JP2000502907A

JP2000502907A - 核酸分子を明らかにし、定量するための方法

Info

Publication number: JP2000502907A
Application number: JP9524744A
Authority: JP
Inventors: ベルトリング，ボルフ
Original assignee: ベルトリング，ボルフ
Priority date: 1996-01-08
Filing date: 1997-01-07
Publication date: 2000-03-14
Also published as: ATE222963T1; US6306592B1; EP0873427B8; WO1997025441A3; CA2241185A1; WO1997025441A2; DE19600362C2; EP0873427B1; EP0873427A2; DE19600362A1; DE59708066D1

Abstract

(57)【要約】この発明は、同一の、類似したまたは異なった配列の核酸（＝ＮＡ）分子の集団（Ｉ）内におけるＮＡ分子を明らかにし定量するための方法に関する。この方法では、ａ）未対合であるかまたは（ワトソンおよびクリックに従って）誤対合であるヌクレオチドがカルボジイミド化合物と化学反応性であるヘテロ二本鎖を形成し、ｂ）集団（Ｉ）に含有される一本鎖もしくは二本鎖リボ核酸（＝ＲＮＡ）分子または一本鎖デオキシリボ核酸（＝ＤＮＡ）分子を二本鎖ＤＮＡ分子の集団（ＩＩ）に変換し、ｃ）変性およびその後の再生を二本鎖ＤＮＡ分子の集団（ＩＩ）に対して行ない、それによりホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をもたらすようにする。明らかにされたＮＡ分子の定量化を可能にするために、工程ａとｂとの間および工程ｂとｃとの間に精製工程を行なうことが提案される。

Description

【発明の詳細な説明】核酸分子を明らかにし、定量するための方法この発明は、請求項１の前段部分に記載されている方法および当該方法を実施するための装置と、当該方法を実施するための複数の手段からなる構成物（comp osition）と、ヘテロ二本鎖の使用とに関する。分子生物学の重要な分野は、ほぼ相同な核酸類の混合物における配列の差異を明らかにすることに関する。差異を識別するためのＤＮＡ分子間の配列比較は、遺伝病などの表現型の相違の分子的基礎について知ることの一助となるだけでなく、感染においてたとえばウイルスの集団のようなＮＡ集団の連続的なモニタリングを可能にする。ＮＡ集団とは、同一の、類似したまたは異なる配列を有する複数のＮＡ分子を意味するものと解される。さらに、配列比較はまた、遺伝子工学により細菌またはウイルスの産物を生産する際、あるいは相同な配列の集団における微量の異なった配列の存在を検出するために、質を保証する指標としての役割を果たす。先行技術には配列の差異を追跡するためのいくつかの方法が知られている。最も困難であるとも言える方法は直接的な配列決定である。（Sanger F.,NjcklenS .,CoulsonA.R.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463 et seq.;Maxam A.M.,Gil bert W.,1977,Proc.Natl.Acad．Sci.USA 74,560-564）。この方法では、統計的に有意な数のＮＡ集団のそれぞれを突然変異の発生について試験することができない。サザン法（Southern E.M.,1975,J.Mol.Biol.98,503-517）またはノーザン法（Alwine J.C.,Kemp D.J.,Stark G.R.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5350 -5354）などの間接的ハイブリダイゼーション法の応用では大きな量的差異しか検出できない。リボ核酸（＝ＲＮＡ）−ＲＮＡヘテロ二本鎖またはＲＮＡ−デオキシリボ核酸（＝ＤＮＡ）ヘテロニ本鎖（R.M.Myers et al.,1985,Science 230, 1242-1246）に関するリボヌクレアーゼ保護アツセイ（D.J.Freeman,A.S.Juan,19 81,J.Gen.Virol.57,103-117; E.Winter et al.,1985,PNAS 82,7575-7579）などの方法はわずかに感度が高い。変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（＝ＰＣＲ）技術を採用し、かつ勾配ゲル中の分離を容易にする特異的なプライマーを使用することにより最近では著しく感度が高まっている。（V.C.Sheffield etal.,19 92,Biofedback 12,386-387）。反応産物を分離するためには異なった配列が適度な量で存在しなければならない。この方法のさらなる欠点は、突然変異体の分離および検出後に突然変異の部位が特定できないため、配列決定などのさらなる識別反応がその後必要とされる点である。