JPH047192B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

架橋剤を用いた固定化酵素は、固定化酵素の最
も広く知られた形態の一つである。この様な固定
化酵素を製造する為、多くの方法が開発されてき
ている。この様な方法の一つにおいてまず担体を
架橋剤でまず活性化し、次いで酵素で処理し、こ
れにより酵素は担体に緊密に付着する。この様な
活性化方法には、米国特許4292199、又はバイオ
テクノロジーアンドバイオエンジニアリング
（Biotechnology and Bioengineering）、22巻、
271〜287頁（1980）に記載されている様に、担体
をポリアミンで含浸し引き続き過剰のグルタルア
ルデヒドで処理する方法が含まれる。この種の他
の活性化には、米国特許37050844に開示されてい
る様に、担体を吸着促進不溶性ポリマーでコーテ
イングし、引き続きポリマー上に酵素を吸着さ
せ、更にその場で架橋により固定化させる方法を
含む。この種の別の活性化は米国特許4069106に
開示されている：ケラチン−含有担体をケラチン
で還元し次いでＳ−Ｓ基を介して酵素を架橋させ
ることにより活性化させる。この種の別の活性化
は米国特許3802909に開示されている：ガラスを
タンパクの存在下で破壊し、タンパクに結合すべ
き新たに調製された活性部位を得る。この種の別
の活性化は米国特許3519538に開示されている：
ガラスを一連の化学薬剤で処理し所望の活性部位
を得る。固定化酵素の他の製造方法がバイオケミ
カルアンドバイオフイジカルリサーチコミユニケ
ーシヨン（Biochemical and Biophysical
Research Communications）、36巻、235〜242
頁（1969年）に開示されている：酵素をあらかじ
め活性化することなくコロイドシリカ表面に吸着
させ次いで更にグルタルアルデヒドを用いて架橋
することにより固定化する。 上記のすべての方法は、担体上で活性部位に直
接付着した酵素分子の薄い層によつて特徴づけら
れており従つて固定化される酵素の量は活性部位
の数によつて決定される。 研究方法のちがいはすべて担体表面に付着され
る層をより厚くすることであり、これにより酵素
分子の小部分のみが担体に直接接触する。この様
な方法において固定化される酵素の量を決定する
のは担体の表面積ではなく、そしてこの方法は最
終の使用中においてプロセスのパラメーターに依
存しつつ、結合される酵素の量を最適化すること
が可能である。しかしながら、この方法は実行す
ることがより困難である。なぜならば相当に多量
の酵素が固定化中にそれを適切に保持することを
困難にしているからである。従つてその明らかな
利点にも係わらずこの方法による文献は比較的に
少ない。カナダ特許1011671及び同1011672に開示
された、一つの提案は架橋媒体として水溶性有機
溶剤の水溶液を使用することであり、この有機溶
剤の濃度は酵素を不溶性に保つのに十分に高く保
持され、しかも架橋反応をひどく紡害しないのに
十分な低さである。この方法に関しての主な欠点
は精巧な安全対策を必要とする爆発の危険性をと
もなう、相当に多量の有機溶剤を必要とすること
である。更にこの方法によつて得られる生成物が
物理的安定性及び回収活性度の見地から全く満足
出来ない。おそらくこれは固定化中に溶液から酵
素を保持するのに必要な有機溶剤の濃度が比較的
高い為であろう。この問題に関係する他の方法が
米国特許4116771に提案されている：限られた水
の容積中酵素を、担体に速やかに添加する前にグ
ルタルアルデヒド及び不活性タンパクで処理し、
次いでゲル化し、次いで粒状化し更に最終的に乾
燥する。この方法の主な欠点は、架橋剤の濃度が
高いことであり、これは水の量が限られたことに
よる。多くの酵素は、架橋剤の高濃度に非常に鋭
敏である。なぜなら該酵素は、後の使用中広範囲
の架橋のため失活するか、又は近づき難いものと
なるかのいずれ、あるいは又その双方の理由によ
る。このことは多量の酵素を担体に適用する場合
の主な困難さを説明している：十分に低濃度の架
橋剤を得る為、比較的多量の媒体を必要とし、こ
