CN117795311A - 制备用于分析或诊断目的的生物样本的设备和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于自动处理体液样本、优选用于液体活检分析的设备，其配置为获得体液样本的一个或多个相互分离且不同的信息组分，其中第一组分包括细胞元素，该细胞元素被固定在平面支撑件上；第二组分包括悬浮样本细胞；第三组分包括样本液体级分，优选装在试管中。本发明还涉及一种通过上述设备制备上述组分的方法。

Description

制备用于分析或诊断目的的生物样本的设备和方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备用于后续分析或诊断目的的生物样本的设备和方法领域。

具体地，本发明涉及一种靠近采集起始样本的点对体液样本进行自动化和标准化处理的设备，优选地用于基于液体活检的分析或诊断，该设备配置为可提供该样本的信息组分和稳定组分，尤其适合分析与多种病症相关的生物内容，包括肿瘤、退行性或感染性病症，或可在产前检测到的病症。

背景技术

众所周知，在临床上，分析前阶段代表了生物样本分析活动中的关键时刻，因为它包括不同的程序阶段，其中不同变量的发生可能影响样本本身的质量、后续分析的结果及其可用性。样本的适用性和可接受性是其分析前阶段的基础部分，实验室研究结果的可变性将被参数化。

分析前变量有多个，包括与样本的采集、制备、保存和运输相关的生物学、生理事件和技术模式，这些变量通常决定了不确定性、误差，有时还决定了实验室管理这些变量的不期望的费用支出。

上述变量可能会对实验室检测结果产生重要影响，增加可获得结果的不确定性因素，也可能导致与患者真实生物状况不符的反应，特别是在基于所谓液体活检的诊断中。

液体活检涉及诊断学领域，主要是肿瘤学诊断，旨在通过分析体液样本(例如外周血)，特别是分析在血液循环中释放的病理(例如肿瘤)相关的元素来识别和/或表征生物成分。液体活检的分析旨在识别和表征循环肿瘤细胞(CTC)或胎儿细胞(在产前诊断的情况下)，或其他无细胞元素(如核酸、蛋白质、外泌体)，这些元素是在去除细胞成分后从样本(主要是无细胞的)液体成分中提取的；悬浮细胞组分可用于信息丰富的遗传分析，以表征基因组DNA的突变状态，并将其与液体成分中存在的无细胞DNA部分中识别的突变特征进行比较。在悬浮细胞部分中可以发现无病理意义的基因突变，对其进行识别是避免出现假阳性的关键：这种现象的频率随着个体年龄的增长而增加，被称CHIP(不确定潜能克隆造血)并且是错误诊断的主要来源之一。悬浮细胞组分还可用于免疫细胞的蛋白质组学和转录组学分析。然而，这三个组分的样本制备需求和分析模式各不相同，这就限制了在不进行多次采集的情况下从所有组分获取临床信息的可能性。

为了保持样本的完整性和组成成分，用于样本制备分析前活动的已知设备和方法通常面临着一些问题，这些问题的原因各不相同，例如保存温度、可能存在的防腐剂、离心、过滤、冷冻、运输和所用试管/容器类型造成的机械/物理应力等。

从采集的那一刻起，体液就开始变质，并且可能会观察到多种降解现象。细胞通过释放其内部所含的遗传物质来改变其形态并分解，该遗传物质与液体成分中循环的遗传物质混合。液体成分中(例如在血液采集的血浆中)存在的非细胞物质(外泌体、蛋白质、囊泡、游离核酸)开始损坏，从而导致信息丢失，从而需要使用防腐剂来阻止或者至少减缓这个过程。然而，这些物质可以干扰细胞生物学，例如通过改变其形态或通过干扰蛋白质表达。例如，如果希望进行需要细胞反应性的测试，例如与底物的粘附或与标记物(例如抗体)的反应，则某些类型的防腐剂是禁用的。此外，例如，冷冻是一种已知可以减少血浆降解现象的技术，但它代表了一种难以控制的不稳定保存模式。

此外，在血液样本的情况下，由于样本本身的等待时间和运输模式，通常会注意到凝块的形成，为了避免这种形成，常见的做法是向收集的血液中添加抗凝剂。这个问题在细胞学、血液学和肿瘤学中尤其明显，特别是在液体活检方案中，其中过度凝固是样本不可接受的原因之一。

另一个例子是血液样本的采集和分析之间的时间间隔，这是获得可靠结果的决定性因素。事实上，在提供使用抗凝剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)的程序中，已知其与血样的长期接触会引起细胞的改变。此外，如果所述程序利用防腐剂，即如前所述延迟上述降解过程的不同于EDTA的物质，则血液的特征及其细胞成分的反应性将被改变，从而下游测试将受到损害，特别是在与循环肿瘤细胞(CTC)相关的分析中。

因此，需要解决方案来克服已知技术中与体液样本分析的时间相关的困难，特别是在液体活检方案中体液样本必须在分离后才能进行分析，目的是不影响其有效性。

考虑到上述情况，并且特别是为了处理体液样本的不同组分以减缓其降解过程的不同需要，这些方法和已知的设备通常收集多个样本，然后根据当时可能搜索/检测的分析类型以不同的时间和模式进行处理和分析，但仍然可能涉及相同的诊断调查。这种情况代表了额外的缺点，无论是在样本信息内容的一致性方面还是在分析实验室的管理成本方面。

已知解决方案的另一个缺点可归因于以下原因：在制备待分析样本的过程中，操作人员需要进行大量的操作活动，这就不可避免地降低了化验和测试的临床有效性，也降低了制备样本的同一可重复程序的适用性，即使在不同的诊断环境中也是如此。

已知技术的另一个问题是：为了能够将所需的生物材料与其他样本成分分离，有必要使用对样品本身构成应力源和/或造成其部分损失的技术。例如，过滤器或微流体系统的过滤、磁珠的使用和细胞离心等。例如，具体到含有细胞的液体样本(例如血液)的管理，最广泛的技术解决方案之一是使用细胞离心单元，通过离心机将细胞直接挤压在载玻片等支撑件上进行收集。

