JPH0576958B2

JPH0576958B2 -

Info

Publication number: JPH0576958B2
Application number: JP61079264A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Yoshimoto; Osamu Shiromichi; Yoshio Watanabe; Tomoyuki Ishikura; Tsutomu Sawa; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1986-04-08
Filing date: 1986-04-08
Publication date: 1993-10-25
Also published as: JPS62238298A; US4897470A; DE3761142D1; EP0242695A1; EP0242695B1

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は制がん作用を有する新規なアントラサ
イクリン抗生物質に関する。従来の技術制がん性アントラサイクリン系抗生物質として
は、従来から放線菌の培養液から得られるダウノ
マイシン（米国特許第3616242号明細書参照）及
びアドリアマイシン（米国特許第3590028号明細
書参照）が知られており、これらの化合物は実験
腫瘍に対して広域抗がんスペクトルを有し、がん
化学療法剤として臨床的にも広く利用されてい
る。しかし、ダウノマイシン及びアドリアマイシ
ンはかなり強い抗がん作用を示すが、一方重篤な
心毒作用などの副作用も強く、制がん剤として決
して満足できるものではない。そのため、発酵
法、半合成法、微生物変換法など各種の手段によ
り、更に、いくつかのアントラサイクリン抗生物
質が提案されている。例えば、〔特公昭51−34915
号公報（アクラシノマイシンＡ及びＢ）、ジヤー
ナル・オブ・アンテイビオテクス（Jornal of
Antibio Tics）、vol.33、第1331〜1340頁、トオ
ピツクス・イン・アンテイビオテイツク・ケミス
トリー（Topics in Antibiotic Chemistry）、
vol.12、第102〜279頁（Ellis Horwood Limited
発行）、特開昭57−56494号公報（４−デメトキシ
−11−デオキシダウノマイシン等）、特開昭56−
15299号（ロドマイシン群抗生物質）等参照〕で
開示されている。発明が解決しようとする問題点抗腫瘍剤としてのアントラサイクリン抗生物質
は、上述の如く、各種の類縁化合物が提案され、
既に一部は臨床的に広く利用されているものもあ
り、また臨床試験に供されているものもある。し
かし、毒性、抗がん作用双方について共に満足で
きるものはない。しかも、抗腫瘍剤は、試験管内
試験、動物試験の結果が必ずしも直接ヒトの抗が
ん作用に相関しないため、多角的な研究が要求さ
れる。そのため抗腫瘍剤として一応の評価がされ
ているアントラサイクリン抗生物質類について、
更に臨床薬として有効な、新たな部類に属する化
合物の提案が望まれている。問題点を解決するための手段本発明者等は、より有用なアントラサイクリン
抗生物質又はその合成中間体となり得る新規化合
物を提案すべく研究を重ねた結果、先に新規アン
トラサイクリン抗生物質D788−６〜10生産菌と
して提案したストレプトミセス、スピーシス
（Streptomyces sp.）D788、RPM−５菌株
（FERMP−7703号、特開昭61−33194号公報参
照）から単離した色素非乃至劣生産性菌株の栄養
培地中または該培養液中に式

【化】Ｒが水素原子を表わすか、または水酸基を表わ
す、で示されるアントラサイクリン（式中、Ｒが水
素原子を表わす化合物をα−シトロマイシノン、
およびＲが水酸基を表わす化合物をβ−イソロド
マイシノンと呼ぶ）を添加培養し、Ｒがそれぞれ
対応する式

【化】式中、Ｒが水素原子を表わすか、または水酸基
を表わす、で示される新規なアントラサイクリン抗生物質を
生産することを見出し、本発明を完成した。これらの化合物は、いずれも、ロドマイシン系
アグリコンとダウノサミンからなる従来の文献に
未載の新規アントラサイクリン化合物で、本発明
者らが単離した特異な菌株を使用する微生物変換
法により初めて得られたものである。以下、式
（）で示される化合物のうち、式