れは架橋が有効なものとなる前に、酵素が媒体中
に溶解することを紡げる事を不可能にし、一方酵
素を溶解した状態に保ち得る架橋剤の高濃度は先
に説明した様に望ましくない。 上記問題に対する全く異つた研究方法は、水性
媒体をすつかり排除する事であり、更にそのかわ
り気体相を用いる事である：これはジヤーナルオ
ブソサイエテイオブケミカルインダストリー
（The Journal of Society of Chemical
Industry）、18巻、16〜20ページ（1899年）にお
いて不溶性ゼラチン繊維の製造に対し記載されて
おり、更に酵素の固定化に対し日本特許
J57002683において開示されている。しかしなが
ら、この方法は非常に精巧な通風システムを要求
し、更に通風システムの内側に不溶性付着物が形
成するのを防止する特別な手段を必要とする。 かくして、本発明の目的は架橋剤を用いること
による固定化酵素製剤の製造方法を提供すること
にあり、該方法は実施するのに簡易であるべきで
あり、たとえば精巧な安全設備を必要とすること
がなく、更にこの方法により固定化酵素の高い酵
素活性の回復性並びに良好な物理的安定性をとも
なつて製造され得る。 今や、本発明によれば以下の事実が見い出され
た：すなわち、ある種の塩を特定した最少濃度で
使用することにより上記目的を達成することが可
能である。仮に先に引用した従来技術が担体のみ
を用いた固定化酵素製剤に関連するとしても、本
発明はその様な固定化酵素製剤に限定されるもの
ではなく、同様の担体を用いない固定化酵素製剤
をも包含するものである。 かくして本発明は架橋剤を用いる固定化酵素製
剤の製造方法において、以下の成分： (a) 固体又は溶解した状態の酵素製剤、 (b) 架橋剤として、水性媒体中0.001〜５％
（ｗ／ｖ）濃度のグルタルアルデヒド及び (c) 0.2M〜飽和濃度の、燐酸、硫酸、クエン酸、
もしくは酢酸の各々のアルカリ金属塩又は硫酸
水素アルカリ金属塩又はそれらのいずれかの組
合せの塩の群から選ばれる水溶性塩、を水性媒
体中に一緒に導入し、しかる後固定化酵素を回
収する、前記方法を提供するものである。 得られた最終の固定化酵素が過剰の架橋剤を含
有する場合、この架橋剤は洗浄することにより除
去出来る。 酵素製剤は固体又は溶解した状態で存在出来る
ことが理解されるべきであり：更に酵素製剤は高
純度であるか、又は不活性添加剤（たとえば充填
剤、強化剤、結合剤もしくは粒状化剤）を含有す
ることが出来る。更に成分が共に導入される順序
は任意である。但し、塩の添加の前に酵素製剤及
び架橋剤をいつしよに導入する場合においてもし
も塩の添加がゆえなく遅れる場合酵素の収率は減
少するであろう。 先に示したカテゴリーの塩は（これにより特定
のカテゴリーの塩が、特定の酵素及び特定の架橋
剤の各々の組み合わせに設定される）、通常安価
な塩を含む。一種又はそれ以上の酵素製剤、一種
又はそれ以上の架橋剤及び一種又はそれ以上の塩
が、本発明方法において使用出来ることが理解さ
れるべきである。 本発明に係る方法の好ましい態様において、酵
素製剤は担体を含んで成る。本発明方法は担体な
しでも実施することが出来る（たとえば例15参
照）けれども、通常は担体を用いるのが好まし
い：これは主に充填層の操作に対し有用であるす
ぐれた流動特性を有する粒子を製造することに対
する、担体によつてもたらされる可能性の故であ
る。酵素が固体状態又は溶解した状態であろうと
なかろうと、この場合酵素は担体に密接に関係し
ている：固体状態において酵素は担体上で被覆層
であり、更に溶解状態において酵素溶液は（多孔
性の）担体を含浸させる。 本発明方法の好ましい態様において、酵素製剤
は固体酵素の層で被覆された担体である。これに
より酵素の層の厚さを変えることにより広い範囲
内で希望の酵素を担持した酵素製剤を製造するこ
とができる。 本発明方法の好ましい態様において、酵素製剤
は酵素溶液を含有した多孔性の担体である。これ
により本発明に係る固定化酵素の製造に対する非
常に簡単な方法が提供される。 本発明方法の好ましい態様において架橋剤はグ
ルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドは
比較的安価であり保険当局による異議はない。
又、多くの酵素に関しグルタルアルデヒドは非常
に有効でありしかもおだやかな架橋剤である。 本発明の好ましい態様において水性媒体中のグ
ルタルアルデヒド濃度は0.001〜５％（ｗ／ｖ）、
好ましくは0.005〜１％（ｗ／ｖ）、である。 本明細書における後記の実施例から明らかな様
に酵素活性回復性（回復率）はグルタルアルデヒ
ドの濃度に依存し、更に最大酵素活性回復に対応
するグルタルアルデヒド濃度は通常先に示された
範囲内で見い出される。グルタルアルデヒドの％
（ｗ／ｖ）は次式： グルタルアルデヒドの量（ｇ）／（塩の溶液及びグルタ
ルアルデヒド）の容量(ml) ×100 に従つて計算される。 本発明の好ましい態様によれば、塩は第２、第
３又は第４アンモニウムもしくは一種のアルカリ
金属のスルフエート、ホスフエート、シトレー
ト、ビカーボネート、カーボネート、フルオライ
ド、アセテート、タートレート、ポリスルフエー
ト、ポリホスフエート、フエロシアニド、フエノ
ールスルホネート、ソルベート、エチルスルフエ
ート、クロリド、ニトレート及びサクシネートか
らなる群から選ばれ、特に硫酸ナトリウム、燐酸
ナトリウム、燐酸カリウム及びクエン酸カリウム
である。一般にこれらの塩は安価でありかつ回収
可能であり、実に高い酵素活性回復性を有する固
体化酵素製剤の製法に対する可能性を有してい
る。 本発明方法の好ましい態様によれば、塩の濃度
は0.1M〜飽和の範囲であり、特に約0.5M〜約
3Mの範囲である。後の実施例から明らかな様に、
非常に高い酵素活性回復性をもたらす、先に示し
た範囲内のグルタルアルデヒド濃度及び塩のモル
濃度を選択することが可能である。 本発明方法の好ましい態様によれば、酵素はグ
ルコースイソメラーゼ、アミラーゼ、特にアミロ
グルコシダーゼ、プルラナーゼ、ラクトース、ペ
クチナーゼ、ナリンギナーゼ、ペニシリンアシラ
ーゼ、イヌリナーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼ
から成る群から選ばれる。 かくして、もし酵素が固体状態である場合、先
に示した塩を、酵素の沈殿の為に必要とされるよ
りもより低い濃度で用いる場合においてさえその
使用により、すべての実際的目的に対し酵素は架
橋剤（塩溶液）中に溶解されず、この間酵素は架
橋剤に十分利用できる様に保持されるか又は、も
しも酵素が溶解している場合、酵素は塩の溶液と
混合されない。この様にして、最適濃度の架橋剤
が使用でき、これにより極めて最少の損害を酵素
に与えるだけであり、しかも十分に良好な物理的
安定性を付与する。かくして以下の事実が見い出
された。すなわち、架橋剤濃度を減少するために
は、最適レベルで酵素活性回復性を保持する為の
塩の濃度を増加しなければならない事である。本
発明によれば、酵素又は架橋剤たとえば銀もしく
は水銀塩（これらは酵素を失活し得る）のいずれ
かと反応する塩、又はアンモニウム塩もしくは第
一級アミン塩もしくはスルフイツト塩（これらは
多種の架橋剤と反応する傾向にある）の使用は避
けるべきである。本発明の目的の為に使用出来る
塩は、それらの有効性に関し非常に広範囲であ
り、更にそれらの有効性は酵素に応じて変化する
傾向にある。しかしながら塩の選択に関しいくつ
かの幅広いガイドラインを次のごとく説明するこ
とが出来る：二種の塩が性質に関しもし同一でな
い場合より可溶性の塩を選ぶことが推奨される。
従つてNa₂SO₄はより高い溶解性の故に、K₂SO₄
よりも通常好ましい。又以下の事実も見い出され
た。すなわち一般に多価アニオンの塩、たとえば
スルフエート、ホスフエート、カーボネート、シ
トレート等は一価のアニオンたとえばクロリド及
びニトレートより有効である。しかるにカチオン
に対しては通常その逆が好ましい：一価のカチオ
ン、たとえばNa⁺、K⁺又はテトラメチルアンモ
ニウムは多価アニオンたとえばMg⁺⁺又はカルシ
ウム⁺⁺より有効である。従つて好ましい塩はスル
フエート、ホスフエート及びシトレートのアルカ
リ金属塩であり、特に硫酸ナトリウム、燐酸ナト
リウム、燐酸カリウム、クエン酸カリウム及びテ
