JPH0669400B2 - 核酸の同定方法 - Google Patents
核酸の同定方法Info
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- JPH0669400B2 JPH0669400B2 JP60299797A JP29979785A JPH0669400B2 JP H0669400 B2 JPH0669400 B2 JP H0669400B2 JP 60299797 A JP60299797 A JP 60299797A JP 29979785 A JP29979785 A JP 29979785A JP H0669400 B2 JPH0669400 B2 JP H0669400B2
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- probe
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- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、溶液中でのハイブリダイゼーションによる核
酸の同定方法に関する。
酸の同定方法に関する。
［従来の技術］ 種々のハイブリダイゼーション法が核酸の同定のために
用いられている。その例として、たとえば直接ハイブリ
ダイゼーション法およびサンドイッチハイブリダイゼー
ション法をあげることができる。直接ハイブリダイゼー
ション法においては、核酸試料は溶液中にあるかまたは
固体の担体に固定される。固定されるべき核酸は、１個
の標識されたプローブによって明示される。サンドイッ
チハイブリダイゼーション法（米国特許第4,486,539号
明細書参照）においては、２個の別々のプローブが用い
られ、それらによって同定されるべき核酸が試料溶液中
で明示される。検出プローブ（detector probe）は標
識物質で標識され、他のプローブが固体の担体に固定さ
れる。
用いられている。その例として、たとえば直接ハイブリ
ダイゼーション法およびサンドイッチハイブリダイゼー
ション法をあげることができる。直接ハイブリダイゼー
ション法においては、核酸試料は溶液中にあるかまたは
固体の担体に固定される。固定されるべき核酸は、１個
の標識されたプローブによって明示される。サンドイッ
チハイブリダイゼーション法（米国特許第4,486,539号
明細書参照）においては、２個の別々のプローブが用い
られ、それらによって同定されるべき核酸が試料溶液中
で明示される。検出プローブ（detector probe）は標
識物質で標識され、他のプローブが固体の担体に固定さ
れる。
［問題点を解決するための手段］ 本発明による方法は、少なくとも２個のプローブがハイ
ブリダイゼーション反応に用いられることで特徴づけら
れる。検出プローブには標識が付着される。他のプロー
ブ、いわゆる捕捉プローブ（capturing probe）には、
他の成分に対して親和性を有する成分が付着され、この
ことによってハイブリダイゼーションの結果できた補足
プローブ：標的の核酸：検出プローブのハイブリッドを
ハイブリダイゼーション混合物中に存在する他の成分か
ら分離することができる。
ブリダイゼーション反応に用いられることで特徴づけら
れる。検出プローブには標識が付着される。他のプロー
ブ、いわゆる捕捉プローブ（capturing probe）には、
他の成分に対して親和性を有する成分が付着され、この
ことによってハイブリダイゼーションの結果できた補足
プローブ：標的の核酸：検出プローブのハイブリッドを
ハイブリダイゼーション混合物中に存在する他の成分か
ら分離することができる。
２個の異なるプローブが用いられ両方のプローブがとも
に溶液相にある新しいハイブリダイゼーション法が今や
開発された。この方法でのハイブリダイゼーションの反
応は、ハイブリダイゼーションにかかわる標的の核酸お
よび該２個のプローブの両方が同じ溶液相にあるので、
１個のプローブが固体の担体に固定されているサンドイ
ッチハイブリダイゼーション法におけるよりもかなり急
速に行なわれる。本発明の方法によれば、１時間のイン
キュベーション時間で充分である、シングルステップハ
イブリダイゼーション（米国特許第4,486,539号明細書
参照）においては、12時間未満では充分なハイブリダイ
ゼーションが達成されない。ツーステップハイブリダイ
ゼーション（ダン（Dunn）およびハッセル（Hassell）
