SE463212B - Metod foer identifiering av nukleinsyror - Google Patents

Description

463 212 2 kommes inte en tillräcklig hybridisering på mindre än 12 timmar. När tvåstegs-sandwich-hybridisering (Dunn & Hassell, Cell. volym 12, p. 23-36, l977) genomföres erfordras en hybridiseringstid av minst 24 timmar.

Minst tvâ sonder användes företrädesvis vid metoden enligt uppfinningen. Sonderna är nukleinsyrafragment tillräckligt homologa till målnukleinsyran. Det är fördelaktigt, men inte nödvändigt, att sonderna är homologa till bindningsställena, vilka är belägna relativt nära varandra i nukleinsyran som skall identifieras. Sonderna behöver inte överlappa varandra.

Sonderna kan framställas syntetiskt eller semi-syntetiskt genom rekombinant-DNA-tekniker eller från nukleinsyror isole- rade direkt från naturen. Sonderna är även kommersiellt till- gängliga från flera källor. En sond kan vara bunden till en lämplig vektor. Den kan innehålla vektordelar eller vara fullständigt utan vektordelar.

Detektorsonden är märkt med en lämplig markör. Olika radio- aktiva isotoper eller radioaktivt märkta föreningar kan användas som markörer. Markörsubstansen kan även vara fluorescerande, luminiscerande, ljusemitterande, enzymatiskt eller immunologiskt påvisbar, etc. Markörer baserade på biotin och advidin eller streptavidin, lantanidkelater, ferritin och hemeföreningar och immunologiskt pâvisbara haptener såsom acetoxiacetylfluorenderivat (WO 8302286) kan omnämnas som exempel. Identifiering genom mediering av proteiner är även möjlig. Sättet enligt uppfinningen beror inte på den använda markören. Alla hittills kända markörsubstanser lämpliga för nukleinsyrahybridisering eller de som utvecklas i framtiden kan fritt appliceras till metoden.

Till den andra sonden, den s.k. infångningssonden är en kom- ponent med affinitet till en annan komponent bunden. Biotin - avidin eller streptavidin, tungmetallderivat - tiogrupper, olika homopolynukleotider, såsom poly dG - poly dC, poly dA - poly dT och poly dA - poly U är lämpliga affinitetspar. Men* _ 3 463 212 även andra affinitetspar kan användas, förutsatt att kompo- nenterna har tillräckligt stark affinitet till varandra.

Lämpliga affinitetspar finns bland ligander och konjugat som användes i de immunologiska metoderna.

Innan hybridiseringsreaktionen sker behandlas provet för att frigöra målnukelinsyrorna i enkelsträngad form i hybridise- ringslösningen. Hybridiseringen sker i en hybridiserings- blandning i vilken målnukelinsyrorna,_den märkta sonden och infångningssonden, när så erfordras, gjorts enkelstränga- de. Olika lämpliga buffertmedel kan användas som hybridise- ringslösningar. Hybridiseringen sker inom temperaturområdet O-80°C, men det är fördelaktigt att använda en temperatur av 65°C. Om hybridiseringslösningen innehåller formamid (40-55 %) kan en temperatur av 37°C användas. En timme är tillräcklig som hybridiseringstid.

När hybridiseringen sker spädes lösningen när så erfordras för att göra betingelserna fördelaktiga för affinitetsparet.

Därefter bringas blandningen i kontakt med den andra medlemmen av affinitetsparet. Affinitetskromatografikolonner, filter, plastytor, glasytor, etc. kan användas för att uppfånga upp- fångningssonden:målnukleinsyranzdetektorsondhybriden.

Bärarmaterialet i affinitetskolonnen kan exempelvis vara cellulosa, latex, polyakrylamid, dextran eller agaros. Dessa material kan även användas som suspension i ett teströr. Det är även fördelaktigt att använda teströr med den andra kompo- nenten av affinitetsparet fixerad till dess inre yta. Det är en nödvändig förutsättning för det valda materialet att det är möjligt att fixera en komponent med affinitet för komponenten bunden till infångningssonden till detta.

Om provet innehåller nukleinsyran som skall identifieras erhålles en infångningssond:målnukleinsyra:detektorsond-hybrid från hybridiseringen. Under fraktionering vidhäftar denna hyb- rid till bäraren. Den markör av fraktionen som vidhäftar till bäraren kan mätas enligt konventionella metoder direkt från 463 212 bäraren eller efter eluering från den eluerade lösningen.

Andra system, exempelvis fasextraktion eller magnetiska fält kan även användas istället för affinitetskromatografi i frak- tioneringen.

Sättet enligt uppfinningen beskrives mera detaljerat i följan- de exempel. Sättet enligt uppfinningen är inte beroende av nuklein- syrafragmenten som användes i exemplen.

Exempel l Identifiering av adenovirus-DNA från ett cellysat genom syran av homopolynukleotider Den använda detektorsonden är 125 I-märkt rekombinantfag mKTH 1206, som innehåller ett Bgl II-fragment av adenovirusgenomet från position 42 - 45,3 % på genmönstret av adenovirus typ 2.