ヒドロキシルアミンおよび四酸化オスミウムを使用した「化学開裂反応」には、毒性の化学薬品および複雑な手順を伴った多くの実験操作を要するという欠点がある。(R.G.H.Cotton,1989,Biochemistry263,１-10）。それらはまた、かなりの量の突然変異体が存在する場合にのみ機能する。さらに、この方法では特定の突然変異しか識別することができない。先行技術のさらなる方法は「一本鎖コンホメーション多形性」（ＳＳＣＰ）反応に基づく。この方法およびＤＧＧＥの両方が実施される（M Urita et al.,198 9,PNAS 86,2766-2770）。ＳＳＣＰ反応の欠点は、誤って陽性になった試料が識別されることである。この方法はまた、多量の突然変異体分子が存在する場合にはすべてのケースのうちの少なくとも１０％で失敗する。先行技術の他の方法では、特定の突然変異の存在を調べること、すなわち個々のヌクレオチドの存在または不存在を確認することしかできない（MAPREC:Chuma kov K.M., Powers L.B., Noonan K.F., Roninson L.B., Levenbook I.S.,1991,P roc.Natl．Acad.Sci.USA88,199-203）。カルボジイミドを使用する方法はこれまで実際には好んで用いられていない。これは当該物質の取扱いが難しく、この方法の感度が十分でないためである。 (D.F.Novack,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,586-590; A.Ganguly,1991,J.Bi o1.Chem.266,1235-1240; 公報［発行された明細書］DE 36 29 190 A1,A.Ganguly and D.J.Prockop,1993,Nucl.Acids Res.18No.13,3933-3939）。先行技術から公知であるさらなる方法（ＷＯ９３／０２２１６）はヘテロ二本鎖における「ミスマッチ」を検出するための方法である。第１の抗体によって結合される「ミスマッチ結合タンパク質」が使用される。この第１の抗体は次に第２の抗体によって認識される。、この方法もやはり実施するのに複雑であり、限られた範囲でしか採用することができない。総合的に見て、先行技術から公知である方法の主な欠点は、ＮＡ集団内に存在する最小量の突然変異体に対して感度が不足していることである。また、正体が明らかにされたＮＡ分子の定量化は不可能である。公知の方法のさらなる問題は過度に失敗率が高いことである。この発明の目的は、先行技術の欠点を克服する方法、装置および手段の構成物を提供することである。プロセスに関する目的は請求項１の特徴によって達成される。好都合な具体例は請求項２から２２の特徴から理解することができる。この発明による方法の利点は、特に、増幅されていないゲノムＤＮＡに適用できることである。さらなる顕著な利点は、単一の反応工程においてフラグメント内の突然変異の位置を特定できることである。さらに、相同な分子の集団において少量の突然変異核酸を検出することができる。５０％の突然変異体の割合までは、集団に存在する異なった配列を有する分子が常に増幅される。このため、この発明による方法はたとえば増幅されるＤＮＡの二次分析のために使用することができる。存在が明らかにされ識別された配列が既存のＮＡ集団の典型であるのか、または類似したＤＮＡの混入に由来し得るのかをこれにより検出することができる。ＰＣＲ法が適用された場合に検出反応にかなりの歪みをもたらす混入物を分子スケールで検出することもこれにより可能になる。このように、この発明による方法は、特にＰＣＲ法と組合せると飛躍的に改善された検出結果をもたらし得る。ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をカルボジイミド化合物と反応あせてカルボジイミド反応生成物をもたらすことができる。有利には、ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をＮＡ特異的酵素および補因子によって処理し塩基対の欠失を検出することが提供される。この方法の特に有利なさらなる具体例は、カルボジイミド化合物と反応したホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物を、好ましくは精製した後に、伸長反応、特にプライマー伸長反応に供することにある。伸長反応の生成物を最後に特徴付けかつ定量することができる。ここでは、慣用的な、たとえばＰＣＲ法が採用される。この発明による方法は、伸長反応が繰返して実施される場合に特に精度が高い。プライマーまたは伸長物は好ましくは標識される。標識されたオリゴヌクレオチドを使用することが特に有利であると考えられる。オリゴヌクレオチドは別個の工程で標識され得る。これにより、組込まれる標識を分けることができる。特に、サイズおよび特徴について選択されたオリゴヌクレオチドを使用することにより、この方法の特異性を高めることができる。この方法は精製工程がクロマトグラフィーによる精製法を含む場合に特に感度が高い。