【化】で示される抗生物質をDCP−１式

【化】で示される抗生物質をDCP−２と称する。これらの化合物は、それぞれ培養マウス白血病
細胞L1210に対して強い増殖阻止作用を有し、そ
れ自体制がん剤として有用である。マウス白血病L1210培養細胞に対する増殖及び核
酸合成阻害作用例えば、20％仔牛血清を含むRPM11640培地
（ローズウエルバーグ研究所）へL1210細胞を５
×10⁴ケ／ml接種し、これに本発明の物質を
0.0005〜0.25μｇ／mlの濃度で添加し、37℃にて
炭酸ガス培養器中で48時間培養し対照区に対する
50％増殖阻害濃度を求めた。なお、本発明に物質
の添加は、Ｍ／50酢酸（PH3.0）中に1μｇ／ml濃
度で溶解したのち、Dulbecco PBS（−）（日水製
薬製）で希釈し、添加した。更に上記のL1210培養細胞を10％仔牛血清を含
むRPM11640培地へ８×10⁵ケ／mlとなる様に懸
濁し、37℃にて炭酸ガス培養器中で1.5時間培養
を行つたのち、上記で調製した本物質溶液を種々
濃度で添加し、15分間後さらに¹⁴C−ウリジン
（0.05μCi／ml）または¹⁴C−チミジン（0.05μCi／
ml）を添加し、37℃にて60分間培養した。反応液
へ冷10％トリクロル酢酸（TCA）を添加し、反
応を中止させると同時に、酸不溶物を沈澱させ、
冷５％TCAにてさらに２回洗滌したのち、ギ酸
に溶解し、放射活性を測定し、無添加対照区に対
する放射能の取込み率から50％取込み阻害濃度を
求めた。第１表に結果を示す。

【表】以上のアントラサイクリン抗生物質の製造は、
アクテイノミセイテス属に属するダウノマイシン
あるいはカルミノマイシン及びその類縁化合物を
生産する能力を有する土壌分離菌株又は公知の菌
株を、変異原として例えば、紫外線或はＮ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）を用いる通常の変異処理により容易に単
離される色素非乃至劣生産性でα−シトロマイシ
ノン或はβ−イソロドマイシノンをそれぞれ
DCP−１或はDCP−２に変換する能力を有する
菌株を、適当な栄養源から或る培地に培養するこ
とにより行なうことが出来る。これらの変換菌株
のうち具体的なものとしては、新規ダウノマイシ
ン系アナログ生産菌として出願のストレプトミセ
ス（Streptomycessp.）D788、RPM−５菌株
（前述）からNTG処理により得られるOXA−４
菌株を挙げることが出来る。該菌株は、昭61年３月22日付で工業技術院微生
物工業研究所に微工研菌寄第8708号（FERMP−
8708）として寄記されている。以下に、OXA−４菌株の菌学的性状を示す。 (i) 形態分枝した基中菌糸より、直線状の気中菌糸を
伸長し、輪生枝は認められない。成熟した胞子
鎖は10ケ以上の胞子の連鎖が認められ胞子の大
きさは0.6〜0.8×0.9〜2.5ミクロンで、胞子の
表面は平滑である。子のう胞子、鞭毛胞子など
は認められない。 (ii) 各種培地における生育状態色の記載について（）内に示す標準はH.
D.Tresner ＆ E.J.Backus著、System of
color wheels for Streptomyces taxonomy
（J.Appl.Microbiol.11巻、335〜338頁、1963
年）を用い、補足的に日本色彩研究所出版の
「色の標準」を用いた。

