JPH04507198A - 核酸の交雑、増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 の六　−・＝ 発明署の技術分野 本発明は、ＲｅｃＡ蛋白質を触媒として使用することによってＤＮＡの合成、修 復および増幅反応を促進する方法に関するものである。

参照文献 ブラホ、　Ｊ、　Ａ、等ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍｇ第２６２巻第６０８２ 頁（１９８７年）； チェフグ。Ｓ０等「Ｊ−Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｊ第２６３巻第１５１１０頁 （１９８８ズ、イン、ゼネチック、アンド、インフェクシャス、ディシーズ、ア ンド、カンサーＪ　（Ｌ、Ｓ、ラーマン編、コールド、スプリング、ハーバ−、 ラボラトリ発行）第１３７頁−第１４１頁に記載の論文（１９８６年））； コックス、　Ｍ、Ｍ、等ｒＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、　Ｊ第５６ 巻第２２９頁（１９８７年）； ソックス、　Ｒ，Ｐ、Ｐ、等ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ第１１巻第２６５９頁（ １９７２年）；ソックス、　Ｒ，Ｐ、Ｐ、等ｒ　Ｂｔｏｃｈｅｍ−Ｊ第１５巻第 ３３４７頁（１９７６年）；グリーン、　Ｃ，Ｊ、等ｒＢ　Ｓ　Ｎｕｃｌ、　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　」第■巻第５７６３頁−第５７４４頁（１９８３年）； ヒンジャーテ４．Ｂ、Ｅ、等ｒＪ、　ｏｆ　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒｅａｎｄ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ」第４巻第３６５頁（１９８６年）；グ リーン、　Ｅ、　ｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、Ｊ第３２巻第２０４２頁（１９７２ 年）；リーヒ、　Ｍ、Ｃ，等ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ＋ｇ第２６１巻第６ ９５４頁−第６９６０頁（１９８６年）； すｓ、Ｃ，等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　Ｊ第 ８３巻、第６１９頁（１９８６年）； マンコンログ、Ｌ１等ｒＮａｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｊ第１６巻、 第９８６９頁（１９８８年）； マディラジｚ、　Ｍ、Ｖ、Ｖ、Ｓ、等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｅｔ、（ＵＳＡ）　Ｊ第８５巻第６５９２頁（１９８８年）；マニアチス、Ｔ 等「モレキュラー、クローニングニア、ラボラトリ、マニュアル」コールド、ス プリング、ハーバ−、ラボラトリ（米国ニューヨーク州コールド、スプリング、 ハーバ−）１９８２年発行； マリス、　Ｋ、Ｂ、等、米国特許第４，６８３．１９５号明細書（１９８７年） ；マリス、　Ｋ、Ｂ、等、米国特許第４．６８３，２０２号明細書（１９８７年 ）；ラディング、　Ｃ，Ｍ、等ｒＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔｇ第１６巻第 ４０５頁（１９８２年）； リガス、Ｂ１等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡＪ第 ８３巻第９５９１頁−第９５９５頁（１９８６年）； セージ、Ｅ１等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ　 Ｊ第７７巻第４５９７頁（１９８０年、）； セージ、Ｅ０等’Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　Ｊ第９巻第１２４１ 頁（１９８１年）； サンテラ、　Ｒ，Ｍ、等ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｊ第９巻第５ ４５９頁（１９８１年ａ）？ サンテラ、　Ｒ，Ｍ、等ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡＪ第７８巻第１４５１頁（１９８１年ｂ）； サイキ、　Ｒ，に、等ｒＳｃｉｅｎｃｅ　Ｊ第２３９巻第４８７頁（１９８８年 ）；シー、　Ｙ−８，等ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｊ第１６巻第 ８９４５頁（１９８８年）； シルパークラング、Ｍｌ等「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｊ第５ ９巻第５８頁（１９７９年）； シュルディナー、　Ａ、Ｒ，等ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｊ第１ ７巻第４４０９頁（１９８９年）； ウェルズ、　Ｒ，Ｄ、等ｒＢｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、　Ｊ第２５７巻第１０１６６ 頁（１９８２年）； ザーリング、　Ｄ、Ａ、等ｒＪ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　１７６第３ ６９頁（１９８４年ａ）； ザーリング、　Ｄ、Ａ、等’Ｊ、　Ｂｉｏｌｍｏｌ　５ｔｒｕｃｔ、　Ｄｙｎａ ｍ、　Ｊ第１巻第１０８１頁（１９８４年ｂ）； ザーリング、Ｄ、＾１等ｒＪ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｔｏｌ、　Ｊ　ムｈ第１４７ 頁（１９９０年）； 従来の技術 ＲｅｃＡ十蛋白質（野生型）は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の 中に見出される３８，０００ダルトンの蛋白質であって、これはＤＮＡの相同組 換えのために重要な物質である。これに関する最も重要な生物化学的および酵素 学的情報は、精製されたＲｅｃＡ＋蛋白質を用いる研究によって得られる。種々 の種類の試験管内研究の結果から、ＲｅｃＡ十蛋白質は、最終的に“相同組換え ”という結果をもたらす相同ＤＮＡ配列間の対合反応（ｐａｒｉｎｇ　ｒｅａｃ ｔｉｏｎ）の性質に関する最近の研究結果については、コックス等の論文を参照 されたい）　、　ＲｅｃＡ十蛋白質は前記対合反応に関与するので、これは、診 断や治療分野へのＤＮＡの利用の際に非常に有利に使用できるものであると考え られる。

ＡＴＰの存在下では、ＲｅｃＡ＋蛋白質は複数の基質間の連鎖交換反応を促進す る。ＤＮＡプローブの利用分野に最も密接に関連するＤＮＡは、一本ＩＮ　Ｄ　 Ｎ　Ａおよび二本ＭＤ　Ｎ　Ａである。−末鎖ＤＮＡ（プローブ）は二本鎖の（ 天然型の）標的配列の相同的部位に作用し、組換え反応の中間体を最初に形成す る。該中間体は、交雑しかつ部分的に合体した複数の分子を含有するものである 。その後に、分岐点移動によって、元の１本鎖ＤＮＡと２本鎖Ｄ　Ｎ　Ａとの完 全交雑分子が生じる。この反応は、元の２種のＤＮＡの相同性の程度に左右され て種々変化するであろう。該反応の結果として、プローブと標的との交雑体であ る生成物が得られる。このような交雑体は、たとえば放射能標識、酵素標識、化 学ルミネセンス標識、燐光標識または蛍光標識を付けたプローブの使用によって 容易に検知できる。

本発明によれば、１本鎖のプライマと、それに相補的な天然型の２本鎖の標的配 列とを含む交雑反応を促進しかつ反応効率を改善するためにＲｅｃＡ十蛋白質が 使用できる。ＲｅｃＡ　＋　Ｎ白質は多くのＤＮＡプローブ利用分野において特 に有用である。なぜならば、交雑操作の前に２本鎖の標的ＤＮＡを変性する（た とえば加熱によって変性する）必要がないからである。さらにまたＲｅｃＡ十蛋 白質は、変性し難いＤＮＡ配列または損傷を受けたＤＮＡ配列からのＤＮＡ鎖の 伸長開始および完全伸長を促進するという長所も有する。

発明の目的および構成 本発明の目的の１つは、互いに相補的な環状または線状鎖である第１鎖および第 ２鎖を有しそして各線状鎖が５′末端部および３′末端部を有する２末鎖ＤＮＡ 標的配列の増幅を、ＲｅｃＡ蛋白質の使用によって促進させる方法を提供するこ とである。

本方法は次の工程を包含する。第１鎖の５′末端部の区域に相補的なプライマ、 および第２鎖の５′末端部の区域に相補的なプライマを、ＡＴＰ−シーＳの存在 下にＲｅｃＡ蛋白質で錯体化する。このようにして錯体化されたプライマをその 後に、前記標的配列、全部で４つのｄＮＴＰ（別の略称ｄＮＴＰ　ｓ）　、Ｒｅ ｃＡ蛋白質およびＤＮＡポリメラーゼもまた含有する混合物中で反応させる。こ の反応は、前記の２つの標的連鎖の熱解離（または熱分解）のために要する温度 よりも低い温度において行い、そして該反応を、前記の標的配列の所望程度の増 幅が達成されるまで続ける。

標的ＤＮＡが阻害性または抑制性二次構造を有するかまたは“増幅に抵抗性を示 す区域”を含むものである場合に、本発明方法は特に有用である。

前記のＤＮＡ合成反応の実施中に、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｒｅｃ＾蛋白質および ／またはＡＴＰ−シーＳをさらに添加してもよく、すなわち追加的添加を行って もよい。

本発明方法の一具体例に使用される２つのプライマは、同−ＤＮＡ配列に対して 相補性を有するものである。別の具体例では、ＤＮＡ標的配列に対し非相補性の 末端５′配列を含むプライマが使用される。このような非相補性の配列は、制限 酵素であるエンドヌクレアーゼの認識部位をコードする配列、キャプチャー配列 （ｃａｐｔｕｒｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）、リポータ配列、ＲｅｃＡ蛋白質担持 配列、Ｚ−ＤＮＡ配列、二本鎖を有する尾部等を包含する。

本発明の重要な利点は、物理的または化学的に損傷したＤＮＡ基質の合成／増幅 のために本発明方法が利用できることである。

本発明の好ましい具体例では、ＲｅｃＡ蛋白質として、ｒｅｃＡ−８０３遺伝子 の蛋白質生成物（ρｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ）が使用される。

また、本発明方法によれば、約５０°Ｃより高く、ただし標的連鎖およびそれに 対応するプライマの熱解離に要する温度よりも低い或一定の温度においてＤＮＡ 合成反応を行うことによって、ＤＮＡが合成または増幅できる。この具体例に有 利に使用できる形のＲｅｃＡ蛋白質およびＤＮＡポリメラーゼは、好熱菌の一種 であるテルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から得 ることができる。

本発明はまた、テルムス・アクアチフスのＲｅｃＡ蛋白質のためのコーディング 配列のクローニングおよび同定方法をも包含する。

本発明に係るＲｅｃ＾被覆プライマは、交雑技術を利用する診断操作において有 用なプローブとして役立つであろう。なぜならば該プライマは、一般に阻害性二 次構造を有する区域の配列および相補性の配列の位置を探知してそれと対合する という好ましい性質を有するからである。

図面の簡単な説明 図１は、ＲｅｃＡ＋蛋白質の活性とｒｅｃＡ−８０３蛋白質の活性とを比較する ためのＤＮＡ結合反応において、電気泳動による分離操作の結果を示す図面であ る。

図２Ａは、ＲｅｃＡ＋蛋白質およびｒｅｃＡ−８０３蛋白質のＡ、ＴＰａｓｅ活 性を相互に比較するだめのＡＴＰ加水分解反応の結果を示す図面である。第２Ｂ 図は、ＲｅｃＡ十蛋白質およびｒｅｃＡ−８０３蛋白質の活性を相互に比較する ための連鎖転移反応の結果を示す図面である。

図３、図４Ａおよび図４Ｂは、ＲｅｃＡ＋蛋白質／二本鎖ＤＮＡ結合反応に関す る実験の結果を示す図面である。

図５は、１本鎖ＤＮＡテンプレートからのバルク（ｂｕｌｋ）　ＤＮＡ合成の際 のＲｅｃＡ十蛋白質および１末鎖結合蛋白質の影響を具体的に例示した図面であ る。

図６は、２本鎖型の線状テンプレートからのバルクＤＮＡ合成の際のｒｅｃＡ− ８０３蛋白質の影響を具体的に例示した図面である。

図７は、天然型のラムダＤＮＡテンプレートからのＤＮＡ合成の際のＲｅｃＡ十 蛋白質の該合成促進効果を示す実験結果の図面である。

図８は、ＲｅｃＡ十蛋白質のＤＮＡ合成促進作用は、１本鎖の結合蛋白質の存在 の有無に左右されないことを示す実験結果の図面である。

図９は、ＲｅｃＡ＋蛋白質によって促進されるべきＤＮＡ合成反応において、そ こに存在する特定のプライマへの該合成反応の依存性に関する実験結果の図面で ある。

図１０および図１１は、ＲｅｃＡ＋蛋白質によって促進される単一温度ＤＮＡ増 幅反応の実験結果を示す図面である。

図１２は、ＲｅｃＡ＋は単一温度増幅反応において生成物の特異性を高めること を示す実験結果の図面である。

図１３は、アクアスピリルム・マグネトタクチクム（ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕ ｍ　ｏ＋ａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃｕｍ）のＲｅｃＡ遺伝子の一部の配列を示す 図面である。