然而，目前在实验室中使用且非常常见的这种模式不仅涉及样本的细胞损失(因为细胞通常倾向于从支撑件上分离)，而且还会造成细胞形态的损失，以及细胞以不均匀的方式粘附在重叠的平面上，从而部分掩盖了细胞的内容，影响了在显微镜下对其进行充分和全面的分析。尽管已经尝试来减轻细胞损失和形态损伤的此类负面影响，但此类尝试实际上仅限于手动或经验解决方案，具体针对每个实验室或其有效性取决于操作员。如果说细胞学分析已经涉及到这个问题，那么考虑到循环肿瘤细胞在液体样本中的稀有性，这个问题在循环肿瘤细胞中就变得更加重要。

发明内容

本发明所提出和解决的技术问题是克服上述问题，特别是提供一种如权利要求1所限定的设备。

本发明的附加特征在相应的从属权利要求中限定。

如权利要求10所限定的，本发明还涉及一种用于自动制备体液样本的方法，对体液样本进行处理以组合或任选地获得该样本的一种或多种、优选多种信息组分，以用于化学分析，特别是液体活检，具体为：

第一固定细胞组分，优选地稳定在平面支撑件上，

第二悬浮细胞组分，优选稳定在试管内，

第三液体、稳定组分或在试管内稳定。

本发明的设备是用于自动处理用于化学分析、特别是液体活检的生物样本的设备，其使用体液样本作为起始材料。在优选实施例中，由该设备处理的体液样本是全血样本。

该设备提供了盒状主体，其包括内部腔室和用于进入该腔室的开口。内部腔室具有第一、第二和第三容纳装置，其分别被配置成容纳流体样本、试剂元素和适合于固定样本的细胞的平面支撑件。该设备甚至包括用于收集液体和固体废料的装置。该设备还包括用于采集和分配内部腔室中的样本和/或试剂和/或样本的中间制剂的装置。

该设备还包括离心装置和控制单元，该离心装置可操作地与该采集和分配装置相关联。控制单元被配置为根据自动化方案控制该采集和分配装置以及离心装置。

该设备的整体构造使得，根据自动化方案，该设备允许从进入内部腔室的生物流体样本获得样本的第一组分和/或样本的第二组分和/或样本的第三组分以及工艺废料的组分，其中每个组分都是彼此分离并且不同的。

第一组分包括固定在平面支撑件上的样本的细胞，第二组分包括在液体悬浮液中的样本的细胞，优选提供在试管中，第三组分包括样本液体级分，例如血浆，优选提供在试管中，第四组分包括工艺废液。

在本发明的一个优选实施例中，上述设备可以同时获得除工艺废液之外的上述三种信息组分中的至少两种组分。

有利地，本发明的设备允许在平面支撑件上制备用于分析的生物样本，例如采集在只含有抗凝剂(优选EDTA)的试管中的血液样本，通过使它们随时间保持稳定，例如长达一年，这要归功于由该设备进行的快速处理和稳定。这样，就可以中断实验室的工作流程，例如，可以通过大大改进分析活动的管理模式(实验室实用性)来冻结所获得样品的成分。换句话说，从生物学的角度来看，本发明的设备保证了分析结果的有效性，由于在样本采集后立即进行处理，分析结果不会被改变；而从样本管理的角度来看，本发明的设备可以轻松实现实验室分析流程，而不强迫操作人员连续工作。特别是在采集血液样本时，本发明的设备甚至可以通过在仅含抗凝剂(优选EDTA)的试管中进行采集来获得上述优点，从而将防腐剂通常引起的样本变化降至最低。

此外，本发明的设备允许处理一个单一样本，由此可以获得所有三个上述信息组分。事实上，从进入设备的一个单一样本中可以获得分别沉积在支撑件上或悬浮液中的包含样本的细胞元素的第一组分和第二组分、包含液体组分的第三组分和包含液体废料的额外组分。有利的是，通过克服对三种组分的不同需要以保证其长期的保存和稳定性所造成的限制，可以同时从进入设备的一个单一样本获得具有极其丰富的信息和临床有效内容的三种不同组分。

本发明的一个特别有利的方面为：该设备允许从一个单一输入样本获得来自其不同组分的多条信息，而不必在不同时间/时刻采集样本来进行所需的一组分析，并且在采集期间不必使用多个装有特定防腐剂或试剂的容器来获取想要从体液中获得的不同信息组分。

有利地，本发明的设备允许从一个单一生物样本获得：

-输入样本的第一细胞组分，其尤其适合识别循环肿瘤细胞(CTC)；

-第二悬浮细胞组分，其主要由白细胞组成，尤其适合于分析其中所含白细胞的蛋白质含量和核酸，特别例如作为分析液体级分中存在的游离核酸的突变情况的对照，或用于免疫细胞含量的特定分析；

-第三组分，其包含液体级分例如血浆，其在临床实践中也广泛用于分析多种分析物，例如游离核酸(无细胞DNA、无细胞RNA)、蛋白质、囊泡和外泌体。

本发明的另一有利方面涉及：该设备允许以自动化方式制备待分析的生物样本，通过为制备样本提供几乎完全标准化的过程，使得随后可以在各种临床环境进行分析并且结果具有有效的临床实用性。

根据优选实施例，该设备被配置为与用于支撑所获得的组分的装置一起工作，特别是平面支撑装置，该装置通过纳米材料的表面沉积而被功能化。该支撑装置，特别是以载玻片的形式，可以立即、精细且有效地粘附任何活细胞，有利地允许在液体活检方案中进行完全捕获。