【表】 (iii) 生理的性質 (1) 生育温度範囲（イースト、麦芽寒天培地を
使用、PH6.0で、20℃、28℃、33℃、37℃、
42℃の各温度で実験）：20℃〜37℃までは生
育が認められた。 (2) ゼラチンの液化（グルコース、ペプトン、
ゼラチン培地を使用し、20℃で培養）：陽性 (3) スターチの加水分解（スターチ、無機塩寒
天培地）：陽性 (4) 脱脂牛乳の凝固及びペプトン化：僅かに凝
固及びペプトン化は陽性 (5) メラニン様色素の生成（トリプトン、イー
ストエキス、鉄寒天培地）：僅かに陽性 (iv) 各種炭素源の利用性（フリドハム、ゴドリー
ブ寒天培地上）：Ｌ−アラビノース陽性Ｄ−キシロース〃Ｄ−グルコース〃Ｄ−フラクトース〃シユークロース〃イノシトール陽性Ｌ−ラムノース〃ラフイノース僅かに陽性Ｄ−マンニツト陽性本発明によるDCP−１及び２生成に使用する
変換菌株の培養は、放射菌の栄養源として通常使
用されるそれ自体公知の培地組成中で行うことが
できる。例えば、炭素源としては、グルコース、
グリセリン、蔗糖、澱粉、マルトーズ、動植物油
などが使用でき、窒素源としては、大豆粉、肉エ
キス、酵母エキス、ペプトン、コーンステープ、
リカー、綿実粕、魚粉などの有機物並びに硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、リン酸アンモニウムなどの無機体窒素が使用
できる。又必要に応じて食塩、塩化カリウム、リ
ン酸塩その他、Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Zn⁺⁺、Fe⁺⁺、
Cu⁺⁺、Mn⁺⁺あるいはNi⁺⁺などの２価金属塩及び
アミノ酸やビタミン類を添加する他、発酵中の発
泡を抑制するため、例えばシリコーン他各種市販
消泡剤を適宜添加することもできる。培養は一般の抗生物質の生産と同じく、好気的
液体培養法（振盪あるいは撹拌培養）が適してお
り、通常25℃〜32℃の培養温度が望ましい。以下
にその具体例を述べる。本菌株の培養はまず種母培地として寒天斜面培
地（酵母エキス0.3％、可溶性澱粉1.0％、寒天1.5
％、PH7.0）培養し、５〜７℃で保存された菌株
を例えば澱粉、グルコース、有機窒素源、無機塩
類から成る通常の液体培地へ接種し、25℃〜32℃
にて24〜72時間振盪或は撹拌培養し、種母を調製
する。次に通常の液体培地例えばスターチ、マルトー
ズ、乾燥酵母、大豆粉、無機塩類より成る培地へ
上記の種母を１〜３％接種し、25℃〜32℃にて48
〜96時間振盪或は撹拌培養を行い、これに基質と
してα−シトロマイシノン或はβ−イソロドマイ
シノンを10〜300μｇ／mlの濃度で添加し、更に、
48〜96時間培養を続けて微生物変換を完結させ
る。培養液は菌体と液に分離し、菌体より生成物
を抽出、精製を行う。菌体からの抽出には通常、
アセトン、メタノール、ブタノール、酸性緩衝液
（PH2.0〜4.0）を用いて行い、濃縮後クロロホル
ム、トルエン、酢酸エチルなどの溶媒で抽出、濃
縮乾固して粗生成物を採取する。精製には
Sephadex LH−20（架橋デキストランゲル、
Pharmacia Fine Chemical AB社製）、CM−
cellulose（カルボキシメチルセルロースBrown社
製）、の如き、ゲル過及びイオン交換クロマト
グラフイー或はシリカゲルを用いる薄層及びカラ
ムクロマトグラフイーが有利に用いられる。得られた化合物はそれぞれ、紫外、可視光線吸
収スペクトル（以下UV）、赤外線吸収スペクト
ル（IR）及び高分解能¹H−NMR及び¹³C−
NMRスペクトル、及びFDマススペクトル分析
などの器機分析、更に酸加水分解により得られる
アグリコン部分、糖部分の分解物のスペクトル分
析、或は薄層クロマトグラフイー分析によつて構
造を下記のごとく決定した。即ち、α−シトロマイシノンを変換基質にした
場合、前記構造式−ａに示した添加基質にダウ
ノサミンが結合したDCP−１が得られ、β−イ
