DK160879B - Anthracyclinantibiotika - Google Patents

Description

DK 160879 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte anthracyc-linantibiotika, som produceres af mikroorganismer, der hører til slægten Streptomyces.

Det er kendt, at antibiotika af anthracyclintypen, daunomy-5 cin og adriamycin, kan isoleres fra en dyrkningsopløsning af actinomycetes, jfr. hhv. USA-patentskrift nr. 3.616.242 og nr. 3.590.028. Disse forbindelser har et bredt anti-cancerspektrum mod eksperimentelle tumorer og har også været anvendt klinisk som kemoterapeutiske midler mod 10 cancer. Imidlertid er daunomycins og adriamycins antican-cervirkning ikke nødvendigvis tilfredsstillende, selv om de har en betydelig kraftig virkning. Det er derfor blevet forsøgt at fremstille forskellige forbindelser analoge med daunomycin og adriamycin på forskellig måd^ såsom fer-15 mentering, semisyntese og omdannelse under anvendelse af mikroorganismer, og nogle anthracyclinantibiotika er blevet fremstillet, jfr. f.eks. publiceret prøvet japansk patentansøgning nr. 34915/76, aclacinomyciner A og B, T. Oki et al., The Journal of Antibiotics, bind 33, side 20 1331-1340, P. Areamone, Topics in Antibiotic Chemistry, bind 2, side 102-279, udgivet af Ellis Horwood Limited, publiceret uprøvet japansk patentansøgning nr. 56494/82 (4-demethoxy-ll-desoxydaunomycin osv.), publiceret uprøvet japansk patentansøgning nr. 15299/81 (antibiotika af 25 rhodomycin-rækken) og andre.

I "Journal of Medicinal Chemistry", 21, 280 (1978), "Canadian Journal of Chemistry, 5j), 1868-1874 (1980) og "Topics in Antibiotic Chemistry", bd. 2, s. 105-108 beskrives monosaccharider, der er analoge med forbindel-30 serne ifølge opfindelsen som beskrevet senere. Imidlertid tilhører disse kendte forbindelsers aglycon- og/-eller sukkerdel forskellige kategorier. Selv om eksempelvis rhodomycin B, der er beskrevet i "Topics in Antibiotic Chemistry" ligner forbindelsen D788-7 ifølge 35 opfindelsen, består en væsentlig forskel mellem de to forbindelser i, at sukkerdelen i den kendte forbindelse 2

DK 160879B

enten er L-rhodosamin eller daunosamin. Denne forskel medfører en klar forskel i disse forbindelsers antitumor-virkning (jf. f.eks. højre spalte på side 1869 i 5 "Canadian Journal of Chemistry").

Endvidere er et antal forbindelser, der ligner forbindelserne ifølge opfindelsen, blevet undersøgt som anti-cancer-midler.

Imidlertid er ingen af de kendte forbindelser tilfreds-10 stillende både med hensyn til toksicitet og anticancer-virkning.

Opfindelsens formål er derfor at tilvejebringe nye forbindelser med lav toksicitet og høj anticancer-virkning.

15 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte anthracyclinantibiotika med formlen

O OH

HO O OH q HO NH2 hvori Y betyder en gruppe med formlen

OH OH

r t CH300C o hooc oh euer ^Sn®·

3 DK 160879 B

Disse forbindelser har en kraftig inhiberende virkning mod formeringen af dyrkede leukæmiceller L 1210 og er nyttige som anticancermidler.

Disse forbindelser er hidtil ukendte antibiotika, som i 5 strukturmæssig henseende er karakteriseret ved ring A i anthracyclinonskelettet. Blandt forbindelserne med formlen (I) har den antibiotiske forbindelse med formlen O OH COOCH3

J *OH

(I-a)

OH O OH O

-Γ ΟΗ nh2 betegnelsen D788-6, den antibiotiske forbindelse med form-10 len

0 OH. OH

YYyV d-b) OH 0 OH q Η3εΓ"0- OH NH2 betegnelsen D788-7, den antibiotiske forbindelse med formlen

4 DK 160879 B

O OH OH

(I-C)

O

Η3αΤΝ^ HO NH2 betegnelsen D788-8, den antibiotiske forbindelse med formlen CCOCH3 O OH o (I-d) HO O OH 1

I nh2 HO

betegnelsen D788-9 og den antibiotiske forbindelse med formlen

0 OH CCOH OH

HO ° °H O (I.e) HO NH2 betegnelsen D788-10.

