헌의 것을 보완하는 것으로 간주되어야 하고; 양립할 수 없는 불일치의 경우, 본 문헌에서의 사용이 지배한다.
본원에 기재된 방법에서, 단계는 시간적 또는 작동적 순서가 명시적으로 언급되는 때를 제외하고는, 본 개시내용의 원리를 벗어나지 않으면서 임의의 순서대로 수행될 수 있다. 더욱이, 명시된 단계는 명시적인 청구항 언어가 이들이 별도로 수행된다는 것을 언급하지 않는 한 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, X를 수행하는 청구된 단계 및 Y를 수행하는 청구된 단계는 단일 작동 내에서 동시에 수행될 수 있고, 생성된 프로세스는 청구된 프로세스의 문언적 범주 내에 속할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 명시된 값 또는 범위의 명시된 한계의, 예를 들어, 10% 이내, 5% 이내, 또는 1% 이내의 값 또는 범위에서의 가변성 정도를 허용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로"는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99%, 또는 적어도 약 99.999% 이상에서와 같이 다수, 또는 대부분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 없는"은 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.001% 미만, 또는 약 0.0005% 미만 또는 그 이하 또는 약 0% 또는 0%를 지칭한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 실시양태에 대한 많은 변형이 본 개시내용 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 설명은 제공된 예를 제한하는 것으로 의도되지 않고 해석되어서는 안 되지만 첨부된 청구항 및 그에 대한 등가물에 의해 제공되는 전폭적인 보호가 인정되어야 한다. 추가적으로, 다른 특색의 상응하는 사용 없이 본 개시내용의 특색 중 일부를 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 상기 설명 또는 예시적인 실시양태는 본 개시내용의 원리를 예시할 목적으로 제공되고 이에 제한되지 않고 그에 대한 변형 및 그의 치환을 포함할 수 있다.
Claims (19)
- 하기 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 자동화된 유동 세포계측 방법:
1개 이상의 혈액 샘플을 유동 세포계측기의 샘플 제조 영역에 위치된 샘플 플레이트의 1개 이상의 리셉터클 내로 배치하는 단계;
1개 이상의 리셉터클을 적어도 1종의 시약으로 처리하여 적어도 1종의 제1 조성물을 수득하는 단계로서, 적어도 1종의 시약 중 적어도 하나는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약인 단계;
조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약의 결합에 충분한 기간 동안 적어도 1종의 제1 조성물을 인큐베이션하여 적어도 1종의 제2 조성물을 제공하는 단계;
적어도 1종의 제2 조성물을 용해 시약으로 처리하여 적어도 1종의 제3 조성물을 제공하는 단계; 및
유동 세포계측에 의해 적어도 1종의 제3 조성물을 분석하여 1개 이상의 혈액 샘플 중에서 생존가능한 총 조혈 줄기 세포 카운트, 생존가능한 총 전구 세포 카운트, 및 생존가능한 총 T-세포 카운트 중 적어도 하나를 수득하는 단계. - 제1항에 있어서, 방법이 중복 혈액 샘플로 수행되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 방법이 음성 대조군과 함께 수행되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 음성 대조군이 CD34에 대한 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 음성 대조군이 CD3에 대한 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 CD45, CD3, 및 CD34 중 적어도 하나인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 영상화 시약이 형광 리포터를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 영상화 시약이 FITC, PE 또는 PC7 형광 리포터를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물이 생존율 염료를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 생존율 염료가 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD)인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 생존가능한 총 조혈 줄기 세포 카운트, 생존가능한 총 전구 세포 카운트, 및 생존가능한 총 T-세포 카운트가 수득되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 플레이트가 96-웰 마이크로타이터 플레이트인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 리셉터클을 적어도 1종의 시약으로 처리하여 적어도 1종의 제1 조성물을 수득하는 단계가 미리 결정된 부피의 적어도 1종의 시약을 전달하도록 구성된 자동화된 피펫에 의해 수행되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션이 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약의 결합에 충분한 미리 결정된 기간 동안 적어도 1종의 제1 조성물을 인큐베이션하여 적어도 1종의 제2 조성물을 제공하도록 자동화된 것인 방법.
- 하기 단계를 포함하는, 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나의 분석 및 계수를 위한 자동화된 유동 세포계측 방법:
제1 혈액 샘플을 샘플 플레이트의 제1 리셉터클 내로 배치하는 단계;
제1 리셉터클을 적어도 1종의 시약으로 처리하여 제1 조성물 f1을 수득하고 제1 조성물 f1을 인큐베이션하여 제2 조성물 s1을 제공하는 단계로서, 적어도 1종의 시약 중 적어도 하나는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약인 단계;
제1 조성물 f1을 인큐베이션하는 동안에, 제2 혈액 샘플을 샘플 플레이트의 제2 리셉터클 내로 배치하고 제2 리셉터클을 적어도 1종의 시약으로 처리하여 제1 조성물 f2를 수득하고 제1 조성물 f2를 인큐베이션하여 제2 조성물 s2를 제공하는 단계로서, 적어도 1종의 시약 중 적어도 하나는 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포, 및 T-세포 중 적어도 하나에 대한 마커에 특이적인 인식 요소를 포함하는 적어도 1종의 영상화 시약인 단계;
제2 조성물 s1 및 s2를 용해 시약으로 처리하여 제3 조성물 t1 및 t2를 제공하는 단계; 및
유동 세포계측에 의해 제3 조성물 t1 및 t2를 분석하여 생존가능한 총 조혈 줄기 세포 카운트, 생존가능한 총 전구 세포 카운트, 및 생존가능한 총 T-세포 카운트 중 적어도 하나를 수득하는 단계. - 제14항에 있어서, 음성 대조군을 제조하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 음성 대조군이 제1 조성물 f1 전에 제조되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 음성 대조군이 제1 조성물 f1 후에 제조되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 음성 대조군이 제1 조성물 f2 후에 제조되는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
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