ソロドマイシノンを変換基質に用いた場合、前記
構造式−ｂに示した添加基質にダウノサミンが
結合したDCP−２が得られた。次に後記実施例において用いるアグリコン基質
の調製を参考例として掲げる。参考例 α−シトロマイシノンの調製：ストレプトマイセスビオラセウス
（Streptomyces violaceus）A262菌株の変異処理
により得た変異菌SC−７菌株（工業技術院微生
物工業技術研究所に昭和61年３月31日付で微工研
菌寄第8720号（FERM P8720）として寄託され
ている。）を0.3％酵母エキス及び１％可溶性デン
プン、PH7.0から成る種母培地（100ml／500ml三
角フラスコ）で２日間振盪培養し、これを４％ス
ターチ、2.5％大豆粉、0.2％酵母エキス、0.25％
食塩、0.32％CaCO₃、0.001％CuSO₄・5H₂O、
0.00016％FeSO₄・7H₂O、0.00032％ZnSO₄・
7H₂O、0.00013％MnCl₃・4H₂O、PH7.0から成る
発酵培地５リツトルを流入殺菌した10リツトル容
ジヤーフアメンター（３基）に、それぞれ１本
（100ml）当たり接種し、通気量５リツトル／分、
撹拌350回転、温度28℃で５日間培養する。得ら
れたブロス（およそ12リツトル）は濃塩酸を添加
してPH1.0となし、80℃で30分間加熱する。しか
るのち、遠心にて菌体を集め、これに５リツトル
のアセトンを添加して抽出、過する。アセトン
の抽出液をおよそ２リツトルに濃縮したのち、ク
ロロホルム２リツトル（総量）で抽出、濃縮乾固
してα−シトロマイシノンを含む粗粉末8.4ｇを
得た。その粗粉末全量をシリカゲルＣ−200（和光絖薬
製）200ｇをクロロホルムに懸濁し、充填したカ
ラム（φ40mm）に吸着させ、クロロホルム500ml、
クロロホルム／メタノール（500／１）混液1000
ml、同（400／１）混液3000ml、同（300／１）混
液2000mlで順次溶出、分画（各10ml）し、α−シ
トリマイシノンを単一成分として分離させる。α
−シトロマイシノン区分を集め濃縮乾固して、純
粋なα−シトロマイシノン黄色粉末0.55ｇが得ら
れる。なお、α−シトロマイシノンとしての同定
は、UV、IRスペクトル、マススペクトル、¹H−
NMR及び¹³C−NMRスペクトルより、文献値
（Tetrahedron Letter、８巻、28頁、1968及び
Chem.Ber.10巻、1341頁1968）を参照にして行つ
た。一方、β−イソロドマイシノン調製に関して
は、上記Streptomyces violaceus A262の変異処
理により取得したオベルマイシン生産菌SE2−
2385株（FERM Ｐ−8165号）をα−シトロマイ
シノン調製に供した上記菌株SC−７の場合と同
様に上記種母培地（フラスコ）で２日間培養、同
発酵培地５リツトルを入れた10リツトル容ジヤー
フアーメンター（３基）に接種し、上記同一条件
下で５日間培養する。得られたブロス（およそ12リツトル）を、前記
同様酸加水分解後、菌体からアセトン抽出、濃
縮、クロロホルム抽出を行い、濃縮乾固してβ−
イソロドマイシノンを含む粗粉末9.8ｇを得る。
この粗粉末全量を100mlのメタノールに懸濁し、
溶解する区分を除去したのち、シリカゲルＣ−
200（前出）300ｇをクロロホルムに懸濁し、充填
したカラム（φ78mm）に吸着させ、クロロホルム
500ml、クロロホルム／メタノール（500／１）混
液1000ml、同（400／１）混液3400ml及び同
（300／１）混液1000mlで順次溶出、分画させる。
β−イソロドマイシノンは400／１混液で溶出さ
れる。β−イソロドマイシノン分画部を集め濃縮
乾固し、エーテルで洗浄して、純粋なβ−イソロ
ドマイシノン0.62ｇを得た。なお、本物質の同定
は¹H−NMR及び¹³C−NMRスペクトル、UV及
びマススペクトルより文献値（Chem.Ber、98巻
