NO166743B - Fremgangsmaate til identifikasjon av nukleinsyrer. - Google Patents
Fremgangsmaate til identifikasjon av nukleinsyrer. Download PDFInfo
- Publication number
- NO166743B NO166743B NO855308A NO855308A NO166743B NO 166743 B NO166743 B NO 166743B NO 855308 A NO855308 A NO 855308A NO 855308 A NO855308 A NO 855308A NO 166743 B NO166743 B NO 166743B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hybridization
- poly
- probe
- affinity
- stated
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 64
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 37
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- -1 heme compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRLRJZRHRJEWJY-VCOUNFBDSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-[3-[3-(4-azido-2-nitroanilino)propyl-methylamino]propyl]pentanamide Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCN(C)CCCNC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1[N+]([O-])=O BRLRJZRHRJEWJY-VCOUNFBDSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 101150115889 al gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til identifisering av nukleinsyrer ved hybridisering i oppløsning. Nærmere bestemt blir i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen to prober anvendt i hybridiseringsxeaksjonen. Til den såkalte detektorprobe er der festet en markør, og til den annen probe, den såkalte oppfangelsesprobe, er der festet en komponent som har affinitet for en annen komponent, ved hvilken oppfangelsesprobe: målnukleinsyre: detektorprobe-hybriden som fås fra hybridiseringen kan separeres fra de andre komponenter som foreligger i hybridiseringsblandingen.
Forskjellige hybridiseringsmetoder er blitt anvendt til identifisering av nukleinsyrer. Direktehybridiseringsmetoder og sandwichhybridiseringsmetoder kan nevnes som eksempler. I direktehybridiseringsmetoder foreligger nukleinsyreprøven enten i oppløsning eller festet til en fast bærer. Nukleinsyren som skal identifiseres påvises ved bruk av en merket probe. I sandwichhybridiseringsmetoder (US-PS 4.486.539) anvendes to separate prober ved hvilke nukleinsyren som skal identifiseres, påvises i prøveoppløsningen. Detektorproben er merket med et markørstoff, og den annen probe er festet til fast bærer.
En ny hybridiseringsmetode, hvor to forskjellige prober brukes, og begge prober er i oppløsningsfasen, er blitt utviklet. Da både målnukleinsyren, som deltar i hybridiseringen, og de to prober er i samme oppløsningsfase, er hybridiseringsreaksjonen adskillig hurtigere enn i sandwichhybridisering, hvor én probe er festet til en fast bærer. I fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er en inkubasjonstid på én time tilstrekkelig. I enkelttrinns-sandwichhybridiseringen (US PS 4.486.539) oppnås ikke tilstrekkelig hybridisering på mindre enn 12 timer. Når totrinns-sandwichhybridisering utføres (Dunn & Hassell, Cell. Vol. 12 pp. 23-36, 1977) er en hybridiseringstid på minst 24 timer nødvendig.
I henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes to i samme væskefase foreliggende prober hvorav den ene, detek-torproben, er merket med en egnet detekterbar markør, og der til den annen, oppfangelsesproben, er festet en komponent som virker som den ene del av et affinitetspar, idet oppfangelsesprobe: målnukleinsyre: detektorprobe-hybriden som dannes i hybridiseringsreaksjonen kan isoleres fra de andre komponenter som foreligger i hybridiseringsoppløsningen ved hjelp av den annen del av affinitetsparet som har festet seg til en fast bærer.
To prober blir brukt i fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Probene er nukleinsyrefragmenter som er tilstrekkelig homologe med målnukleinsyren. Det er en fordel, men ikke nødvendig, at probene er homologe med seter anordnet for-holdsvis nær hverandre i nukleinsyren som skal identifiseres. Probene må ikke overlappe hverandre.
Probene kan fremstilles syntetisk, semi-syntetisk, ved rekombinant DNA-teknikker, eller fra nukleinsyrer isolert direkte fra naturen. Prober er også tilgjengelig i handelen fra forskjellige kilder. En probe kan være bundet til en egnet vektor. Den kan inneholde vektordeler eller være fullstendig blottet for vektordeler.
