DE10251338B4

DE10251338B4 - Vorrichtung zur Durchführung von Färbe- und Hybridisierungsreaktionen

Info

Publication number: DE10251338B4
Application number: DE2002151338
Authority: DE
Inventors: Heinrich Dr. Gausepohl
Original assignee: INTAVIS Bioanalytical Instruments AG
Current assignee: INTAVIS Bioanalytical Instruments AG
Priority date: 2002-11-05
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2022-11-06
Also published as: DE10251338A1

Abstract

Vorrichtung zur Behandlung biologischer Proben mit Flüssigkeiten, bestehend aus zwei oder mehr Sätzen von Objektträgern (1), die mit je einer Deckplatte (3), Abstandshaltern (4, 11, 12) und je einer elastischen Dichtscheibe (5) in einer Klemmvorrichtung (6) unter Ausbildung jeweils eines Reservoirs (8) mit einem oben und unten offenen parallelen Spalt (9) zusammengepresst werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichtscheibe (5) ein Höhenprofil zur seitlich formschlüssigen Aufnahme von Objekträger (1) und Deckplatte (3) aufweist, dass der Spalt (9) unterhalb der Klemmvorrichtung (6) an den Längsseiten offen ist, so dass die in eines der Reservoirs (8) gegebene Flüssigkeit über genau den mit diesem Reservoir (8) verbundenen Spalt (9) nach unten abläuft.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung komplexer Protokolle in der Immuncytochemie und in situ Hybridisierung an biologischen Proben auf Objektträgern oder vergleichbaren Halterungen. Hauptzweck der Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe derartige Protokolle in einem dafür geeigneten Automaten durchgeführt werden können. Gelöst wird das durch eine Vorrichtung, in der mindestens ein Objektträger mit einer biologischen Probe, eine Deckplatte und eine Dichtscheibe so eingespannt werden, dass ein schmaler Spalt zwischen Objektträger und Deckplatte mit darüber liegendem Reservoir entsteht. Mehrere Paare aus Objektträger und Deckplatte werden durch Dichtscheiben in einer Klemmvorrichtung gehalten, wobei die Dichtscheiben ein Reservoir über jedem Paar von Objektträger und Deckplatte ausbilden. In das mit dem jeweiligen Spalt verbundene Reservoir aufgegebene Flüssigkeit läuft in diesen hinein und wird über Kapillarkräfte gehalten. Neue Flüssigkeit wird von oben in das Reservoir gegeben und verdrängt die vorher im Spalt enthaltene Flüssigkeit. Das Reservoir kann manuell oder über einen Pipettierroboter gefüllt werden und die aufgegebene Flüssigkeit läuft in den jeweils zugehörigen Spalt. Die Klemmvorrichtung mit mindestens einem Paar von Objektträger und Deckplatte wird für Experimente in der in situ Hybridisierung in einer beheizbaren, feuchten Kammer gehaltert. Dadurch wird die Verdunstung über die seitlich offenen Spaltflächen auf ein akzeptables Maß reduziert.
Die Analyse von Genexpressionsmustern oder der räumlichen Verteilung immunreaktiver Moleküle ist eine gängige Methode in der modernen Biologie und Medizin. Während die meisten solcher Untersuchungen zur Zeit an Gewebsschnitten durchgeführt werden, wächst ein neues Anwendungsfeld rasch heran. Dabei werden Expressionsmuster an Bibliotheken von mechanisch oder chemisch auf einen Träger aufgebrachten biologischen Molekülen analysiert. Die Bibliotheken sind unter den Namen "Biochips", "Mikroarrays" oder "DNA Chips" bekannt. Protokolle zur Hybridisierung an solchen Bibliotheken oder an Gewebsschnitten