発明の詳細な記述 １．　ＲｅｃＡ＋蛋白質およびＲｅｃＡ−８０３蛋白質のＤＮＡ結合活性および ＤＮＡ＠転移活性の比較 本発明の目的の１つは、ＤＮＡ交雑反応およびＤＮＡ合成反応を促進するすぐれ たＲｅｃＡ十蛋白質触媒を提供することである。

本発明方法に関する実験を行った結果、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質は有用な触媒で あることが見出された。ｒｅｃＡ−８０３突然変異体の遺伝子のクローニングを 行い、配列を調べ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）、蛋白質生成物をオーバエキスプレス しくｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）　、次いで精製した（マディラジュ等）。

この新規なｒｅｃ＾突然変異体蛋白質は標的とプローブＤＮＡとの間の組換え反 応において安定な中間体を効果的に生成し、その効果は天然型のＲｅｃＡ士蛋白 質の場合よりも大である。該効果の評価は、ニトロセルロースフィルタを用いる 結合測定法〔マディラジュラ等〕によって行った。この実験結果から、ｒｅｃＡ −８０３蛋白質のＤＮＡ対合効果（こればニトロセルロースフィルタを用いる結 合測定法によって評価できる）は、野生型のＲｅｃＡ十蛋白質の該効果よりもは るかに大であることが判った。或種の条件下では突然変異体ｒｅｃＡ蛋白質は反 応速度の増大によって対合反応を促進し、その最終生成物の収率は、野生型のＲ ｅｃＡ＋酵素を用いる場合の通常の該収率よりも一層高い。

大量の突然変異体ｒｅｃＡ−８０３蛋白質が、遺伝子をオーバエキスプレスする プラスミドを含む大ＨＩＩ菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）がら単離された（分子生物学研 究室のＡ、プリン、クラーク博士〔Ｕｃバークレイ〕）。当該細菌の細胞中の全 蛋白質の約４０％が突然変異体ｒｅｃＡ−８０３蛋白質であった。

例１　（図１）は、ゲル遅延測定法によってＲｅｃＡ十蛋白質および、ｒｅｃＡ −８０３蛋白質のＤＮＡ結合効率（相対値）をめる実験の結果を述べたものであ る。　ＲｅｃＡ十蛋白質またはｒｅｃＡ−８０３蛋白質と、ファイＸ１７４の線 状化された２本１ｊＤＮＡとの反応を、蛋白質／ＤＮＡ錯体が生成するような条 件下に行った。その反応生成物として得られた試料を２つの部分に分けた。各試 料の半分はＳＤＳのごとき洗剤で処理して蛋白質／ＤＮＡ錯体を分解した。この ように処理された試料と無処理試料とを並べて、０．７％アガロースゲル上で処 理した（「材料および方法」の項参照）。ゲル遅延測定方法は、ＤＮＡ／蛋白質 錯体はゲルのマトリックス中を非常に遅い速度で移動するという原理に基いて行 われる測定方法である。図１中のレーン（ｌａｎｅ）　７およびレーン８は、無 処理試料および処理試料の実験結果をそれぞれ表わす。レーン３　（ＲｅｃＡ十 蛋白質）とレーン７　（ｒｅｃＡ−８０３蛋白質）との比較から、ｒｅｃＡ−８ ０３蛋白質はＲｅｃＡ十蛋白質よりも一層効果的に線状の２本鎖ファイＸ−１７ ４ＤＮＡに結合することが判る。２本鎖プラスミドまたはウィルスＤＮＡを用い る同様な実験においても、上記の場合と同じ結果が得られた。

例２は、ＡＴＰの加水分解の場合にもｒｅｃＡ　−８０３蛋白質はＲｅｃＡ＋蛋 白質よりもすぐれた触媒であって、ＤＮＡ連鎖転移生成物の生成量がかなり増大 することを示す実験データに関するものである。例２Ａの実験結果から、ｒｅｃ Ａ−８０３蛋白質はＲｅｃＡ十蛋白質よりも、一層高度のＤＮＡ依存性ＡＴＰａ ｓｅ活性を有することが明らかになった（図２Ａ）。例２Ｂの実験では、１本鎖 ファイＸ−１７４ピリオン環状ＤＮＡをｒｅｃＡ−８０３蛋白質またはＲｅｃＡ ＋蛋白質と共に３７°Ｃに１０分間保つことからなる前期定温放置操作を行って 、ラディング型のフィラメントを形成させた（ラディング）。次いで２本鎖標的 物質を添加し、該連鎖を、補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）としてのＡＴＰ−シー Ｓの作用下に転移させた。該実験の結果から、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質はＲｅｃ Ａ十蛋白質に比して一層強力な触媒作用を示し、連鎖転移生成物の生成量のかな りの増大をもたらすことが判った。この連鎖転移生成物は、図２Ｂ中に矢印で示 される不連続状バンド（ｄｉｓｃｒｅｔｅ　ｂａｎｄ）によって確認できた。さ らに、レーン３およびレーン６　（ＲｅｃＡ＋蛋白質）とレーン８　（ｒｅｃＡ −８０３蛋白質）との比較から、ＤＮＡＮ軽鎖生成物の生成量増大効果はｒｅｃ Ａ−８０３蛋白質の方が一層大であることが判った。前記実験およびそれと同様 な実験の結果から、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質を用いた場合には■型（Ｆｏｒ＋ｓ 　Ｕ　）の連鎖転移生成物の生成量が、ＲｅｃＡ＋蛋白質を用いた場合に比して 約５−７倍増大することが判った。

ｒｅｃＡ−８０３蛋白質はＤＮＡ結合活性が高く、がっ、連鎖転移反応用触媒と しての効果が大であるから、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質はＤＮＡの合成、交雑およ びそれらを利用する診断や治療分野において触媒として非常に有利に使用できる 。ｒｅｃＡ−８０３蛋白質は前記のごとき好ましい性質を有するがら、ＤＮＡプ ローブの配列を天然型の２本鎖ＤＮＡ標的と溶液中で交雑させることを含む迅速 かつ効果的な測定操作（検定）操作を行う際の理想的な触媒であるといえよう。

このような測定を行う場合には、無交雑プローブ（１＊鎖のまま残ったもの）七 、プローブ／！Ｉ的交［ｆ体（これはその一部が二本鎖または多重類のものであ り、すなわち、二本鎖の区域と、それに付随した１零鎖プローブの部分とを含む 錯体である）とを相互に分けるための任意の分離手段（コリンズ等、リガス等、 およびリーヒ等）が利用できる。

ＲｅｃＡ蛋白質を触媒として使用して同族配列との交雑を高効率で行う技術をＤ ＮＡ診断に利用する場合には、従来の技術の場合のように標的ＤＮＡの通常の変 性を行うための面倒な操作を行う必要は全くなく、また、変性や検出が行いにく い、スナップバックや他の反復性配列に関する厳重な制限条件もな（、広範囲の 診断に利用できる。ＲｅｃＡ十蛋白質の本来の作用は、ＤＮＡの重合または組換 えを、（ｉ）錯体または特異的な二次構造の区域を介して、または（ｉｉ）化学 的または物理的損傷を受けたＤＮＡ配列を介して、促進することを包含する。

■、損傷を受けたＤＮＡまたはＺ−コンホメーションを有するＤＮＡへのＲｅｃ Ａ蛋白質の高度の結合大腸菌のＲｅｃＡ十蛋白質は、損傷したＤＮＡ二重らせん の認識および真後の修復の際の主要関与物質（ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ）である 。

２本１￥ＤＮＡコンホメーシヨン中のピリミジン塩基に付加でき、および／また は該塩基を歪曲（ｄｔｓｔｏｒｔ）できる物理的および化学的手段、たとえば紫 外線（ルー等）やブソラレン（シー等）を用いて、ＲｅｃＡ十蛋白質の結合を促 進することは公知である。

プリンによってアダクト化された二重らせんＤＮＡに対するＲｅｃＡ十蛋白質の 認識反応に間する試験は今迄行われていなかった。Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−ア セチルアミノフルオレン（Ｎ−ＡｃＯ−ＡＡＦ）は強力な突然変異原でありがっ 代表的な化学性発癌因子であるが、これはデオキシグアニン残基に共有結合によ って結合して、主としてＣ−８位においてアダクトを形成する（クリーク）。こ の変性によってデオキシグアニン塩基が回転してアンチ−コンホメーションから シン−コンホメーションに変化し、すなわちＤＮＡらせんの大なる構造的変化が 生じ、かつらせんの巻きはどじという変化も起る（フックス等、１９７６年）。

エネルギー最小化（ｅｎｅｒｇｙ　ｍ１ｎｉａ＋１ｚａｔｉｏｎ）に関する研究 から、前記回転に伴ってらせん内部に複素環式構造のアダクトが入り込み、その ためにらせん軸が曲がるのであろうということが推定されている（ヒンジャティ 等）。さらに、Ｎ−Ａｃ０−ＡＡＦによる共有結合形成を伴う変性作用に伴って 、２本鎖ＤＮＡ中の或種のプリン−ピリミジン交互配列または他の配列において Ｂ→Ｚ転移が生じる（セージ等、１９８０年、１９８１年；サンテラ等、１９８ １年ａ、１９８１年ｂ；ウェルズ等）。

例３には、ＲｅｃＡ十蛋白質７２本鎖Ｄ末鎖結合測定実験の結果が示されている 。ブラホ等は以前に、ＲｅｃＡ十蛋白質は、Ｂ−ＤＮＡ重合体に比して、臭素化 またはメチル化された線状の合成Ｚ−ＤＮＡに対して一層結合し易いと述べてい る。例３の結果を図３に示すが、この結果は臭素化基質に結合し易いことを示し ており、ブラホ等の結果と一致している。さらに、図３の結果から、補助因子と してのＡＴＰ−シーＳの存在下の中性ｐＨにおける２本鎖合成りＮＡへのＲｅｃ Ａ十蛋白質の結合は、Ｎａ　−Ａｃ０−ＡＡＦによるプリンのアダクト化によっ て一層促進されることが判る。また、前記実験および他の類似実験において、二 本鎖ＤＮＡ中のＮ−Ａｃ０−ＡＡＦアダクトの量が多い場合には、ＤＮＡの二重 らせんへのＲｅｃＡ十蛋白質の結合量も多いことが認められた。Ｎ　−Ａｃ０− ＡＡＦの付加率が５−２０％の範囲内である限り、前記結合の数（ｂｉｎｄｉｎ ｇ）はＮａ−Ａｃ０−ＡＡＦの付加率に比例することが見出された。

例４　（図４Ａおよび図４Ｂ）の結果は、オリゴ−（ｄ　（ｂｒ’Ｃ−Ｇ）　） またはオリゴ−（ｄ（Ｃ−Ｇ）］から生じたデュプレックスへの結合に比較して 、二本鎖オリゴ−（ｄ（Ｃ−Ａ）・　ｄ（Ｇ−Ｔ））への結合を一層行い易いと いう連鎖特異性を、ＲｅｃＡ十蛋白質が有することを示している。ＲｅｃＡ十蛋 白質は、これらのＤＮＡデュプレックスに特異的に結合し易い連鎖（図４Ａおよ び図４Ｂ）およびコンホメーション（図３）を有すると考えられる。