Detektorproben er merket med en egnet markør. Forskjellig radioaktive isotoper eller radioaktivt merkede forbindelser kan anvendes som markørene. Markørstoffet kan også være fluor-escent, luminescent, lysemitterende, enzymatisk eller immunologisk påviselig etc. Markører basert på biotin og avidin eller streptavidin, lantanidchelater, ferritin og hemefor-bindelser, og immunologisk påviselige haptener såsom acetoksy-acetylfluoren-derivater (PCT-søknad WO 8302286) kan nevnes som eksempler. Identifisering ved formidling av proteiner er også mulig. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er ikke avhengig av den markør som anvendes. Alle for tiden kjente markørstoffer egnet til bruk ved nukleinsyrehybridisering eller de som utvikles i fremtiden, kan fritt anvendes i fremgangsmåten.
Til den annen probe, den såkalte oppfangelsesprobe, er festet en komponent som har affinitet for en annen komponent. Biotin - avidin eller - streptavidin, forskjellige homopolynukleotider såsom poly dG - poly dC, poly dA - poly dT, og poly dA - poly U er egnede affinitetspar. Men også andre affinitetspar kan anvendes, forutsatt at komponentene har tilstrekkelig sterk affinitet for hverandre. Egnede affinitetspar finnes blant ligander og konjugater brukt i immunologiske metoder.
Før hybridiseringsreaksjonen utføres blir prøveeksemplaret behandlet således at det frigjør målnukleinsyrene i enkelt-trådet form inn i hybridiseringsoppløsningen. Hybridiseringen utføres i en hybridiseringsblanding hvor målnukleinsyrene, den merkede probe og oppfangelsesproben der hvor det er nødvendig, er blitt etterlatt enkelttrådede. Forskjellige egnede buffere kan anvendes som hybridiseringsoppløsningene. Hybridiseringen finner sted i temperaturområdet 0-80°C, men det er fordelaktig å anvende en temperatur på 65°C. Dersom hybridiserings-oppløsningen inneholder formamid (40-55%) kan en temperatur på 37°C anvendes. En time er tilstrekkelig som hybridiseringstid.
Når hybridiseringen har funnet sted blir oppløsningen fortynnet om nødvendig for å gjøre forholdene fordelaktige for affinitetsparet. Deretter blir blandingen bragt i berøring med den annen komponent av affinitetsparet. Affinitets-kromatografi-kolonner, filtere, plastflater, glassflater etc. kan brukes til å fange opp oppfangelsesprobe: målnukleinsyre: detektorprobe-hybriden.
Bærermateriale.t av af f initetskolonnen kan f. eks. være cellu-lose, lateks, polyacrylamid, dekstran eller agarose. Disse materialer kan også anvendes som suspensjoner i et prøverør. Det er også en fordel å anvende prøverør som har den andre komponent av affinitetsparet festet til sin indre flate. Det er en forutsetning for det materiale som velges at det er mulig å feste det til en komponent som har affinitet for den komponent som er festet til oppfangelsesproben.
Dersom prøveeksemplaret inneholder nukleinsyren som skal identifiseres, vil man som resultat av hybridiseringen få en oppfangelsesprobe: målnukleinsyre: detektorprobe-hybrid. Under fraksjoneringen fester denne hybrid seg til bæreren. Markøren av fraksjonen som fester seg til bæreren kan måles ved vanlige metoder direkte fra bæreren eller etter eluering fra den eluerte oppløsning.
Andre systemer, f.eks. faseekstraksjon eller magnetfelter, kan også anvendes i stedet for affinitetskromatografi i fraksjoneringen.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er beskrevet i nærmere detalj i de følgende eksempler. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er ikke avhengig av de nukleinsyrefragmenter som anvendes i eksemplene.
Eksempel 1
Identifisering av DNA- adenoviruset fra et cellelvsat ved hielp av homopolvnukleotider
Detektorproben anvendt er <12>^i-merket rekombinant fag mKTH 1206, som inneholder et Bgl Il-fragment av adenovirusgenomet fra stilling 42 - 45,3% på genkartet av adenovirustype 2. Den rekombinante fag er deponert i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nummer DSM 2827. Dens spesifikke aktivitet er 7 x 10<7> cpm/ug DNA. Proben er beskrevet nærmere hos Ranki et al Gene 21 pp. 77-85, 1983.