3145頁、1965年）を参照して行つた。以下に本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。実施例１ストレプトシセスD788、OXA−４菌株（微工
研条菌寄第8708号）のYS（0.3％酵母エキス、１
％可溶性デンプン、1.5％寒天、PH7.2）斜面培養
より、一白金耳を採り、下記にする種母培地100
mlを分注殺菌した500ml容フラスコに接種し、30
℃で、ロータリーシエカー（220rpm）にて２日
間振盪培養して種母を作成した。種母培地可溶性デンプン 0.5％グルコース 0.5％エスサンシート（大豆粉、味の素社製） 1.0％酵母エキス 0.1％食塩 0.1％第二リン酸カリ 0.1％硫酸マグネシウム（含７水分子） 0.1％水道水 PH7.4（殺菌前）殺菌：120℃、15分次いで、下記組成の発酵培地50mlを分注殺菌し
た500ml容三角フラスコ800本へ、上記種母培養を
１mlずつ接種し、ロータリーシエカー（220rpm）
にて、28℃で96時間培養した。発酵培地可溶性デンプン 5.0％マルトーズ 3.0 魚粉 3.0 大豆粉（エスサンシート、前出） 2.0 酵母エキス 0.2 食塩 0.1 CaCO₃ 0.2 MgSO₄・7H₂O 0.1 CuSO₄・5H₂O 0.0007 FeSO₄・7H₂O 0.001 MnCl₂・4H₂O 0.0008 ZnSO₄・7H₂O 0.0002 PH7.5（殺菌前）殺菌：120℃、15分培養フラスコ800本を２等分し、１等分400本
（Ａ群）に予めメタノールに懸濁、溶解させたα
−シトリマイシノン４mg／ml溶液を１フラスコ当
り0.4mlずつ添加し、さらに72時間振盪培養を続
けた。一方、残り400本（Ｂ群）にはβ−イソロ
ドマイシノンメタノール溶液（４mg／ml）をフラ
スコ当り0.4mlずつ添加し、同様72時間振盪培養
を行い変換させた。実施例２Ａ群及びＢ群ブロスをそれぞれ集め、個別に以
下の方法で本発明のDCP−１或はDCP−２を含
む粗粉末を採取した。即ち、遠心操作にて菌体を集め、これよりアセトン10
リツトル（総量）にて撹拌抽出した。過にて抽
出液を採り、次いで減圧にておよそ４リツトル
まで濃縮した。6N塩酸でPH3.5となし、クロロホ
ルム700mlで２回洗浄抽出を行い、非変換アグリ
コン基質を除去したのち、再び4N苛性ソーダー
でPHを8.0に調整し、クロロホルム３リツトル
（総量）で抽出した。芒硝で脱水したのち濃縮し、
過剰のエーテルを添加して沈澱させ、遠心操作に
て沈澱を集め、真空乾燥により粗粉末を取得した
（Ａ群ブロスから300mg、Ｂ群からは250mg）。実施例３実施例２で得たＡ群からの粗粉末を10mlのメタ
ノール／クロロホルム（２／１）混液に溶解さ
せ、同溶媒に懸濁作成したSephadex LH−20
（前出）カラム（φ30×200mm）にかけ、ゲル過
を行つた。生成物DCP−１区分を集め濃縮乾固
したのち、分取用シリカゲル薄層プレート
60PF254（メルク社製：10枚使用）を用い、溶媒
系クロロホルム／メタノール／ギ酸（40／10／
１）で展開、かきとり溶出し、再び同プレート
（５枚）を用いクロロホルム／メタノール／濃ア
ンモニア水（50／10／１）の溶媒系でクロマトを
行い精製した。なお、DCP−１区分のシリカゲ
ルバンドからのかきとり抽出はクロロホルム／メ
タノール（７／１）混液で行つた。本薄層クロマ
トにより、精製標品として52mgを取得した。さらに、上記標品を１％酢酸水（PH3.0）10ml
に溶解し、トルエン４mlで２回抽出洗浄した。水
層部に飽和重炭酸ソーダ水を添加してPHを8.0と
なしたのち、クロロホルム50ml（総量）で抽出し
た。クロロホルム抽出液を飽和食塩水で洗浄した
のち、芒硝を添加して脱水、過した。抽出液を
小量まで濃縮し、過剰のｎ−ヘキサンを添加して
DCP−１を沈澱させ、遠心操作にて集積、真空
乾燥して純粋なDCP−１粉末42mgを得た。 DCP−１ (A) 性質：黄色粉末 (B) 融点：144〜147℃ (C) ［α］²³ _D：＋137°（Ｃ 0.02、クロロホルム中
）