sind arbeitsintensiv und erfordern eine Reihe von Inkubationen mit verschiedenen Waschflüssigkeiten und Reagenzien. Einige der Schritte müssen bei definierter Temperatur durchgeführt, und in vielen der Schritte muss eine Kontamination mit ubiquitären Enzymen verhindert werden. Der zentrale Schritt ist eine Inkubation über oft mehrere Stunden mit ei ner zu untersuchenden Probe, deren zur Verfügung stehendes Volumen limitiert sein kann. Die Vielzahl der Schritte macht eine Automatisierung der Protokolle wünschenswert.
Vorrichtungen zur manuellen Durchführung der Hybridisierung sind bekannt. Hier wird auf einen Objektträger mit Hilfe einer Silikonmaske eine Plastikmembran mit zwei Öffnungen aufgeklebt. Über die Öffnungen sind Flüssigkeiten manuell einfüllbar und während der Hybridisierung werden die Öffnungen verschlossen. Ein automatisierter Flüssigkeitsaustausch ist nicht vorgesehen und nicht realisierbar.
Zur Durchführung einfacher Färbereaktionen und auch komplexerer Protokolle sind Automaten im Markt bekannt. Alle Automaten haben aber Defizite, wenn für jeden Objektträger eine spezifische, im Volumen limitierte Menge an Probenmaterial zur Verfügung steht. Die in der Pathologie verwendeten Färbeautomaten sind per se nicht zur Hybridisierung bei erhöhter Temperatur nutzbar, da sie mit offenen Tanks arbeiten. In der Literatur sind manuelle Verfahren sowie Geräte zur Automatisierung im Bereich der in situ Hybridisierung beschrieben, aber bisher hat kein Gerät nennenswerte Verbreitung gefunden.
Auch die in der Patentliteratur beschriebenen Vorrichtungen weisen jeweils spezifische Nachteile auf, die mit der vorgeschlagenen neuen Vorrichtung vermieden werden.
Die in EP 0310 399 A2 (Firma Shandon Ltd.) beschriebene Halterung aus Polystyrol ist, wie in DE 199 41 905 C2 ausgeführt, nicht für die in situ Hybridisierung verwendbar. Die in DE 199 41 905 C2 beschriebene Variante aus Glas ist hierfür brauchbar, benötigt aber viel Platz und eine aufwändige Klemmvorrichtung. Wegen der dicken Abdeckplatte ist die zu temperierende Masse relativ hoch.
Eine in US 4731 335 beschriebene Vorrichtung wird von der Firma DAKO für Färbereaktionen benutzt. Hier werden Flüssigkeiten durch Kapillarkräfte von unten nach oben in den Spalt zwischen zwei eng benachbarten Objektträger gezogen und durch Abtupfen auf saugfähigem Papier wieder entfernt. Das Verfahren ist langsam, umständlich und für die ISH kaum anwendbar. Der Spalt ist zudem nicht vollständig spülbar.
US 6.183.693 B1 beschreibt eine heizbare Vorrichtung für ISH, bei der wie in US 5.425.918A die Proben auf horizontal liegenden, offenen Objektträgern behandelt werden. Hier werden große Volumina an Reagenzien benötigt und die Verdunstung ist kaum zu kontrollieren.
Eine frühere Anwendung von Kapillarspalten in der Gewebefärbung wird beschrieben in US 4129093 und GB 2008 270 A . Hier wird die Flüssigkeit auf die oberen Kanten einer Vielzahl von Objektträger geschüttet, die durch eine geeignete Vorrichtung auf so geringem Abstand gehalten werden, dass Kapillarspalte ausgebildet werden. Hier werden aber alle Spalte simultan mit der gleichen Flüssigkeit beaufschlagt und die Flüssigkeit kann an den Kanten der Objektträger herablaufen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist nun, eine Vorrichtung bereitzustellen, die folgende Anforderungen erfüllt:

– Einschluss des auf einem Objektträger fixierten biologischen Materials in der Art, dass zusammen mit einer Deckplatte ein mit Flüssigkeit befüllbarer Spalt entsteht.
– Zufuhr und Abfuhr von Flüssigkeiten individuell für jeden Objektträger bei einer Vielzahl gleichzeitig behandelter Proben
– Zugänglichkeit für automatischen Wechsel der Flüssigkeiten
– Geringes Flüssigkeitsvolumen
– Kontrolle der Verdunstung während längerer Inkubationen bei höherer Temperatur wie z.B. für ISH
– Einfacher und kompakter Aufbau
– Einfache Handhabung

Gelöst wird die Aufgabe durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt die automatisierte Durchführung von Protokollen zur in situ Hybridisierung in dafür vorgesehenen Automaten. Dadurch wird eine erhebliche Arbeitserleichterung erreicht und die Durchführung der Experimente wird reproduzierbarer.
1 zeigt den Querschnitt, 2 die Aufsicht auf die Vorrichtung. 3a/b zeigt mögliche Anordnungen der Abstandshalter auf der Deckplatte. 4 zeigt eine Reihe von Objektträgern in einer feuchten Kammer.
Eine Anzahl von Objektträgern (1) mit Proben eines biologischen Materials (2) sowie Deckplatten (3) mit Abstandshaltern (4) und Dichtungsscheiben (5) werden parallel ausgerichtet, aufeinander gestapelt und mit Hilfe einer Klemmvorrichtung (6) und ggfls. Klemmplatten (7) zusammengedrückt. Dabei bilden die Dichtscheiben gegeneinander und mit den paarweise verspannten Objektträgern und Deckplatten je ein individuelles Reservoir (8) über der oberen Kante eines Paares von Objektträger und Deckplatte aus. Die Abstandshalter (4) oben und unten auf jeder Deckplatte (3) sorgen für parallele Ausrichtung von Objektträger und Deckplatte. Der gebildete Kapillarspalt (9) ist an allen Seiten offen, sofern er nicht teilweise durch die Abstandshalter geschlossen wird (3c).
Flüssigkeit, die von oben auf Kanten eines Paares aus Objektträger und Deckplatte gegeben wird, fließt durch Schwerkraft in den Spalt und tropft an der unteren Kante ab. Bei geeignetem Abstand im Bereich von weniger als etwa 0,2 mm bleibt der Spalt durch Oberflächenspannungseffekte gefüllt. Wird eine zweite Flüssigkeit aufgegeben, so verdrängt sie die erste nach unten hin, wobei die Front wegen der geringen Spaltbreite deutlich begrenzt verläuft. Flüssigkeiten lassen sich damit sehr effektiv austauschen, d.h., es wird nur ein Volumen von etwa dem 1,2- bis 1,5-fachen des Spaltvolumens zur vollständigen Verdrängung benötigt.
Werden die Dichtscheiben aus einem verformbaren, elastischen Material wie z. B. Silikon, Kautschuk oder Gummi hergestellt, so dichten diese bei genügend hohem Druck gegeneinander ab und bilden Flüssigkeitsreservoire aus. Die Dichtscheiben habe ein Höhenprofil zur Aufnahme von je einem Paar aus Objektträger und Deckplatte, wie in 2 dargestellt. Die durch die Dichtscheiben im Zusammenwirken mit Objektträger und Deckplatte ausgebildeten Reservoire erlauben es, jedes Paar von Objektträger und Deckplatte mit einer individuellen biologischen Sonde zu beaufschlagen. Das Reservoir kann so dimensioniert werden, dass es das Mehrfache des Spaltvolumens fasst. Damit kann der Spalt mit nur einer Füllung mehrfach überspült werden, um so einen vollständigen Austausch der Flüssigkeiten zu gewährleisten.
Handelsübliche Objektträger sind nicht immer exakt dimensioniert und die Abdichtung zwischen Dichtscheiben einerseits und Objektträger und Deckplatte andererseits ist nicht immer vollständig. Die erfindungsgemäß vorgeschlagene Vorrichtung ist aber tolerant gegen kleinere Undichtigkeiten. Bei geeigneter Wahl der Dicke der Dichtscheiben sind eventuelle auftretende Leckagen auf genau das einem Reservoir zugeordnete Paar von Objektträger und Deckplatte beschränkt. Das gleiche gilt für evtl. aus dem seitlich offenen Spalt austretende Flüssigkeiten, die dann an der Kante ablaufen, ohne andere Objektträger zu benetzen. Mehrere Sätze aus Dichtscheibe, Objektträger und Deckplatte werden durch eine Klammvorrichtung gegeneinander verspannt. Die Klemmvorrichtung (6) besteht im einfachsten Fall aus einem oder zwei Paaren von Gewindestangen und Klemmplatten (7) aus einem steifen, inerten Material wie z. B. Edelstahlblech.