Oppfangelsesproben som anvendes er det rekombinante plasmid
pKTH 1202, som er deponert i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nummeret DSM 2824, og det omfatter et BamHI D-fragment av adenoviruset (kartposisjon 29 - 42%) klonet inn i plasmidet pBR322. Det rekombinante plasmid pKTH 1202 (DSM 2824) ble fragmentert ved bruk av restriksjonsenzymet Hae III, og en poly-A-hale ble koblet til 3'-endene av fragmentene ved bruk av terminal-transferaseenzym. Lengden av halen ble målt ved <3>H-A-innlemmelse. Lengden var gjennomsnittlig på ca. 70 A-
rester. Før den ble brukt ble oppfangelsesproben denaturert ved koking.
Prøven som ble brukt besto av adenovirusinfiserte A-549 celler. Cellene ble inkubert i 21 timer etter infeksjonen. Cellene ble samlet opp og lysert ved bruk av 1% natriumdodecylsulfat-oppløsning. Oppløsningen inneholdt ca. 10^ celler/ml. Dens viskositet ble redusert ved lydbehandling (sonication). Identisk behandlede ikke-infiserte A-549 celler ble brukt som sammenligningsprøver. Før hybridisering ble prøven kokt i 5 minutter i 0,02 M NaOH, avkjølt til 0°C, og nøytralisert med eddiksyre.
For forsøket ble 500.000 cpm detektorprobe, 50 ng oppfangelsesprobe-DNA og 10 ul prøve kombinert i et prøverør. Volumet ble justert til 50 ul, og bufferoppløsningen som ble anvendt var 0,6 M natriumklorid, 0,06 M natriumcitrat, 0,02 M natriumfosfat (pH 7,6) og 0,5% natriumdodecylsulfat. Blandingen ble inkubert i 1 time ved 65°C.
Etter hybridiseringen ble oppløsningen avkjølt til 20°C og langsomt kjørt gjennom en kromatografikolonne med 1 ml oligo-dT-cellulose. Oppløsningen som passerte igjennom ble utvunnet og kjørt gjennom kolonnen på nytt. Deretter ble kolonnen vasket med 20 ml av en oppløsning som inneholdt 0,15 M natriumklorid, 0,015 M natriumfosfat (pH 7,6) og 0,5% natriumdodecylsulfat. Det festede DNA ble tilslutt adskilt ved bruk av 1 ml 0,02 M NaOH. Denne oppløsning ble utvunnet og dens radioaktivitet ble bestemt.
Eksempel 2
Identifisering av DNA av Chlamvdia trachomatis ved hielp av biotin- streptavidin
Detektorproben som ble anvendt var <125>I-merket rekombinant fag mKTH 1245, som inneholder to BamHI - Sali DNA-fragmenter fra klonen pKTH 1220, som sammen er koblet til M13mp8-vektoren. Klonen pKTH 1220 er deponert i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nummeret DSM 2825 og er beskrevet i Palva et al FEMS Microbiology Letters 23. pp. 83-89, 1984.
Oppfangelsesproben som ble anvendt var det rekombinante plasmid pKTH 1250. Dette plasmid består av et 2,9 kb Sali - Clal-fragment fra plasmidet pKTH 1220 (DSM 2825) og av vektoren pAT 153. Biotinmolekyler ble' koblet kovalent til pKTH 1250 DNA ved bruk av den kjente enkeltrådstranslasjonsmetode (nick-trans-lation method) (Rigby el al. J.Moi.Biol. 113, pp. 237-251, 1977) og biotin-ll-UTP som substratet (Bethesda Research Laboratories). Oppfangelsesprobe-DNA ble kokt i en buffer bestående av 10 mM Tris-Cl pH 7,6, 1 mM EDTA i 5 minutter fer bruk.