の「セル（Cell）、12巻、23〜36頁、1977年」参照）が
行なわれるときは、少なくとも24時間のハイブリダイゼ
ーション時間が必要である。
に溶液相にある新しいハイブリダイゼーション法が今や
開発された。この方法でのハイブリダイゼーションの反
応は、ハイブリダイゼーションにかかわる標的の核酸お
よび該２個のプローブの両方が同じ溶液相にあるので、
１個のプローブが固体の担体に固定されているサンドイ
ッチハイブリダイゼーション法におけるよりもかなり急
速に行なわれる。本発明の方法によれば、１時間のイン
キュベーション時間で充分である、シングルステップハ
イブリダイゼーション（米国特許第4,486,539号明細書
参照）においては、12時間未満では充分なハイブリダイ
ゼーションが達成されない。ツーステップハイブリダイ
ゼーション（ダン（Dunn）およびハッセル（Hassell）
の「セル（Cell）、12巻、23〜36頁、1977年」参照）が
行なわれるときは、少なくとも24時間のハイブリダイゼ
ーション時間が必要である。
少なくとも２個のプローブが本発明による方法において
有利にも用いられる。プローブは標的の核酸に充分に相
同な（homologous）核酸断片である。同定されるべき核
酸中のお互いに比較的接近した部位にプローブが相同で
あることが、必要ではないが有利である。プローブはお
互いに重複してはならない。
有利にも用いられる。プローブは標的の核酸に充分に相
同な（homologous）核酸断片である。同定されるべき核
酸中のお互いに比較的接近した部位にプローブが相同で
あることが、必要ではないが有利である。プローブはお
互いに重複してはならない。
プローブは、組みかえDNA技術によって合成的もしくは
半合成的に調製することもできるし、天然から直接単離
された核酸から調整することもできる。プローブはま
た、いくつかの筋から商業的に入手できる。プローブは
適当なベクターに結合していてもよい。プローブはベク
ター部分を含んでいてもよいし、ベクター部分が完全に
欠けていてもよい。
半合成的に調製することもできるし、天然から直接単離
された核酸から調整することもできる。プローブはま
た、いくつかの筋から商業的に入手できる。プローブは
適当なベクターに結合していてもよい。プローブはベク
ター部分を含んでいてもよいし、ベクター部分が完全に
欠けていてもよい。
検出プローブは適当な標識で標識される。標識として
は、直接的に検出されうる標識、すなわち種々の放射性
同位元素もしくは放射的に標識された化合物などの放射
性のもの、螢光性のもの、冷光を発するものまたは光を
発するものを用いる。
は、直接的に検出されうる標識、すなわち種々の放射性
同位元素もしくは放射的に標識された化合物などの放射
性のもの、螢光性のもの、冷光を発するものまたは光を
発するものを用いる。
他のプローブ、いわゆる捕捉プローブには、他の成分に
対して親和性を有する成分が付着される。ビオチン−ア
ビジンもしくはストレプトアビジン、重金属誘導体−チ
オ基、およびポリdG−ポリdC、ポリdA−ポリdT、および
dA−ポリＵのような種々のホモポリヌクレオチドが好適
な親和性のペア（affinity pair）である。他の親和性
のペアもまた用いることができるが、そのばあい各成分
はお互いに充分強力な親和性を有していなければならな
い。好適な親和性のペアは、免疫学的方法に用いられる
リガンドおよびコンジュゲート（conjugates）に見出さ
れる。
対して親和性を有する成分が付着される。ビオチン−ア
ビジンもしくはストレプトアビジン、重金属誘導体−チ
オ基、およびポリdG−ポリdC、ポリdA−ポリdT、および
dA−ポリＵのような種々のホモポリヌクレオチドが好適
な親和性のペア（affinity pair）である。他の親和性
のペアもまた用いることができるが、そのばあい各成分
はお互いに充分強力な親和性を有していなければならな
い。好適な親和性のペアは、免疫学的方法に用いられる
リガンドおよびコンジュゲート（conjugates）に見出さ
れる。
ハイブリダイゼーション反応が行なわれる前に、ハイブ
リダイゼーション溶液中にシングルストランドのかたち
の標的の核酸を放出するように試料が処理される。ハイ
ブリダイゼーションは、標的の核酸、標識されたプロー
ブおよび捕捉プローブが、必要なばあいにシングルスト
ランドにされたハイブリダイゼーション混合物中で行な
われる。種々の好適なバッファーをハイブリダイゼーシ
ョン溶液として用いることができる。ハイブリダイゼー