如此构造的设备允许以完全平面模式分配试剂并执行随后的清洗，从而避免了在装满大量试剂的容器中提供浸泡基底的溶液。

该装设备被配置为使得吸取和分配速度、移动的体积和臂定位精度能够协调每个信息组分的工艺需求。

上述结果在液体活检方案中特别有利，因为由于样本的立即、自动化和标准化制备，该设备返回至少一个组分，该组分实际具有来自新鲜样本(例如CTC)的临床信息细胞的基本上完整的库，即使在早期疾病的情况下也能获得最大的灵敏度。

有利地，本发明的设备随后允许在固定或悬浮的单细胞水平上或在液体成分中包含的无细胞组分(从样本中获得的第三组分)上对形态学、蛋白质组学和遗传特征进行后续完整的分析评估；还允许完成可检测的临床分析信息以及对比不同信息内容的特征。

用该设备获得的第一组分适合于用病理解剖学的传统技术进行分析，例如细胞学、免疫细胞化学、免疫荧光、FISH和分子分析。

第二组分由悬浮细胞成分组成，适用于通过FACS技术、质谱仪、ELISA进行蛋白质组分析，以及通过测序(NGS、RNAseq、Sanger、数字PCR)进行遗传研究，均用于获得其中所含的白细胞的具体信息，并将第三种液体组分中的无细胞DNA中鉴定的突变与从第二组分中的悬浮细胞中提取的细胞基因组DNA中可能存在的突变进行比较；这种比较对于验证在第三组分的无细胞DNA中鉴定的突变结果以及排除可能使分析结果无效的假阳性的存在至关重要。

与此相对的，第三组分适用于游离核酸的遗传和表观遗传分析(NGS、Sanger、数字PCR)以及对其他分析物(例如循环蛋白和外泌体)的其他分析。

结合由人工智能引导的对平面支撑件上的细胞成分的成像分析与对相同细胞进行的先进基因测序，结合对从用本发明设备制备的样本的液体组分(无细胞成分)和悬浮细胞组分中提取的元素进行分析，使液体活检试验在任何临床环境下都能达到最高的灵敏度和特异性。收集过程中不存在防腐剂以及减少由用于分离重要成分的最常见方法引起的应力，结合二者可有效减少可从样本获得的信息的损失。

实质上，本发明提供了一种预分析设备，该设备保证了标准化和自动化制备新鲜体液样本，适合于实施液体活检的主要方案，并且优选地使用特定的支撑件，例如载玻片，其被功能化且被配置为保留细胞的形态特征，目的是提供适合于鉴定细胞成分的该样本的第一组分。除了标准显微镜载玻片之外，可选的支撑件还可以是盖玻片、单孔板或多孔板。

同时，本发明的设备被配置为除第一组分之外还提供用于悬浮细胞分析的样本的第二组分，以及样本的第三组分，特别是包含液体级分的组分，用于分析不含细胞的内容，样本的提供无需使用测试专用试管采集血液，也无需专业技术人员的帮助。

本发明在肿瘤学背景下特别有利，特别是在寻找细胞和稀有成分，例如第一组分中的CTC和第三组分中的循环核酸或其他肿瘤标志物，以及与第二组分中悬浮白细胞的核酸进行比较。特别有利的是，可以将第一和第三组分中的一种(或两种)基因组含量的可能异常与含有悬浮细胞的组分的基因组含量进行比较，以区分白细胞中存在的无病理意义的突变。此外，例如，在免疫治疗中，通过转录组分析来分析悬浮白细胞的特定特征是特别有用的。

最后，系统可以被编程为同时管理来自一个或多个不同受试者的可变数量(优选地从1到8个)的样本，由此通过为每个样本使用可变数量(优选地从1到80个)的载玻片，使其灵活地适应可能需要分析不同数量样本的诊断环境。

本发明的其他优点以及特征和使用模式将从以下对本发明的优选实施例的详细描述中变得显而易见，这些优选实施例以示例而不是限制的方式示出。

附图说明

请参考附图所示，其中：

-图1示出了根据本发明的设备的一个优选实施例的整体视图；

-图2是图1所示设备内部的俯视示意图；

-图3示出了在图1的设备中实施的用于容纳待处理的体液样本的装置的优选实施例；

-图4示出了在图1的设备中实施的用于容纳试剂和废料的装置的优选实施例；

-图5示出了用于容纳平面支撑件的装置的优选实施例，该平面支撑件旨在承载待处理的流体样本的固定细胞并且优选地与图1的设备结合使用；

-图6示出了用于容纳并入图1的设备中的采集和分配装置的可更换部件、特别是吸头的装置的优选实施例；

-图7示出了并入图1的设备中的离心装置的优选实施例。

具体实施方式

下面将参考上述附图描述本发明。

首先参考图1，示意性地示出了用于处于分析或诊断目的自动处理生物流体、特别是血液的样本的设备的整体视图。该设备作为一个整体用附图标记1表示。

该设备优选地应用于在临床分析、特别是液体活检的过程中制备血液样本。然而，不排除液体活检的其他应用，通过使用其他类型的体液，例如尿液、脑脊液、胸膜液、支气管冲洗液、痰、通过抽吸针收集的细胞学样本、通常由多种信息丰富的生物成分(无细胞成分和细胞成分)组成的样本。此外，不排除在其他领域的有利应用，例如细胞学、免疫学、寻找病原体以及作为所有细胞离心应用的替代。

该装置优选地是台式工具并且包括盒状本体10，盒状本体10具有内部腔室20和用于进入内部腔室20的开口12。在优选实施例中，下文描述的部件包含在内部腔室20中，即制备生物样本的地方。