. DK 160879B

5

Disse forbindelser har kraftig inhiberende virkning mod formeringen af dyrkede leukæmiceller L 1210 og er per se anvendelige som anticancermidler.

Inhiberende virkning mod formering af muse-L 1210 leu- 5. kæmiceller og mod syntesen af nucleinsyre_ L 1210-celler i en mængde på 5 x 10^/ml inokuleres på f.eks. RPM 11640-medium (Rosewellberg Research Laboratories) indeholdende 20%'s okseserum, og forsøgsforbindelsen tilsættes i en koncentration på 0,02-0,25 ug/ml 10 på lignende måde. Dyrkningen gennemføres ved 37°C i en carbondioxiddyrkningskolbe. Derefter bestemmes 50%'s inhiberingsvirkningen mod formering baseret på en kontrolfraktion. Desuden suspenderes ovennævnte L 1210-cel-lekultur i 10% okseserumholdigt RPM 11640 medium i en 15 koncentration på 5 x 10^/ml. Efter dyrkning ved 37°C i 1-2 timer i en carbondioxiddyrkningsflaske tilsættes stoffet i forskellige koncentrationer, og 15 minutter senere tilsættes ^C-uridin (0,05 yCi/ml) eller ^C-thymidin (0,05 yCi/ml), hvorpå dyrkningen fortsættes i 20 60 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved tilsæt ning af kold 10%'s trichloreddikesyre til reaktionsopløsningen, og samtidigt udfældes materiale, som er uopløseligt i det sure medium. Efter yderligere vask-ning to gange med kold 5%'s trichloreddikesyre opløses 25 det uopløselige materiale i myresyre, og der foretages måling af radioaktiviteten. 50%'s optagelsesinhiberings-koncentration bestemmes ud fra optagelsesraten for radioaktivitetet, baseret på grundlag af kontrolfraktionen, hvortil der ikke er sat noget stof. Resulta-30 terne er vist i nedenstående tabel 1.

DK 160879B

6

Tabel 1

Inhiberende virkning mod formering af museleukæmi-L 1210-kulturceller og mod syntese af nucleinsyre_ 50%'s inhiberingskoncentration (IC,.q) 5 _(ug/ml) _

Inhibering af Inhibering af Inhibering af celleformering DNA-syntese RNA-syntese D 788-6 0,25 2,6 1,30 D 788-7 0,0003 0,29 0,68 10 D 788-8 0,22 3,4 1,58 D 788-9 0,22 4,2 2,59 D 788-10 0,083 10 10

Antitumorvirkningen mod muse-L 1210-leukæmi er vist i nedenstående tabel 2.

15 Tabel 2

In vivo antitumorvirkning af D788-7 mod muse-L 1210-leukæmi__

Antitumorvirkning in vivo

Dosis Antitumorvirkning T/c (%) 20 (uq/kg/dag) __ 250 100 125 172 62,5 204 32 187 25 16 133 8 104 4 102 mus: CDF1 n = 6 5 inokulering: 1 x 10 celler/mus (i.p.) 30 behandling: dag 1 til dag 10 (i.p.)

7 DK 160879B

De ovenfor omtalte anthracyclinantibiotika kan fremstilles ved/ at man i et medium indeholdende egnede næringskilder dyrker en stamme/ som danner forbindelserne ifølge opfindelsen, og som let isoleres ved en konventionel varia-5 tionsbehandling af en stamme hørende til slægten Actinomyces, som er i stand til at producere daunomycin og dermed analoge forbindelser, og som er isoleret fra jord eller er kendt, under anvendelse af et variationsmiddel, f.eks. N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Blandt 10 disse producerende stammer udgør et specifikt eksempel stammen RPM-5, som er en variant fremkommet ved en variationsbehandling af Streptomyces stamme D 788, som danner daunomycin og paumycin, og som nylig er blevet isoleret fra jord, med NTG.

15 Denne stamme er deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Sciences and Technology den 2. juli 1984 under det internationale deponeringsnummer 811 (FERM BP-811).

De bakteriologiske egenskaber ved stamme RPM-5 beskrives 20 i det følgende.