したがってＲｅｃＡ蛋白質は診断および治療分野において有用である。標的ＤＮ Ａが損傷した場合または通常みられないような二次構造を有する場合には、従来 のＤＮＡ交雑および／または合成方法は利用できない。一方、例３および例４の 実験結果から、ＲｅｃＡ蛋白質は錯体状ＤＮＡへの結合および相補的塩基の対合 反応を促進する性質を有することが見出された。

Ｉｌｌ、ＲｅｃＡ十蛋白質およびｒｅｃＡ　−８０３蛋白質によるＤＮＡ合成の 促進（試験管内操作） 従来のＤＮＡ増幅方法はすべて、ＤＮＡテンプレート変性工程と、プライマ交雑 工程と、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマ伸長工程との三工程からなる方法で あった（マリス；およびマーリス等）。これに対し本発明は、ＲｅｃＡ蛋白質の 触媒作用を利用する独特な、かつ効果的な新規方法を提供する。

ＲｅｃＡ蛋白質の触媒作用を利用する新規なりＮＡ増幅方法の一例について述べ る。ＤＮＡ標的連鎖と、該標的連鎖に相補的なりＮＡプライマとを、ＡＴＰまた はＡＴＰ−シーＳの存在下にＲｅｃＡ十蛋白質またはｒｅｃＡ−８０３蛋白質の 作用下に３７℃に保つ（低温放置）。この条件のもとで、ＲｅｃＡ蛋白質の触媒 作用によって、プライマと標的ＤＮＡとの間にラディング型のＤ−ループまたは ジヨイント分子が生じる。ＲｅｃＡの触媒作用によって生した安定な前記ジヨイ ント分子は、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片との反応によって伸長する。

例５は、１本鎖テンプレートからのＤＮＡ合成におけるＲｅｃＡ＋蛋白質の合成 促進効果に関するものである。図５のデータから明らかなように、１本鎖ＤＮＡ の合成はＲｅｃＡ＋蛋白質および大腸菌の１本鎖結合（ＳＳＢ）蛋白質の使用に よって促進でき、しかしてこれらの２種の蛋白質は相乗効果を奏するように思わ れる。ファイ−Ｘ−１７４の１本鎖環状ＤＮＡテンプレートの合成の場合には、 プライマをＲｅｃＡ＋で被覆してラディング型のフィラメントを形成させること によって合成反応が促進できる。

さらにまた、反応混合物中に大腸菌のＳＳＢ蛋白質を入れることによって、１本 鎖ＤＮＡの合成を指向するＤＮＡ合成反応が促進できた。この効果は、高分子量 ＤＮＡ　（冷ＴＣＡに不溶）中に（′ＬＨ）ｄＧＴＰを入れて測定を行うことに よって確認できる。

また、２本鎖のＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）テンプレートからのＤＮＡ合成の場合の ＲｅｃＡ蛋白質の触媒作用も調べた（例６）。図６のデータから明らかなように 、１８マー（１８ｍｅｒ）であるプライマーを使用する２本鎖テンプレートから のＤＮＡ合成は、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質の触媒作用によって促進できる。ｄｓ ＤＮＡの添加前に、該プライマとｒｅｃＡ−８０３蛋白質（３μＭ）とを３７° Ｃにおいて５分間反応させて、フィラメントを形成させた。さらに５分間にわた って定温放置した後に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大形フレノウ断片を添加 した。ｒｅｃＡ−８０３蛋白質はＤＮＡ合成を著しく促進したが、このことは、 高分子量ＤＮＡ中への（α−”５）ｄＡＴＰの付加量の増大によって確認された 。

例５および例６から明らかなように、ＲｅｃＡ＋蛋白質またはｒｅｃＡ−８０３ 蛋白質で被覆したプライマを使用することによって、ＤＮＡ合成反応の速度およ び合成進行度（ｅｘｔｅｎｔ）を著しく高めることができる。

例７は、天然型のウィルス性ＤＮＡテンプレートからのＤＮＡ合成の場合にもま た、ＲｅｃＡ蛋白質は合成促進効果を有することを示す実施例である。例７では 、前記のプライマを使用せずに反応を室温において行った。ＲｅｃＡ十蛋白質を ２種の２５７−型の１本鎖プライマ（表１中のＰＣＲＯＩおよびＰＣＲＯ２）と 共に定温放置した。次いで、ＡＴＰ−シーＳおよびＳＳＢ蛋白質を反応混合物に 添加し、その後に天然型のλ−ＤＮＡテンプレートを添加した。反応混合物を３ ７°Ｃの加熱帯域（ｈｅａｔｂｌｏｃｋ）内で定温放置し、平衡化操作を３７° Ｃにおいて３分間行い、次いでフレノウＤＮＡポリメラーゼ（略称フレノウ）を 添加した。前記のフレノウの第１回目の添加によって反応を開始させた後に、１ ０分毎に新鮮なタレノウポリメラーゼを１単位づつさらに添加する操作を８０分 間にわたって行った。反応混合物から試料を採取し、新たに合成されたＤＮＡの 量を測定した。図７のデータから明らかなように、単一温度（３７°Ｃ）におい てフレノウＤＮＡポリメラーゼの触媒作用のもとで行われる長時間反応（７２時 間）では、ＲｅｃＡ十蛋白質およびＡＴＰ−シーＳの使用によって、天然型のλ ＤＮＡの合成が促進された。

前記のＤＮＡ合成促進効果は、０．７％アガロースゲル中の電気泳動によって分 離されたＤＮＡ生成物における臭化エチジウムの結合量の増大および染色状態の 観察によって確認できた。

さらにまた例７のデータから、ｄｓＤＮＡテンプレートからのＤＮＡ合成におけ るＲｅｃＡ蛋白質の合成促進効果は、ＳＳＢ蛋白質の存在の有無に左右されるも のではないことが確認された。

図８のデータには、ＳＳＢ蛋白質の不存在下のＤＮＡ合成の結果が示されており （レーン１）、また、短時間の反応によるＤＮＡ合成のときにも、ＲｅｃＡ十蛋 白質は合成促進効果を有することが示されている（８０分間にわたってポリメラ ーゼの添加を１０分毎に行い、すなわち添加を逐次的に８回行った）。

例８は、ＲｅｃＡ蛋白質を触媒として用いるＤＮＡ合成反応のプライマ依存性に 関するものである。

図９のデータから明らかなように、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■の大形のフレノ ウフラグメントの２本鎖型の突然変異体（ｄｏｕｂｌｅ　ｍｕｔａｎｔｓ）　（ エキソヌクレアーゼを含まないもの；ＵＳバイオケミカル）とポリメラーゼとの 反応による天然型のＤＮＡの合成は、ＲｅｃＡ十蛋白質およびプライマの存在下 においてのみ促進される。

ＰＣＲＯＩとＰＣＲＯ２とのプライマ対を使用して５００−ｂｐのＤＮＡテンプ レートを酵素の作用下に合成した（パーキン−エルマー−センス製のアンプリタ ークキソト（登録商標）；第１表）。この二本鎖生成物を単純５００−ｂρテン プレートとして、４０マーのプライマＰＣＲＯＩおよびＰＣＲＯ２と共に使用し てＤＮＡ合成反応を行った（表１）。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１の大形フレノ ウ断片の二本鎖型の突然変異体（エキソヌクレアーゼを含まないもの）を使用し 、反応混合物を３７°Ｃにおいて１７．５時間にわたって定温放置した。図１０ のデータ（例９、レーン４）には、電気泳動実験のときに泳動性を示しそして５ ００−ｂｐの天然型λ−ＤＮＡテンプレートと調和する分子量を有する新規合成 りＮＡ生成物のバンドが示されてしする。該ＤＮＡ生成物の合成は、絶対に、反 応混合物へのＲｅｃＡ　＋蛋白質の添加の有無に左右されるものであると思われ る。同し条件下で反応混合物にＲｅｃＡ十蛋白質とＳＳＢ蛋白質との両者を添加 した場合には、別の低い分子量の生成物が生じた（レーン５）。この結果から明 らかなように、ＳＳＢ蛋白質が存在する場合には、ＤＮＡ合成の生成物が一層不 均質になり、すなわち、ＳＳＢ蛋白質の存在によってバルクＤＮＡ合成が改善で きるけれども、該ＳＳＢ蛋白質は反応の特異性に対し悪影響を与えるものである 。

別の実験において、２５マーのプライマ対を有する５００−ｂｐのラムダＤＮＡ テンプレートから５００−ｂｐのＤＮＡ生成物を合成した（例９）。例９では、 ＤＮＡ合成におけるＲｅｃＡ十蛋白質の触媒活性を試験したが、その反応条件を 表２に示す。さらに、これらの反応の結果を図ＩＩに示す。一般にＲｅｃＡ蛋白 質の反応促進効果は、ＲｅｃＡ蛋白質の濃度、蛋白質／ＤＮＡ比、定温放置時間 、および適当な濃度の前記の特定のプライマ対の存在の有無に左右されて種々変 わるであろう（レーン７）。

ＲｅｃＡ十蛋白質の触媒作用下に行われたフレノウの単一温度ＤＮＡ増幅反応の 生成物への、５００塩基対のラムダテンプレートに対して特異的な放射能標識付 プローブの交雑操作では、ＲｅｃＡ十蛋白質は真の生成物の合成を促進すること が認められた（例９Ｃ）、図１２のデータから明らかなように、５００塩基対の テンプレートの著しい増幅は、ＲｅｃＡ十蛋白質およびＡＴＰ−シーＳを含むが ＳＳＢ蛋白質を含まない反応混合物を使用した場合にのみ認められた（レーン３ ）。

本発明方法によれば、均質なオリゴヌクレオチドプライマ配列を用いる標的交雑 をＲｅｃＡ触媒の存在下に行うことによって、天然型の２本鎖の（すなわち無変 性の）標的ＤＮＡ配列の合成および増幅を溶液中で行うことができる。この交雑 反応では該プライマは、ＤＮＡポリメラーゼによる逐次伸長に適した位置に存在 するであろう。この反応操作は二段階操作であって、両方の段階において反応を 最適条件下に行うことが必要である。

これらの段階は、（ｉ）プライマの交雑および（１１）プライマの伸長からなる 。

標的ＤＮＡ配列は種々の原料から種々の方法によって得られる。たとえば、（１ ）オリジナルの標的ＤＮＡ配列は、−末鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のごとき一末 鎖核酸テンプレートから標準的方法（マニアチス等）によって合成でき、または 、（１１）オリジナルの標的配列は、生物の細胞または組織である原料から抽出 できる。標的ＤＮＡ配列はまた、主として標的配列からなる均質混合物、または 種々の他種配列も存在する不均質混合物の中に存在するであろう。

最初に、標的配列に相補的なプライマと標的ＤＮＡ配列とを次の条件下に反応さ せ、すなわち、ＲｅｃＡ蛋白質の触媒作用によって該プライマと該標的ＤＮＡと の間にジヨイント分子が形成できるような条件下に反応させる。この反応は天然 型のＤＮＡ基質（すなわち、ＤＮＡ結合鎖が熱変性されていないＤＮＡ基質）を 用いて実施できる。　ＲｅｃＡ蛋白質の触媒作用下に生じた多重鎖構造の伸長操 作を、ヌクレオチド三燐酸の存在下にＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を使 用して実施する。ＲｅｃＡＩ白質は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長に適した交雑ＤＮ Ａをトポロジカルに生成させる作用を有する。

その次の増幅段階において、既存の標的ＤＮＡの連鎖に相補的な遊離プライマを 、オリジナルの連鎖または新規な連鎖に結合させることができる。交雑反応後に 、既述のＤＮＡポリメラーゼを使用して当該錯体の伸長操作を行う。この操作を 反復し、すなわち、標的配列を合成し増幅する操作を何回も反復する。