Rekombinantfagen har deponerats vid depositionsinstitutionen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nummer DSM 2827.

Dess specifika aktivitet är 7 x 107 cpm/pg DNA. Sonden beskri- ves mera detaljerat i Ranki et al Gene 21, p. 77-85, 1983.

Den använda infångningssonden är rekombinantplasmiden pKTH 1202, som deponerats vid depositionsinstitutionen Deutsche Samm- lung von Mikroorganismen under nummer DSM 2824 och innefattar ett BamHI D-fragment av adenoviruset (mönsterposition 29 - 42 ) klonad i plasmiden pBR322. Rekombinantplasmiden pKTH 1202 (DSM 2824) fragmenterades med användning av restriktions- % enzymet Hae III och en poly A-svans bands till 3'-ändarna av fragmenten med användning av terminaltransferasenzym. Svansens längd mättes genom 3H-A-inkorporation. Längden var i medeltal ungefär 70 A-rester. Innan den användes denaturerades infång- ningssonden genom kokning.

Det använda provet bestod av adenovirus-infekterade A-549- celler. Cellerna inkuberades i 21 timmar efter infektionen.

Cellerna samlades och lyserades med användning av en 1%-íg natriumdodecylsulfatlösning. Lösningen innehöll ungefär 106 celler/ml. Dess viskositet sänktes genom sonikering. Iden- 465 212 tiskt behandlade icke-infekterade A-549-celler användes som kontroll. Innan hybridisering kokades provet i 5 minuter i 0,02M NaOH, kyldes till 0°C och neutraliserades med ättik- syra.

För testet kombinerades 500.000 cpm detektorsond, 50 ng in- fångningssond DNA och 10 pl prov i ett teströr. volymen justerades till 50 ul och den använda buffrade lösningen var 0,6M natriumklorid, 0,06M natriumcitrat, 0,02M natrium, fos- fat (pH 7,6) och 0,5 % natriumdodecylsulfat. Blandningen in- kuberades i en timme vid 65°C.

Efter hybridisering kyldes lösningen till +20°C och fick sakta rinna genom en kromatografikolonn med l ml oligo dT-cellulosa.

Lösningen som fick passera genom återvanns och kördes ännu en gång genom kolonnen. Därefter tvättades kolonnen med 20 ml av en lösning innehållande 0,l5M natriumklorid, 0,0l5M natrium- fosfat (pH 7,6) och 0,5 % natriumdodecylsulfat. Testad DNA frigjordes slutligen med användning av l ml 0,02M NaOH. Denna lösning återvanns och dess radioaktivitet bestämdes. 125 Resultat: I-aktivitet (cpm) 83-89, 1984.

Målnukelinsyra:infekterade celler Kontrollceller 5230 325 Exempel 2 Identifiering av DNA av Chlamydia trachomatis med hjälp av biotin-streptavidin Den använda detektorsonden var 1251-märkt rekombinantfag mKTH 1245, innehållande två BamHI - SalI DNA-fragment från klonen pKTH 1220, vilka tillsammans är bundna till Ml3mp8-vektorn.

Klonen pKTH 1220 har deponerats vid depositionsinstitutionen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under nummer DSM 2825 och beskrives i Palva et al FEMS Microbiology Letters 22, p. 463 212 6 Den använda infångningssonden var rekombinantplasmiden pKTH 1250. Denna plasmid består av 2,9 kb SalI - ClaI-fragment från plasmiden pKTH 1220 (DSM 2825) och av vektorn pAT 153. Biotin- molekyler bands kovalent till pKTH 1250 DNA med användning av den kända"nickïtranslationsmetoden (Rigby et al., J. Mol.

Biol. 113, p. 237-251, 1977) och biotin-ll-UTP som substrat (Bethesda Research Laboratories). Infångningssond-DNA kokades i en buffert innefattande 10 mM tris-Cl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 5 minuter innan användningen.

Målnukleinsyran var rekombinantplasmiden pKTH 1220 (DSM 2825).

Denna plasmid innehåller ungefär 10 kb av DNA-karaktäristiken av Chlamydia trachomatis, bunden till vektorn pBR322. Plasmi- den tjänar som en modell-DNA, representerande bakteriens genom-DNA. Innan användningen kokades plasmiden i 5 minuter i 0,02M NaOH varefter lösningen neutraliserades med ättiksyra.

Streptavidin, som användes som affinitetsmateríal, fixerades till CNBr-aktiverad Sepharose (Pharmacia) enligt Axen et al., Nature 214, p. 1302-1304, 1967.

För testet kombinerades 500.000 cpm sond, 50 ng infångnings- sond-DNA och 10 ng mål-DNA i ett teströr. Volymen justerades till 20 ul och buffertlösningen var samma som i exempel l.

Kontroll-DNA var kalvtymus-DNA.

