JPH05192176A

JPH05192176A - β−ロドマイシノンの製造法

Info

Publication number: JPH05192176A
Application number: JP20899691A
Authority: JP
Inventors: Osamu Shiromichi; 修城道; Hiroshi Tone; 弘刀根; Rokuro Okamoto; 六郎岡本
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1991-05-17
Filing date: 1991-05-17
Publication date: 1993-08-03

Abstract

(57)【要約】【目的】抗腫瘍剤の原料として使用されることが期待
されるβ−ロドマイシノンを微生物培養物から、純度の
高い粉末として効率良く製造する方法を提供する。【構成】 β−ロドマイシノングリコシドを生産する能
力を有する微生物、例えば、ストレプトマイセス・ビオ
ラセウスＡ２６２ＳＣ−７（ＦＥＲＭＢＰ−１３３
１）を栄養培地で培養し、（Ａ）培養物を酸性条件下、
４０℃以下で処理する工程、（Ｂ）微生物菌体を除去す
る工程、（Ｃ）菌体除去液を酸性条件下、加熱処理する
工程、の各工程を行った後、β−ロドマイシノンを採取
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、β−ロドマイシノンの
製造法に関し、さらに詳しくは、式

【化１】で示されるβ−ロドマイシノンを、アグリコンとして有
するアントラサイクリン（β−ロドマイシノングリコシ
ド）を生産する微生物の培養物からβ−ロドマイシノン
を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】β−ロドマイシノンをアグリコンとして
有するアントラサイクリン系抗生物質は、優れた抗腫瘍
性を示すことが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３９（７），９０２〜９０
９，１９８６、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｓ，３６（８），１０８０〜１０８３，１９８３、
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４０
（１）１１６〜１２１，１９８７など）、β−ロドマイ
シノンを製造原料とした抗腫瘍剤の開発が期待されてい
る。これらの公知文献にはβ−ロドマイシノンを取得す
る方法が示されており、β−ロドマイシノングリコシド
を生産する能力のある微生物を栄養培地に接種し、培養
した後、得られた培養液からβ−ロドマイシノングリコ
シドを精製し、さらに酸性条件下で加熱加水分解するこ
とによりβ−ロドマイシノンを得ると記載されている。
しかしβ−ロドマイシノングリコシドを精製する必要が
あるため、簡単にβ−ロドマイシノンを得ることはでき
なかった

【０００３】また、上記培養液を酸性条件下でそのまま
加熱加水分解してもβ−ロドマイシノンを得ることがで
きるが、得られた加水分解物には不純物が多く含まれ、
通常、アセトン抽出、クロロホルム抽出、ヘキサン沈殿
等行うが、純度の高いβ−ロドマイシノンを得るために
はさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の精製
手段を加える必要があり、精製のために多大の労力を必
要とする。また、ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．Ｃｈｅ
ｍ．，（１０），９４９〜９５３，１９８８およびＣｈ
ｅｍ．Ｂｅｒ．，１１３（９），２９７６〜２９９３，
１９８０には、β−ロドマイシノンの合成法が記載され
ている。これらの合成法によるβ−ロドマイシノンの製
造も工程数が多く収率も高くないため、いずれも工業的
に充分なものとはいえない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、優れた抗腫
瘍作用を有するアントラサイクリン系抗生物質の合成中
間体となり得るβ−ロドマイシノンの簡便な製造法を提
供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、β−ロド
マイシノンの製造法を鋭意研究した結果、アグリコンと
してβ−ロドマイシノンを有するアントラサイクリン
（β−ロドマイシノングリコシド）を生産する微生物の
菌体を、加熱することなく酸性条件下で処理すると、β
−ロドマイシノングリコシドが選択的に上清に移行する
ことを見出だした。また、この処理液から遠心分離等に
より菌体を除去して得たβ−ロドマイシノングリコシド
溶液を、そのまま、または必要により精製操作を加えた
後、さらに酸性条件下で加熱加水分解することにより、
純度の高いβ−ロドマイシノンが容易に得られることを
見出だし、本発明を完成した。

【０００６】本発明の方法に使用できる微生物は、β−
ロドマイシノングリコシドを生産する微生物であればと
くに制限はないが、その中でアグリコンとしてβ−ロド
マイシノンを相対的に多く生産する微生物が特に好適で
ある。このような微生物として、ストレプトマイセス・
ビオラセウスＡ２６２ＳＣ−７株が挙げられる。本菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１
３３１号（ＦＥＲＭＢＰ−１３３１）として寄託され
ている。