クロマトグラフィーによる精製法はシリカゲルまたはＤＥＡＥ材料などのマトリクスを使用して実施されるカラムまたはバッチ法とすることができ、これらのマトリクスはすべてイオン交換、アフィニティまたはサイズによる排除の原理に基づいた分離を可能にする。精製工程は特にシリカカラムを使用して実施され得る。ここでの利点は、先行技術で要求された、カルボジイミド残基の熱分解とエタノールによる抽出および沈殿とが不要となり得ることである。この発明によると、請求項１から２２のいずれかに記載された方法を実施するための装置と複数の手段からなる組成物とがさらに提供される。最終的に、この発明の目的は、同一の、類似したまたは異なる配列のＮＡ分子の集団内におけるＮＡ分子をその存在について明らかにし定量するためにヘテロ二本鎖を使用することによって達成される。以下の試験では、まず、この発明による方法の実施が、一般的な表現でＮＡ集団における突然変異の検出に関連してより詳細に説明される。カルボジイミドと反応させるためのヘテロ二本鎖の調製には、適当なプライマーを用いる増幅反応と、ＲＮＡの場合には、逆転写反応において予めｃＤＮＡを生成させることとが含まれる。反応生成物は、ゲルによって、好ましくは強度の高いポリアクリルアミドゲルであるゲルによって検出できるが、たとえばシリカカラムまたはシリカゲルカラム、ＨＰＬＣ（＝高速液体クロマトグラフィー）のような他のクロマトグラフィー法、または抗体によっても検出することができる。カルボジイミド処理の前または間に、たとえばタンパク質Ｍｕｔ−ＬまたはＭｕｔ−ｓなどの他の付加的な「ミスマッチ検出物質」をこの発明による方法に採用して、カルボジイミド誘導体の反応性を高めることができる。集団のそれぞれに対して逆転写および／または増幅が行なわれる場合には、その後のＤＮＡポリメラーゼによる酵素反応のため、それぞれ増幅または逆転写のためのプライマーの外側にないプライマーを選択することが好都合である。ホモ二量体を（ＰＣＲによって）増幅の後分析する場合には、結果物は所定の長さを有するプライマー伸長物となる。突然変異の存在によりヘテロ二本鎖が形成され、これは、カルボジイミドによって修飾されるヌクレオチドの特定の位置における形成をもたらし、さらにＤＮＡポリメラーゼによって終結されるべき鎖の複製を引起こす。突然変異の位置に依存して、結果物は特徴的な長さを有する終結物となり、この終結物は、その存在（たとえばカルボジイミドによって修飾されたヌクレオチドに対する抗体によって）またはその長さ（ゲル電気泳動またはＨＰＬＣのようなクロマトグラフィー法によって）に関するその後の分析において識別することができる。ＲＮＡ集団の分析は下記の工程を有する分析スキームによって説明することができる。 −適当なプライマーを用いて、一本鎖または代わりに二本鎖ＤＮＡが逆転写反応における後の工程のために提供されるか、調製されるが、得られるか、またはさもなくば獲得される。ＲＮＡから調製する場合には、高温で作用できる酵素を使用すると好都合であろう。後の工程において、適当なプライマーに補助されて既存の任意の一本鎖ＤＮＡから二重螺旋ＤＮＡが調製されるか、得られるか、またはさもなくば獲得される。 −二本鎖ＤＮＡ分子が増幅反応を受けてもよいが、受けなくてもよい。これはＰＣＲとして知られている反応であるか、またはたとえばポリメラーゼ鎖連結反応であるその派生法であってもよい。 −これらの予備的な処理を終了した後、二本鎖ホモ二量体のＤＮＡ分子が存在する。先に増幅が行なわれた場合でも、ホモ二量体の比は依然として、元の集団（Ｉ）において優勢な個々の配列変異体の比に対応する。ホモ二量体の二本鎖は後の変性工程において融解し、この変性工程は好ましくは適当な溶液中で温度を上昇させることによって行なわれる。好ましくは温度を低下させることによって引起こされる後の再生工程において、相同な一本鎖が対合して統計的にホモおよびヘテロ二本鎖をもたらす。元の集団（Ｉ）において異なった配列を有する個体の数が少ないほど、突然変異体一本鎖の各々がヘテロ二本鎖を形成すろ確率が高くなることを考慮に入れることが必要である。極端な場合、形成されるヘテロ二本鎖の数は元の集団（Ｉ）において異なった配列を有していた個体数の２倍である。 −次の工程は、突然変異検出タンパク質の存在または不存在下でヘテロ二本鎖ホモ二量体混合物をカルボジイミド誘導体と反応させることである。適当な濃度および緩衝剤の条件を選択した場合、カルボジイミド誘導体のホモ二量体との結合は起こらない。 −次いで、核酸およびカルボジイミド誘導体は、好ましくはシリカゲルカラムなどのカラムによってＮＡ反応物から分離される。さらなる工程において初期濃度にしてもよい、得られた精製反応物はここで後の酵素反応に利用できる。 −核酸テンプレートに結合されるプライマーを使用してこれらテンプレートの複製物を生成させるＤＮＡポリメラーゼが、トリホスフェートとして標識することができるヌクレオチドと、放射性標識することのできる適当なプライマーとが添加された適当な緩衝剤における混合物に添加される。カルボジイミド修飾の存在により、新たに複製されたＮＡ分子の鎖の伸長が終結し、これにより、配列変異の特定的な位置を決定するのに特徴的な長さを有する、好ましくは標識された反応物がもたらされる。