Blandningen inkuberades i 60 minuter vid 65°C. Därefter tillsattes 500 ul av en buffertlösning med sammansättningen 0,lM tris-Cl, pH 7,5, 0,1M NaCl, 2mM MgC12, 0,05 % Triton x-100. Slutligen fraktionerades lösningen i en 0,2 ml strep- tavidin-Sepharose-kolonn. Kolonnen tvättades med 10 ml av ovannämnda buffert och 10 ml 0,0l5M natriumklorid, 0,015M natriumfosfat (pH 7,6), 0,5 % natriumdodecylsulfat (50°C).

Således vidhäftade det biotinylerade DNA till streptavidinen under det att det andra DNA passerade genom kolonnen. Den radioaktiva sonden vidhäftade endast som ett resultat av I hybridbildning. Den infångade radioaktiviteten bestämdes genom§ | ___» att hela kolonnen överfördes i ett räknerör av en gamma- 7 463 212 räknare. l25I-aktivitet (cpm) Resultat: Målnukleinsyra: ng pKTH 1220 10 ng kontroll-DNA 1350 115 Exempel 3 Identifiering av plasmiden pBR322 DNA med hjälp av ett anti- gen-antikropp-par Den använda detektorsonden är ett derivat av plasmiden pBR322 (kommersiellt tillgänglig från flera källor) från vilken PstI - Sa1I (3613 - 615) fragment avlägsnats. Plasmiden märktes med fotobiotin med användning av en känd metod (Forster et al., Nucleic Acids Res. 13, p. 745-761, 1985) och kommersiellt reagens (Bresa, Adelaide, Australien).

Den använda infångningssonden var DNA från en rekombinantfag Ml3mp11 i vilken pBR322 PstI - SalI-fragment introducerats.

DNA:et hade sulfonerats med användning av en känd metod (Orgenics Ltd., Yavne, Israel).

Provet var E. coli HBl0l, som bar plasmiden pBR322, vars mängd ökats med användning av kloramfenikolamplifiering (Maniatis et al., Molecular cloning, A laboratory manual, Cold Spring Har- bor Laboratory 1982). Bakteriecellerna lyserades med lysozym följt av kokning i NaOH som beskrivits i publikationen Palva, J. Clin. Microbiol. 18, p. 92-100, 1983.

Antisulfonmonoklonala antikroppar användes för att belägga polystyrenmikrotiterbrunnar enligt standardmetoder (McKearn, ii Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, ed. ¿ Kennett et al., Plenum Press 1980). ; F För testet kombinerades 5 x 106 lyserade E. coli-celler (både É med och utan pBR322) med 100 ng vardera av infångnings-DNA och: _ nu ___4 465 212 8 detektorsond i en 50 pl hybridiseringsblandning. Betingelserna var som i exempel l förutom att 5 % polyetylenglykol (PEG 6000) sattes till blandningen och natriumdodecylsulfatkoncen- trationen var 0,1 %. Efter hybridisering späddes lösningen till 250 ul genom tillsats av 0,02M natriumfosfat (pH 7,6), varefter lösningen överfördes till antikroppbelagda mikro- titerbrunnar. Detta följdes av inkubation i 2 timmar vid 37°C.

Brunnen tvättades därefter väl med en lösning innehållande 0,l5M natriumklorid, 0,02M natriumfosfat, pH 7,6 och 0,05% triton X-100. Närvaron av detektorsonden visualiserades genom tillsats av streptavidin (Bethesda Research Laboratories BRL), tvättning, tillsats av biotinylerad alkalifosfatas (BRL) och tvättning såsom beskrivits av Leary et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 80, p. 4045-4049,l983. Slutligen tillsattes 250 pl av en 35 mg/ml paranitrofenylfosfat (Sigma)-lösning i dietanol- aminbuffert (pH 10). Efter 60 minuter upphörde reaktionen och absorbansen mättes vid 410 nm.

BÉÉEÄÉÉÉ= A410 nm Målnukleinsyra: celler med pBR322 Celler utan pBR322 )2 0,15

Claims (8)

4-65 212 PATENTKRAV

1. Sätt för identifiering av nukleinsyror, k ä n n e - t e c k n a t därav, att minst två sonder, vilka är i samma lösningsfas, användes i en hybridiseringsmetod varvid detek- torsonden märkts med en detekterbar markör och till infång- ningssonden en medlem av ett affinitetspar fästats och att infångningssonden:målnukleinsyranzdetektorsondhybriden bildad i hybridiseringsreaktionen isoleras med hjälp av den andra medlemmen av affinitetsparet.

2. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att affinitetsparet är biotin-streptavidin eller biotin-avi- din.

3. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att affinitetsparet är ett homopolynukleotidpar. k n a t (D O

4. Sätt enligt patentkravet l och 3, k ä n n e t därav, att affinitetsparet är poly cD - dG.

5. Sätt enligt patentkravet l och 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att affinitetsparet är poly dA - poly dT.

6. Sätt enligt patentkravet l och 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att affinitetsparet är poly dA - poly U.

7. Sätt enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att affinitetsparet är ett tungmetallderivat - en tiogrupp.

8. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att affinitetsparet är en antigen - en antikropp.