【０００７】以下にＳＣ−７菌株の菌学的性状を示す。（Ｉ）形態良く分枝した基中菌糸より、螺旋状の気中菌糸を形成
し、輪生枝は認められない。成熟した胞子鎖は１０〜５
０ヶの胞子の連鎖を認める。胞子の表面はとげ状であ
る。（ＩＩ）各種培地における生育状態色の記載について（）内に示す標準は、Ｈ．Ｄ．Ｔｒ
ｅｓｎｅｒ＆Ｅ．Ｊ．Ｂａｃｋｕｓ著、Ｓｙｓｔｅ
ｍｏｆｃｏｌｏｒＷｈｅｅｌｓｆｏｒＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｔｅＴａｘｏｕｏｍｙ（Ｊ．Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１巻３３５〜３３８頁、１
９６３年）を用い、補足的に日本色彩研究所出版の「色
の標準」を用いた。各種培地における生育状態を表１に
示す。

【０００８】（ＩＩＩ）生理的性質（１）生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地（ｐＨ
６．０）、２０℃、２８℃、３３℃、３７℃、４２℃の
各濃度で実験）：２０〜３７℃で生育が認められた。（２）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン・ゼラチ
ン培地、２０℃培養）：僅かに陽性（３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培
地）：陽性（４）脱脂牛乳の凝固及びペプトン化：僅かに凝固、及
びペプトンは陽性（５）メラニン様色素の生成（トリプトファン・イース
トエキス・鉄寒天培地）：陽性

【０００９】（ＩＶ）各種炭素源の利用性（フリードハム・コドリーブ寒天培地）^＊：Ｌ−アラビノース＋ ^＊＋はよく発育Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース＋シュクロース＋イノシトール＋Ｌ−ラムノース＋ラフィノース＋Ｄ−マンニット＋

【００１０】本発明によるβ−ロドマイシノンの製造に
使用する菌株の培養は、放線菌の栄養源として通常使用
されるそれ自体公知の培地組成中で行うことができる。
例えば、炭素源としてはグルコース、グリセリン、シュ
クロース、澱粉、マルトース、動植物油などが使用で
き、窒素源としては、大豆粉、肉エキス、酵母エキス、
ペプトン、コーンスティープリカー、綿実粕、魚粉など
の有機体窒素並びに硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウムなどの無機体
窒素が使用できる。また必要に応じて食塩、塩化カリウ
ム、リン酸塩、その他マグネシウム、カルシウム、亜
鉛、鉄、銅、マンガンあるいはニッケルなどの２価金属
塩及びアミノ酸やビタミン類を添加するほか、発酵中の
発泡を抑制するため、例えばシリコーン等の各種市販消
泡剤を適宜添加することもできる。

【００１１】温度、ｐＨ、通気撹拌および発酵時間など
の発酵条件は、用いられる菌株が最大量のβ−ロドマイ
シノングリコシドを蓄積するように選択する。例えば、
温度は、２０〜４０℃、好ましくは２８℃、ｐＨは５〜
９、好ましくは６〜７において、発酵時間は３〜１０日
間、好ましくは６〜７日間で発酵を行うのが有利であ
る。

【００１２】このようにして得られた培養液からβ−ロ
ドマイシノンを採取するには、以下の操作を行えばよ
い。発酵終了後の培養液に濃塩酸、濃硫酸、濃リン酸等
の酸を加えてｐＨを２．０以下、好ましくはｐＨ０．６
〜１．４としたのち、およそ５〜１２０分、好ましくは
１０分間、４０℃以下、好ましくは２０〜３０℃で撹拌
することにより、微生物菌体からβ−ロドマイシノング
リコシドを菌体外へ移行させる。これを遠心分離するか
または硅藻土のような適当な▲ろ▼過助剤の存在下で▲
ろ▼過することにより、菌体と上清または▲ろ▼液に分
離する。

【００１３】このようにして得られたβ−ロドマイシノ
ングリコシドを含む上清または▲ろ▼液に濃塩酸、濃硫
酸、濃リン酸等の酸を加えて再度ｐＨを２．０以下、好
ましくはｐＨ０．６〜１．４に調整し、これを８０〜９
０℃でおよそ０．５〜３時間、好ましくは１時間維持す
ることにより、β−ロドマイシノングリコシドを分解し
β−ロドマイシノンを生成させる。このようにして得ら
れたβ−ロドマイシノン溶液からβ−ロドマイシノンを
回収するためには、公知の精製法を用いればよく、例え
ば、クロロホルム等の有機溶媒により抽出すれば、高純
度のβ−ロドマイシノンを得ることができる。