ションは０〜80℃の温度範囲内でおこるが、65℃の温度
を用いるのが有利である。ハイブリダイゼーション溶液
がホルムアミド（40〜55％）を含有しているときは、37
℃の温度を用いることができる。ハイブリダイゼーショ
ン時間としては１時間で充分である。
リダイゼーション溶液中にシングルストランドのかたち
の標的の核酸を放出するように試料が処理される。ハイ
ブリダイゼーションは、標的の核酸、標識されたプロー
ブおよび捕捉プローブが、必要なばあいにシングルスト
ランドにされたハイブリダイゼーション混合物中で行な
われる。種々の好適なバッファーをハイブリダイゼーシ
ョン溶液として用いることができる。ハイブリダイゼー
ションは０〜80℃の温度範囲内でおこるが、65℃の温度
を用いるのが有利である。ハイブリダイゼーション溶液
がホルムアミド（40〜55％）を含有しているときは、37
℃の温度を用いることができる。ハイブリダイゼーショ
ン時間としては１時間で充分である。
ハイブリダイゼーションがおこったときは、溶液は、必
要なばあいに、親和性のペアに有利な条件にするために
希釈される。そののち混合物は親和性のペアのもう一方
と接触される。捕捉プローブ：標的の核酸：検出プロー
ブのハイブリッドを捕捉するために、アフィニティーク
ロマトグラフィーカラム、フィルター、プラスチック表
面およびガラス表面などを用いることができる。
要なばあいに、親和性のペアに有利な条件にするために
希釈される。そののち混合物は親和性のペアのもう一方
と接触される。捕捉プローブ：標的の核酸：検出プロー
ブのハイブリッドを捕捉するために、アフィニティーク
ロマトグラフィーカラム、フィルター、プラスチック表
面およびガラス表面などを用いることができる。
アフィニティーカラムの担体材料は、たとえばセルロー
ス、ラテックス、ポリアクリルアミド、デキストランま
たはアガロースであってよい。これらの材料はまた試験
管中での懸濁液としても用いることができる。その内部
表面に親和性のペアの他の成分が固定化された試験管を
用いることもまた有利である。捕捉プローブに付着した
成分に対して親和性を有する成分がそれに固定化されう
るということが、選ばれた材料の必要条件である。
ス、ラテックス、ポリアクリルアミド、デキストランま
たはアガロースであってよい。これらの材料はまた試験
管中での懸濁液としても用いることができる。その内部
表面に親和性のペアの他の成分が固定化された試験管を
用いることもまた有利である。捕捉プローブに付着した
成分に対して親和性を有する成分がそれに固定化されう
るということが、選ばれた材料の必要条件である。
試料中に同定されるべき核酸が含まれていると、ハイブ
リダイゼーションの結果、捕捉プローブ：標的の核酸：
検出プローブのハイブリッドがえられる。分別のあいだ
にこのハイブリッドは担体に付着する。担体に付着した
分画の標識は、従来の方法によって担体から直接または
溶出液から溶出したのちに測定することができる。
リダイゼーションの結果、捕捉プローブ：標的の核酸：
検出プローブのハイブリッドがえられる。分別のあいだ
にこのハイブリッドは担体に付着する。担体に付着した
分画の標識は、従来の方法によって担体から直接または
溶出液から溶出したのちに測定することができる。
アフィニティークロマトグラフィーのかわりに他のシス
テム、たとえば相抽出または磁場を分別に用いることが
できる。
テム、たとえば相抽出または磁場を分別に用いることが
できる。
［実施例］ つぎに本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明する
が、本発明はもとよりこれらに限られるものではない。
が、本発明はもとよりこれらに限られるものではない。
実施例１ ホモポリヌクレオチドによる細胞溶解産物からのアデノ
ウィルスDNAの同定 用いた検出プローブは125Iで標識された組みかえファー
ジmKTH1206であり、該ファージは、アデノウィルス２型
の遺伝子地図上の42−45.3％の位置からのアデノウィル
スゲノムのBg1 II断片を含んでいた。該組みかえファ
ージは、菌保存機関であるドイチェ ザムルンク フォ
ン ミクロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von
Microorganismen（DSM））に寄託番号DSM 2827で寄
託されている。該ファージの特性は７×107cpm／μｇ
DNAであった。該プローブは、ランキ（Ranki）らの「ジ