トラメチルアンモニウムスルフエートである。 塩の濃度は通常最少に保たれる。この最少値は
一方では当面の酵素に依存する：なぜならば酵素
が異なればしばしば異つた濃度を要求するからで
あり、更に又一方では架橋剤濃度に依存する。架
橋剤濃度が高ければ高い程、より少ない塩が必要
とされ、そして逆もまた同じである。架橋剤濃度
は又、多くの酵素が架橋剤に鋭敏であるので最少
に保持される。しかし該濃度は有効な固定を確保
するために十分高くなければならない。しかしな
がら特に有効な塩を用いる場合、非常に高い塩の
濃度での架橋反応に対する最適条件を確立する場
合、特に留意が必要である。かくして以下の事実
が見い出された：たとえば高濃度のNa₂SO₄又は
燐酸カリウムにおいては活性率は適当な濃度での
それらに比較して相当に減少している。これはお
そらく酵素分子を部分的に利用できない様にして
いる非常に強固な架橋の為であろう。 もしも酵素が固体状態で存在するならば、架橋
媒体中でこれらの塩を使用する別の利点は粒子を
含有する酵素が固定化反応中凝集することを妨げ
ることにある。この様な凝集はそれが使用中に有
効性及び流動特性を低下せしめることとなるので
好ましくない。又この点において塩は大いに異つ
ている。 本発明方法は多くの工程で行なうことが出来、
その順序は限定されない。たとえば本発明の好ま
しい態様において、まず担体が酵素溶液で処理さ
れ、乾燥され次いで架橋剤及び塩を含有する溶液
で処理され、洗浄され更に所望により乾燥され
る。同じプロセスの変法において、塩の全量の１
部が酵素溶液中に含有される。別の変法におい
て、まず酵素が架橋剤で処理され、その後ただち
に塩で処理される。ある種の目的に対し、たとえ
ば固定化酵素が少なくかつ繊維状であることが望
まれる場合、担体の量は非常に少ないか、又は担
体は全く避けられ、かつ酵素は架橋剤及び塩を有
する凝固浴中で処理される。従つて酵素は塩浴中
で凝固する溶液中に溶解され、架橋剤は凝固前又
は凝固後のいずれかで、酵素溶液又は該浴に添加
される。又、塩は、水の量を制限することが望ま
れる場合溶液の変わりに乾燥粉末として添加され
る。従つて異つた成分を導入する順序、又はそれ
らの状態つまり溶液であるか又は乾燥しているか
は本発明方法に対し限定されない。 架橋反応のPH温度及び持続時間は酵素及びもし
存在するとして不活性担体に依存しつつ、活性度
の回復性に対し深遠な効果を有する。一般に約４
〜約９の範囲のPHが適当であることが見い出され
た。多くの場合に適当な温度範囲は約15℃〜約30
℃であるが、ある種の場合、たとえば架橋反応時
間を短くすることが望まれる場合、より高温度が
有利に用いられ、更に非常な感温性酵素の場合に
はより低い温度が有利に用いられる。架橋反応時
間は架橋剤のタイプ及び濃度、塩のタイプ及び濃
度、酵素、PH及び温度に依存して２〜３分から数
日の範囲で変化し、従つて各々のケースに応じて
決定されるべきである。しかるにグルタルアルデ
ヒド及び大部分の酵素に対しては、室温で約10分
〜数時間の範囲が適当と思われる。 以下の文章において、別々のノボ（Novo）の
文献が参照される。これらのすべての参照文のコ
ピーはノボインダストリーＡ／Ｓ（Novo Alle、
2880、バグスバードデンマーク）から入手出来
る。 本発明方法を次の実施例によつて説明する。 実施例を含む明細書の以下の箇所において、カ
ラム操作中の圧力降下（物理的強度）の値が示さ
れる。この値はノボの実験手順を記載する、
AF166／２に従つて決定される。この圧力降下の
決定に関するいくつかの理論的考察がStarch／
Starte 31（1979）No.１、13〜16頁に記載されてい
る。公知の商品と比較する為、固定化グルコース
イソメラーゼ製剤SWEETZYMEに対する圧力降
下の最も良い値は約10ｇ／cm²であることが言及さ
れる。次の実験から本発明方法によつて製造され
る固定化酵素製剤に関する圧力降下は２ｇ／cm²の
低さであり、更にすべての値は10ｇ／cm²よりも相
当に低く、これにより本発明の利点が明らかに証
明される。 例 １ 28％ｗ／ｗの程度に部分的に精製したグルコー
スイソメラーゼ製剤でコートされかつ係続するデ