【００１４】また、上記のβ−ロドマイシノングリコシ
ドを含む上清または▲ろ▼液にあらかじめ精製操作を加
えてから加熱処理を行えば、さらに純度の高いβ−ロド
マイシノンを回収することができる。この場合に用いる
ことのできる精製操作として、ゲル▲ろ▼過、イオン交
換クロマトグラフィー、吸着樹脂、分配クロマトグラフ
ィー等が挙げられるが、とくに非イオン性の多孔性スチ
レン系樹脂を用いる方法が好適である。

【００１５】非イオン性の多孔性スチレン系樹脂として
は、スチレン−ジビニルベンゼンの共重合体からなり、
β−ロドマイシノングリコシドを吸着し得るものであれ
ば樹脂の種類を問わないが、該抗生物質の吸着に選択性
を付与するためには、前記共重合体の比表面積が１５０
〜１０００ｍ^２／ｇの範囲で、かつ気孔率４０〜６５％
および最多頻度細孔径１０〜１０００オングストローム
並びに骨格密度１．０５〜１．２６ｇ／ｍｌが好適に用
いられる。

【００１６】この種の吸着剤の例としては、商品名ダイ
ヤイオンＨＰ−１０、同ＨＰ−２０、同ＨＰ−３０、同
ＨＰ−４０及び同ＨＰ−５０（それぞれの比表面積５０
１．３ｍ^２／ｇ、７１８ｍ^２／ｇ、５７０ｍ^２／ｇ、７
０５ｍ^２／ｇ及び５９０ｍ^２／ｇ：最多頻度細孔径２０
０〜１０００オングストローム）（三菱化成工業株式会
社製）並びにアンバーライトＸＡＤ−２及びＸＡＤ−４
（それぞれの比表面積３００ｍ^２／ｇ及び７８４ｍ^２／
ｇ：最多頻度細孔径９０オングストローム及び５０オン
グストローム）（ローム・アンド・ハース社製）が挙げ
られる。

【００１７】本発明の方法において、上記樹脂にβ−ロ
ドマイシノングリコシドを吸着させた後、これからのβ
−ロドマイシノングリコシドの溶出に用いられる溶剤と
しては、アセトン、メタノール、アセトニトリル、ジメ
チルスルホキシドなどの溶媒またはこれらと水の混合物
の混合比を適宜調整して用いるのがよいが、水−有機溶
媒の系で、有機溶媒の含有率が直線的に増大する、いわ
ゆるグラジエント法によるのが、発酵培養液のような多
成分系から分離回収する場合には望ましい。

【００１８】このようにして得られた溶出液は、蒸留等
の操作で有機溶媒を除いた後、上記のとおり、酸を添加
し、ｐＨを２．０以下、好ましくはｐＨ０．６〜１．４
に調整し、これを８０〜９０℃でおよそ０．５〜３時
間、好ましくは１時間維持することにより、β−ロドマ
イシノングリコシドを分解しβ−ロドマイシノンを生成
させればよい。以下に本発明を実施例および比較例によ
りさらに詳細に説明する。

【００１９】

【実施例】

【実施例１】ＹＳ培地（０．３％酵母エキス、１％可溶
性デンプン、１．５％寒天、ｐＨ７．２）よりなる寒天
斜面培地に維持させたストレプトミセス・ビオラセウス
Ａ２６２、ＳＣ−７菌株（微工研条寄第１３３１号）の
一白金耳を、予め１２１℃、２０分で殺菌し５００ｍｌ
容三角フラスコに分注した下記の組成の種母培地１００
ｍｌに接種した。

【００２０】これをロータリーシェーカー（２２０ｒｐ
ｍ）にて、２８℃で２日間振盪培養して種母を調製し
た。種母培地可溶性デンプン０．５％グルコース０．５％大豆粉（エスサンミート、味の素社製）１．０％酵母エキス０．１％食塩０．１％第二リン酸カリ０．１％硫酸マグネシウム０．１％水道水ｐＨ７．４（殺菌前）