Målnukleinsyren var det rekombinante plasmid pKTH 1220 (DSM 2825). Dette plasmid inneholder ca. 10 kb av det DNA som er karakteristisk for Chlamydia trachomatis, koblet til vektoren pBR322. Plasmidet tjener som et modell-DNA som representerer genom-DNA av bakterien. Før bruk ble plasmidet kokt i 5 minutter i 0,02 M NaOH, hvoretter oppløsningen ble nøytralisert med eddiksyre.
Streptavidin som ble brukt som affinitetsmaterialet, ble festet til CNBr-aktivert Sepharose (Pharmacia) i henhold til Axen et al. Nature 214 pp. 1302-1304, 1967.
For forsøket ble 500.000 cpm probe, 50 ng oppfangelsesprobe DNA og 10 ng mål-DNA kombinert i et prøverør. Volumet ble justert til 20 ul, og bufferoppløsningen var den samme som i eksempel 1. Sammenlignings-DNA var kalvethymus-DNA.
Blandingen ble inkubert i 60 minutter ved 65°C. Deretter ble 500 lal av en bufferoppløsning med sammensetningen 0,1 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2- 0,05% Triton x-100 tilsatt. Tilslutt ble oppløsningen fraksjonert i en' 0,2 ml streptavidin-Sepharose-kolonne. Kolonnen ble vasket med 10 ml av den ovenfor angitte buffer og 10 ml 0,015 M natriumklorid, 0,015 M natriumfosfat (pH 7,6), 0,5% natriumdodecylsulfat (50°C). Det biotinylerte DNA festet seg således til streptavidinet mens det andre DNA passerte gjennom kolonnen. Den radioaktive probe festet seg bare som et resultat av hybriddannelse. Den oppfan-gede radioaktivitet ble bestemt ved overføring av hele kolonnen til tellerrøret av en gammateller.
Eksempel 3
Identifisering av plasmid PBR322 DNA ved hnelp av et antiaen-antistoff- par
Detektorproben som ble anvendt var et derivat av plasmidet pBR322 (tilgjengelig i handelen fra forskjellige kilder) fra hvilket Pstl - Sali (3613 - 651)-fragmentet var blitt fjernet. Plasmidet ble merket med fotobiotin ved bruk av en kjent metode (Forster et al. Nucleic Acids Res. 13, pp. 745-761, 1985) og i handelen tilgjengelige reagenser (Bresa, Adelaide, Australia).
Oppfangelsesproben som ble anvendt var DNA fra en rekombinant fag M13mpll inn i hvilken pBR322 Pstl - Sall-fragmentet var blitt introdusert. DNA var blitt sulfonert ved bruk av en kjent metode (Orgenics Ltd. Yavne, Israel).
Prøven var E. coli HB101 som bar plasmidet pBR322, hvilken mengde ble øket ved bruk av kloramfenikol-forstørrelse (Maniatis et al. Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982). De bakterielle celler ble lysert med lysozym fulgt av koking i NaOH som beskrevet i publikasjonen Palva, J. Clin. Microbiol. 18, pp. 92-100, 1983.
Antisulfone monoklonale antistoffer ble brukt til å belegge mikrotitrervæskebrønner (microtiter wells) av polystyren ved standardmetoder (McKearn, i Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. Kennett et al., Plenum Press 1980).
For forsøket ble 5 x 10^ lyserte E. coli-celler (både med og uten pBR322) kombinert med 100 ng hver av oppfangelses-DNA og detektorprobe i en 50 ul hybridiseringsblanding. Betingelsene var som i eksempel 1, med den unntagelse at 5% polyetenglykol (PEG 6000) ble satt til blandingen, og natriumdodecylsulfat-konsentrasjonen var 0,1%. Etter hybridisering ble oppløsningen fortynnet til 250 ul ved.tilsetning av 0,02 M natriumfosfat (pH 7,6), hvoretter oppløsningen ble overført til den med antistoffer belagte mikrotitrervæskebrønn. Dette ble fulgt av inku-bering i 2 timer ved 37°C. Brønnen ble deretter vasket med en oppløsning inneholdende 0,15 M natriumklorid, 0,02 M natriumfosfat, pH 7,6, og 0,05% triton X-100. Nærværet av detektorproben ble gjort synlig ved tilsetning av streptavidin (Bethesda Research Laboratories BRL), vasking, tilsetning av biotinylert alkalisk fosfatase (BRL), og vasking som beskrevet av Leary et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80,pp. 404 5-4049,1983. Tilslutt ble 250 ul av en 35 mg/ml paranitro-fenylfosfat-oppløsning (Sigma) i dietanolamin-buffer (pH-10) tilsatt. Etter 60 minutter ble reaksjonen stanset og absor-bansen ble målt ved 410 nm.