如下文将描述的，设备1优选地设置有用于过滤存在于内部腔室20中的空气和/或蒸气的系统。该系统用附图标记50整体表示。

内部腔室20被分成用于接收容纳装置的多个区域或区，该容纳装置被配置为容纳用设备1获得的流体样本、其中间制剂、试剂、废料和样本的信息组分。

容纳装置优选地是可拆卸的，并且可以通过盒状本体10的开口12插入/抽出，以插入/收回/更换其中的内容物。

图2示出了设备1的内部的俯视示意图。在优选实施例中，内部腔室20包括引导装置21，该引导装置21被构造成与容纳装置联接，以便于将容纳装置从设备中取出/插入设备中以保证其正确定位。在图2中，引导装置通过示例被示出为由内部腔室20的支撑平面20a承载的轨道，该轨道被构造为在静止时接收容纳装置和滑动容纳装置。

设备1还设置有(样本、试剂及其中间制剂的)移动系统，其包括采集和分配装置，其被配置为与优选地例如1毫米或5毫米的可更换的吸头一起工作。

用于采集和分配液体的活动优选地通过可移动臂来执行，例如沿着三个相互正交的轴，有利地包括两个彼此独立的采集/分配通道。

该臂允许吸头在空间中运动，以将其定位在内部腔室20中的所需的位置处，特别是在容纳装置处。臂允许在内部腔室20中的多个样本制备中间位置中移动液体。

例如，臂运动允许将吸头定位在平面xy上，而通道相对于可移动臂的相对运动允许将吸头沿着与平面xy正交的z方向定位。该通道可通过与可移动臂一体的引导件滑动地联接至可动臂，以实现沿z方向的运动。两个通道之间的(轴间)距离优选地是固定的。

移动系统优选地具有十分之一毫米量级的分辨率和定位精度。移动系统，特别是采集和分配装置，仅移动液体，并且例如不移动可容纳在容纳装置中的容器、瓶子、试管或载玻片。

采集和分配装置被配置为根据所执行的程序的类型以不同的速度执行程序。在优选实施例中，采集和分配装置设有步进电机以允许控制小流体体积的移动，理想地以低于ul(微升)、优选为0.3ul的精度，并且获得精度为3ul/s(微升每秒)，优选1ul/s的速度。这有利地允许获得缓慢、恒定且均匀的抽吸和分配，这些特征在样本的手动处理中无法保证并且影响其稳定性。

在设备1的优选实施例中，吸头也可以装在容纳装置中，其如图6中示例性地示出并用附图标记34表示。有利的是，可以更换采集和分配通道所使用的吸头，以避免试剂和样本污染。

该设备还包括可操作地与采集和分配装置相关联的离心装置40以及控制单元。后者被配置为根据自动化样本制备方案来控制离心装置40以及采集和分配装置，这将在下文中更详细地描述。控制单元优选地放置在内部腔室20的外部。

设备的整体配置使得自动化方案允许从进入内部腔室20的样本获得最终制剂，除了工艺废料组分之外其包含样本的一种或多种、优选多种彼此分离且不同的信息组分，即样本的第一组分和/或样本的第二组分和/或样本的第三组分。

特别地，第一组分包括细胞或由细胞组成，细胞被固定在用于液体活检分析的平面支撑件上，该支撑件旨在由容纳装置接收。第二组分包括悬浮在液体中的细胞，并且其包含在专用采集装置中。第三组分包括样本液体级分，例如血浆，或由样本液体级分组成，并且其也包含在专用容纳装置中。废料组分收集样本处理的废料，优选液体废料，并且其包含在专用采集装置中。

通过进一步参考图3-图6，下文描述容纳在内部腔室20中的容纳装置的实施例示例。

例如，图3示出了第一容纳装置31的优选实施例，第一容纳装置31被配置为接收进入设备1的生物流体样本。如图所示，该容纳装置包括多个座31a，以形成例如架，其成形为以便接收含有样本的试管。例如，每个样本可以容纳在10ml试管中。特别地，血液样本可以包含在类似的10ml试管中。在优选实施例中，该设备可容纳可变数量的样本，优选1至8个样本，优选来自1个或多个不同受试者，优选每个样本具有两个相同的小瓶。座31a可具有侧向开口31b，以允许读取装置读取试管上的识别码和/或可追踪码。

图4示出了第二容纳装置33的优选实施例，该第二容纳装置33被配置为接收试剂并容纳废料组分的收集装置。具体地，第二容纳装置33包括多个座33a，每个座33a成形为接收容纳所述试剂或废料的相应的瓶子33b。与本发明的设备1执行的程序相关联使用的试剂的示例是PBS(磷酸盐缓冲液)、RBL(红血裂解缓冲液)和优选包含甲醛(优选在2％和4％之间)的固定液。满载的设备1例如可以包含400ml的PBS、300ml的RBL、45ml的固定液和500ml的废料。

图5示出了第三容纳装置的优选实施例，该第三容纳装置被配置为接收用于支撑用图1的设备获得的并包括细胞的样本的第一组分的装置。

与上面关于第一容纳装置描述的类似，第三容纳装置优选地包括多个座32a，以形成例如架，每个座优选地成形为接收平面支撑件，特别是载玻片。在优选实施例中，设备1可以容纳八个架，其中每个架可以容纳多达十个载玻片。

移动系统将执行将细胞分配到平面支撑件上的过程，并且自动化方案的结果优选地包括平面支撑件，该平面支撑件包括均匀的细胞层，例如白细胞。优选地，第三容纳装置32，即每个座32a和/或容纳在其中的每个载玻片，具有允许设备1生成可追溯性报告的识别码。

用实施方案中的一种形式获得的样本的第二组分被收集在容器中，优选地是试管中，该容器由第四容纳装置或离心装置40的合适的座(在图7中用附图标记42表示)承载，稍后将描述该座。

通过该设备执行的方案获得的样本的第三组分，例如血浆，被收集在由第四容纳装置承载的容器中，优选地在试管中，该第四容纳装置在图中未示出，但其具有与上文针对第一容纳装置31所描述的形状类似的形状。第四容纳装置设置在内部腔室20中以接收样本的中间制剂。在本发明的替代实施例中，第一容纳装置31的架的一部分31p在内部腔室20中装载有空试管，被抽出时试管装有通过处理样本获得的第二和/或第三信息组分。