増幅操作を数回行った後に、天然型の標的配列は次の手段によって検知でき、す なわち、ＲｅｃＡ蛋白質を触媒として用いる交雑反応の場合の質量作用下の交雑 によって、および／またはＲｅｃＡ蛋白質／プローブ錯体によって作動する標識 付−末鎖ＤＮＡプローブを用いて検知できる。あるいは、該反応は多くの回数に わたる反復実施によって進行させることができ、これによって増幅生成物が得ら れる。該増幅生成物は次の方法によって検知でき、すなわち、分離された反応成 分にアガロースゲル上で電気泳動操作を行ってさらに分画し、該ゲル中で分離さ れたＤＮＡを臭化エチジウムで染色することによって肉眼で検知できる。

ＤＮＡ増幅反応およびＤＮＡ合成反応の場合にＲｅｃＡ十蛋白質やｒｅｃＡ−８ ０３蛋白質を使用することによって得られる効果として、これらの蛋白質が、標 的ＤＮＡ配列への一末鎖ＤＮＡプライマの効果的な交雑反応を強く促進すること があげられる。さらにまた、これらの蛋白質の使用によって、伸長のためにトポ ロジカルに適したＤＮＡプライマと天然型標的との錯体が生成できる。ＲｅｃＡ 十蛋白質はトポロジカルな効果を奏するから、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフ レノウ断片のごときセルラー（ｃｅｌｌｕｌａｒ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼに よってプライマが伸長できる。なぜならばテンプレートの連鎖が巻きはどされる からである。この反応操作は、−末鎖テンプレートの生成のために加熱を行いそ してその後に冷却してプライマを交雑させることからなる増幅反応操作に比して 一層簡単である。

したがって、前記のＲｅｃＡ蛋白質を触媒とするＤＮＡ合成反応の主な用途は、 通常のＤＮＡ配列、または光線の作用または化学的作用によって損傷したＤＮＡ 配列を増幅して、プライマをその同族型の標的（これはその後にＤＮＡポリメラ ーゼによって伸長させる）上の適切な位置に存在させる操作に利用することであ る。ＲｅｃＡ蛋白質を触媒として用いるＤＮＡ合成反応を利用したときに得られ る別の利点は、高温変性および自然状態復元操作（サイキ等）を何回も反復する 必要がないことである。

第２の重要な用途は、ＤＮＡをトポロジカルに生成させることができるというＲ ｅｃＡ蛋白質の能力を、ＤＮＡ合成の際に利用することであって、その重要な例 には、熱変性法のごとき従来の方法では合成または増幅が困難であったコンホメ ーションまたは二次構造を有するＤＮＡを合成することがあげられる。

前記のＲｅｃＡ蛋白質を触媒として用いる反応の第３の重要な用途は、ＲｅｃＡ 蛋白質／ＤＮＡプライマ錯体は相補的配列を効果的に見出す能力を有するという 利点を利用することである。この蛋白質／プライマ錯体は、−たとえば、プライ マに対する相補性に基づいて試料中の配列の同定を行うことからなる診断用検査 の際に、プローブとして使用できる。これによって結合した前記錯体はその後に 、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質に対する抗体の場合と同様に種々の方法によって安定 化でき、そして同定できる。

■、　ＲｅｃＡ蛋白質の場合と同様な活性を有する別の有用な蛋白質本明細書で はＲｅｃＡ蛋白質は、実質的に同し機能を有する種々のＲｅｃＡ型蛋白質の１種 であるとみなして取り扱う。すなわちＲｅｃＡ型蛋白質は特に次の機能を有し、 すなわち、い）プライマを、その後にＤＮＡポリメラーゼによって伸長させるべ きその同族型標的上の適切な位置に存在させる機能、（ｉｉ）ＤＮＡ合成の場合 には、ＤＮＡをトポロジカルに生成させることができるというＲｅｃＡ蛋白質の 機能、および（ｉｉｉ）相補的な配列を効果的に見出してそれに結合できるとい う機能（これはＲｅｃＡ蛋白質／ＤＮＡプライマ錯体の機能である）を有する。

この特性を最もよく示すＲｅｃＡ蛋白質は、大腸菌から得られたＲｅｃＡ蛋白質 である。この野生型の蛋白質の他に、若干種の突然変異体ｒｅｃＡ蛋白質（たと えばｒｅｃＡ−８０３）もまた見出された。さらにまた、多くの生物がこのよう なＲｅｃＡ型蛋白質を含有している（後記参照）。

ＲｅｃＡ蛋白質を触媒とするＤＮＡ合成の別の用途は、熱安定性を有するＤＮＡ ポリメラーゼを用いて一定の高温において行われるＤＮＡポリメラーゼ増幅反応 の促進のために利用することである。熱安定性を有するＤＮＡポリメラーゼは、 チルミス、アクアチフス（Ｔｈｅｒｉｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　（Ｕ　Ｓバ イオケミカルズ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）　％スルホルブス（Ｓｕｌｐｈｏｌｕ ｂｕｓ）、ビロジクチウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｓ＋）等の生物のごとき種々 のものから単離されている。一般にこれらの酵素の活性は熱に安定で、すなわち 約９５゛Ｃまでの温度において安定である。強力な阻止構造または抑制性構造（ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有するＤＮＡ配列、またはアー チファクトの形成が知られているＤＮＡ配列（マツクコンローグ等、およびシュ ルジナー）の増幅が上記の系を用いて実施できる。大腸菌のＲｅｃＡ蛋白質の半 減期は５２゛Ｃにおいて数分程度であり、すなわちこれは掻端に熱に敏怒であり 高温では使用できない。したがって、熱に安定なＲｅｃＡ蛋白質が必要である。

すなわち、−緒に使用されるＤＮＡポリメラーゼの場合と実質的に同じ温度範囲 （たとえば約９５°Ｃまでの温度）にわたって活性を維持できるような熱安定性 ＲｅｃＡ蛋白質が必要である。

本発明方法に関する実験においてチルミス・アクアチフスからのＲｅｃＡ蛋白質 が同定され、そして、それをエンコードする遺伝子がクローニングされた。チル ミス・アクアチフスのゲノム遺伝子のサザンプロット分析を、アクアスピリルム ・マグネトタクチクムのＲｅｃＡ遺伝子をプローブとして用いて行った（例１０ ）。

アクアスピリルム・マグネトタクチクムの遺伝子は一般にＧ−Ｃに冨み、Ｔ、ア クアチフスのＲｅｃＡ遺伝子への整合性が大腸菌のＲｅｃＡ遺伝子の場合より一 層良好である。１本鎖ＤＮＡのバンドの同定は、前記プローブとの交雑によって 行われ、しかしてこの場合には次の各消化物（別名ダイジェスト）すなわち１２ −１５ｋｂのＢａｍｆ（Ｉ　、５ｋｂの旧ｎｄｌＩＩおよび１．５ｋｂの５ｓｔ Ｉが使用された。

前記のＴ、アクアチフスのＲｅｃＡ遺伝子のクローニングを次のごとく行った。

Ｔ、アクアチフスからのゲノムＤＮＡを精製し、制限酵素であるエンドヌクレア ーゼＢａｍＨＩ　（マニアチス等）で切断し、次いでＥＭＢＬラムダクローニン グ系（プロメガ）を用いてクローニングを行った。Ｔ、アクアチフスからのＲｅ ｃＡ遺伝子（すなわちＴ、アクアチクスＲｅｃＡ遺伝子）を含有するＢａｓ＋Ｆ Ｉ■の大型断片（１５ｋｂ）を、ファージＤＮＡ含有クローンから単離した。該 クローンは、厳格な交雑ウオ・ノシング条件下に前記のプローブに強く交雑させ たものであった。完全な配列を得るために、前記遺伝子にサブクローニングをＭ １３ベクター中で行った。前記ＲｅｃＡ蛋白質の発現および同定のために、該遺 伝子にさらにサブクローニングプロトクローンＴＭラムタｇ　ｔ　ｔ　ｔベクタ ー（プロメガ）中で行った。

ＤＮＡ増幅反応における生成物の最終収率および標的の長さを改善する機能を前 記のＴ、アクアチクスＲｅｃＡ蛋白質が有するか否かについて調べる試験は、既 述のＲｅｃＡ蛋白質試験法に従って行うことができる。特に、枯草菌（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）からのＤＮＡの２．５−ｋｂρ断片中で見出され た２１ｔＲＮＡ遺伝子のクラスタおよび人のｔ　ＲＮＡ遺伝子のごとき顕著な二 次構造を有するテンプレート（グリーン等）が、標的として使用される。

本発明を詳細に例示するために次に実施例を示すが、本発明の範囲は決して実施 例の範囲のみに限定されるものではない。

材料および操作方法 ＤＮＡおよび酵素 ポリ＝（ａ（Ｃ−Ｃ））およびポリ−（ｄ　（ｂｒ’ｃ　−Ｇ）　）を含む合成 重合体を、ポリ−（ｄ（１−Ｃ））テンプレート（ファーマシア）から、ＤＮＡ ポリメラーゼを用いて酵素学的に合成した。この重合体は前記の文献（ザーリン グ等、１９８４年ａおよび１９８４年ｂ；ザりリング等、１９９０年）に記載の 特徴を有するものであった。

ポリ−（ｄ（Ｃ−Ａ）・　ｄ（Ｇ−Ｔ））をファーマシアＰ、Ｌ、から購入した 。ポリヌクレオチドに超音波処理を行って（ｓｏｎ　ｉｃａ　ｔｅ　）平均寸法 （アガロースゲル電気泳動による測定値）を５ｓｏｂｐにすることによってオリ ゴヌクレオチドを調製した。シルパークラング等の論文に記載の方法によってポ リヌクレオチドの末端部に標識を付けた。制限酵素であるエンドヌクレアーゼは 、種々の製造会社（たとえばニュー、イングランド、バイオラブズやベーリンガ ー、マンハイム）からめた。

精製された野生型のＲｅｃＡ十蛋白質および制限酵素エンドヌクレアーゼはファ ーマシアから購入した。ＲｅｃＡ十蛋白質を一７０°Ｃにおいて、トリス−■ｃ Ｉ（ｐＨ＝　７．５　）　２０ｍＭ、ＥＤＴＡｏ、１ｍＭ、ジチオトレイトール （ＤＴＴ）０．１ｍＭおよび５０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール（最終濃度）という 組成の媒質の中で貯蔵した。

Ｍ　１３ｎ＋ｐｌ　８　ＤＮＡおよびＡＴＰ−シーＳはヘーリンガー、マンハイ ムから購入した。

蛋白質−ＤＮＡ錯体のアガロースゲル電気泳動５０％グリセロール（Ｖ／Ｖ）中 にブロムフェノールブルー０．２５％およびキシレンシアツール０．２５％を含 有するＴＢＥ緩衝液（トリス−ＨＣｌ　（９０ｍＭ）　、はう酸９ｏＩＩＩＭ、 ＥＤＴＡ２．８ｍＭ、ｐ）Ｉ＝８）の添加によって、反応を停止させた。

すべての試料を、０．７％アガロースゲルを使用して１）ｌリス−ボレート−Ｅ ＤＴＡｉ衝液中で常法に従って分析した（マニアチス等）。試料が蛋白質／ＤＮ Ａ錯体である場合には、アガロースゲルを用いて電気泳動操作を４°Ｃにおいて ９０Ｖの電圧下に約２−３時間行った。ＤＮＡバンドを肉眼で見えるようにする ために前記ゲルを臭化エチジウム（４μｇ／ｍｌ）で染色し、次いで該ゲルを蒸 留水中に入れて過剰の色素を除去しくｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ）　、その後に紫外 線の照射下に該ゲルの写真撮影を行った。

ＤＮＡプライマの供給源 プライマを購入しくたとえば第１表に記載のプライマはセンス、パーキン−エル マーから購入できる）１．あるいは次の方法で調製した。プライマーの調製は、 市販の自動化されたオリゴヌクレオチド調製装置を用いて行った。すなわち、通 常の形状の合成プライマをシンセチソク、ゼネチクス（米国カルホルニア州すン ジエゴ）等の製造業者から購入することも可能である。