ンマーク出願第4430／82における実施例８に記載
された方法によつて製造される乾燥担体粒子20ｇ
の部分を、PH7.0に調節した。0.06M燐酸ナトリ
ウム、1.4M硫酸ナトリウム及び種々の量のグル
タルアルデヒドを含有する溶液500ml中に懸濁さ
せ次いで室温でおだやかに撹拌した。１時間後粒
子を除去し次いでPH7.0に調節した0.06M燐酸ナ
トリウム溶液に１時間懸濁させた。この洗浄を三
回くり返し、次いで粒子をホスフエート溶液中で
１昼夜放置し、しかる後その活性度をNOVO分
析AF 189／１に従つて決定した。結果を第１図
に示すがこの第１図はグルタルアルデヒドの％を
酵素単位／ｇで表わした酵素活性回復性に対しプ
ロツトした物であり、これはグルタルアルデヒド
に対する酵素の感度を示す。 例 ２ （比較） 粒子を例１に記載したと同様に調製したが、塩
は添加せず、最少量のホスフエートを緩衝剤
（0.06M燐酸ナトリウム、PH6.5）として役立たせ
た。グルタルアルデヒドの％を酵素単位／ｇで表
わされる酵素活性回復性に対しプロツトした（第
２図参照）。この図は架橋剤が二つの相反する作
用を有することを示している：一方では該架橋剤
は酵素を溶解させない様にして収率を増加させ；
他方では酵素を失活させることにより収率を減少
させる。この場合、最適値はグルタルアルデヒド
１％付近に設定される。第１図及び第２図の比較
から、グルタルアルデヒド濃度の最適値は硫酸ナ
トリウム1.4Mの約40倍である様に思われ、更に
この場合収率は塩を用いた場合の収率のわずか約
60％であろう。 例 ３ 粒子を例１におけると同様に調製したが、この
場合燐酸カリウムを塩として用い、更に該塩の濃
度は、グルタルアルデヒド濃度を三段階にかつPH
を6.5に保持しつつ変化させた。燐酸カリウムの
％を酵素単位／ｇで表わされる酵素活性回復性に
対しプロツトした（第３図参照）。この図から塩
の濃度が増加すると明らかに有効な作用が表わ
れ、特に低濃度のグルタルアルデヒドは有効であ
る。 例 ４ 例３における実験をくり返したが、この場合硫
酸ナトリウムを燐酸カリウムの変わりに用いた。
Na₂SO₄のモル濃度を酵素単位／ｇで表わされる
酵素活性回復性に対しプロツトした（第４図参
照）。この図から塩の有用な効果が明らかに現わ
れる。又第４図から明らかな様に、塩の作用に対
し最適値が存在し、この最適値以上では活性回復
性は減少し、これによりこの最適値はグルタルア
ルデヒド濃度に依存する。 例 ５ 例３に説明した実験をくり返したが、塩の濃度
だけを増加させた。燐酸カリウムのモル濃度を、
酵素単位／ｇで表わされる酵素活性回復性に対し
プロツトした（第５図参照）。第４図及び第５図
の比較からNa₂SO₄及び燐酸カリウムは同様の挙
動を示すことがわかる。 例 ６ 例１で説明した実験をくり返したが、架橋剤に
溶解したホスフエート及びスルフエートの変わり
に、PH7.0のクエン酸カリウムを用いた。第６図
において、グルタルアルデヒド濃度を酵素単位／
ｇで表わされる活性度に対しプロツトしたが、結
果は例１の結果にあきらかに似ている。 例 ７ 継続しているオランダ出願4430／82における実
施例４と同様に製造した乾燥担体粒子20ｇをLab
型流動床で流動化させた。バチルス（Bacillus）
sp.NRRL Ｂ−11、229から得られる高温ラクタ
ーゼ80.1U／ｇを含有する11.1％ｗ／ｗのホモジ
ユナイズした細胞スラツジ（デンマーク特許出願
5190／79の例１で示されると同様に発酵させた、
デンマーク特許出願5190／79の例４で示されると
おりに製造したスラツジ）45.8ｇを、30〜40℃で
担体粒子上にスプレーし、次いでコートした粒子
を乾燥せしめた。ラクターゼ活性単位を、次の反
応条件下で毎分1μmolのラクトースを放出させ
る、ラクターゼの量として定義される：基質濃度
は10％ラクトース、温度は60℃、PHは6.5及び反
応時間は30分である。酵素活性回復性は79.8％で
あつた。次いでコートされた球体10ｇを、0.06M
Na₂HPO₄、1.4M Na₂SO₄及び0.1％ｗ／ｖグル
タルアルデヒドを含有する溶液250ml中PH7.5で処
理した。室温で１時間後粒子を除去し次いでPH