【００２１】次いで、１０ｌ容ジャーファーメンターに
下記組成の生産培地５ｌを入れ、１２１℃、２０分で殺
菌した後、上記種母培養液２００ｍｌを添加した。生産培地可溶性デンプン５．０％エスサンミート（前出）３．０％酵母エキス０．２％食塩０．２％炭酸カルシウム０．３％ミネラル溶液^＊０．２％水道水ｐＨ７．０（殺菌前）^＊ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ２．８ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏ０．４ｇ，ＭｎＣｌ_２．４Ｈ_２Ｏ３．２ｇ，Ｚ
ｎＳＯ_４。・２Ｈ_２Ｏ０．８ｇを蒸留水５００ｍｌに
溶解した。

【００２２】通気量２．５ｌ／分、撹拌３５０ｒｐｍ、
２８℃で６日間培養した。培養液５ｌを回収し、同量の
水を加えた後、４Ｎ塩酸を添加してｐＨを１．０に調整
した。室温にて１０分間撹拌したのち、遠心操作にて菌
体と上清を分離した。遠心上清のみを、予め酸性水（ｐ
Ｈ１．５）で満たされた吸着樹脂のカラム（φ６０×３
００ｍｍ、ダイヤイオンＨＰ−２０、三菱化成工業社
製）に通してアントラサイクリン化合物を吸着させ、２
ｌの酸性水（ｐＨ１．５）及び１ｌの１５％アセトン水
（ｐＨ１．５）で洗浄後、６０％アセトン水で溶出させ
た。

【００２３】溶出液約１ｌを真空下にて濃縮してアセト
ンを除去し、６Ｎ塩酸でｐＨ１．０に調整した後、６０
分間、８５℃に維持する。生成したβ−ロドマイシノン
をクロロホルム３ｌで抽出し、約２５０ｍｌまで濃縮し
た後、過剰のｎ−ヘキサンを添加して抽出物を沈殿させ
た。これを真空下にて、２４時間乾燥させることにより
β−ロドマイシノンの赤だいだい色の粉末８５０ｍｇを
得た。得られた粉末を下記の液体クロマトグラフィーに
よる分析系で純度分析したところ、β−ロドマイシノン
の含量は６１０ｍｇ（純度７１．３％）であった。

【００２４】液体クロマトグラフィー分析系カラム逆相系カラムＡ３１２（ＯＤＳ）（山村科学社製）移動相アセトニトリル／水＝３５／６５（リン酸でｐＨを２．０に調整する）流速１．０ｍｌ／分検出２５４ｎｍサンプル濃度約２００μｇ／ｍｌサンプル注入量１０μｌ

【００２５】比較例実施例１と同様に調製したストレプトミセス・ビオラセ
ウスＡ２６２、ＳＣ−７菌株の培養液５ｌに４Ｎ塩酸を
添加してｐＨを１．０に調整した。８０℃にて６０分間
撹拌したのち、遠心操作にて菌体と上清を分離した。沈
殿した菌体にアセトン２．５ｌを加え、室温で１０分間
攪拌した後、遠心操作にて菌体と上清を分離し、アセト
ン層にβ−ロドマイシノンを抽出した。アセトン１．２
５ｌを用いて再度同様の操作を行い、アセトン抽出液を
得た。

【００２６】抽出液を併せ、真空下にて濃縮しアセトン
を除去した後、クロロホルム２．５ｌと１．２５ｌを用
い、β−ロドマイシノンを２回抽出した。クロロホルム
抽出液を併せ、約２５０ｍｌまで濃縮した後、過剰のｎ
−ヘキサンを添加して抽出物を沈殿させた。これを真空
下にて、２４時間乾燥させることによりβ−ロドマイシ
ノンの茶褐色の粉末１９５０ｍｇを得た。得られた粉末
を前記の液体クロマトグラフィーによる分析系で純度分
析したところ、β−ロドマイシノンの含量は９４５ｍｇ
（純度４８．５％）であった。

【００２７】

【化１】

【００２８】

【表１】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 β−ロドマイシノングリコシドを生産す
る能力を有する微生物を培地で培養し、培養物からβ−
ロドマイシノンを採取する方法において、（Ａ）培養物を酸性条件下、４０℃以下で処理する工程（Ｂ）微生物菌体を除去する工程（Ｃ）菌体除去液を酸性条件下、加熱処理する工程の各工程を含むことを特徴とするβ−ロドマイシノンの
製造法