例１ ｒｅｃＡ−８０３蛋白質とＲｅｃＡ十野生型蛋白質との結合力の比較ＤＮＡ基質 に対する活性 本例はＲｅｃＡ十蛋白質およびｒｅｃＡ−８０３蛋白質の活性を比較するために 行われたＤＮＡ結合反応の実験の結果を述べたものである。

トリスアセテート緩衝液（３７°ＣにおいてｐＨ＝７−５　）　１０ｍＭ、酢酸 マグネシウム２ｎ＋Ｍ、ジチオトレイトール１ｍＭ、酢酸ナトリウム５０１ＩＩ Ｍ、５％グリセロール（ＩＯＸ緩衝液として添加）、ＡＴＰ−シー３　１．６ｍ Ｍ、ファイＸ１７４（０，０５μｇ）（環状ピリオンＤＮＡとして）、ならびに ＲｅｃＡ＋蛋白質またはｒｅｃＡ−８０３蛋白質３４，３μＭ（図１、レーン２ ．５および６）または１７．１μＭ（図１、レーン３．４．７および８）を含有 する容量０．０１ｍ１の反応混合物を調製した。反応混合物の平衡化操作を３７ °Ｃにおいて１０分間行った。次いで０．２　Ｍ酢酸マグネシウムの添加によっ てマグネシウム濃度を上昇させ、その最終濃度を１２ｍ旧こした。Ｘｈｏｌ　（ ０，４ｕ　ｇ　）がファイＸ１７４線状二本＃１ＮＡ（Ｉｆ型ＤＮＡ）を消化し た。次いで適量（容量）のＩＯＸ緩衝液を反応混合物に添加して反応混合物の最 終容量を２０μｌとした。３７°Ｃにおいて３０分間にわたって定温放置した後 に、反応混合物全体を２等分し、その１つをプロティナーゼＫ　１０　ｍｇ／ｍ ｌで３７°Ｃにおいて１５分間処理した（レーン２．４．６および８）。一方、 無処理の試料（図１中のレーンｌおよび２に相当する）は示されていない。

レーン３とレーン７　（図１）との比較から明らかなように、蛋白質濃度が等し い場合には２本類型の標的ＤＮＡへのＲｅｃＡ−ｉ−蛋白質の結合量はｒｅｃＡ −８０３の該結合量より少ない。

例２ ＲｅｃＡ十蛋白質およびｒｅｃＡ−８０３蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性および連鎖 転移反応促進活性の比較 本例は、ＲｅｃＡ＋蛋白質およびｒｅｃＡ−８０３蛋白質のＡ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ 活性および連鎖転移反応促進活性を比較した結果を述べたものである。

Ａ、ＡＴＰａｓｅ活性に関する反応 等濃度のＲｅｃＡ十蛋白質およびｒｅｃＡ−８０３蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を 比較した。反応は、トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ＝　７．５　）　３５ｍＭ、ＭｇＣ １□６．７ｎ＋Ｍ、ジチオトレイトール２ＩＩ＋Ｍ、牛の血清アルブミン（Ｂ　 ＳＡ）　Ｉ　ＯＯＩＩ　ｇ／ｍ１ＳＡＴＰ　１．４ｍＭ、（ν　３ｚｐ：］−Ａ ＴＰ　０．０２μＭを含有する全容量１８μｌの緩衝液の中で行った。この反応 混合物にＲｅｃＡ蛋白質またはｒｅｃＡ−８０３蛋白質を、１本鎖ファイＸＲ４ ファージＤＮＡの存在下または不存在下に添加した。

反応混合物を０．６ｍ１−マイクロ遠心管の中で３７°Ｃにおいて３０分間にわ たって定温放置した。Ｏ′Ｃに冷却することによって反応を停止させ、次いで、 標識が付いていないＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰの各々を担体として３ｍＭづつ 含む２５ｍＭＥＤＴＡを１２μｌ添加した。その後に各反応混合物１０μＩを、 プラスチックで裏打ちしたＰＥｌ−セルロースＦのＴＬＣシート（ファーマシア ）上に斑点状に散布し、該ＴＬＣシートを、ＬｉＣｌ　（０，５Ｍ　）およびぎ 酸０．２５　Ｍを含有する溶媒中に入れて現像した。放射能を有する生成物をオ ートラジオグラフィ技術によって観察した。該ＴＬＣシート内の遊離無′ａ燐酸 塩が存在する区域をけずり落とし、シンチレーシゴンカウンタで測定した。該生 成物のｃｐｍを前記の１０μｌの試料の全ｃｐｍで割ることによって加水分解率 （％）をめた。

前記反応の結果を図２Ａに示す、ＤＮＡの不存在下では、ｒｅｃＡ−８０３蛋白 質（塗りつぶしていない菱形）およびＲｅｃＡ＋蛋白質（塗りつぶした四角形） は充分なＡ、ＴＰａｓｅ活性を示さない。

しかしながらＤＮＡの存在下ではｒｅｃＡ−８０３蛋白質（塗りつぶした菱形） はＲｅｃＡ＋蛋白質（塗りつぶしていない菱形）よりも一層高度のＡＴＰａｇｅ 活性を示す。

Ｂ、連鎖転移反応 例１の場合と同様に容量０．０１ｍ１の反応混合物を調製した。

ただし今回はすべての反応においてファイＸ１７４の１本鎖環、状ピリオンＤＮ Ａを０．０５μｇでなく０９３μｇ使用し、かつ、ＲｅｃＡ＋蛋白質またはｒｅ ｃＡ−８０３蛋白質を３４．３　μＭ使用した。

３７°Ｃにおいて３０分間定温放置した後に反応混合物を２つに分け、各試料の 半分にはＳＤＳを０，５％の最終濃度で添加した。すべての試料にゲル担持染料 （グリセロール５０％、ＴＥ８５０％、ブロムフェノールブルー０．２５％、キ シレンシアツール０．２５％；マニアチス等）を添加した。試料に電気泳動操作 を、標準的な０．７％アガロースゲルを使用して７．６　Ｖ　／　ｃｍの電圧下 に３時間行った。臭化エチジウムで染色することによってＤＮＡバンドを肉眼で 観察できるようにした。

レーン３．４．５および６　（図２Ｂ）中の反応混合物はＲｅｃＡ−Ｆ蛋白質を 含有し、レーン７および８　（図２Ｂ）中の反応混合物はｒｅｃＡ−８０３蛋白 質を含有するものであった。レーンｌおよび２はＲｅｃＡ＋蛋白質を含有しない ものであった。レーン３．６および８中の試料はＳＤＳで処理したものであった 。レーン１中の２つの明瞭なバンドは反応基質を表す。完全な連鎖転移の結果と して、ニックの入った２本鎖環状ＤＮＡ　（Ｉ　Ｉ型）が生じる。連鎖転移生成 物は図２Ｂ中に矢印で示されている。

例３ オリゴ（ｄ（ｂｒ’Ｃ−Ｇ）　）およびＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミ ノフルオレン変性ＤＮＡへの大なるＲｅｃＡ十蛋白質結合量本例は、ＲｅｃＡ十 蛋白質７２本鎖Ｄ末鎖結合試験の結果を述べたものである。この試験の結果から 、光線の作用によって損傷したＤＮＡ、化学的作用によって損傷したＤＮＡ、ま たはＺ−コンホメーシジンを有するＤＮＡに対してＲｅｃ＾十蛋白質が高度の結 合性を示すことが判った。

Ａ、アダクト化されたＤＮＡの調製 Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン（米国アリシナ州ジェファ ーソシのドクター、フレデリック、ベランド、ナショナル、センター、フォア、 トキシコロジカル、リサーチから購入）を−２０℃において貯蔵した。下記の試 薬すなわちＤＮＡ（オリゴ−（ｄ　（ｂｒ５Ｃ−Ｇ）　〕またはオリゴ（ｄ（Ｃ −Ｇ））２．５μｇ、Ｎ−アセトキシーＮ−２−アセチルアミノ−フルオレン（ Ｎ−ＡｃＯ−ＡＡＦ）　０７２００　ｍＭ、ＮａＣｌ　（５０ｌ１Ｍ）およびト リス−ＨＣｌ　（ｐＦｌ＝　７．５　）　５　ｎ＋Ｍを含有する全反応混合物容 量５０μ■の反応混合物を用いてアダクト化反応を行った。反応は暗所で２５° Ｃにおいて１０分間行った。氷冷した無水ジエチルエーテル２０容量を用いる抽 出操作によって、非結合状態のＮ−Ａｃ０−　ＡＡＦを除去した。次いで、アダ クト化されたＤＮＡをエタノールで沈澱させ、トリス−ＨＣｌ　（１０ｍＭ）お よびＥＤＴＡ１＋ｗＭ（ｐＨ＝　７．５　）を用いて透析操作を広範囲に行った 。各反応において変性の程度を、フックス等（１９７２年）の方法に従ってＮ− Ａｃ０−ＡＡＦの消衰係数ε＝１８，０００を用いて、Ａ　ｚｏ５／　Ａ　２６ ０比から算出した。アダクト成分としてＮ−Ａｃ０−ＡＡＦを５−２０％含有す るＤＮＡアダクトを、その後の反応に使用した。

Ｂ、　ＲｅｃＡ十蛋白質の結合性評価試験この結合性評価試験に使用したＤＮＡ 基質は、シルパークラング等の方法によってアデノシン三燐酸〔シーｐｉｚ）　 にニュー、イングランド、ニューフレアー）を使用して末端部に標識を付けたも のであった。この結合反応の反応混合物は、オリゴ−（ｃｌ　（ｂｒ’Ｃ−Ｇ） 　）またはオリゴ−Ｃｄ（Ｃ−Ｇ）　）　０．５７　μＭ、　ＲｅｃＡ＋蛋白質 ０．３３μＭ、ＴＥＡｌ’ｌ衝液（トリエタノールアミン（ｐ！（＝　７．５　 ）　２５　ｍＭ、ジチオトレイトー／Ｌ／　１．　Ｏ＋ｎＭおよびＭｇＣｌ。

５．０ｍＭ）およびＡＴＰ−シー３２０μＭを含有する全容量５０μ！のもので あった。ＲｅｃＡ十蛋白質を３７“Ｃにおいて添加することによって反応を開始 させ、そして図３に記載の時間にわたって定温放置した。

ニトロセルロース膜フィルタ（ミリボア、ミリタイタ（登録すべての反応を停止 させた。前記フィルタは、試料の濾過前に蒸留水（２回蒸留して作った蒸留水） で湿らせ、かつＴＥＡ緩衝液で予備処理を行ったものであった。該フィルタをＴ ＥＡ緩衝液で６回洗浄し、加熱用ランプで乾燥し、アクアゾル−２（デュポン、 ニューイングランド、ニュークリア）の中に浸漬した。各フィルタ上に保たれた 放射能を液体シンチレーションカウンタ（ヒュウエノト、バラカード、２０００ 　ＣＡ型）で測定した。前記の条件下では、ニトロセルロースによる蛋白質結合 ＤＮＡの保持効率は約５０％であった。

図３はＤＮＡ結合性評価試験の結果を示した図面である。図３中の記号は次の種 類のＤＮＡ基質を表し、すなわち、塗りつぶしていない四角形はオリゴ−（ｄ　 （ｂｒ’Ｃ−Ｇ）　〕を表し、塗りつぶした四角形はＮ−Ａｃ０−ＡＡＦでアダ クト化されたオリゴ−（ｄ（ｂｒＳＣ−Ｇ）　）を表し、塗りつぶしていない三 角形はオリゴ−（ｄ（Ｃ−Ｇ））を表わし、塗りつぶした三角形はＮ−Ａｃ０− ＡＡＦでアダクト化されたオリゴ−（ａ（ｃ−Ｇ））を表す。