Typische Protokolle der Immuncytochemie und in situ Hybridisierung sind aus der Literatur, z.B. aus den zitierten Patenten hinlänglich bekannt. Allen Protokollen gemeinsam ist die se rielle Inkubation der biologischen Proben mit einer Reihe von Flüssigkeiten unterschiedlicher Zusammensetzung und Viskosität, zum Teil auch bei erhöhter oder erniedrigter Temperatur. Im Laufe der Prozedur entstehen gelegentlich Luftblasen durch Ausgasen der Flüssigkeit oder durch sehr unterschiedliche Oberflächenspannungen. Diese Blasen werden in der beschriebenen Vorrichtung in nachfolgenden Waschschritten nach unten oder seitlich aus dem Spalt herausgespült.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt es, eine Vielzahl von Objektträgern auf kleinem Raum unterzubringen. Die folgenden Angaben dienen der Illustration an einem Beispiel ohne die Patentansprüche einzuschränken. In einem typischen Aufbau ist der Platzbedarf für eine Einheit 4 mm bei einem Abstand von 2 mm. Die Breite der Dichtscheiben ist z. B. 35 mm und die Spaltbreite 0.075 mm. Damit ergibt sich bei handelsüblichen Objektträgern von 25 mm Breite ein Spaltvolumen von 140 μl. Als Deckplatten werden vorzugsweise Objektträger mit aufgebrachten Abstandshaltern benutzt. Diese Abstandhalter können, wie in 3 gezeigt, streifenweise (4, 12, 13) oder in anderen geometrischen Formen (11) ausgeführt sein. Ein Abstandshalter in der Mitte (12) wirkt der Verformung der Objektträger durch die elastischen Dichtscheiben entgegen. Lange, streifenförmige Abstandshalter (13) halten den Spalt auf der gesamten Länge auf einen bestimmten Abstand und verringern die Verdunstung von Flüssigkeit über die sonst offenen Kanten.
Für Experimente in der ISH muss die Flüssigkeit auf den biologischen Proben für längere Zeit auf erhöhte Temperatur gebracht werden, z. B. für 16 h auf 60°C. Wegen der offenen Kanten muss hier die Vorrichtung in einer feuchten Kammer mit dampfgesättigter Atmosphäre gehalten werden. Eine solche Kammer (14) ist in 4 dargestellt. Auch hier ist die enge Anordnung der Proben von Vorteil, da das Gesamtvolumen klein gehalten werden kann und die Sättigung mit dem Flüssigkeitsdampf schnell erreicht wird. Der Ablauf (17) wird vorzugsweise so angeordnet, dass ein Flüssigkeitsreservoir (16) in der Kammer bleibt. Die Beheizung (nicht gezeichnet) erfolgt über den Boden und die Seiten. Dabei wird vorzugsweise der Hauptteil der Leistung über den Boden eingebracht, um aus dem Sumpf (16) Flüssigkeit zur Sättigung der Atmosphäre zu verdunsten.
Die Beschickung der einzelnen Spalten zwischen den Objektträgern erfolgt über eine Kanüle, z. B. eines Pipettierroboters, durch Löcher im Deckel (15) der Kammer. Die Flüssigkeit kann dabei entweder direkt auf die Kanten der Objektträger und Deckplatten getropft werden, oder in die zusammen mit den Dichtscheiben geformten Reservoire eingebracht werden.
Zur Abkühlung wird die warme Flüssigkeit im Sumpf durch kalte Flüssigkeit ausgetauscht und/oder die feuchte Kammer aktiv, z. B. durch ein Peltier-Element (nicht gezeichnet) gekühlt. Die Objektträger und Deckplatten können zusätzlich durch Waschen mit kalten Puffer gekühlt werden. Für schnellere Kühlung ist es auch denkbar, die gesamte feuchte Kammer mit Waschpuffer zu fluten (nicht gezeichnet). Eine Kreuzkontamination der Proben ist hier nicht zu erwarten, da die Reagenzien im Sumpf dabei stark verdünnt werden und die engen Spalten einen Flüssigkeitsaustausch erschweren. Das Fluten der Kammer kann daher kein Ersatz für Waschschritte sein, bei denen der Waschpuffer auf die obere Kante des Spalts zwischen Objektträger und Deckplatte gegeben wird.
In einer weiteren Ausführung der Vorrichtung haben mindestens einige der Dichtscheiben eine Geometrie, die im zusammengepressten Zustand zur Ausbildung weiterer Reservoire über mehrere Ensembles aus Objektträger, Deckplatte und Dichtscheibe hinweg führt. Die Geometrie ist in 5 dargestellt. In dieser Ausführung kann die Waschflüssigkeit für mehrere Objektträger simultan aufgegeben werden, was den Ablauf der Prozedur beschleunigt. Werden die Ausschnitte in den Dichtscheiben nicht bis an die Oberkante der Objektträger geführt, so bleiben die individuellen Reservoire in verkleinerter Form erhalten und erlauben so eine Kombination aus raschem gemeinsamem Waschen und individueller Zufuhr definierter Probenflüssigkeiten.