如上所述，图6示出了构造成接收上述吸头的容纳装置34的优选实施例。特别地，可更换吸头被承载在内部腔室20中，优选地靠近分配和/或采集装置。

除了用于收集由液体形式的废料组成的组分的装置之外，该设备甚至可以包括用于收集在样本制备期间获得的固体形式的废料的装置。

如上所述，本发明的设备1有利地包括读取装置，优选地集成在可移动臂中。具体地，读取装置有利地包括例如光学类型的第一读取器和第二读取器，其能够读取用于从样本制备中获得的第一、第二或第三组分的样本、试剂元件和支撑件(试管或载玻片)的唯一识别码。这样，就保证了它们的完全可追溯性。由读取装置读取的代码被传送到控制单元，该控制单元例如可以生成可追溯性报告。优选地，第一读取器被配置为读取与样本的试管、与含有试剂的小瓶和瓶子相关联的代码。优选地，第一读取器的光束被包含在基本上平行于内部腔室20的支撑平面20a的平面中。第二读取器的光束优选地被包含在基本上正交于内部腔室20的支撑平面20a的平面中，并且优选地被配置为读取可与平面支撑装置和/或相应的座32a相关联的代码。

进一步参考图7，示出了离心装置的优选实施例(图中未示出壳体)，整体用附图标记40表示。离心装置优选地包括可旋转的鼓或篮41，其设有多个座42，多个座42相对于鼓41的旋转轴线α沿径向周向地布置。移动该离心装置的电机优选地是步进电机。多个座中的每个座42沿着大体平行于旋转轴线α的方向延伸，并且成形为容纳含有样本、其中间制剂或样本的上述第二信息组分的试管。例如，多个座可设置为容纳多达八个试管，每个试管的容量为30ml。在本发明的替代实施例中，每个座42成形为容纳多个具有不同尺寸的试管，该试管包含中间制剂的样本。

优选地，鼓41和/或座42是倾斜的，并且座42在静止或静态位置时在其自身的延伸方向与内部腔室20的支撑平面20a之间形成直角。鼓41可以达到相当于400g的旋转速度。在离心过程中，根据离心机本身达到的速度，座42可以倾斜直至到达平行于内部腔室20的支撑平面20a的位置。

有利地，离心装置40被配置成使得鼓41和/或座42可以通过设备1的控制单元停止在预定位置，从而允许可移动臂以自动方式接近其承载的试管。

实现离心装置40的运动的附加结构部件在本领域技术人员的理解范围内，在此不进一步地描述。

如前所述，设备1优选地设置有用于过滤内部腔室20中存在的空气和/或蒸气的系统50。制备样本的自动化方案优选地使用固定溶液。在血液样本的情况下，这种溶液包括例如4％的甲醛，并且有利地，过滤系统50允许能够安全地使用设备1，而不需要额外的外部密封装置，例如化学罩。本发明的另外实施例可以使用其他有机化合物，例如醇基固定剂，由于过滤系统50的存在，其也可以在不使用另外的密封装置的情况下使用。

返回图2，过滤系统50是主动系统，优选地组装在盒状本体10的顶部分上。过滤系统50设置有凹陷，其通过合适的活性过滤器过滤试剂的蒸气以将它们限制在设备内部。过滤系统50包括(不可见的)扇和过滤器，例如一到三个过滤器，以产生用于限制内部腔室20中产生的蒸气的强制空气流。

扇的速度可以根据自动化方案的步骤进行调节。例如，在方案的前几步中当固定液仍在瓶中时，由扇产生的气流被调节至足以避免蒸气从设备1泄漏的最小值。在分配固定液的过程中，即蒸发速率最大时，扇相反地会保证更大的流量，以降低固定液蒸气的浓度。过滤系统50的尺寸可以设计成保证相当于工作至少六个月的工作负荷。该设备的控制单元优选地被配置为向用户发出信号，用于指示需要进行维护干预以更换过滤器。在优选实施例中，可以使扇在自动化方案结束时以其最大速度运行，以加快平面支撑件上残留的试剂残留物干燥的时间。

在优选实施例中，设备1可操作地关联被配置为对生物样本中存在的细胞数量进行计数的装置。在本发明的优选实施例中，这种装置被配置为对白细胞的数量进行计数。

这种被配置为对细胞数量进行计数的装置可以并入设备1中，或者其可以是可操作地联接到设备1的外部装置，并且其实际上允许确定样本制备的合适稀释度。优选地在内部腔室20的样本装载期间执行细胞计数的步骤，并且可以通过在装载步骤期间对进入的样本进行评估来执行。

例如，通过实验验证了全血中存在的白细胞计数与通过裂解过程获得的沉淀物(沉淀到试管底部的白细胞)的高度之间的线性相关性。利用这种相关性，对于每个样本，其白细胞的浓度是已知的，可以获得沉淀相对于上清液的高度。然后，可以有利地在裂解方案中以预定方式去除上清液级分。此外，甚至可以轻松计算单个小瓶中的沉淀体积和白细胞总数。通过根据上述两个参数评估试管中的缓冲液体积，可以为每个样品获得密度相当的细胞重悬液。该过程允许为每个样本在每个平面支撑件上分配数量相当的细胞。

然后，细胞计数的处理有利地为由设备1实施的自动化方案提供一些操作参数。如下文将详细描述的，优选地，该参数包括在样本处理期间在试管中沉淀的细胞元素(或沉淀)的高度和重悬体积，以获得要分配在平面支撑件上的相当的细胞密度。

如上所述，设备的控制单元执行用于制备样本的自动化方案，除了提供接收优选液体废物的组分之外，其提供包括固定在平面支撑件上的细胞的第一组分和/或包括悬浮细胞的第二组分，和/或第三组分，第三组分包括优选接收在试管中的液体级分，上述组分中的每一个是彼此分离且不同的。