図３は、ＲｅｃＡ十蛋白質が無変性ＤＮＡよりも化学変性ＤＮＡ（Ｎ−Ａｃ０　 ’　ＡＡＦでアダクト化されたＤＮＡ）に対して一層多く結合することを示して いる。図３はさらに、ＲｅｃＡモ蛋白質はＢ−コンホメーションを有するオリゴ −（ｄ（Ｃ−Ｇ）　）よりも、Ｚ−コンホメーションを有するオリゴ−（ｄ　（ ｂｒ’Ｃ−Ｇ）　）に対して一層多く結合することを示している。

例４ オリゴ−（ｄ（Ｃ−Ｇ））またはオリゴ−（ｄ（ｂｒ’Ｃ−Ｇ）　）と比較した 場合の２本鎖オリゴ−（ｄ（（、−Ａ）　・（ｄ（Ｇ−Ｔ））　ヘのＲｅｃＡ＋ 蛋白質の選択的結合性 本例はＤＮＡ結合試験の結果を示したものであり、すなわち、プリンおよびピリ ミジン交互配列（たとえば、（ＰｕＰｙＰｕＰｙＰｕＰｙＰｕＰｙ）、ｌ〕を有 する２本鎖ＤＮＡに対してＲｅｃＡモ蛋白質が選択約６こ結合することを示す実 施例である。

Ａ、一定のＲｅｃＡモ蛋白質／ＤＮＡ１１ｇ度の場合（図４Ａ）このＤＮＡ、結 合反応の反応混合物は、次の成分すなわちＲｅｃＡ十蛋白質０．３５μＭ、ＤＮ Ａ　（分子）基質０．７μＭ、ＴＥＡ緩衝液（既述の説明参照）およびＡＴＰ− シー８２０μＭを含有する全容量５０μｍのものであった。反応を２０°Ｃにお いて行い、そして、図４に記載の時点においてニトロセルロースフィルタ（例３ 参照）で蛋白質／　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｊＷ体を濾過することによって反応を停止させ た。

Ｂ、ＤＮＡ濃度一定、ＲｅｃＡ＋蛋白質濃度増加の場合このＤＮＡ結合反応の反 応混合物は、次の成分すなわちＲｅｃＡ＋蛋白質０−５．０μＭ、ＤＮＡ基質（ 分子）１．０ＭＭ、ＴＥＡ緩衝液（既述の説明参照）およびＡＴＰ−シー３２０ μＭを含有する全容量５０μＩのものであった。反応を２０°Ｃにおいて２０分 間行い、そして、ニトロセルロースフィルタ（Ｎ３参照）で蛋白質／ＤＮＡ錯体 を濾過することによって反応を停止させた。

前記の反応に使用されたＤＮＡ基質は図４Ａおよび図４Ｂに記載のものであった 。すなわち該図中において、塗りつぶしていない四角形はオリゴ−（ｄ（Ｃ−Ｇ ））　、塗りつぶした四角形はオリゴ−［ｄ（ｂｒ５Ｃ−Ｇ）］、　２りつぶし ていない三角形はオリゴ−（ｄ（Ｃ−□Ａ）・　ｄ（Ｇ−Ｔ））をそれぞれ表す 。

図４Ａおよび図４Ｂのデータから明らかなように、ＲｅｃＡ十蛋白質はプリンお よびピリミジンの交互配列を有する下記のものに対して選択的に結合するが、結 合量の多いものから順に記載すると次の通りである。石像Ｂ−コンホメーション を有する２本鎖オリゴ−（ｄ（Ｃ−Ａ）・　ｄ（Ｇ−Ｔ））　、左像Ｚ−コンホ メーションを有するオリゴ−（ｄ（ｂｒ５Ｃ−Ｇ））　、石像Ｂ−コンホメーシ ョンを有するオリゴ−（ｄ（ｃ−ｃ））。

例５ １本鎖の環状ＤＮＡテンプレートを用いるＤＮＡ合成に対する１？ｅｃＡ＋蛋白 質の促進作用 本例は、１本鎖テンプレートからのバルクＤＮＡ合成に対するＲｅｃＡ十蛋白質 の促進効果を具体的に示したものである。

２４７−７：　；Ｉｏ　Ｚｒ　７’　ライフ　（ｄ（ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡ ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ）　〕に、〕Ａ、ＴＰ−シーを用いてＲｅｃＡ十蛋白 質を被覆した。被覆されたプライマを、反応混合物中のＭ１３ｍｐ１８の１本鎖 ＤＮＡに付加した。この反応混合物はｒＡＴＰ、ＲＡＴＰ再生系のＰＥＰ／ＰＫ （ベーリンガー、マンハイム）、ｄＮＴＰ　（別の略称ｄＮＴＰｓ）および（Ｈ ’　）ｄＧＴＰ　にュ−、イングランド、ニューフレア）、大腸菌の１末鎖結合 （ＳＳＢ）蛋白質（ＵＳバイオケミカル、コーポレーション）を含有するもので あった。反応混合物の全容量は２６．２５μｌであった。ＲｅｃＡ　＋蛋白質お よびＳＳＢ蛋白質は存在させるがまたは存在させないというようにして反応条件 を種々変えた（図５参照）。３７°Ｃにおいて４分間保った後に、ＤＮＡポリメ ラーゼ■の大形フレノウ断片（二ニー、イングランド、バイオラブズ）０．５単 位を添加した。

反応混合物を３７°Ｃにおいて定温放置し、５分毎に試料を採取する操作を１５ 分間にわたって行った。反応混合物の試料に冷たい５％トリクロロ酢酸を添加し てｙＨ標識付ＤＮＡを沈澱させ、ガラスフィルタ（シュライヘル、アンド、シュ エル、インコーホレーテッド）で濾過することによって該試料を集めた。

新たに合成された高分子１ｌＤＮＡ中に入った（　’Ｈ）ｄＧＴＰの量を、パン カードＰ　２０００型液体シンナレーションカウンタを用いてトルエン含有シン チレーションミックス中で該ガラスフィルタに計数操作を行うことによって測定 した。

前記反応の結果を図５に示す。図５に記載の反応成分を表す記号は次の意味を有 し、すなわち、白丸はＤＮＡポリメラーゼ■を、黒丸はＤＮＡポリメラーゼＩお よびＳＳＢ蛋白質を、塗りつぶしていない四角形はＤＮＡポリメラーゼＴおよび ＲｅｃＡ　＋蛋白質を、そして、塗りつぶした四角形はＤＮＡポリメラーゼ１、 ＲｅｃＡ＋蛋白質およびＳＳＢ蛋白質を表す。

図５のデータから明らかなように、ＳＳ’Ｂ蛋白質の不存在下にＲｅｃＡ十蛋白 質を添加することによってバルクＤＮＡ合成の効率が改善できる。さらにまた、 １本鎖の環状テンプレートからのＤＮＡの合成の際にはＳＳＢ蛋白質およびＲｅ ｃＡ十蛋白質の相乗効果も認められた。

例６ ｒｅｃＡ−８０３蛋白質によって促進された線状の２本１ＤＮＡテンプレート上 のＤＮＡ合成 本例は、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質によるバルクＤＮＡ合成の促進に関する実験結 果を述べたものである。

反応に使用した２本鎖の線状テンプレートはプラスミドｐＪＣ８０１−８８６で あった。このプラスミドは、大腸菌のＲｅｃＡ遺伝子のためのコーディング配列 を含み、制限酵素エンドヌクレアーゼ５ａｒｌで切断した８ｋｂの線状断片から なるものであった。

次のＲｅｃＡ遺伝子特異性プライマ、すなわち、プライマＡ（ｄ（ＡＴＧＣＧＡ ＣＣＣＴＴＧＴＧＴＡＴＣ）　）およびプライマＢ１：ｄ（ＧＴＧＧＴＧＧＧＴ ＡＧＣＡＡＡＣＣ）　）を使用した。トリス−アセテート３０ａ＋Ｍ、酢酸ナト リウム６０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭを含有し、さらにまた、ｒＡＴＰ再 生系ＰＥＰ／ＰＫ（ヘーリンガー、マンハイム）を含む混合物中で、前記プライ マをＲｅｃＡ＋蛋白質（３，０μＭ）で被覆する操作を３７゛Ｃにおいて５分間 行った。

前記のＤＮＡ合成反応を、反応混合物の全容量を３２μｌとして行った。反応混 合物はｐＪｃ８０１−８８６　（０，５μｇＬプライマＡおよびＢ各０．６μＭ 、トリス−アセテ−）（ｐＨ＝８．３）３０１、酢酸ナトリウム６０ｍＭ、酢酸 マグネシウムｌｏＯＩＭ、例５記載＜７）ＡＴＰ再生系、ｄＮＴＰおよびＣａ− ”５）ｄＡＴＰを含有するものであった。フレノウＤＮＡポリメラーゼ■を５単 位添加した。反応混合物を３７°Ｃにおいて３０分間定温放置し、図６に記載の 時点において試料を採取した。冷たい５％トリクロロ酢酸によって″５Ｓ１ａ識 付ＤＮＡを沈澱させ、ガラスフィルタ（シュライヘル、アンド、ジェニル、イン コーホレーテッド）で濾過することによって反応混合物の試料を集めた。新たに 合成された高分子量ＤＮＡ中に入った（”５）ｄＡＴＰの量を、パンカードＰ　 ２０００型液体シンチレーションカウンタを用いてトルエン含有シンチレーショ ンミックス中で該ガラスフィルタについて計数する操作を行うことによって測定 した。

図６に記載の実験データ（図６中の塗りつぶしていない四角形はｒｅｃＡ−８０ ３蛋白質が存在しない試料を表し、塗りつぶした四角形はｒｅｃＡ−８０３蛋白 質が存在する試料を表す）から明らかなように、ｒｅｃＡ−８０３蛋白質の存在 下では線状の２本鎖テンプレートからのバルク合成が確実に促進される。

例７ ＲｅｃＡ十蛋白質によって促進された天然型の線状ラムダＤＮＡテンプレート上 のＤＮＡ合成 本例は、２５マーのプライマを用いる天然型のラムダＤＮＡテンプレートからの ＤＮＡ合成をＲｅｃＡ十蛋白質が促進するという実験結果を述べたものである。

Ａ、　ＲｅｃＡ＋蛋白質／プライマ錯体の調製ＤＮＡ合成反応に、表１に記載の プライマを使用した。

Ｉ　ＰＣＲＯＩ−２５７−７１３１−７１５５（５’）ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴ ＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧ（３’）２　ＰＲＣＯ２−２５７−７６０６−７ ６０３（５’）ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣ（３’）３ 　ＰＲＣＯＩＡ−４０？−７１３１−７１７０（５’）ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴ ＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧ−ＴＡＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴ　（３’　） ４　ＰＲＣＯ２Ａ−４０ｖ−７５９１−７６３０（５’）ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡ ＡＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＴＣ−ＣＣＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴ　（３° ）前記プライマの配列はラムダウィルスＤＮＡ配列がら導がれたものであった（ 米国コネチヵット州ノーウオークのセラスーパーキンエルマー）。このラムダウ ィルスゲノムの寸法は約４８．５ｋｂであった。該プライマの標的であるＤＮＡ セグメントは５００ｂｐのものであって、その中にプライマ配列を約１％（ラム ダゲノム全量基準）含んでいた。

ＲｅｃＡ十蛋白質を前記の１本ｔＮＤ　ＮＡプライマに次の反応条件下に結合さ せた。ＲｅｃＡ＋蛋白質０．６６μＭを、最終濃度１μＭの各プライマと共に定 温放置した（全量２μＭ）。反応混合物を２２°Ｃにおいて１．０分間定温放置 した。上記の条件下にＲｅｃＡ＋蛋白質は前記の１本鎖プライマに効果的に結合 した。これはプライマ／ＲｅｃＡ＋蛋白質錯体のゲル遅延（ｇｅｌ　ｒｅｔａｒ ｄａｔｉｏｎ）によってｌｉ！認された。