(A) Morphologi

Lineært luftmycelium udvikles fra forgrenet substratmycelium, men der dannes ingen spiraler. Modne sporer i en kæde på 10 eller flere har en diameter på ca. 0,6-0,8 x 25 0,9-2,5 jum. Sporerne har glatte overflader. Der dannes hverken ascosporer elller flagellasporer.

(B) Vækstbetingelser i forskellige medier

Med hensyn til farveangivelsen er standarder angivet i parentes baseret på "System of Color Wheels for Strepto-30 mycete Taxonomy" af Tresner & E.J. Backus (J.Appl. Microbiol., bind 11, side 335-338, 1963), som er suppleret med "Color Standard" udgivet af Nippon Color Research Laboratories .

8 DK 160879 B

(C) Fysiologiske egenskaber (1) . Væksttemperaturområde: (testet ved temperaturerne 20°C, 28°C, 30°C, 37°C og 42°c ved pH-værdi 6,0 under anvendelse af gær-maltosé-agar-medium). Vækst ved tempe- 5 raturerne fra 20-37°c; men ingen vækst ved 42°C.

(2) Smeltning af gelatine: positiv (dyrkning ved 20°C under anvendelse af glucose-pepton-gelatine-medium) (3) Hydrolyse af stivelse: 10 positiv (stivelse-uorganisk salt-agar-medium).

(4) Koagulering af skummetmælk og peptonisering: resultatet negativt i startfasen, men efter 15 dages dyrkning indtræder peptonisering.

(5) Dannelse af melanin-agtigt pigment: 15 (anvendelse af trypton-gær-kulturvæske, pepton-gær-jernagar og tyrosin-agar-medier) positiv i alle medier.

(D) Udnyttelse af forskellige kulstofkilder: (Pridham-Gottlieb-agarmedium) 1. L-Arabinose positiv 20 2. D-Xylose positiv 3. D-Glucose positiv 4. D-Fructose positiv 5. Saccharose positiv 6. Inositol positiv 25 7. L-Rhamnose negativ 8. Raffinose negativ 9. D-Mannitol positiv

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at dyrke producerende bakterier i medier med kendt sammen-30 sætning, der sædvanligvis anvendes til dyrkning, af acti-nomycetes. Som kulstofkilder kan eksempelvis anvendes glucose, glycerol, saccharose, stivelse, maltose, animalske og vegetabilske olier osv., som nitrogenkilder kan eksem-

9 DK 160879B

pelvis anvendes organiske stoffer, som f.eks. sojabønnepulver, kødekstrakt, gærekstrakt, pepton, majsstøbevand, rester af bomuldsfrø, fiskepulvere osv., samt uorganiske nitrogenkilder, såsom ammoniumsulfat, ammonium-5 chlorid, natriumnitrat, ammoniumphosphat osv. Om nødvendigt eller om ønsket kan der tilsættes natriumchlorid, kaliumchlorid, phosphater eller salte af divalente metaller, 4*4* -t-4- 4»4* 4*4* 4*4· 4*4* I “I· f.eks. af Mg , Ca+ , Zn , Pe , Cu , Mn eller Ni osv.j og aminosyrer eller vitaminer. Til undgåelse af skum-10 dannelse under fermenteringen kan der desuden hensigtsmæssigt tilsættes antiskummidler, f.eks. silicone "KM75" (Shin-Etsu Kagaku K.K.).

Fermenteringsbetingelser, såsom temperatur, pH-værdi, luftomrøring og fermenteringstid og lignende kan vælges på 15 en sådan måde, at de anvendte bakterier akkumulerer den maksimale mængde af den ønskede forbindelse. Det er eksempelvis fordelagtigt at gennemføre fermenteringen ved temperaturer på 20-40°C, fortrinsvis 28°C, ved pH-værdien 5-9, fortrinsvis 6-7, ved en fermenterings-20 tid på 1-10 dage, fortrinsvis 6 dage.

Til isolering af forbindelserne D788-6 til -10 fra fermenteringsopløsningen kan denne efter endt fermentering separeres ved centrifugering eller filtrering i nærværelse af et egnet filterhjælpemiddel, såsom diatoméjord, hvor-25 ved fermenteringsvæsken adskilles i bakterier og supernatant eller filtrat. Forbindelserne ekstraheres fra supernatanten med organiske opløsningsmidler, såsom chloroform, toluen, ethylacetat osv. ved pH-værdien 7-9.