放射性標識を付けられたオリゴヌクレオチドを使用すると感度を高めることができる。 −この複製物は後の反応または一連の反応において特徴付けることができる。反応のバッチは好ましくは強度の高いポリアクリルアミドゲルに適用されて分離され、これにより本来のおよび突然変異のＮＡ集団の長さおよび量の割合が同時に測定できる。しかしながら、反応生成物はＨＰＬＣ分析の使用などの他のクロマトグラフィー法によって分離および定量することもできる。状況によっては、カルボジイミドによって修飾されたヌクレオチドに対して特異的である抗体と反応生成物を反応させ、さらなる検出のためにそれらを調製することも有意義である。本来、抗体の結合は、反応生成物のサイズ測定をより困難にし得るが、これはしかし、特に他の抗体特異的抗体と関連して感度を高め得る。この発明による方法を実施するための２つの使用例を以下の本文において説明する。例１ヘテロ二本鎖とカルボジイミドとの反応ａ．）ＤＮＡヘテロ二本鎖の生成同じ長さを有し１つの位置においてのみ配列が異なる２つの核酸が反応バッチのために使用される。配列は弱毒化ポリオウイルス（灰白髄炎ウイルス）血清型３のヌクレオチド番号３９４から５７２の部分である。採用される２つの核酸の配列差異は位置４７２にある。ＮＡ集団のうち約９９％がこの位置にチミンを塩基として有し、１％はこの位置にシトシンを塩基として有し、いずれの場合もコード鎖上にある。両ＮＡ相違体は二本鎖の形態であり、通常の増幅反応によつて、すなわちＥＰ−Ａ−０２００３６２に記載されているＰＣＲ法によって増幅される。反応後、ＰＣＲの水相が５倍容量のＰＢ緩衝液と混合され、その後シリカゲルカラムを介して１５０００回転／分（＝ｒｐｍ）で１分間回転させる。次の工程において、シリカゲルカラムを７５０μｌの塩化グアニジン溶液（水１００ｍｌに対し３５ｇ）で洗浄し、１５０００ｒｐｍで１分問遠心分離機にかける。これによりシリカゲルカラムから残りのプライマーおよび二量体が除去される。その後７５０μｌのＰＥ洗浄緩衝液をシリカゲルカラムに適用し、これをさらに１分間回転させる。１分間遠心分離機にかけることによりシリカゲルカラム中の残留洗浄緩衝液を除去する。次にシリカゲルカラムを１．５ｍｌの反応容器に移し、１分間遠心分離機にかけることにより、シリカゲルカラムに結合したＤＮＡを５０μｌの水中に溶出させる。ｂ）ＤＮＡヘテロ二本鎖のカルボジイミド修飾２０μｌの溶出液をシリコンによって処理された「薄壁のチューブ」の中に移す。このときＤＮＡの存在量は４０ｎｇから５００ｎｇの範囲で変化する。その量は通常は１バッチにつき２００ｎｇである。１０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウム；３０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝液中の３５ｍＭＭｇＣｌ₂，ｐＨ７．４）と７０μｌの水とを添加した後、バッチには２滴の鉱油が塗布され、１００℃の水浴で１０分間変性され、その後直ちに氷上に移される。４２℃で１晩アニーリングが行なわれる。その後（グアニジン塩酸塩を含有する）５倍容量のＰＢ緩衝液を添加し、バッチを混合し１分間回転させる。この後シリカゲルカラムによって再度精製する。６０μｌのＴＥ（０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭトリス−ＨＣＬ，ｐＨ７．４）中に溶出が行なわれる。新たな２００ｍＭのカルボジイミド溶液（８４．７ｍｇ／ｍｌ）は、直前に調製される（ＣＭＥカルボジイミド：Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ−（２−モルホリノ−エチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート）。カルボジイミド溶液は、アニーリングによって形成された所要量のヘテロ二本鎖ＤＮＡ（２００− ２００ｎｇ）によって処理される。４μｌの１Ｍホウ酸ナトリウム溶液、ｐＨ８．０を添加した後、１０μｌのカルボジイミド溶液を添加し、混合物を３０℃で３時間インキュベートする。その後バッチを４０μｌの水に調合する。ｃ．反応混合物からの未結合のカルボジイミドの除去カルボジイミド修飾バッチを５倍容量のＰＢ緩衝液で処理し、混合し１分間回転させる。この後、別のカラム精製工程が行なわれ、この工程の間洗浄処理が３回繰返される。２６μｌのＴＥ（ｐＨ７．４）を使用し室温で１晩シリカゲルカラムからＤＮＡを溶出させる。その後シリカゲルカラムを１分間回転させる。例２カルボジイミド−抱合体−特異的プライマー伸長典型的なプライマー伸長バッチは、例１に記載した５μｌのヘテロ二本鎖ＤＮＡと５μｌのＰＣＲ混合物とを含み、このＰＣＲ混合物は０．４ｍＭの濃度のヌクレオチドＡ、ＧおよびＴと、２０μＭの濃度のヌクレオチドＣと、さらに１００μＣｉのＰ³²ｄＣＴＰとを含有する。プライマー伸長に必要な１００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドおよび５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼに加えて、１００μ１のバッチは、緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣＬ，ｐＨ８．