下面通过示例而不是限制本发明的范围的方式参照由全血组成的生物流体样本来描述由设备1执行的自动化方案的优选实施例。

首先，除了可能的试剂之外，将带有待处理的血液样本的试管装载到本发明的设备1中。具体地，将适当标记的试管引入内部腔室20中，并将其容纳在相应的架31中。将架31插入支撑区域20a的相应区域中，启动用于读取与样本相关的可追溯性代码的过程。优选地，将每种类型的容纳装置插入到支撑平面20a的相应区域中启动用于读取相对位置和可追踪性代码的过程，二者位于容纳装置本身和插入其中的支撑件上。如果内部腔室20中尚未存在，则容纳装置还要装载试剂的平面支撑件或载玻片和用于收集废液的烧瓶、可更换的(一次性的)吸头、用于收集血浆和悬浮细胞成分的试管，这些试管位于离心装置40的篮41的座42中。通过多支移液管从采集和分配装置中将第一等分血液转移到篮41中的试管中。吸血和分血速度优选在460至650ul/s之间，每个移液管的转移体积优选在3至5ml之间。一旦完成血样的转移过程，就开始通过离心将血浆与血液的细胞部分分离。离心装置40达到规定速度，其优选地保持十分钟，并且随后以温和且受控的方式减速以避免试管内容物的再悬浮。在本发明的优选实施例中，离心装置的步进电机允许控制位置、旋转速度、加速度和减速度。如此获得血液样本的两种初始组分，一种含有细胞的组分和一种含有血浆的组分。

篮41停止在预定位置，然后可移动臂收集包含血浆的样本组分并将其转移到专用的容纳元件中。血浆吸取速度优选在20至150ul/s之间，更优选在90至110ul/s之间，并且使得有利地减少对细胞内容物的损害(类似于由于样本随时间自发降解所造成的损害)。分配速度介于300至400ul/s之间。每个移液管转移的体积优选在2至3ml之间。

在本发明的第一实施例中，这种容纳元件优选地由内部腔室20的容纳装置31的隔板承载，特别是在用于随后保存和处置的新试管中。在本发明的第二实施例中，该容纳元件被承载在离心装置40的先前未使用的座42中，特别是在新的试管中，以执行第二次离心。

优选地通过一系列移液管进行转移过程。对于每个血液试管，转移的血浆体积优选等于约3ml。在本发明的优选实施例中，可移动臂设置有步进电机，可在z轴上实现十分之一毫米的定位精度。这样的精度可以在不吸入下层细胞成分的情况下尽可能多地吸入血浆。

随后，收集试剂并将它们分配到含有血液样本的细胞部分(即从中除去血浆)的篮41的试管中，用于随后裂解红细胞，优选地具有固定体积，例如稀释比例为1:4或最大最终体积为30ml。优选地，还进行重悬浮以使仅含有细胞部分的试管的内容物均质化，然后获得中间制剂。

用于吸取、分配和重悬浮试剂的速度优选地在500至2000ul/s之间，更优选地在1400至1600ul/s之间。每个移液管转移的体积优选在4至5ml之间。在本发明的替代实施例中，可以通过在离心机底部旋转的带有永久磁铁的支架所产生的旋转磁场，使放置在离心机中每个试管底部的小磁铁高速旋转，从而实现重悬浮。

此后，自动化方案优选地提供关于中间制剂的一系列循环程序，其依次包括(上述)稀释、重悬、离心和去除上清液的步骤，直到获得含有细胞、特别是白细胞的血液样本的组分。在提供第二次离心的情况下，该离心步骤与中间制剂的第一循环程序同时进行。

详细地，在稀释步骤中，移动装置收集试剂并将其分配到含有细胞级分的试管中(再悬浮)，以便均质化试管的内容物。优选地快速连续地重复最后一个过程五次。

接下来是等待时间，优选为五分钟。

在随后的离心步骤中，控制单元启动离心装置，优选地直至转速等同于400g，离心时间优选地等于五分钟，随后是减速步骤。减速可以通过机械制动来执行。在本发明的替代实施例中，减速度可以由步进电机控制。当篮41停止时，可移动臂定位以收集总体约29ml的上清液，并将其分配到将废弃的瓶子中。上清液吸取速度在450至550ul/s之间。每个移液管转移的体积优选地在2至5ml之间。具体地，根据计数装置测定的白细胞数量，通过自动化方案评估中间制剂中所含细胞级分的残余体积。

在提供第二次离心的情况下，在第一循环结束时，可移动臂从座42中的试管吸取血浆并将其分配到容纳装置31中的先前未使用的试管中。血浆吸取速度为优选地在20至150ul/s之间，更优选地在90至110ul/s之间，而分配速度在300至400ul/s之间。每个移液管转移的体积优选在2至3ml之间。

该一系列循环过程优选地重复三次，直到容纳在离心装置40中的试管优选地包含大约1ml的沉淀。用试剂稀释中间产物的步骤优选以1:4的比例进行，例如通过使用试剂RBL。最终的悬浮步骤通过优选使用PBS优选以1:10的比例来进行。

一旦获得携带最佳浓度的细胞(具体是白细胞)的样本组分，自动化方案提供优选五个重悬循环。

随后，细胞组分的一部分被收集并分配到容纳在内部腔室20的第二容纳装置32中的平面支撑件上。抽吸速度在450和500ul/s之间，而分配速度优选在100至500ul/s之间，更优选在300至380ul/s之间。每个移液管转移的体积优选在700至900ul之间。

用于将细胞组分分配在载玻片上的步骤有利地在每个平面支撑件上提供了单层基本上均匀的白细胞的沉积，优选地约200万个白细胞，使得它们基本上不重叠。

分配步骤有利地通过分配吸头的单次连续移动来进行。具体地，吸头定位在载玻片的功能化表面处，并且在吸头本身沿着载玻片的功能化表面的较大尺寸、具体是较大轴线移动期间执行连续分配。这种分配的优点是快速并且保证粘附的基本均匀性。