7.5で0.06M K₂HPO₄を用いて完全に洗浄した。
架橋工程に関し活性回復性は17.2％であつた。 例 ８ 継続するデンマーク出願4430／82における実施
例４と同様に製造した乾燥担体粒子24ｇを、市販
製品AMG200L（ノボパンフレツトにNOVO
AMG、Ｂ 020 ｇ−GBと記載）を限外濾過法
により製造されるＡ、ナイガー（Niger）から得
られる39.6％ｗ／ｗの部分精製アミログルコシダ
ーゼ20.2ｇ溶液中で浸漬し、39.6％ｗ／ｗの乾物
濃度（活性2610IAG／ｇ、活性単位はノボ分析基
準AF 159／２で定義される）に低分子成分を除
去する。真空条件を１時間付与した。この様にし
て得られた成生物は77.9％の酵素活性回復性を有
する乾物部分精製アミログルコシダーゼ25重量％
を含有した。 次いで乾物71.8％を有する粒子20ｇを、0.06M
NaH₂PO₄、1.4M Na₂SO₄及び0.2％グルタルア
ルデヒドの溶液1600ml中PH4.5で処理した。１時
間後粒子を濾過して除去し、0.06M NaH₂PO₄を
用い、PH4.5で洗浄した。 架橋工程に関し酵素活性回復性は55.1であつ
た。 例 ９ 継続するデンマーク出願4430／82における実施
例４に示したと同様に製造されかつ乾燥物質濃度
98.8％を有する担体粒子48ｇ並びに５％のグルコ
ース及び８％の硫酸ナトリウムを添加した（乾燥
物質41.8％）、真空蒸留で部分精製したバチルス
コアギユランスグルコースイソメラーゼコンセン
トレート24ｇを混合し、次いて液状物から、真空
処理により粒子の孔内の空気を放出せしめた。混
合後の重量は63.22ｇであつた。乾燥物質は79.2
％であつた。 この製剤の18ｇ部分（14ｇまでの乾燥物質）
を、すべての場合において、PH7.5に調節した、
1.5Mの硫酸ナトリウム、５％のグルコース及び
0.06Mの燐酸ナトリウムを含有する溶液375ml及
び更に0.1又は0.2又は0.3％のグルタルアルデヒド
を用いて室温で１時間処理した。 この処理の後、該部分をPH7.5の１％の燐酸ナ
トリウム約150mlを用いて五回洗浄した。 酵素活性を、粒子から液体を除去した後AF
189／１に従つて決定した。更に乾燥物質と液体
を除去した粒子について決定した。

【表】 ントレー
ト＋担体

【表】 固定化
乾燥物質５ｇに等価の部分を圧力降下に対し試
験した。

【表】 例 10 この例は、担体としてノリツト（Norit）から
入手される活性化炭素をもとにした固定化酵素製
品を製造する方法を説明する。ノリツトロツクス
（Norit Rox）0.8の活性化炭素、タイプＡ−3397
の20ｇを、バチルスコアギユランス（Bacillus
coagulans）から得られる39.2％ｗ／ｗの部分精
製グルコースイソメラーゼ（活性度3950U／乾物
（ｇ）、活性単位はノボ「分析基準」AF 189／１
で定義される）の溶液33ｇ中で浸漬した。 ４℃で20時間真空条件を付与した：ただし真空
はこの時間中４度開放した。この様にして得られ
た製品は97％の酵素活性回復率を有する部分精製
グルコースイソメラーゼ乾物35重量％を含有し
た。 次いで98％の先に示した凝集産物を4N NaOH
を用いてPH7.5に調節した0.06MのKH₂PO₄、
1.4MのNa₂SO₄及び0.18％のグルタルアルデヒド
の溶液890ml中で固定化した。室温で２時間おだ
やかに撹拌した後、粒子を濾過して除き次いでPH
8.0の0.06M KH₂PO₄で完全に洗浄した。架橋工
程に関し活性の回復性は31％であつた。 例 11 この例は直径約２mmを有するシリカ球体から成
る担体を用いた固定化酵素製剤の製造方法を説明
する。 Ａ シリカ球体20ｇを実験室用タイプの流動床内
で流動化させ、次いでバシラスコアギユランス
源の15％ｗ／ｗ部分精製グルコースイソメラー
ゼ（活性度3306U／乾物（ｇ）、活性度はノボ
分析基準AF 189／１で定義される）の40ｇ溶
液を25〜30℃で球体上に散布し、次いでコート
した球体を乾燥させる。得られた生成物は活性
度の78％回復率を有する部分精製グルコースイ
ソメラーゼ23重量％を含有した。 次いでコートした球体の95％を、4N NaOH