Fra bakterierne ekstraheres stofferne om nødvendigt eller 30 om ønsket under anvendelse af organiske opløsningsmidler, såsom acetone, methanol, ethanol, butanol osv. De enkelte ekstrakter koncentreres til tørhed, hvorved man får et rødt, råt pulver. Pulveret underkastes kromatografi under anvendelse af adsorberende bærestoffer, f.eks.

35 syntetiske adsorberende harpikser eller silicagel, eller de behandles med anionbytterharpikser og kationbytterhar-pikser enkeltvis eller i passende kombination til udvinding af stofferne D788-6 til -10 i ren form.

DK 160879B

10

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler. Den som D-788-6 betegnede forbindelse er kendt fra det ovennævnte litteratursted i Canadian J. Chem. og 5 er ikke omfattet af opfindelsen.

Eksempel 1

Fra en YS (0,3% gærekstrakt, 1% opløselig stivelse, 1,5% agar, pH-værdi 7,2) skrårørskulturopløsning af Strepto-myces D788, stamme RPM-5 (deponeret i Fermentation Re-10 search Institute, Agency of Industrial Science and Technology, deponeringsnr. 7703) udtages ved hjælp af et pla-tinpcxdenålmateriale, som inokuleres i en 500 ml-Erlen-meyerkolbe, som indeholder 100 ml af det nedenfor beskrevne podekulturmedium i steril form. Der foretages ryste-^5 dyrkning ved 20°C i 2 dage på et roterende rystebord (220 o/m) til fremstilling af podekultur.

Podekulturmedium:

Opløselig stivelse 0,5%

Glucose 0,5% 20 Esusankød (sojabønnepulver fra firmaet Ajinomoto Limited) . 1,0% Gærekstrakt 0,1%

Natriumchlorid 0,1%

Sekundærtkaliumphosphat 0,1% 25 Magnesiumsulfat (indholdende 7^0) 0,1%

Ledningsvand pH-værdi 7,4 (inden sterilisering).

15 liter produktionsmedium med den nedenfor beskrevne sammensætning sættes til en 30-liters fermenterings-30 beholder, hvorpå der steriliseres, derpå tilsættes 750 ml (svarende til 5%) af den ovenfor- beskrevne pode-kulturopløsning, hvorpå der foretages inokulering.

11

DK 160879 B

Produktionsmedium:

Taiwangær 5,00%

Opløselig stivelse 7,50% Gærekstrakt 0,20% 5 Natriumchlorid 0,20%

Calciumcarbonat 0,30%

Mineralblanding* 0,06%

Ledningsvand pH-Værdi 8,2 (inden sterilisering) 10 * En opløsning af 2,8 g CuS0^.5H20, 0,4 g FeSO^. 71^0, 3,2 g MnCl2.4H20 og 0,8 g ZnSO^^I^O i 500 ml destilleret vand.

Dyrkningen gennemføres ved 28°C i 130 timer med en beluft-ning på 15 1/min. under omrøring med 45 o/m, og dyrknings-15 opløsningen antager en dyb rødbrun farve på grund af det dannede produkt. Dyrkningsvæsken udtages fra fermenteringsbeholderen, og dyrkningsopløsningen stilles på pH-værdi-en 1,7 med kone. svovlsyre, hvorpå der omrøres ved stuetemperatur i ca. 1 time. Til dyrkningsvæsken sættes 2% 20 filtreringshjælpemiddel, og bakterierne isoleres ved filtrering, hvorved der fås 13,5 liter filtrat. Bakteriefraktionen suspenderes i 6 liter acetone, hvorpå suspensionen omrøres i 20 minutter og ekstraheres. Efter filtrering koncentreres acetoneekstrakten til et rumfang på 25 ca. 1,5 liter under formindsket tryk. Koncentratet kombineres med det ovenfor dannede filtrat til et samlet rumfang på 15 liter.