其他分配方法也是可能的。例如，可以通过位于载玻片的功能化表面处的两个固定吸头来进行细胞组分的同时分配，虽然这种模式需要更长的时间。分配步骤优选地在最后执行的重悬浮循环后二十分钟内结束。

在分配步骤结束时，细胞悬浮液的一部分保留在离心装置40的篮41的座42中的试管内部以供使用。该一部分构成可用本发明的设备获得的第二信息组分。该一部分可以被可移动臂抽吸并且分配到放置在容纳装置31中的先前未使用的试管中。抽吸速度在450至500ul/s之间，而分配速度在300至380ul/s之间。

随后，该方案提供了将细胞组分粘附在平面支撑件上的步骤，平面支撑件被有利地处理以保留细胞的形态特征。在本文描述的自动化方案中与本发明的设备结合使用的平面支撑件具有特定的表面特征并且优选地通过纳米材料的表面沉积来功能化。细胞成分的粘附在室温下进行，持续约二十分钟。

接下来是从平面支撑件吸取上清液的步骤，优选地在两个不同点处使用两个吸头，使得仅在平面支撑件上留下液体级分(例如100ul)。抽吸速度在80至120ul/s之间，而分配速度在1400至1600ul/s之间。每个移液管转移的体积优选在600至700ul之间。

随后，在平面支撑件上/从平面支撑件上分配和吸取(上清液)的步骤交替进行，首先是PBS，然后是固定液，最后是洗涤液。抽吸速度在1400至1600ul/s之间，而分配速度在300至380ul/s之间。每个移液管转移的体积优选在500至1000ul之间。该过程一直在平面支撑件的预定点(例如四个点或两个点)上执行，并且所有这些点沿着z方向距支撑件的距离相同。

具体地，试剂分配同时通过位于载玻片的功能化表面处的两个固定吸头进行。一旦装载了试剂，吸头就会定位在预定点上方距载玻片表面预定距离的位置，并释放所需体积的试剂。距载玻片的最佳分配和吸取距离是根据实验获得的一系列值来定义的。超过所述范围的上限(公差低于毫米)，留在载玻片上的试剂残留物与随后的试剂体积相当，这稀释了随后分配的试剂。在所述范围的下限以下，细胞成分的粘附受到吸头的干扰，这导致了在吸头所占据的位置上没有或实际上缺乏细胞的载玻片区域。对于分配在载玻片上的所有液体(包括样本的细胞组分)，载玻片的外部疏水边缘和用亲水材料(优选亲水纳米材料)功能化的内表面的存在允许液体伸展并覆盖整个限制范围内的区域。

优选地，根据所使用的固定剂的类型，固定时间在分配固定剂溶液之后30秒至20分钟之间。在本发明的优选实施例中，使用含有4％甲醛的固定剂的固定时间大约等于20分钟。在本发明的替代实施例中，使用含有醇溶液的固定剂，固定时间等于约30秒。

应当理解，有利地，设备的采集和分配装置还被配置为通过采集和分配固定剂溶液来允许血液样本的成分的“暂时”稳定。

特别地，对于固定的细胞组分(第一信息组分)，稳定步骤通过施用固定液来实施。

有利地，悬浮细胞组分(第二信息组分)不需要通过固定溶液的稳定步骤并且可以用于后续分析。在本发明的替代实施例中，在收集这种成分的试管中放置用于制备该成分以供后续分析的试剂。

对于液体组分(第三信息组分)，稳定步骤可以通过施用固定液和/或通过冷冻来实施。有利地，在该液体组分已经进行二次离心的情况下，不需要稳定步骤。

这种优选的配置允许使用单个自动化设备，该设备能够进一步提高血液样本组分的信息内容的质量，并在时间(稳定化)和空间(固定化)方面以最佳方式将制备输入血样的预分析步骤与随后获得的输出组分的分析步骤分开。

例如，可以使用浓度不高于4％的含有甲醛的固定液来稳定附着在支撑件上的包括细胞的血液组分，这种固定液是一种醇基溶液；如果需要稳定步骤，还可以使用含有抑制细胞凋亡的化合物的固定液来稳定包括血浆的血液组分。

为了方便起见，将解释实施例所述的并由本发明设备实施的自动化方案在对血液样本组分使用固定液时，与已知解决方法的区别，以及本发明设备本身所保证的相关优势。

如前所述，如今全血样本通常使用防腐剂，在进行CTC分析时，这有助于避免细胞恶化和死亡。然而，由于血液样本的液体级分的存在，这种保存模式实际上仅成功地限制了该过程。在血浆分析的情况下，防腐剂反而可用于避免现有细胞死亡并释放健康DNA，这会污染样本。实际上，需要处理两个互补的需求，一方面是为了保存待分析样本的细胞成分，另一方面是为了防止污染待分析的血浆。

在本发明的优选实施例中，与已知的解决方案不同，其实施的设备和方案允许在收集血液样本的步骤期间不使用任何防腐剂，而仅使用EDTA，这保证了对样本的影响尽可能小，因为可以通过将样本插入设备1中来立即处理样本。

事实上，在将细胞固定在支撑件上之后，可以用一种明确的方法固定作为输出物获得的含有细胞的第一组分，目的是使其稳定，并可以在已经为分析准备好的环境中进行分析，这与将组织切片固定在载玻片上的情况完全相同。在这种情况下，固定剂会冻结细胞的状态，必要时可在后续步骤中对其进行分析。

对于悬浮细胞组分，可以使用一定量的未固定在悬浮液中的细胞，在添加特定试剂(例如通过提取各种细胞成分的裂解溶液)后，可以在分析测试中使用这些细胞用于鉴定蛋白质、代谢物和分子分析。