【表】 (E) 赤外線吸収スペクトル（KBr）cm^-1 3400、2920、1620、1600、1580、1450、
1370、1325、1255、1110、1010、980、900 (F) FD−MSスペクトル：ｍ／ｚ 500（Ｍ＋Ｈ）
⁺（C₂₆H₂₉O₉Nとして分子量499.5）

【表】実施例４実施例２で得たＢ群からの粗粉末を10mlのメタ
ノール／クロロホルム（２／１）混液に溶解さ
せ、同溶媒に懸濁、作成したSepkadex LH−20
（前出）カラム（φ30×200mm）にかけ、ゲル過
を行つた。生成物DCP−２区分を集め濃縮乾固
した。これをクロロホルム懸濁、作成したシリカ
ゲルＣ−200（前出）カラム（φ37mm、60ｇ）にか
け、クロロホルム／メタノール（100／１）混液
300ml、同（50／１）混液250ml、同（10／１）混
液500mlで順次、溶出、分画して、DCP−２を主
成分とする区分を取得した。濃縮乾固し、分取用
シリカゲル薄層プレート60PF254（前出：20枚）
を用い、クロロホルム／メタノール／濃アンモニ
ア水（50／10／１）溶媒系で展開、かきとり溶出
し、再び同プレート（10枚）を用い、クロロホル
ム／メタノール／ギ酸（40／10／１）溶媒系でク
ロマトを行い精製した。シリカゲルからのDCP
−２の抽出は前述のクロロホルム／メタノール
（７／１）混液を用いて行つた。本薄層クロマト
により、精製標品として38mgを取得した。さらに、上記標品を１％酢酸水（PH3.0）10ml
に溶解し、トルエン４mlで２回抽出洗浄した。水
層部に飽和重炭酸ソーダ水を添加して、PHを8.0
となしたのち、クロロホルム80ml（総量）で抽出
した。クロロホルム抽出液を飽和食塩水で洗浄し
たのち、芒硝を添加して、脱水、過した。抽出
液を小量まで濃縮し、過剰のｎ−ヘキサンを添加
して、DCP−２を沈澱せしめ、遠心操作にて集
積、真空乾燥して純粋なDCP−２粉末29mgを得
た。 DCP−２ (A) 性質：赤褐色粉末 (B) 融点：249−253℃ (C)［α］²³ _D：＋398°（C0.004、クロロホルム中）

【表】 (E) 赤外線吸収スペクトル（KBr）νcm^-1 3400、2920、1590、1460、1405、1305、1260、
1190、1015、985、800 (F) FD−MSスペクトル：ｍ／z531(M)⁺ （C₂₆H₂₉O₁₁Nとして分子量 531.5）

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１式【化】式中、Ｒは水素原子を表わすか、又は水酸基を
表わす、で示される新規アントラサイクリン抗生物質。２式【化】で示される特許請求の範囲第１項記載の新規アン
トラサイクリン抗生物質。３式【化】で示される特許請求の範囲第１項記載の新規アン
トラサイクリン抗生物質。