ーン（Gene）、77〜85頁、1983年」に一層詳細に記載さ
れている。
ウィルスDNAの同定 用いた検出プローブは125Iで標識された組みかえファー
ジmKTH1206であり、該ファージは、アデノウィルス２型
の遺伝子地図上の42−45.3％の位置からのアデノウィル
スゲノムのBg1 II断片を含んでいた。該組みかえファ
ージは、菌保存機関であるドイチェ ザムルンク フォ
ン ミクロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von
Microorganismen（DSM））に寄託番号DSM 2827で寄
託されている。該ファージの特性は７×107cpm／μｇ
DNAであった。該プローブは、ランキ（Ranki）らの「ジ
ーン（Gene）、77〜85頁、1983年」に一層詳細に記載さ
れている。
捕捉プローブは組みかえプラスミドpKTH1202であり、該
プラスミドは菌保存機関であるドイチェ ザムルンク
フォン ミクロオルガニスメンに寄託番号DSM 2824で
寄託されており、プラスミドpBR322にクローニングされ
たアデノウィルスのBamHI Ｄ断片（遺伝子地図の位置:
29−42％）からなっていた。組みかえプラスミドpKTH12
02（DSM 2824）は制限酵素Hae IIIを用いて断片化
し、その断片の３′末端にターミナルトランスフェラー
ゼ酵素を用いてポリＡの尾を連結した。ポリＡの尾の長
さは3H−Ａを組み込むことによって測定した。ポリＡの
尾の平均の長さはＡの約70残基であった。捕捉プローブ
は用いる前に沸騰させることによって変性させた。
プラスミドは菌保存機関であるドイチェ ザムルンク
フォン ミクロオルガニスメンに寄託番号DSM 2824で
寄託されており、プラスミドpBR322にクローニングされ
たアデノウィルスのBamHI Ｄ断片（遺伝子地図の位置:
29−42％）からなっていた。組みかえプラスミドpKTH12
02（DSM 2824）は制限酵素Hae IIIを用いて断片化
し、その断片の３′末端にターミナルトランスフェラー
ゼ酵素を用いてポリＡの尾を連結した。ポリＡの尾の長
さは3H−Ａを組み込むことによって測定した。ポリＡの
尾の平均の長さはＡの約70残基であった。捕捉プローブ
は用いる前に沸騰させることによって変性させた。
用いた試料は、アデノウィルスの感染したＡ−549細胞
からなっていた。該細胞を感染後21時間インキュベート
した。細胞を集め、１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を
用いて溶解した。溶液は約106細胞／mlを有していた。
超音波処理によってその粘度を下げた。同様に処理され
た感染されていないＡ−549細胞をコントロールとして
用いた。ハイブリダイゼーションする前に試料を５分
間、0.02M NaOH中で沸騰させ、０℃に冷却し、酢酸で
中性にした。
からなっていた。該細胞を感染後21時間インキュベート
した。細胞を集め、１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を
用いて溶解した。溶液は約106細胞／mlを有していた。
超音波処理によってその粘度を下げた。同様に処理され
た感染されていないＡ−549細胞をコントロールとして
用いた。ハイブリダイゼーションする前に試料を５分
間、0.02M NaOH中で沸騰させ、０℃に冷却し、酢酸で
中性にした。
テストのために、500000cpmの検出プローブ、50ngの捕
捉プローブDNAおよび10μの試料を試験管中に一緒に
入れた。容量を50μに調節し、バッファー溶液として
0.6Mの塩化ナトリウム、0.06Mのクエン酸ナトリウム、
0.02Mのリン酸ナトリウム（pH7.6）および0.5％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを用いた。混合物を65℃で１時間イン
キュベートした。
捉プローブDNAおよび10μの試料を試験管中に一緒に
入れた。容量を50μに調節し、バッファー溶液として
0.6Mの塩化ナトリウム、0.06Mのクエン酸ナトリウム、
0.02Mのリン酸ナトリウム（pH7.6）および0.5％ドデシ
ル硫酸ナトリウムを用いた。混合物を65℃で１時間イン
キュベートした。
ハイブリダイゼーション後、溶液を20℃に冷却し、オリ
ゴdTセルロース1mlを有するクロマトグラフィーカラム
にゆっくり通した。カラムを通した溶液を回収し、再び