Filtratet (pH-værdi indstillet på 2,0-2,5 med 4 N natrium-hydroxidopløsning) ledes gennem en søjle pakket med 750 ml 30 "Dia Ion HP-20" (syntetisk absorptionsharpiks fra Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) ved SV på 4,5 til absorption af produktet. Derefter foretages vaskning med 1,5 liter vand med pH-værdi 1,7 (fortyndet svovlsyre), hvorefter det absorberede materiale elueres med 1,4 liter 50%'s 35 vandig acetone (pH-værdi 1,7). Eluatet koncentreres under formindsket tryk til et rumfang på ca. 800 ml. Derefter

12 DK 160879 B

indstilles koncentratet på pH-værdien 8,5 med 4 N natriumhydroxidopløsning, og der ekstraheres med i alt 2 liter chloroform. Den således fremkomne chloroformekstrakt vaskes med vand og derpå med mættet vandig natriumchloridop-5 løsning, hvorpå den tørres over natriumsulfat. Natriumsulfatet frafiltreres, og filtratet koncentreres til et lille rumfang under formindsket tryk. Overskud af n-hexan tilsættes til udfældning. Der foretages filtrering og tørring i vakuum, hvorved man får 1,84 g råt pulver inde-10 holdende D788-6, D788-7, D788-8 og D788-9.

Ekstraktionsremanensen fra chloroformekstraktionen indstilles på pH-værdien 2,5' med 6 N saltsyre, hvorpå der foretages ekstraktion med i alt 1,5 liter n-butanol. De dannede butanolekstrakter udrystes med vand med en pH-værdi 15 2,5. Butanolet fjernes ved koncentrering under formindsket tryk, og remanensen opløses i en lille mængde methanol.

Til opløsningen sættes overskud af toluen til udfældning af produktet. Opløsningsmidlet fjernes ved destillation, hvorved man får 5,0 g råt pulver indeholdende D788-10.

20 Eksempel 2

En søjle pakkes med 30 g Wako Silica Gel C-200 (Wako Junya-ku Kogyo Co., Ltd.) under anvendelse af en blanding af chloroform og methanol (20:1). Det rå pulver, 600 mg, fremkommet i eksempel 1 ved ekstraktion med chloroform 25 opløses i en lille mængde af en blanding af chloroform og methanol (20:1), og opløsningen absorberes på det øverste lag af silicagelsøjlen, hvorpå der fremkaldes med samme opløsningsmiddelsystem. Først elueres aglycon, hvorpå der foretages fremkaldelse med 160 ml af en blan-30 ding af chloroform og methanol (15:1), 140 ml af en blanding af chloroform og methanol (13:1) og derpå med 260 ml af en blanding af chloroform og methanol (12:1) til elu-ering af en D788-6-fraktion. Endvidere elueres en fraktion indeholdende D788-9 med 200 ml af en blanding af 35 chloroform og methanol (10:1). Derefter foretages eluering med 200 ml af en blanding af chloroform, methanol og. vand (200:20:0,5) og derpå med 200 ml af en blanding af chloro-

13 DK 160879 B

form, methanol og vand (180:20:1), hvorved man får en fraktion, som indeholder D788-7 og D788-8. Mængden af det rå pulver i de enkelte fraktioner efter koncentration til tørhed er som følger: 5 D788-6**fraktion 21 mg D788-7*“fraktion 45 mg D788-8*fraktion 79 mg D788-9-fraktion 85 mg

De ovenfor beskrevne rå pulvere renses og fraktioneres 10 ved tyndtlagskromatografi som beskrevet i det følgende.

D788-6: Den ovenfor beskrevne D788-6-fraktion renses un der anvendelse af et tyndt lag silicagel (20 x 20 cm) (PF 254Silica Gel, Merck Inc.) til fraktionering. Fraktionen afsættes i form af en vandret linie i en afstand 15 af 15 mm fra den nederste ende af det tynde lag, hvorpå der fremkaldes med en blanding af chloroform, methanol og vand (25:10:1). Der udtages D788-6-bånd, som ekstra-heres med en blanding af chloroform og methanol (8:1). Ekstrakten koncentreres til tørhed, det fremkomne pulver 20 opløses i 0,1 M eddikesyrepufferopløsning (pH-værdi 3,0), og opløsningen ekstraheres og vaskes med chloroform. Den efter ekstraktionen tilbageblevne vandige fase indstilles med 4 N natriumhydroxidopløsning på pH-værdien 8,5, hvorpå der ekstraheres med chloroform. Den fremkomne ekstrakt 25 vaskes med vand og derpå med en mættet vandig natrium-chloridopløsning, hvorpå ekstrakten tørres over natriumsulfat. Chloroformekstrakten filtreres, og filtratet koncentreres under formindsket tryk. Til koncentratet sættes overskud af n-hexan til fremkaldelse af udfældning. Det 30 udfældede produkt frafiltreres og tørres i vakuum, hvorved man får 10 mg D788-6 på ren form.