Claims (7)
1. Fremgangsmåte til identifisering av nukleinsyrer ved en hybridiseringsmetode ved anvendelse av to i samme væskefase foreliggende prober, hvorav den ene, detektorproben, er merket med en egnet detekterbar markør, karakterisert ved at man til den annen, oppf.angelsesproben, har festet en komponent som virker som den ene del av et affinitetspar, idet oppfangelsesprobe: målnukleinsyre: detektorprobe-hybriden som dannes i hybridiseringsreaksjonen kan isoleres fra de andre komponenter som foreligger i hybridiseringsoppløsningen ved hjelp av den annen del av affinitetsparet som har festet seg til en fast bærer.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der som affinitetspar anvendes biotin-streptavidin eller biotin-avidin.
3..Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der som affinitetspar anvendes et homopolynukleotidpar.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 3, karakterisert ved at der som affinitetspar anvendes poly dC - poly dG.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 3, karakterisert ved at der som affinitetspar anvendes poly dA - poly dT.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 3, karakterisert ved at der som affinitetspar anvendes poly dA - poly U.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der som affinitetspar anvendes et antigen - et antistoff.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI850004A FI72146C (fi) | 1985-01-02 | 1985-01-02 | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO855308L NO855308L (no) | 1986-07-03 |
| NO166743B true NO166743B (no) | 1991-05-21 |
| NO166743C NO166743C (no) | 1991-08-28 |
Family
ID=8520136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO855308A NO166743C (no) | 1985-01-02 | 1985-12-27 | Fremgangsmaate til identifikasjon av nukleinsyrer. |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0669400B2 (no) |
| AT (1) | AT397514B (no) |
| AU (1) | AU561382B2 (no) |
| BE (1) | BE903937A (no) |
| CA (1) | CA1271705A (no) |
| CH (1) | CH666696A5 (no) |
| DE (1) | DE3546312A1 (no) |
| DK (1) | DK164932C (no) |
| FI (1) | FI72146C (no) |
| FR (1) | FR2575493B1 (no) |
| GB (1) | GB2169403B (no) |
| HU (1) | HU196453B (no) |
| IE (1) | IE58290B1 (no) |
| IL (1) | IL77489A (no) |
| IT (1) | IT1201514B (no) |
| LU (1) | LU86238A1 (no) |
| NL (1) | NL189427C (no) |
| NO (1) | NO166743C (no) |
| RO (1) | RO94651B (no) |
| SE (1) | SE463212B (no) |
| ZA (1) | ZA859895B (no) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288609A (en) * | 1984-04-27 | 1994-02-22 | Enzo Diagnostics, Inc. | Capture sandwich hybridization method and composition |
| US6060237A (en) | 1985-02-26 | 2000-05-09 | Biostar, Inc. | Devices and methods for optical detection of nucleic acid hybridization |
| IL79112A (en) * | 1985-06-13 | 1992-01-15 | Abbott Lab | Method for the isolation of a nucleic acid sequence and kit for performing a hybridization assay |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
| AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
| AU2084988A (en) * | 1987-06-26 | 1989-01-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Affinity removal of contaminating sequences from recombinant cloned na using capture beads |
| JP2783568B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1998-08-06 | ジェン‐プローブ インコーポレイテッド | 望ましくない交差反応を排除するためにオリゴヌクレオチドを使用するポリヌクレオチドの検定法 |
| EP0305145A3 (en) * | 1987-08-24 | 1990-05-02 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Methods and probes for detecting nucleic acids |
| EP0304845A3 (en) * | 1987-08-28 | 1991-03-06 | Profile Diagnostic Sciences Inc. | Method and kit for assaying gene expressions |
| CA1325761C (en) * | 1987-12-25 | 1994-01-04 | Takanori Oka | Method of detecting an intended nucleic acid in a sample |