カラムに通した。そののちカラムを、0.15Mの塩化ナト
リウム、0.015Mのリン酸ナトリウム（pH7.6）および0.5
％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶液20mlで洗浄し
た。付着したDNAは0.02M NaOH 1mlを用いることによ
って最終的に取りはずされた。この溶液を回収し、その
放射能を決定した。結果を第１表に示す。
ゴdTセルロース1mlを有するクロマトグラフィーカラム
にゆっくり通した。カラムを通した溶液を回収し、再び
カラムに通した。そののちカラムを、0.15Mの塩化ナト
リウム、0.015Mのリン酸ナトリウム（pH7.6）および0.5
％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶液20mlで洗浄し
た。付着したDNAは0.02M NaOH 1mlを用いることによ
って最終的に取りはずされた。この溶液を回収し、その
放射能を決定した。結果を第１表に示す。
実施例２ ビオチン−ストレプトアビジンによるトラコ−マクラミ
ディアDNAの同定 用いた検出プローブは125Iで標識した組みかえファージ
mKTH1245であり、該ファージはpKTH1220クローンからの
２つのBamHI−Sall DNA断片を含んでおり、それら２つ
のDNA断片はM13mp8ベクターに一緒に連結した。pKTH122
0クローンは菌保存機関であるドイチェ ザムルンク
フォン ミクロオルガニスメンに寄託番号DSM 2825で
寄託されており、パルバ（Palva）らの「FEMS ミクロ
バイオロジー レターズ （Microbiology Letter
s）、23巻、83〜89頁、1984年」に記載されている。
ディアDNAの同定 用いた検出プローブは125Iで標識した組みかえファージ
mKTH1245であり、該ファージはpKTH1220クローンからの
２つのBamHI−Sall DNA断片を含んでおり、それら２つ
のDNA断片はM13mp8ベクターに一緒に連結した。pKTH122
0クローンは菌保存機関であるドイチェ ザムルンク
フォン ミクロオルガニスメンに寄託番号DSM 2825で
寄託されており、パルバ（Palva）らの「FEMS ミクロ
バイオロジー レターズ （Microbiology Letter
s）、23巻、83〜89頁、1984年」に記載されている。
用いた捕捉プローブは組みかえプラスミドpKTH1250であ
った。このプラスミドは、プラスミドpKTH1220（DSM 2
825）からの2.9kbのSalI−ClaI断片およびベクターpAT1
53からなっていた。知られたニックトランスレーション
法（リグビー（Rigby）らの「ジャーナル オブ モレ
キュラー バイオロジー、113、237〜251頁、1977年参
照）および基質としてビオチン−11−UTP（ベテスダ
リサーチ ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories）製）を用いてビオチン分子をpKTH1250 DNA
に共有結合的に連結させた。捕捉プローブは、用いる前
に10mMのトリス−Cl（pH7.6）および1mMのEDTAからなる
バッファー中で５分間沸騰させた。
った。このプラスミドは、プラスミドpKTH1220（DSM 2
825）からの2.9kbのSalI−ClaI断片およびベクターpAT1
53からなっていた。知られたニックトランスレーション
法（リグビー（Rigby）らの「ジャーナル オブ モレ
キュラー バイオロジー、113、237〜251頁、1977年参
照）および基質としてビオチン−11−UTP（ベテスダ
リサーチ ラボラトリーズ（Bethesda Research Labo
ratories）製）を用いてビオチン分子をpKTH1250 DNA
に共有結合的に連結させた。捕捉プローブは、用いる前
に10mMのトリス−Cl（pH7.6）および1mMのEDTAからなる
バッファー中で５分間沸騰させた。
標的の核酸は、組みかえプラスミドpKTH1220（DSM 282
5）であった。このプラスミドは、ベクターpBR322に連
結した、トラコーマクラミディア（Chlamydia trachom
atis）の特性を示すDNAの約10kbを含有していた。該プ
ラスミドは、細菌のゲノムDNAをあらわす標準的なDNAと
して役立った。使用する前に該プラスミドは0.02MのNaO
H中で５分間沸騰させ、そののち酢酸で溶液を中性にし