３，３．５ｍＭＭｇＣｌ₂；７５ｍＭＫＣＬ）と、７μｇ／ｍｌの最終濃度のＢＳＡとをさらに含む。温度が９０℃に上昇したときにのみ、試料をパーキン−エルマーサイクラー４８０の中に導入する。１サイクルが行なわれた後、反応が終了する。その後試料は氷の上で貯蔵される。サイクルは、変性（９６℃で７０秒間）、その後のアニーリング反応（６２℃で３０秒間）、および伸長（７２℃で１分間）からなる。反応の終了後、５μｌの充填緩衝液（５０％スクロース，０．１ＭＥＤＴＡｐＨ８．０，０．１％ブロモフェノールブルー，０．１％キシレンキシラノール）が添加され、バッチは氷の上で貯蔵される。その後１０％ＰＡＡゲルに８μｌのアリコートが適用される。Ｘ線フィルムを重ねるか、またはリン造影剤中で露光することにより検出を行なうことができ、これにより定量化が容易になる。上記の例において説明した方法はフローチャートの形式の図面に示される。例として選択された元の集団は、弱毒化（＝ａｔｔ）ＲＮＡウイルス９９％と突然変異（＝ｍｕｔ）ＲＮＡウイルス１％とからなるＲＮＡ集団であった（参照番号１）。逆転写２の後、ｃＮＤＡ３が同じ割合で形成される。さらなる工程において、このｃＤＮＡは３０サイクルにわたるＰＣＲ反応４によって増幅される。弱毒化増幅物と、突然変異増幅産物との比は依然として９９：１％である（参照番号５）。最後の変性／再生工程６ではその間にＤＮＡポリメラーゼ活性が排除され、このときホモおよびヘテロ二本鎖７は新たな比で存在する。このホモおよびヘテロ二本鎖７の混合物はここでカルボジイミド８と反応させられ、精製後にプライマー伸長反応９を受ける。次の工程はマーカーの適用１０である。標識された反応生成物１１がゲル電気泳動１２によって最終的に分析される。得られるパターンの図には、マーカーＭの他に、純粋なホモ二本鎖のバッチ、混合されたヘテロ／ホモ二本鎖のバッチ、および純粋なヘテロ二本鎖のバッチの分析が示される。参照番号１３はマーカーの適用を示し、参照番号１４は１００％弱毒化ＮＡの第１の対照レーンを示し、参照番号１５は分析の適用を示し、参照番号１６は１００％突然変異ＮＡの第２の対照レーンを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月１４日（１９９８．１．１４）【補正内容】請求の範囲１．同一の、類似したまたは異なった配列の核酸（ＮＡ）分子の集団（Ｉ）内における核酸分子を明らかにし、定量するための方法であつて、ａ）前記集団（Ｉ）に含有される一本鎖もしくは二本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）分子または一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮΛ）分子を二本鎖ＤＮＡ分子の集団（ＩＩ）に変換し、ｂ）変性およびその後の再生を前記二本鎖ＤＮＡ分子の集団（ＩＩ）に対して行ない、それにより、ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をもたらすようにし、ｃ）未対合であるかまたは（ワトソンおよびクリックに従って）誤対合であるヌクレオチドが存在する前記集団（ＩＩ）に形成されたヘテロ二本鎖をカルボジイミド化合物と化学反応させ、ｄ）得られるカルボジイミド反応生成物を分析し、前記工程ａからｄの各々の間にクロマトグラグィーによる精製法を行なうことを特徴とする、方法。２．前記クロマトグラフィーによる精製法が、シリカゲルを使用して行なわれるカラム法またはバッチ法であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．前記精製工程がシリカカラムを使用して行なわれることを特徴とする、請求項１および２のいずれかに記載の方法。４．Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、ジメチルアジピミデート、ピロメリトジイミド、Ｎ，Ｎ−ビス（２，６−ジメチルフェニル）ペリレン−３，４，９−テトラ−カルボキシジイミド、ビス（トリメチルシリル）−カルボジイミド、Ｎ，Ｎ−ジ−ｔ−ブチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ −−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピル−カルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロフピル）−Ｎ−エチル−カルボジイミド、Ｎ，Ｎ−ジトリデシルペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボキシジイミド、ジメチルピメリミデート、ジメチルオクタニミデートおよび１−エチル−３− （３−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド）の１つまたはそれ以上を前記カルボジイミド化合物として使用することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。