前記の１０分間の定温放置の後に、前記のＲｅｃＡ＋蛋白質／プライマ混合物を 反応混合物（トリス−１１ｃＩ　（ｐＨ＝　７．５　）　ｌ　ＯｍＭ、ＮａＣ１ （５０ｍＭ）　、門ｇｃｌｚ　１０ｍＭ、ｄＮＴＰの最終濃度７５０μＭ、ＤＭ ＳＯの最終濃度１０％）に添加した。次いでＡＴＰ−シーＳｌμＭ（最終濃度） およびＳＳＢ蛋白質０−０９４＋ｍＭ（最終濃度）を反応混合物に添加し、その 後にラムダウィルスゲノムＤＮＡにュー、イングランド、ハイオラブズ）０．５ μｇを添加した。

Ｂ、　ＲｅｃＡ＋蛋白質の存在によって促進されたＤＮＡ合成前記の反応混合物 の平衡化を３７°Ｃにおいて３分間行った。

フレノウのＤＮＡポリメラーゼ■　（略称フレノウ）１単位の添加によってＤＮ Ａ合成反応を開始させた。反応混合物を３７°Ｃに保った。前記のフレノウの最 初の添加の後に、８０分間の反応時間内にフレノウ１単位を追加する操作を１０ 分間隔で７回行った。

ＤＮＡ合成反応におけるＲｅｃＡ＋蛋白質添加の効果を調べるために、個々の場 合の反応条件を次のごとく種々変えて実験を行った（図７）、（ａ）レーンｌ　 、ＲｅｃＡ十蛋白質０．６６μＭおよびＳＳＢ蛋白質０．０９４ｎ＋Ｍを１０分 間隔で８回にわたって逐次添加、（ロ）レーン２、ＲｅｃＡ十蛋白質０．６６μ Ｍ、ＳＳＢ蛋白質０．０９４ｍＭおよびＡＴＰ−シーＳｌ＋Ｍを１０分間隔で８ 回にわたって逐次添加、（Ｃ）レーン３、プライマと錯体化したＲｅｃＡ十蛋白 質は最初だけ添加し、次いでＡＴＰ−シーＳおよびＳＳＢ蛋白質を８回にわたっ て逐次添加、（ｄ）レーン４、対照反応実験（ＲｅｃＡ　＋蛋白質、ＳＳＢ蛋白 質およびＡＴＰ−シーＳを添加せず）。

レーン５およびレーン６の実験に使用された反応混合物はラムダＤＮＡ　（０， ５ｕ　ｇ）　、および一連のｌｋｂ　ＤＮＡ分子量マーカ（ＢＲＬ）をそれぞれ 含有するものであった。

反応生成物を０．７％アガロースゲル中の電気泳動によって分離し、臭化エチジ ウムで染色してＤＮＡバンドを肉眼で観察できるようにした。実験結果を図７に 示す。

図７のデータから明らかなように、ラムダＤＮＡ合成はＲｅｃＡ＋蛋白質の添加 によって促進できることが確認された。すなわち、臭化エチジウム染色量の増大 から明らかなように、ＲｅｃＡ　＋蛋白質を含むレーンにおいてＤＮＡ生成物の 濃度が高いという事実によって反応促進効果が確認された。

Ｃ，ＲｅｃＡ十蛋白質によるＤＮＡ合成の促進は、１本鎖結合蛋白質の存在によ って影響されないことを示す実験この場合の反応条件は小節Ａに記載の条件と同 様であった。

反応混合物の平衡化を３７゛Ｃにおいて３分間行った。フレノウのＤＮＡポリメ ラーゼＩ　（略称フレノウ）１単位の添加によってＤＮＡ合成反応を開始させた 。反応混合物を３７°Ｃに保った。

フレノウの最初の添加を行った後に、８０分間の反応時間内に反応混合物に１０ 分毎にフレノウ１単位を補充した。すなわち反応混合物にフレノウを全部で８単 位（最初の１単位の添加を包含する）添加した。

ＲｅｃＡ十蛋白質の存在下におけるＤＮＡ合成に及ぼす大腸菌の１本鎖結合（Ｓ ＳＢ）蛋白質の影響を調べるために、個々の場合の反応条件を次のごとく種々変 えた。すなわち、第１番目の反応混合物（図８、レーンｌ）はＳＳＢ蛋白質を含 まないものであった。第２番目の反応混合物（図８、レーン２）には、ＲｅｃＡ ＋蛋白質プライマの添加後にＳＳＢ蛋白質を０．０９４μＭ添加した。第３番目 の反応混合物（図８、レーン３）はＲｅｃＡ　＋蛋白質およびＳＳＢ蛋白質を含 まない対照反応試料であった。

すべての反応混合物はＡＴＰ−シー３　１ｍＭを含有し、そしてこれらの反応混 合物を３７°Ｃにおいて８０分間にわたって定温放置した。

前記の８０分間の反応時間の末期にプロティナーゼに２．５μｌ　（５０μｇ／ μｍ）を反応混合物に添加し、そして反応混合物を３７°Ｃに１５分間保った。

次いでアガロースゲル電気泳動操作によってＤＮＡ分子を分離した。

前記反応の結果を図８に示す。前記の各レーン中の試料については既に述べた。

レーン４は標準的なｌｋｂの分子量のラダー（ｌａｄｄｅｒ　；　Ｂ　ＲＬ　） を含有するものであった。レーンｌおよび２中には大なる分子量の生成物が生じ たが、これによって、ＤＮＡ合成反応はＳＳＢ蛋白質の存在によって影響される ものではないことがはっきりと確認できた。一方、レーン３では、該反応はＲｅ ｃＡ十蛋白質の存在によって確実に促進されることが確認された。

例８ ＲｅｃＡ十蛋白質が３７°Ｃにおいてプライマ依存性ＤＮＡ合成を促進すること を示す実験 本例は、ＤＮＡ合成反応はＲｅｃＡ十蛋白質およびラムダ特異性プライマの両者 に左右されることを示す実験結果を述べたものである。

反応条件は下記の例外を除いて例７Ａの場合と大体同様であった。すなわち本例 における第１番目の反応混合物はＲｅｃＡｌ−蛋白質を含むがプライマを含まな いものであった（図９、レーンｌ）。第２番目の反応混合物はプライマを含むが ＲｅｃＡ十蛋白質を含まないものであった（図９、レーン２）。第３番目の反応 混合物（図９、レーン３）はＲｅｃＡ＋蛋白質およびプライマの両者を含むもの であった。

これらの反応混合物の平衡化を３７°Ｃにおいて３分間行った。

エキソヌクレアーゼを含まない大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■（大形フレノウ断片 のダブルミュータント（ｄｏｕｂｌｅ　ｎ＋ｕｔａｎｔ）　；該酵素はＵＳバイ オケミカルズから入手可能）１単位の添加によってＤＮＡ合成反応を開始させた 。反応混合物を３７°Ｃに保った。該ポリメラーゼの最初の添加を行った後に、 各反応混合物に１０分毎に所定の単位のフレノウを補充した。反応混合物を３７ °Ｃにおいて全部で７２時間にわたって定温放置した。

２８μｍの試料を前記のごとくブロティナーゼにで処理し、その後に電気泳動分 離操作を行った。

レーン３　（図９）のデータから明らかなように、ＤＮＡ合成反応はＲｅｃＡ十 蛋白質およびラムダ特異性プライマの存在下においてのみ起こる。

例９ ３７°ＣにおいてＲｅｃＡ十蛋白質によって促進されたＤＮＡの増幅本例は、５ ００ｂρのラムダ標的配列からのＤＮＡ合成反応におけるＲｅｃＡ十蛋白質の反 応促進効果を示す実施例である。

Ａ、ＳＳＢ蛋白質の影響 った。すなわち本例では、すべての反応混合物は５００ｂｐのテンブレーＦ−０ ，５μｇを含むものであった。前記の５’０Ｏｂｐのテンプレートは、天然型の ラムダゲノムＤＮＡを置換するラムダＤＮＡテンプレート（マリス）を使用して Ｔ、アクアチフスＤＮＡポリメラーゼ■の触媒作用下の熱的増幅操作の生成物の 精製によって得られたラムダゲノムのヌクレオチド７１３１−７６３０に相当す るテンプレートであった。

最初の２種の反応混合物はＲｅｃＡ十蛋白質を含まないものであった（図１０、 レーン２および３）。第３番目の反応混合物はＲｅｃＡ＋蛋白質を０，６６μＭ の最終濃度で含むがＳＳＢ蛋白質を含まないものであった（図１０、レーン４） 。第４番目の反応混合物はＲｅｃＡ十蛋白質を０．６６μＭの最終濃度でふくみ 、がっＳＳＢ蛋白質を０．０９４μＭの最終濃度で含むものであった（図１０、 レーン５）。

反応混合物の平衡化を３７゛ｃにおいて３分間行った。エキソヌクレアーゼを含 まない大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（ＵＳバさせた。反応混合物を３７°Ｃに 保った。該ポリメラーゼの最初の添加を行った後に、その後の７０分間にわたっ て反応混合物に１０分毎にフレノウを１単位づつ追加分として添加した。全反応 時間は１７．５時間であった。試料に電気泳動分離操作を行う前に、該試料を既 述の方法によってプロティナーゼにで処理した。

図１０のデータから明らがなように、ＲｅｃＡ＋蛋白質の不存在下ではＤＮＡ合 成反応は進行しない（レーン２および３）。レーン１では、前記の５００ｂｐの テンプレートを標準試料として使用した。ＲｅｃＡ±蛋白質の存在下に行われた 合成反応では、前記の５００ｂｐのテンプレートに類似の寸法の生成物のバンド が認められた（レーン４）。一方、ＲｅｃＡ＋蛋白質およびＳＳＢ蛋白質の存在 下の合成反応では、新たに生じた合成反応生成物の寸法は前記の５００ｂｐのテ ンプレートより小であった（レーン５）。

Ｂ、ＤＮＡ合成反応において反応混合物の各成分が合成反応に及ぼす影響 反応条件は本例中の既述の実験の場合と大体同様であった。

個々の実験における反応条件を表２に示す。

反応混合物中の各成分の濃度は次の通りであり、すなわち反応混合物はＲｅｃＡ 十蛋白質０．６６μＭ、ＳＳＢ蛋白質０．０９４μＭ、、ＡＴＰ−シー８１μＭ 、４０マーのプライマ２μＭ、２５７−のプライマ２μＭ、５００ｂρのテンプ レート０．５μｇを含有するものであった。エキソヌクレアーゼを含まないＤＮ Ａポリメラーゼ■の１回当たりの添加量は１単位、全添加量は８単位であった。

反応実験の番号は図１１記載のレーン番号に対応する。

図１１記載の実験結果から明らかなように、ＲｅｃＡ十蛋白質およびＡＴＰ−シ ーＳを存在させるという反応条件のもとで行われた反応実験７の場合に、ＤＮＡ 合成反応が最も顕著に促進された。反応実験８の場合の反応混合物は、さらにま たＳＳＢ蛋白質をも使用したことを除いて、反応実験７の場合と同じ成分を含む ものであった。レーン８とレーン７との比較がら明らがなように、ＳＳＢ蛋白質 を存在させることは、決して２本鎖テンプレートからのＤＮＡの合成反応におけ るＲｅｃＡ＋蛋白質およびＡＴＰ−シーＳの反応促進効果をさらに高めるもので はない。