た。
5）であった。このプラスミドは、ベクターpBR322に連
結した、トラコーマクラミディア（Chlamydia trachom
atis）の特性を示すDNAの約10kbを含有していた。該プ
ラスミドは、細菌のゲノムDNAをあらわす標準的なDNAと
して役立った。使用する前に該プラスミドは0.02MのNaO
H中で５分間沸騰させ、そののち酢酸で溶液を中性にし
た。
親和性の材料として用いるストレプトアビジンを、アク
セン（Axen）らの「ネーチャー、214、1302〜1304頁、1
967年」にしたがってCNBr活性化セファロース（ファル
マシア（pharmacia）製）に固定した。
セン（Axen）らの「ネーチャー、214、1302〜1304頁、1
967年」にしたがってCNBr活性化セファロース（ファル
マシア（pharmacia）製）に固定した。
テストのために、500000cpmの検出プローブ、50ngの捕
捉プローブDNAおよび10ngの標的のDNAを試験管中に一緒
に入れた。容量を20μに調節し、バッファー溶液は実
施例１と同じものを用いた。コントロールのDNAは子牛
胸腺DNAであった。
捉プローブDNAおよび10ngの標的のDNAを試験管中に一緒
に入れた。容量を20μに調節し、バッファー溶液は実
施例１と同じものを用いた。コントロールのDNAは子牛
胸腺DNAであった。
混合物を65℃で60分間インキュベートした。そののち、
0.1Mのトリス−Cl（pH7.5）、0.1MのNaCl、2mMのMgCl2
および0.05％のトリトンＸ−100からなるバッファー溶
液500μｌを加えた。最後に溶液をストレプトアビジン
−セファロースカラム0.2ml中で分別した。叙上のバッ
ファー10ml、および0.015Mの塩化ナトリウム、0.015Mの
リン酸ナトリウム（pH7.6）および0.5％のドデシル硫酸
ナトリウム（50℃）のバッファー10mlで洗浄した。こう
してビオチン化された（biotinylated）DNAはストレプ
トアビジンに付着し、一方その他のDNAはカラムを通り
過ぎた。放射性のプローブはハイブリッドの形成の結果
としてのみ付着した。カラム全体をガンマカウンターの
カウンター管内に移すことによって捕捉された放射能を
決定した。結果を第２表に示す。
0.1Mのトリス−Cl（pH7.5）、0.1MのNaCl、2mMのMgCl2
および0.05％のトリトンＸ−100からなるバッファー溶
液500μｌを加えた。最後に溶液をストレプトアビジン
−セファロースカラム0.2ml中で分別した。叙上のバッ
ファー10ml、および0.015Mの塩化ナトリウム、0.015Mの
リン酸ナトリウム（pH7.6）および0.5％のドデシル硫酸
ナトリウム（50℃）のバッファー10mlで洗浄した。こう
してビオチン化された（biotinylated）DNAはストレプ
トアビジンに付着し、一方その他のDNAはカラムを通り
過ぎた。放射性のプローブはハイブリッドの形成の結果
としてのみ付着した。カラム全体をガンマカウンターの
カウンター管内に移すことによって捕捉された放射能を
決定した。結果を第２表に示す。
Claims (5)
- 【請求項１】標的の核酸に充分に相同であり、かつお互
いに重複しない核酸断片である捕捉プローブおよび検出
プローブからなる少なくとも２個の異なるプローブが同
一溶液相にあり、該捕捉プローブには親和性のペアの一
方が付着しており、ハイブリダイゼーション反応で生成
した捕捉プローブ：標的の核酸：検出プローブのハイブ
リッドが該親和性のペアのもう一方によって分離される
ハイブリダイゼーションによる核酸の同定方法におい
て、検出プローブが直接的に検出されうる標識で標識さ
れていることを特徴とする核酸の同定方法。 - 【請求項２】直接的に検出されうる標識が放射性のもの
である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】直接的に検出されうる標識が螢光性のもの
である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】直接的に検出されうる標識が冷光を発する
ものである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】直接的に検出されうる標識が光を発するも
のである特許請求の範囲第１項記載の方法。
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