D788-7: Den ovenfor omtalte D788-7 fraktion underkastes tyndtlagskromatografi på silicagel (se ovenfor) til fraktionering, idet der som fremkalderopløsningsmiddel 35 anvendes en blanding af chloroform, methanol, vand og eddikesyre (120:25:6:14). Der udtages bånd svarende til

DK 160879B

14 D788-7, og det udtagne materiale ekstraheres med en blanding af chloroform, methanol og vand (4:1:0,5). Efter koncentrering af ekstrakten til tørhed opløses remanensen i 0,1 M eddikesyrepuffer (pH-værdi 3,0), og opløsningen 5 vaskes med chloroform og ekstraheres med chloroform ved pH-værdien 8,5 på samme måde som beskrevet ovenfor i forbindelse med rensningen af D788-6, hvorved man får 21 mg D788-7 på ren form.

D788-8: Den ovenfor omtalte D788-8-fraktion fremkommet 10 ved søjlekromatografi på silicagel renses ved tyndtlags-kromatografi til fraktionering på den ovenfor beskrevne måde under anvendelse af et fremkalderopløsningsmiddel bestående af en blanding af chloroform, methanol, vand, eddikesyre og 28%'s ammoniakvand (125:55:5,5:0,9:1,1).

I5 Bånd svarende til D788-8 udtages og ekstraheres med en blanding af chloroform, methanol og vand (4:1:0,5). Derpå behandles ekstrakten analogt med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til rensning af D788-6-fraktionen, og man får 28 mg ren D788-8.

20 D788-9: D788-9-fraktionen (80 mg) fremkommet ved kroma tografi på silicagel som beskrevet ovenfor sættes på- en søjle fyldt, med en suspension af 4 g Wako Silica Gél C-200 (se ovenfor) i en blanding af chloroform og methanol (20:1), hvorpå der igen kromatograferes, idet der som 25 fremkalder anvendes det samme opløsningsmiddelsystem, hvorved man får D788-9 med en renhed på ca. 50%. Dette stof fraktioneres ved tyndtlagskromatografi (se ovenfor) under anvendelse af et fremkalderopløsningsmiddel bestående af en blanding af chloroform, methanol, vand og 30 eddikesyre (120:25:6:14) til rensning og adskillelse af blandingen. Der udtages bånd svarende til D788-9, og materialet ekstraheres med en blanding af chloroform, methanol og vand (4:1:0,5). Derpå oparbejdes ekstrakten på samme måde som beskrevet ovenfor for D788-6, hvorved man får 35 22 mg rent D788-9.

DK 160879 B

15

Eksempel 3

Det i eksempel 1 fremstillede rå pulver (5 g) indeholdende D788-10 ekstraheret med butanol anbringes på en søjle, som er fyldt med en suspension af 35 g Wako Silica Gel C-200 5 (se ovenfor) i en blanding af chloroform, methanol og vand (100:10:0,5), hvorpå der fremkaldes med 200 ml af en blanding af chloroform, methanol og vand (90:10:1), derpå med 360 ml af en blanding af chloroform, methanol og vand (80:10:1), 240 ml af en blanding af chloroform, meth-10 anol og vand (70:10:1) og til sidst med 210 ml af en blanding af chloroform, methanol og vand i forholdet 60:10:1, hvorved man får fraktioner af D788-10, som er yderligere renset. D788-10-fraktionerne udtages og koncentreres under formindsket tryk, hvorved man får delvis renset D788-10 15 på pulverform. Det pulverformige produkt opløses i en fortyndet vandig natriumhydrogencarbonatopløsning. Opløsningen vaskes med chloroform, og den tilbageblevne vandige fase indstilles på pH-værdien 2,5 med 6 N saltsyre, hvorpå den vandige fase ekstraheres med n-butanol. Ekstrak-20 ten inddampes under formindsket tryk, hvorved man får 80 mg pulverformigt produkt. Produktet renses yderligere ved tyndtlagskromatografi med henblik på fraktionering under anvendelse af en blanding af chloroform, methanol, vand, eddikesyre og 28%'s ammoniakvand (125:55:5,5:0,9:1,1).