Ｃ，ＲｅｃＡ＋蛋白質が単一温度反応における特異的な増幅を促進することを示 す実験 すべての反応混合物は５００ｂｐのテンプレート０．５μｇを含むものであった 。この５００ｂρのテンプレートは、天然型のラムダゲノムＤＮＡを置換するラ ムダＤＮＡテンプレート（マリス）を使用して、Ｔ、アクアチフスのＤＮＡポリ メラーゼＩの触媒作用下の熱的増幅操作で得られる生成物の精製によって得られ たラムダゲノムのヌクレオチド７１３１−７６３０に相当するものであった。反 応条件は、例７Ａの場合と実質的に同様であるが次の点が異なっていた。すなわ ち、反応混合物１はＡＴＰ−シーＳを含むがＲｅｃＡ＋蛋白質およびＳＳＢ蛋白 質を含まないものであった（図１２、レーン１）。反応混合物２は、ＡＴＰ−シ ーＳおよびＳＳＢ蛋白質を含むがＲｅｃＡ＋蛋白質を含まないものであった（図 １２、レーン２）。反応混合物３は、ＡＴＰ−シーＳおよびＲｅｃＡ＋蛋白質を 含むがＳＳＢ蛋白質を含まないものであった（図１２、レーン３）１反応混合物 ４は、これらの反応成分をすべて含むものであった（図１２、レーン４）。

単一温度ＤＮＡ合成反応を例７Ａの場合と実質的に同様な方法に従って行った。

３７°Ｃにおける定温放置操作を７２時間行った後に、各反応混合物の一部（１ ６μｍ）をプロティナーゼＫ１００μｇ（前記の“反応混合物の一部”当たり） で３７°Ｃにおいて１５分間処理し、０．７％アガロースゲル上に担持させた。

電気泳動分離操作の後に、ＤＮＡ断片を標準的なプロトコール（マニアチス等） によって交雑転移膜（ハイボンド−Ｎ、アマ−ジャム）に転移させた。該ＤＮＡ をＵＶ光の照射下に架橋反応によって前記の膜に結合させた（ストラータリンカ ー、ストラータジェーン）、前記のＵＶ処理後の転移膜を、３２Ｐの末端部に標 識の付いたプローブＰＣＲＯ３Ａと交雑させた。

プローブＰＣＲＯ３Ａ（天然型のラムダゲノムのヌクレオチド７３５１−７３９ ０　）は、前記の増幅反応に使用された５００ｂｐのラムダテンプレートの内部 ＤＮＡ配列に対応する４０マーのものである。次いで、前記の膜にオートラジオ グラフ操作を行った。

ＲｅｃＡ十蛋白質の触媒作用下のフレノウの単一温度増幅反応の生成物に、ある 特定の放射能標識付プローブを交雑させる実験によって、ＲｅｃＡ十蛋白質は真 の生成物の合成反応を促進させるものであることが明らかになった。オートラジ オグラフのデータ（図１２）から、ＲｅｃＡモ蛋白質およびＡＴＰ−シーＳを含 むがＳＳＢ蛋白質を含まない反応混合物を使用した場合（レーン３）にのみ、５ ００ｂｐの生成物の顕著な増幅が起こることが確認された。

例１０ テルムス・アクアチフスのＲｅｃＡ遺伝子の同定およびクローニング 本例は、サザンの交雑分析によるＴ、アクアチフスのＲｅｃＡ遺伝子の同定、お よびその後の該遺伝子のクローニングを述べたものである。

Ｔ、アクアチフスからのゲノムＤＮＡを精製し、下記の制限酵素すなわちＢａｍ Ｈｒ　、　Ｈｉｎｄｌｌｒおよび５ｓｔＩを用いて消化した。

消化されたＤＮＡを０．８％アガロースゲルに担持させ、電気泳動操作を行い、 そしてこのＤＮＡ断片をニトロセルロース膜に転移した（マニアチス等）。大腸 菌のＲｅｃＡ遺伝子に対して６１．６％の相同性を有するアクアスピルム・マグ ネトタクチクムカラのＲｅｃＡ遺伝子（Ａ−バーソン、Ｍ、ビーターズおよびＮ 、ウェーレ（すべてＳＲＩインターナショナルに所属）からの私的情報提供）を プローブとして使用した。Ａ、マグネトタクチクムはＴ、アクアチフスの場合と 同様にコドンとしての有用性を有する。該プローブは、図１３に記載の配列と、 Ａ、マグネトタクチクムの非特徴的なゲノムＤＮＡの８００個の塩基とからなる ものであった。ニックトランスレーション操作によって該プローブに放射能標識 を付けた（ベセスダ、リサーチ、ラボラトリーズ）。

サザンの交雑操作を、標準的技術（マニアチス等、１９８７年）を用いて４２“ Ｃにおいて２０％ホルムアミド中で行った。交雑体は、０．１ｘＳＳＣおよび０ ．１％ＳＤＳ中で５５’ｃにおいて厳格な作業条件下に洗浄した。オートラジオ グラフのデータには各制困ダイジェスト（ｄｉｇｅｓｔ）のシングルバンドのみ が認められた。プローブに交雑したＤＮＡのバンドは１２−１５ｋｂ、５ｋｂお よび１．５ｋｂであって、これらはそれぞれＢａｎ＋ＨＩ　、旧ｎｄｌｌｌおよ び５ｓｔｌに対応する。

このＲｅｃＡ遺伝子のクローニングを次の方法によって行った。

前記のＢａ＊ＨＩ／Ｔ、アクアチフスのゲノムＤＮＡをＥＭＢＬラムタリローニ ング系（プロメガ）にクローニングした。その結果得られたファージヘクターを 平板培養して（ｐｌａｔｅｄ）プラークを生成させた。このファージＤＮＡをニ トロセルロースフィルタに転移させた（プラークリフチング、マニアチス等）。

既述のごとく、アクアスピリルム・マグネトタクチクムのｒｅｃＡ遺伝子（図１ ３）をテルムス・アクアチフスのｒｅｃＡ遺伝子のためのプローブとして使用し た。前記のニトロセルローズフィルタを前記の標識付プローブと交雑させた。厳 格な交雑洗浄条件下に前記プローブと強く交雑したファージＤＮＡ含有クローン がら、Ｔ、アクアチフスのＲｅｃＡ遺伝子を含む大形のＢａｍＨＩ断片（１５ｋ ｂ）が単離された。

曲Ｆ’、Ｊｌ　（竹） 時間（→） カー；＝＝＝口丁（＝＝区沖；諷覧＝尻哄；＝−τ茄ム丁Ｃ訪＝糧痣＝−４２要 　約　書 要約 目　的 ＲｅｃＡ蛋白質の増幅促進作用下に、第１および第２の相補的連鎖を有し、各連 鎖が５′および３′末端部ををする２本鎖ＤＮＡ標的配列を増幅する方法を提供 する。

構成 前記第１連鎖の５′末端部の区域に相補的なプライマと前記第２連鎖の５′末端 部の区域に相補的なプライマとを、ＡＴＰ−シーＳの存在下にＲｅｃＡ蛋白質で 錯体化する。錯体化された前記のプライマをその後に、前記の標的配列、全部で ４つのｄＮＴＰ、ＲｅｃＡ蛋白質およ０′ＤＮＡポリメラーゼもまた含有する混 合物中で反応させる。この反応は、前記の２種の標的連鎖の熱解離のために要す る温度よりも低い温度において実施し、そして該反応を、前記の標的配列の所望 程度の増幅が達成されるまで続ける。本発明はさらに、チルミス・アクアチフス のＲｅｃＡ蛋白質のためにコードする配列のクローニングおよび同定方法を包含 する。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．第１および第２の相補性連鎖を有し、各連鎖が３′および５′末端部を有す る２本鎖ＤＮＡ標的配列の増幅方法において、 （ａ）前記の第１連鎖の５′末端部の区域に相補的なプライマと、前記の第２連 鎖の５′末端部の区域に相補的なプライマとを、ＡＴＰ−ν−Ｓの存在下にＲｅ ｃＡ＋蛋白質で錯体化させ、（ｂ）前記のごとく錯体化されたプライマを、前記 の標的配列、全部で４つのｄＮＴＰ、ＲｅｃＡ＋蛋白質およびＤＮＡポリメラー ゼもまた含有する反応混合物中で反応させ、前記の反応は、前記の２つの標的配 列の熱解離のために要する温度よりも低い温度において実施し、そして該反応を 、前記の標的配列の所望程度の増幅が達成されるまで続けることを特徴とする２ 本鎖ＤＮＡ標的配列の増幅方法。
2. ２．前記の２本鎖の標的ＤＮＡが阻止または抑制性二次構造の区域を有するもの である請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記の２本鎖の標的ＤＮＡが次の製法によって製造されたものであり、すな わち、１本鎖のＤＮＡ分子を用意し、これを２本鎖のＤＮＡ分子に変換させ、該 変換のために次の操作を行い、 （ａ）前記の１本鎖の５′末端部の区域に相補的なプライマをＡＴＰ−ν−Ｓの 存在下にＲｅｃＡ蛋白質で錯体化し、（ｂ）前記のごとく錯体化されたプライマ を、前記の１本鎖標的配列、全部で４つのｄＮＴＰおよびポリメラーゼもまた含 有する反応混合物中で反応させることによって、前記の１本鎖標的配列に相補的 な連鎖を生成させる操作を行うことを包含する請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．前記の１本鎖ＤＮＡが、阻止または抑制性二次構造の区域を有するものであ る請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．前記に１本鎖ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子である請求の範囲第３項に記載の方 法。
6. ６．前記の反応工程がさらにポリメラーゼの追加的添加操作を包含する請求の範 囲第１項に記載の方法。
7. ７．前記の反応工程がさらにＲｅｃＡ蛋白質の追加的添加操作を包含する請求の 範囲第１項に記載の方法。
8. ８．前記の反応工程がさらにＡＴＰ−ν−Ｓの追加的添加操作またはｄＡＴＰと ＡＴＰ−ν−Ｓとの混合物の追加的添加操作を包含する請求の範囲第７項に記載 の方法。
9. ９．前記の２種のプライマーが、同一のＤＮＡ配列に相補的なものである請求の 範囲第１項に記載の方法。
10. １０．前記のプライマが、前記のＤＮＡ標的配列に相補的でない５′末端部配列 を含むものである請求の範囲第１項に記載の方法。
11. １１．前記の非相補的な配列が、制限酵素エンドヌクレアーゼ認識部位のために コードする配列を包含するものである請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．前記の２本鎖の標的ＤＮＡが、物理的または化学的に損傷したものである 請求の範囲第１項に記載の方法。
13. １３．前記のＲｅｃＡ蛋白質が、ｒｅｃＡ−８０３遺伝子の蛋白質生成物である 請求の範囲第１項に記載の方法。
14. １４．前記のポリメラーゼが大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの大形のクレノウ断 片であり、前記反応を３７℃において実施する請求の範囲第１項に記載の方法。
15. １５．第１および第２の相補的連鎖を有し、各連鎖が５′および３′末端部を有 する２本鎖ＤＮＡ標的配列の合成および増幅方法において、 （ａ）前記の第１連鎖の５′末端部の区域に相補的なプライマと前記の第２連鎖 の５′末端部の区域に相補的なプライマとを、ＡＴＰ−ν−Ｓの存在下に熱安定 性ＲｅｃＡ蛋白質で錯体化し、　（ｂ）前記のごとく錯体化されたプライマを、 前記の標的配列、全部で４つのｄＮＴＰおよび熱安定性ポリメラーゼもまた含む 反応混合物中で反応させ、しかして該反応は、約５０℃より上の、ただし前記の 標的連鎖およびそれに対応するプライマの熱解離のために要する温度よりも低い 温度において実施し、そして該反応を、前記の標的配列の所望程度の増幅が達成 されるまで続けることを特徴とする２本鎖ＤＮＡ標的配列の合成および増幅方法 。
16. １６．前記の熱安定性ＲｅｃＡ蛋白質がテルムス・アクアチクスのＲｅｃＡ蛋白 質である請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. １７．前記の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがテルムス・アクアチクスのＤＮＡポ リメラーゼＩである請求の範囲第１５項に記載の方法。
18. １８．前記の熱安定性ＲｅｃＡ蛋白質がテルムス・アクアチクスのＲｅｃＡ蛋白 質である請求の範囲第１７項に記載の方法。