1: Objekträger
2: Probe eines biologischen Materials
3: Deckplatte
4: Abstandshalter
5: Dichtscheibe
6: Klemmvorrichtung
7: Klemmplatten
8: Reservoir
9: Kapillarspalt
10: Bohrung für Klemmvorrichtung
11: Abstandshalter, alternative Form
12: Abstandshalter
13: Abstandshalter, lange Form
14: feuchte Kammer
15: Deckel
16: Flüssigkeitssumpf
17: Überlauf
18: Auflage
19: Aussparung
20: Übergreifendes Reservoir

Claims

Vorrichtung zur Behandlung biologischer Proben mit Flüssigkeiten, bestehend aus zwei oder mehr Sätzen von Objektträgern (1), die mit je einer Deckplatte (3), Abstandshaltern (4, 11, 12) und je einer elastischen Dichtscheibe (5) in einer Klemmvorrichtung (6) unter Ausbildung jeweils eines Reservoirs (8) mit einem oben und unten offenen parallelen Spalt (9) zusammengepresst werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichtscheibe (5) ein Höhenprofil zur seitlich formschlüssigen Aufnahme von Objekträger (1) und Deckplatte (3) aufweist, dass der Spalt (9) unterhalb der Klemmvorrichtung (6) an den Längsseiten offen ist, so dass die in eines der Reservoirs (8) gegebene Flüssigkeit über genau den mit diesem Reservoir (8) verbundenen Spalt (9) nach unten abläuft.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Spalt (9) durch aufgeklebte oder aufgedruckte Abstandshalter (4, 11, 12) in Form von Streifen, Punkten oder anderer Geometrie definiert wird, die geeignet sind, Objektträger (1) und Deckplatte (3) im zusammengedrückten Zustand auf definiertem Abstand zu halten.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckplatte (3) aus einem Objektträger (1) mit darauf aufgebrachten Abstandshaltern (4, 11, 12) besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichtscheibe (5) aus Silikon, Kautschuk, Gummi, Neopren oder einem anderen gegen die verwendeten Flüssigkeiten inerten Elastomer besteht.