５．前記ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物がＮＡ特異的酵素および補因子とともに処理され、不足する塩基対を認識することを特徴とずる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。６．前記ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物を、好ましくは「ミスマッチ認識タンパク質」を添加して前記カルボジイミド化合物と反応させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。７．前記集団（ＩＩ）が、前記工程ｃの前に１つまたはそれ以上の増幅工程を受けることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。８．前記工程ｄにおいて、前記カルボジイミド化合物と反応した前記ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物が伸長反応を受け、伸長物が、特徴付けられかつ定量されることを特徴とする、請求項４から７のいずれかに記載の方法。９．前記伸長反応がプライマーなしで行なわれることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。１０．プライマー伸長反応が行なわれることを特徴とする、請求項８に記載の方法。１１．修飾されたまたは修飾されていない形態のオリゴヌクレオチドが、前記伸長反応に使用されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。１２．プライマーまたは伸長物が、標識されているが、または標識されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。１３．前記伸長反応が繰返して行なわれることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。１４．前記カルボジイミド反応生成物の検出が、先に伸長反応を行なうことなく行なわれることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。１５．前記カルボジイミド反応生成物が、カルボジイミド特異的抗体によって認識されることを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。１６．同一の、類似したまたは異なった配列のＮＡ分子の集団内におけるＮＡ分子を明らかにし、定量するためのヘテロ二本鎖の使用。

Claims

【特許請求の範囲】１．同一の、類似したまたは異なった配列の核酸（ＮＡ）分子の集団（Ｉ）内における核酸分子を明らかにし、定量するための方法であって、ａ）未対合であるかまたは（ワトソンおよびクリックに従って）誤対合であるヌクレオチドがカルボジイミド化合物と化学反応性であるヘテロ二本鎖を形成し、ｂ）集団（Ｉ）に含有される一本鎖もしくは二本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）分子または一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を二本鎖ＤＮＡ分子の集団（ＩＩ）に変換し、ｃ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団（ＩＩ）に対して変性およびその後の再生を行ない、これによりホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をもたらし、前記工程ａとｂとの間および前記工程ｂとｃとの間にそれぞれ精製工程を行なうことを特徴とする、方法。２．前記二本鎖ＤＮＡ分子の集団（ＩＩ）が存在することを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。３．前記集団（ＩＩ）が、前記工程ｃの前に１またはそれ以上の増幅工程を受けることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。４．前記ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物を、好ましくは「ミスマッチ認識タンパク質」を添加して前記カルボジイミド化合物と反応させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。５．前記ＮＡ分子が二本鎖の形態であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。６．前記ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子が、前記カルボジイミド化合物と反応してカルボジイミド反応生成物をもたらすことを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。