でPH7.5に調節した、0.06MのK₂HPO₄、1.4M
のNa₂SO₄及び0.1％ｗ／ｖグルタルアルデヒド
を含有する溶液500ml中で処理し：室温で１時
間後粒子を除去し次いでPH8.0の0.06Mの
KH₂PO₄で完全に洗浄した。しかる後活性度を
測定した。 架橋工程に関する活性回復率は55％であつ
た。 Ｂ シリカ球体20ｇを、0.56MのNa₂SO₄を添加
したバシラスコアギユランス源の40％ｗ／ｗ部
分精製グルコースイソメラーゼ（活性度
3270U／乾物（ｇ））の溶液15ｇに浸漬した。
20分間真空状態を付与した。ただし真空は該期
間中４度開放した。この様にして得られた生成
物は90％の酵素活性回復率を有する部分精製グ
ルコースイソメラーゼ20重量％を含有した。次
いでコートされた球体の95％をこの例のパート
Ａで説明したごとく処理した。架橋工程に関す
る活性回復率は45％であつた。 酵素が特に架橋するのに困難である様ないくつ
かの場合において、もしも酵素が純粋な状態で固
定化しなければならない場合、塩は有利であるの
みならず不可欠でもある。よい例はアミログルコ
シダーゼであり、これはノボ（NOVO）社によ
つて製造されかつたとえば商標名AMG 200Lの
もとで市販されており（小冊子ノボ酵素AMG、
BB 020 ｇ−GB2500 ７月1982年参照）、これは
純粋な状態にある場合実際固定化することは不可
能である：このアミログルコシダーゼを50％ｗ／
ｗのグルタルアルデヒドのごとき高濃度において
さえも不溶化することは困難であることがわかつ
た。しかしながら本発明で使用する塩（相当高い
濃度ではあるが）を用いることにより、次の例12
〜17によつて実証されている様に、0.05％ｗ／ｖ
のグルタルアルデヒドのごとき低濃度においてさ
え酵素を有効に不溶化することが可能である。す
ぐれた濾過性並びに容易に浮揚しうる、得られた
製剤はたとえば低カロリービールの製造において
有利に用いられる。 例 12 乾燥物質濃度30％ｗ／ｖに希釈した市販の
NOVO AMG 200Lを、ハイフロセライト
（Hyflo Celite）（珪藻土）と混合し次いで乾燥
し、これによりAMG製剤から帰因する乾物21％
ｗ／ｗを含有する製剤を得た。次いで製剤の１ｇ
部分をPH6.5の燐酸カリウム0.06M、2.4Mの
Na₂SO₄及び種々の濃度のグルタルアルデヒドを
含有する溶液に32℃で添加し、次いで全混合物を
20時間該温度で放置した。次いで粒子を濾過し更
に脱イオン水で３回洗浄し、更に活性収率を測定
した。結果は、0.05％で最適を示すグルタルアル
デヒドの２個の相対する作用を示す類似のパター
ンを示す（第７図参照）。 例 13 例12におけると同様の手順をくり返したが、こ
の例では異つた濃度のNa₂SO₄を用いた。この酵
素に関する活性回復性は存在する塩の量に非常に
鋭敏である（第８図参照）。 例 14 例12の手順をくり返したがこの例においては酵
素の半分のみを含有するAMG製剤を用いた。そ
の結果最適グルタルアルデヒド濃度が低濃度にシ
フトしていることが明らかに観察された（第９図
参照）。 例 15 NOVO AMG 200Lをスプレー乾燥し次いで得
られた粉末を出発原料として用い、更にいく分手
順を変えた：AMG粉末0.5ｇを、2.5Mの
Na₂SO₄、PH6.5を有する0.1Mの燐酸カリウム並
びに１％ｗ／ｖのグルタルアルデヒドを含有する
溶液100mlに32℃で添加し、次いで時々振とうさ
せながら該温度で１時間放置した。この様にして
形成した不溶性粒子を濾過し次いでグルタルアル
デヒドなしで、再び該媒地中でインキユベート
し、更に20時間同温度でインキユベートした。次
いで濾過し脱イオン水で三回洗浄した。これらの
易濾過性微小球は10〜100μｍの直径を有し、更
に最初の活性を19％保持していた。 例 16 例15の手順と同様の手順を行なつた。ただしグ
ルタルアルデヒドは酵素粉末を塩の溶液に添加し
た後、該塩溶液に添加した。最初の活性の34％を
有する同様の生成物を得た。 例 17 例15の手順を再びくり返したが、ただ0.4％
ｗ／ｖグルタルアルデヒドを用い更に全体のイン
キユベーシヨンを３時間に短縮した。最初の活性