25 Der udtages fraktioner svarende til D788-10, og de ekstraheres med en blanding af chloroform, methanol og vand (4:1:0,5), som er tilsat 1 dråbe eddikesyre. Efter koncentrering af ekstrakten under formindsket tryk opløses remanensen i en fortyndet vandig natriumhydrogencarbo-30 natopløsning. Opløsningen vaskes med chloroform, hvorpå den indstilles på pH-værdien 2,5 med 6 N saltsyre, og der ekstraheres med n-butanol. Ekstrakten koncentreres til tørhed, hvorved man får 32 mg renset D788-10.

De fysisk-kemiske egenskaber for hver enkelt af de oven-35 stående eksempler fremstillede forbindelser er anført i det følgende.

D788-6 16

DK 160879B

A) Smeltepunkt 138-140°C (sønderdeling) B) [α]β5 + 165° (° = methanol) C) Absorptionsspektre i UV-området og det synlige omrade 5 (methanol) nm · ): 206 1311) max 1 cm 235 (647) 255 (403) 290 (141) 10 492 (229) 511sh (177) 527sh (153) D) IR-absorptionsspektrum (KBr) γ cm”1 1720, 1590, 1450, 1420, 1390, 1280, 1270, 1190, 1160, 15 1000, 980 E) 1H-NMR-spektrum (CDCl^) δ ppm 1,1 (3H, t, J=7,5 H-14) 1,33 (3H, d, J=6,5 H-6') 1,51 (IH, dd, J=12,4 H-2'a) 20 1,6-2,1 (3H, m, H-13, H-2'b) 2,1-2,4 (2H, m, H-8) 3,05 (IH, dd, J=ll,4 H-3') 3,41 (IH, bs, H-4') 3,69 (3H, s, COOCH3) 25 4,1 (IH, g, J=6,5 H^) 4,26 (IH, s, H-10) 5.22 (IH, bs, H-7 )

5,43 (IH, bs, H-1M

7.22 (IH, dd, J=8,2 H-3 ) 30 7,62 (IH, t, J=8 H-2 ) 7,71 (IH, dd, J=8,2 H-l ) D788-7

17 DK160S79B

A) Smeltepunkt 165-167°C

B) [a]j^ + 16° (c-= 0,0125, raethanol) C) Absorptionsspektre i UV-området og det synlige område 5 (methanol) λ^30Η nm (e}% ) : 207 (332) max 1 cm 235 (702) 254 (424) 292 (139) 10 492 (254) 512sh (187) 528 (169) D) IR absorptionsspektrum (KBr) γ 0¾-1 1595, 1450, 1430, 1400, 1290, 1230, 1190, 1160, 1110, 1005, 980 15 E) 1H“NMR-spektrum (CDC13 + CD30D) δ ppm 1,09 (3H, t, J=7,5 H-14) 1,32 (3H, d, J=6,5 H-6') 1,6-1,9 (4H, m, H-2\ H-13) 2,2 (2H, bs, H-8 ) 20 2,7-3,2 (IH, m, H-3') 3,46 (IH, bs, H-4') 4,12 (1H, g, J=6,5 H-5') 4,81 (IH, s, H-10) 5,1 (IH, bs, H-7 ) 25 5,4 (1H, bs, H-l') 7,23 (1H, dd, J=8, 1,5 H-3) 7,64 (IH, t, J=8 H-2 ) 7,79 (1H, dd, J=8, 1,5 H-l) D788-8

18 DK 160879B

A) Smeltepunkt 126-128°C (sønderdeling) B) [α]^ + 309° (c = 0,0175, methanol) C) Absorptionsspektra i UV-området og det synlige område 5 (i methanol) XCH30H nm (E?-% ) : 206 (609) max 1 cm 227 (429) 269 (619) 494 (283) 10 515 (300) 550sh (183) D) IR-absorptionsspektrum (KBr) γ cm ^ 1600, 1460, 1400, 1370, 1285, 1250, 1200, 1170, 1110, 1015, 980 15 E) ^H-NMR-spektrum (CDCl-^-CDgOD) δ ppm 1.3 (IH, d, J=6,5 H-61) 1.4 (3H, d, J=6,5 H-14) 1,5-1,9 (2H, m, H-2') 2.5 (IH, dd, J=18, 4,5 H-8a) 20 2,8 (IH, d, J=18 H-8b) 2,8-3,2 (IH, m, H-3') 3,38 (IH, bs, H-41) 3,98 (IH, q, J=6,5 H-5') 4,49 (IH, q, J=6,5 H-13) 25 5,2 (IH, bs, H-l') 6,97 (IH, bs, H-10) : 7,18 · (IH, dd, J=8, 1,5 H-3) ! 7,59 (IH, t, J=8 H-2 ) 7,75 (IH, dd, J=8, 1,5 H-l)