７．前記ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物が、ＮＡ特異的酵素および補因子とともに処理され、不足する塩基対を認識することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。８．前記カルボジイミド化合物と反応した前記ホモおよびヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の混合物が、好ましくは精製工程の後に、仲長反応、特にプライマー伸長反応を受けることを特徴とする、請求項４から７のいずれがに記載の方法。９．前記伸長反応物が特徴付けられ定量されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。１０．前記Ｎ−シクロヘキシル-Ｎ′−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、ジメチルアジピミデート、ピロメリトジイミド、Ｎ，Ｎ′−ビス（２，６− ジメチルフェニル）ペリレン−３，４，９−テトラ−カルボキシジイミド、ビス（トリメチルシリル）−カルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジ−ｔ−ブチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′エチル−カルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−ジトリデシルペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボキシジイミド、ジメチルピメリミデート、ジメチルオクタニミデートおよび１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピルカルボジイミドの１つまたはそれ以上を前記カルボジミド化合物として使用することを特徴とする、請求項１から９のいずれかに記載の方法。１１．前記伸長反応にＤＮＡポリメラーゼが使用されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。１２．修飾されたまたは修飾されていない形態のオリゴヌクレオチドが前記伸長反応に使用されることを特徴とする、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。１３．前記仲長反応が繰返して行なわれることを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。１４．プライマーまたは伸長物が標識されているか、または標識されることを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。１５．カルボジイミド反応生成物が、カルボジイミド特異的抗体によって認識されることを特徴とする、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。１６．カルボジイミド反応生成物の検出が、先に伸長反応を行なうことなく行なわれることを特徴とする、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。１７．前記伸長反応にＲＮＡ特異的ＲＮＡポリメラーゼが採用されることを特徴とする、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。１８．前記伸長反応がプライマーなしに行なわれることを特徴とする、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。１９．ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが前記伸長反応に使用されることを特徴とする、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。２０．前記精製工程がクロマトグラフィーによる精製法を含むことを特徴とする、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。２１．前記クロマトグラフィーによる精製法が、シリカゲルを使用して行なわれるカラム法またはバッチ法であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。２２．前記精製工程がシリカカラムを使用して行なわれることを特徴とする、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。２３．請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施するための装置。２４．請求項１から２２のいずれかに記載の方法を実施するための複数の手段からなる組成物。２５．同一の、類似したまたは異なった配列のＮＡ分子の集団内におけるＮＡ分子を明らかにし、定量するためのヘテロ二本鎖の使用。