の37％を有する生成物を得た。 例 18 この例はグルタルアルデヒド以外の他の架橋
剤、すなわち多価カチオンを用いた本発明方法の
適応性を示す。この例においてSn⁺⁴を架橋剤と
して用いた。すなわち架橋前の状態において、例
12からのセライト−AMG（Celite−AMG）製剤
0.5ｇを、2MのNa₂SO₄、0.4Mの酢酸カリウム
（PH4.35）及び0.0086MのSnCl₄、５倍のH₂Oを含
有する溶液100mlに撹拌しながらゆつくり添加し、
更に該混合物をときおり振とうさせながら室温で
５時間放置した。精製した粒子を濾過し次いでPH
4.35の0.2M酢酸カリウム100ml中に懸濁させ次い
で懸濁液を５分間撹拌した。この手順を三回くり
返した。最終生成物は43％の酵素活性回復率を有
していた。 例 19 この例において生成物は例18に記載した方法に
従つて製造したがただアセテート及び錫塩の濃度
はそれぞれ２倍の0.8M及び0.017Mであつた。同
様の製品を得、酵素活性回復率は65％であつた。 例 20 この例においても例18と同様の手順をくり返し
たがただアセテート濃度は半分すなわち0.2Mに
減少せしめた。再び同様の生成物を、48％の酵素
活性回復率を持つて得た。 例 21 この例においては他の架橋剤すなわちベンゾキ
オンの使用を説明している。すなわち例12におけ
るごとき乾燥セライト−AMG製剤0.5ｇを、
2.1MのNa₂SO₄及び0.05Mの酢酸ナトリウムを含
有する溶液75mlに添加し、次いで純粋エタノール
に溶解した20％ｗ／ｖのベンゾキノン溶液５mlに
添加し、次いで全混合物を室温で80分間放置し、
ときおり撹拌した。精製した粒子を濾過し、PH
4.4の0.1M酢酸カリウム緩衝液75ml中に懸濁さ
せ、５分間撹拌し次いで再び濾過した。この手順
を三回くり返し、活性度を測定した。酵素活性回
復率は14％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図それぞれグルタルアルデヒド
及び酵素単位／ｇの関係を示すグラフであり、第
３図は燐酸カリウム及び酵素単位／ｇの関係を示
すグラフであり、第４図は硫酸ナトリウムと酵素
単位／ｇの関係を示すグラフであり、第５図は燐
酸カリウムと酵素単位／ｇの関係を示すグラフで
あり、第６図はグルタルアルデヒドと酵素単位／
ｇの関係を示すグラフであり、第７図はグルタル
アルデヒドと回復率（％）の関係を示すグラフで
あり、第８図は硫酸ナトリウムの回復率（％）の
関係を示すグラフであり、第９図はグルタルアル
デヒドと回復率（％）の関係を示すグラフであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 架橋剤を用いる固定化酵素製剤の製造方法に
   おいて、以下の成分： (a) 固体又は溶解した状態の酵素製剤、 (b) 架橋剤として、水性媒体中0.001〜５％
   （ｗ／ｖ）濃度のグルタルアルデヒド及び (c) 0.2M〜飽和濃度の、燐酸、硫酸、クエン酸、
   もしくは酢酸の各々のアルカリ金属塩又は硫酸
   水素アルカリ金属塩又はそれらのいずれかの組
   合せの塩の群から選ばれる水溶性塩を水性媒体
   中に一緒に導入し、しかる後固定化酵素を回収
   する、前記方法。 ２ 前記酵素製剤が担体を含む、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３ 前記酵素製剤が固体酵素の層でコートされた
   担体である、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 前記酵素製剤が酵素溶液で含浸された多孔性
   担体である、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５ 前記酵素がグルコースイソメラーゼ、アミラ
   ーゼ、特にアミログルコシダーゼ、プルラナー
   ゼ、ラクターゼ、ペクチナーゼ、ナリンギナー
   ゼ、ペニシリンアシラーゼ、イヌリナーゼ、リパ
   ーゼ及びプロテアーゼから成る群から選ばれる、
   特許請求の範囲第１〜第４項のいずれか１項に記
   載の方法。