| DE3800644A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum hochspezifischen nachweis von nukleinsaeuren in loesung |
| US5104791A (en) * | 1988-02-09 | 1992-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Particle counting nucleic acid hybridization assays |
| ATE114726T1 (de) * | 1988-05-10 | 1994-12-15 | Du Pont | Verfahren zum schnellen nachweis von nukleinsäuren. |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| US5858652A (en) * | 1988-08-30 | 1999-01-12 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
| GB2225112A (en) * | 1988-11-22 | 1990-05-23 | Ici Plc | Hybridisation probes |
| US5082935A (en) * | 1988-12-15 | 1992-01-21 | Amoco Corporation | Diagnostic reagents made by attaching cytidine containing nucleic acid probes to amino functionalized solid supports by bisulfite mediated transamination |
| CA2025236A1 (en) * | 1989-02-06 | 1990-08-07 | Walter King | Probes and methods for the detection of listeria |
| DE69031121T2 (de) * | 1989-03-10 | 1997-11-13 | Vysis Inc | Interferenzverhinderung mit affinitätseinfangschemas |
| JP3046837B2 (ja) | 1989-03-10 | 2000-05-29 | バイシス・インコーポレーテツド | 固定化されたオリゴヌクレオチドのプローブおよびそれらの使用 |
| AU6075490A (en) * | 1989-07-11 | 1991-02-06 | Microprobe Corporation | Quantification of bacteria using a nucleic acid hybridization assay |
| US5334501A (en) * | 1989-07-11 | 1994-08-02 | Microprobe Corporation | Quantification of bacteria using a nucleic acid hybridization assay |
| GB8924989D0 (en) * | 1989-11-06 | 1989-12-28 | Scotgen Ltd | Method and device for the detection of antibiotic resistance |
| US5580970A (en) * | 1989-12-01 | 1996-12-03 | Amoco Corporation | Detection of HPV transcripts |
| AU7429591A (en) * | 1990-04-18 | 1991-10-24 | Gene-Trak Systems | Nucleic acid probes for the detection of giardia lamblia |
| WO1992015708A1 (en) * | 1991-02-27 | 1992-09-17 | Amoco Corporation | Methods for improving the sensitivity of hybridization assays |
| WO1993020234A1 (en) * | 1992-03-31 | 1993-10-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | A rapid, high capacity nucleic acid based assay |
| US7713528B1 (en) | 1993-02-18 | 2010-05-11 | Enzo Therapeutics, Inc. | Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate |
| US5853993A (en) * | 1996-10-21 | 1998-12-29 | Hewlett-Packard Company | Signal enhancement method and kit |
| GB0016833D0 (en) | 2000-07-07 | 2000-08-30 | Lee Helen | Improved dipstick assays (2) |
| US7465540B2 (en) | 2000-09-21 | 2008-12-16 | Luminex Corporation | Multiple reporter read-out for bioassays |
| CN1303221C (zh) * | 2003-01-27 | 2007-03-07 | 英科新创(厦门)科技有限公司 | 使用亲和放大的集成信号基团的靶核酸检测法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| FR2518755B1 (fr) * | 1981-12-23 | 1986-04-11 | Pasteur Institut | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissable par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
| CA1228811A (en) * | 1983-05-05 | 1987-11-03 | Robert G. Pergolizzi | Assay method utilizing polynucleotide sequences |
| CA1256005A (en) * | 1983-09-26 | 1989-06-20 | W. Peter Hansen | Sandwich hybridization method for nucleic acid detection |
| ZA849596B (en) * | 1983-12-12 | 1985-07-31 | Miles Lab | Hybridization assay with immobilization of hybrids by anti-hybrid binding |
| FR2558172B1 (fr) * | 1984-01-16 | 1986-06-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| CA1223222A (en) * | 1984-02-22 | 1987-06-23 | Nanibhushan Dattagupta | Immobilized nucleic acid-containing probes |
| FR2560298B1 (fr) * | 1984-02-28 | 1988-07-15 | Mors | Procede et dispositif de reglage avec precision de la chute de pression d'un fluide initialement sous pression elevee, tel qu'un fluide hydraulique par exemple alimentant un groupe hydraulique, et application du procede au dispositif dans un groupe ou une centrale hydraulique, en etant integre ou non, notamment a une table de machine ou a tout dispositif de support d'outillage |