19 DK 160879B

D788-9

A) Smeltepunkt 175-180°C

B) [α]^ + 62° (c ^=.0,0145, methanol) C) Absorptionsspektre i UV-området og det synlige område 5 (i methanol) ACH30H nm (E?"% ): 206 (307) max 1 cm 235 (671) 255 (428) 291 (153) 10 481sh (212) 493 (226) 512sh (171) 526 (148) D) IR-absorptionsspektrum (KBr) γ cm ^ 15 1725, 1710sh, 1600, 1450, 1430, 1400, 1290, 1240, 1190, 1165, 1110, 1005, 980 E) ^H-NMR-spektrum (CDCl^): <5 ppm 1.36 (3H, d, J=6,5 H-6') 1,5-2,0 (2H; m, H-21) 20 2,2 (IH, dd, J=16, 4,5 H-8a) 2,27 (3H, s, H-14) 2.6 (IH, d, J=16 H-8b) 2,9-3,3 (IH, m, H-3') 3,46 (IH, bs, H-41) 25 3,69 (3H, s, C00CH3) 4,13 (IH, q, J=6,5 H-5·) 4.37 (IH, s, H-10) 5,12 (IH, d, J=4,5 H-7 ) 5,42 (IH, bs, H-l*) 7,23 (IH, dd, J=8, 1,5 H-3) 7.6 (IH, t, J=8 H-2) 7,77 (IH, dd, J=8, 1,5 H-l) D-788-10 20

DK 160879B

A) Smeltepunkt 174-176°C

B) [a]p5 + 200° (C = 0,0185, methanol) C) Absorptionsspektre i UV-området og det synlige område 5 (i methanol) XCH30H nm (eJ% ): 209 (362) max 1 cm ' 226 (371) 257 (329) 497 (169) 10 514sh (155) D) IR absorptionsspektrum (KBr) γ cm-^ 1710, 1600, 1450, 1390, 1280, 1230, 1190, 1160, 1115, 1010, 980 E) ^H-NMR-spektrum (CDCl^-CD^OD) δ ppm 15 1,3 (3H, d, J=6,5 H-6') 1.4 (3H, d, J=6,5 H-14) 1,5-1,9 (2H, m, H-21) 2,1-2,8 (2H, m, H-8 ) 3,7 (IH, bs, H-41) 20 4,0 (IH, g, J=6,5 H-13) 4.1 (IH, s, H-10) 4.2 (IH, q, J=6,5 H-5') 5,1 (IH, bs, H-7 ) 5.5 (IH, bs, H-l ) 25 7,2 (IH, dd, J=8 1,5 H-3) 7.6 (IH, t, J=8 H-2 ) 7.7 (IH, dd, J=8, 1,5 Η,Ι)

Claims (5)

21 DK 160879 B

1. Anthracyclinantibiotika, kendetegnet ved, at de har den almene formel O OH HO O OH 0 »“piV HO NH2 5 hvori Y betyder en gruppe med formlen OH OH ''OH , I CH °°C O HOOC OH ΛΛ I 'OH eller | ΌΗ *

2. Anthracyclinantibiotikum ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dethar formlen O OH OH ^ || 'I I 'OH YyYV HO O OH O OH NH2

22 DK 160879 B

3. Anthracyclinantibiotikum ifølge krav 1, kende-5 tegnet ved/ at det har formlen OH O OH q ' NH, OH l

4. Anthracyclinantibiotikum ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen cocch-3 O OH r, OH 0 °H g *3Cpd U CS2

5. Anthracyclinantibiotikum ifølge krav 1, k endete g n e t' ved, at det har formlen O OH ““ (°H OH 0 0H ° h3 cpp Γ NH, OH 1