对于包含血浆的信息组分，由于其已经与细胞分离，因此最多具有最低限度的细胞含量，从而显著降低了污染风险。有利地，执行第二次离心过程进一步降低了该风险。此外，应当理解，对于大多数应用，用本发明涉及的设备获得的血浆不需要冷冻或添加保存液。

实际上，有利地，既可以中断细胞的降解过程，因为细胞可以被固定在其自身的支撑件上(这是全血所不具备的条件)，又可以大大减少(甚至完全去除)血浆中防腐剂的使用，因为血浆中的大部分潜在污染细胞成分会被立即去除。

然后，操作员可以从内部腔室20中抽出容纳装置31、32，并回收由进入设备1的血液样本制备的第一组分和/或第二组分和/或第三组分。

到目前为止已经参考本发明的优选实施例描述了本发明。这意味着，在本文中以示例的方式描述的优选实施例中实现的每一个技术方案可以有利地进行不同的组合，以创建属于同一发明核心但均在所附权利要求的保护范围内的其他实施例。

Claims (15)

1.一种设备(1)，其用于自动处理体液样本，优选全血，以用于临床分析，特别是液体活检，所述设备(1)包含：

■盒状主体(10)，其包括内部腔室(20)和用于进入所述内部腔室(20)的开口(12)；

■在所述内部腔室(20)中的第一容纳装置(31)，其被配置成容纳所述样本；

■在所述内部腔室(20)中的第二容纳装置(33)，其被配置成容纳试剂；

■第三容纳装置(32)，其被配置成容纳用于接收所述样本的细胞的平面支撑件；

■第四容纳装置(31p)，其被配置成容纳用于盛放所述样本的液体级分的容器；

■用于将所述样本和/或试剂和/或所述样本的中间制剂采集和分配到所述内部腔室(20)中的装置；

■离心装置(40)，其可操作地与所述采集和分配装置相关联；

■控制单元，其被配置为根据自动化方案控制所述采集和分配装置以及所述离心装置(40)；

所述设备的整体构造使得，所述自动化方案允许从进入所述内部腔室(20)的体液样本获得所述体液样本的一个或多个信息组分和废料组分，所述一个或多个信息组分包含彼此分离且不同的所述体液样本的第一组分、第二组分和/或第三组分，其中所述第一组分包括固定在所述平面支撑件上的样本细胞，其中所述第二组分包括悬浮样本细胞，并且其中所述第三组分包括容纳在所述容器、特别是试管中的样本液体级分。

2.如权利要求1所述的设备(1)，其中所述采集和分配装置进一步配置为通过采集和分配固定液来稳定所述第一组分。

3.如权利要求1或2所述的设备(1)，其中所述采集和分配装置进一步配置为通过采集和分配固定液来稳定所述第三组分。

4.如任一前述权利要求所述的设备(1)，所述设备可操作地关联至被配置为计算所述体液样本中存在的细胞数量，特别是白细胞数量的设备。

5.如任一前述权利要求所述的设备(1)，其中所述分配装置被配置为在所述平面支撑件上以基本不重叠的方式分配单层均匀的细胞。

6.如任一前述权利要求所述的设备(1)，其中所述采集和分配装置包括读取装置，所述读取装置被配置为识别所述体液样本、所述试剂、所述第一组分、所述第二组分和/或第三信息组分。

7.如任一前述权利要求所述的设备(1)，其中所述采集和分配装置被配置为与可更换的吸头一起工作，所述吸头可装填在第五容纳装置(34)中。

8.如任一前述权利要求所述的设备(1)，还包含过滤系统(50)，其被配置为限制并过滤由所述内部腔室(20)中的所述试剂产生的蒸气。

9.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述的设备(1)的系统，所述设备(1)用于自动处理体液样本，优选为全血以用于临床分析特别是液体活检，以及至少一个平面支撑件，所述平面支撑件用于接收第一组分并且包含固定细胞元素的表面，所述表面经过纳米材料处理。

10.一种通过根据权利要求1至8中任一项所述的设备从体液样本自动制备固定在平面支撑件上的细胞、悬浮细胞和液体级分的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供体液样本并将其引入所述设备(1)的内部腔室(20)中的第一容纳装置；

b)从所述第一容纳装置(31)中收集样本，并将其分配到离心装置(40)中；

c)对所述样本进行离心，以获得包含细胞的组分和包含液体级分的组分；

d)从所述离心装置(40)中收集所述包含液体级分的组分，并将其分配到容器中，具体是试管中，所述容器由所述内部腔室(20)中的另外的容纳装置(31p)容纳；

e)从所述离心装置(40)中收集所述包含细胞的组分，并将其分配到以下任选或结合的：

-平面支撑件上，其由所述内部腔室(20)中的另外的容纳装置(32)容纳；

-另外的容器中，具体为试管中，其由所述另外的容纳装置(31p)容纳；

f)将所述细胞固定在所述平面支撑件上。

11.根据前述权利要求所述的方法，还包含在所述内部腔室(20)的第三容纳装置(33)中提供试剂元素、具体为固定液的步骤，以及步骤g)：将所述固定液注入所述第一组分和/或所述第三组分，以使其稳定。

12.根据权利要求10或11所述的方法，还包含以下步骤：对所述体液样本中的细胞进行计数，以获得参考值，并根据所述参考值在所述平面支撑件上分配一定数量的细胞。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述体液样本是全血样本，所述第三组分包含血浆。

14.根据前述权利要求所述的方法，其中离心步骤c)允许获得两种初始组分，呈包含细胞的中间制剂和包含血浆的组分的形式，其中在所述步骤d)之后所述方法还包含：

d’)收集试剂元素并将其分配到所述中间制剂中；

d”)将所述中间制剂离心，得到基本上包含白细胞的中间组分；

并且其中所述步骤e)包含从所述离心装置(40)中收集白细胞，并在所述平面支撑件上分配一层均匀的、基本上不重叠的白细胞。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述试剂元素包含磷酸盐缓冲盐水、红血球溶解缓冲液、含甲醛的溶液。