| NZ211453A (en) * | 1984-03-22 | 1989-01-06 | Biotechnology Research Enterpr | Aryl azides, their preparation and use in the detection, localisation and isolation of polynucleotides |
| US4766062A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
-
1985
- 1985-01-02 FI FI850004A patent/FI72146C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-12-17 CH CH5378/85A patent/CH666696A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-20 GB GB08531414A patent/GB2169403B/en not_active Expired
- 1985-12-24 BE BE0/216059A patent/BE903937A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-12-27 JP JP60299797A patent/JPH0669400B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-27 NO NO855308A patent/NO166743C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-12-29 HU HU855030A patent/HU196453B/hu unknown
- 1985-12-30 DE DE19853546312 patent/DE3546312A1/de active Granted
- 1985-12-30 ZA ZA859895A patent/ZA859895B/xx unknown
- 1985-12-30 FR FR858519394A patent/FR2575493B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-30 RO RO121637A patent/RO94651B/ro unknown
- 1985-12-30 AT AT0376785A patent/AT397514B/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-30 IT IT23408/85A patent/IT1201514B/it active
- 1985-12-30 LU LU86238A patent/LU86238A1/fr unknown
- 1985-12-31 CA CA000498834A patent/CA1271705A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-31 IE IE333385A patent/IE58290B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-31 IL IL77489A patent/IL77489A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-12-31 AU AU51748/85A patent/AU561382B2/en not_active Expired
- 1985-12-31 NL NLAANVRAGE8503597,A patent/NL189427C/xx not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-01-02 SE SE8600011A patent/SE463212B/sv not_active IP Right Cessation
- 1986-01-02 DK DK000386A patent/DK164932C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO166743B (no) | Fremgangsmaate til identifikasjon av nukleinsyrer. | |
| US4563417A (en) | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes | |
| EP0163220B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies | |
| US4358535A (en) | Specific DNA probes in diagnostic microbiology | |
| US5200313A (en) | Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies | |
| DK175384B1 (da) | Forbedret fremgangsmåde til bestemmelse af nukleinsyrer samt reagenskombination og reagenssæt dertil | |
| US4816389A (en) | Probe for DNA and a process for the detection of "shigellae" and entero-invasive strains of Escherichia coli | |
| US5124444A (en) | Lactam-containing compositions and methods useful for the extraction of nucleic acids | |
| US5981171A (en) | Diagnostic assays using nucleic acid probes | |
| US7270982B2 (en) | Helicobacter pylori antigens in blood | |
| EP0146815B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes | |
| Dahlén et al. | Sensitive detection of genes by sandwich hybridization and time-resolved fluorometry | |
| Edberg | Principles of nucleic acid hybridization and comparison with monoclonal antibody technology for the diagnosis of infectious diseases. | |
| Stark et al. | Immunomagnetic separation and solid-phase detection of Bordetella pertussis | |
| EP0172153B1 (en) | Polynucleotide hybridization probes | |
| Nichols et al. | A rapid purification of T4 polynucleotide kinase using Blue Dextran-Sepharose chromatography | |
| Zwadyk et al. | Nucleic acid probes in clinical microbiology | |
| Fortass et al. | Diversity of luteoviruses infecting faba bean (Vicia faba L) in Morocco, and their detection by the polymerase chain reaction | |
| JPH0690793A (ja) | ラクトバチルス属細菌の検出方法 | |
| WO2000043546A9 (en) | Detection of drug resistant organisms | |
| Fortass et al. | by the polymerase chain reaction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |