JPS63109800A - Ｄｎａ塩基配列決定法 - Google Patents
Ｄｎａ塩基配列決定法Info
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- JPS63109800A JPS63109800A JP25499486A JP25499486A JPS63109800A JP S63109800 A JPS63109800 A JP S63109800A JP 25499486 A JP25499486 A JP 25499486A JP 25499486 A JP25499486 A JP 25499486A JP S63109800 A JPS63109800 A JP S63109800A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はＤＮＡ塩基配列の決定法に関する。更に詳しく
は、ｒｅｃ Ａ蛋白によるＤループ生成反応を利用した
ＤＮＡ塩基配列決定法に関する。
は、ｒｅｃ Ａ蛋白によるＤループ生成反応を利用した
ＤＮＡ塩基配列決定法に関する。
ＤＮＡの塩基配列の解析に、現在、Ｍ１３など単鎖ＤＮ
Ａファージベクター、単鎖ＤＮＡ断片（プライマー）、
ＤＮＡ合成酵素、ヂデオキシ３リン酸を用いた方法が広
く使われている（第２法：第２図）。これは、ヂデオキ
シ３リン酸が合成されつつあるＤＮＡ鎮に取り込まれる
とそこで、合成反応が停止するという特性を利用し、特
定の塩基のある部位で合成反応を止め、更にこの合成さ
れたり、ＮＡＯ鎖長を、ゲル電気泳動で解析する事によ
って、鋳型となったＤＮＡの塩基配列を読み取る事がで
きるという原理を用いている。
Ａファージベクター、単鎖ＤＮＡ断片（プライマー）、
ＤＮＡ合成酵素、ヂデオキシ３リン酸を用いた方法が広
く使われている（第２法：第２図）。これは、ヂデオキ
シ３リン酸が合成されつつあるＤＮＡ鎮に取り込まれる
とそこで、合成反応が停止するという特性を利用し、特
定の塩基のある部位で合成反応を止め、更にこの合成さ
れたり、ＮＡＯ鎖長を、ゲル電気泳動で解析する事によ
って、鋳型となったＤＮＡの塩基配列を読み取る事がで
きるという原理を用いている。
この方法の欠点として次のような事が挙げられる。
（１）塩基配列を解析しようとする被検体ＤＮＡを、Ｍ
１３ベクターにクローニングし直さなければならない（
第２図、第１１第■段階）。このクローニングの操作は
、繁雑である。
１３ベクターにクローニングし直さなければならない（
第２図、第１１第■段階）。このクローニングの操作は
、繁雑である。
（２）被検体ＤＮＡによっては、Ｍ１３ベクターにクロ
ーニングする事ができない。この事は、その部分の塩基
配列の解析は不能である事を意味する。
ーニングする事ができない。この事は、その部分の塩基
配列の解析は不能である事を意味する。
（３）被検体ＤＮＡによっては、Ｍ１３ベクターにクロ
ーニングして、鋳型となる単鎖ＤＮＡとして調製する間
に高い率で変異を受ける。この事は、塩基配列の解析結
果の精度を下げる事となる。単鎖ＤＮＡベクターを用い
る事に起因する第３の欠点を除く為に、二重鎖ＤＮＡブ
ラスミドヲ用いたクローニング専用のベクターも開発さ
れているが、（１）、（２）の点についてはＭ１３を用
いる方法となんら変りはない。
ーニングして、鋳型となる単鎖ＤＮＡとして調製する間
に高い率で変異を受ける。この事は、塩基配列の解析結
果の精度を下げる事となる。単鎖ＤＮＡベクターを用い
る事に起因する第３の欠点を除く為に、二重鎖ＤＮＡブ
ラスミドヲ用いたクローニング専用のベクターも開発さ
れているが、（１）、（２）の点についてはＭ１３を用
いる方法となんら変りはない。
そこで本発明の方法は、Ｍ１３ベクターを用いる方法の
もつ上記の３つの欠点を解決する事を目的とする。
もつ上記の３つの欠点を解決する事を目的とする。
本発明は、
（ａ） 被検体ＤＮＡを有する二重鎖ＤＮＡと単鎖Ｄ
ＮＡ断片とを、ｒｅｃ Ａ蛋白又はその類似蛋白及びＡ
ＴＰの存在下で共存させて該単鎖Ｄ Ｎ Ａ断片を上記
二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位にＤルー
ズの形で載せ、 （ｂ）（ａ）で得られた単鎖ＤＮＡ断片を載せた二重鎖
ＤＮＡ上の単鎖ＤＮＡ断片をプライマーとし、該二重鎖
ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡ合成酵舅を
用い、かつ４種のｄＮＴＰおよび該ｄＮＴＰの１種の塩
基に対応する２’ 、 ３’−ジデオキシヌクレオシ
ド三リン酸類似体（ｄｄＮＴＰ）の存在下行う相補的Ｄ
ＮＡの合成を、各ｄＮＴＰに対応する４種のｄｄＮＴＰ
についてそれぞれ行い、鎖長の異なるＤＮＡ分子を合成
し、 （ｃ） （ｂ）で得られたＤＮＡ分子を二重鎖ＤＮＡ
から分離し、次いでゲル電気泳動法により該ＤＮＡ分子
を展開し、各バンドに対応する塩基を同定する、 諸工程を含むＤＮＡ塩基配列決定法に関する。
ＮＡ断片とを、ｒｅｃ Ａ蛋白又はその類似蛋白及びＡ
ＴＰの存在下で共存させて該単鎖Ｄ Ｎ Ａ断片を上記
二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位にＤルー
ズの形で載せ、 （ｂ）（ａ）で得られた単鎖ＤＮＡ断片を載せた二重鎖
ＤＮＡ上の単鎖ＤＮＡ断片をプライマーとし、該二重鎖
ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡ合成酵舅を
用い、かつ４種のｄＮＴＰおよび該ｄＮＴＰの１種の塩
基に対応する２’ 、 ３’−ジデオキシヌクレオシ
ド三リン酸類似体（ｄｄＮＴＰ）の存在下行う相補的Ｄ
ＮＡの合成を、各ｄＮＴＰに対応する４種のｄｄＮＴＰ
についてそれぞれ行い、鎖長の異なるＤＮＡ分子を合成
し、 （ｃ） （ｂ）で得られたＤＮＡ分子を二重鎖ＤＮＡ
から分離し、次いでゲル電気泳動法により該ＤＮＡ分子
を展開し、各バンドに対応する塩基を同定する、 諸工程を含むＤＮＡ塩基配列決定法に関する。
以下本発明について第１図に従って説明する。
まず本発明の決定法においては、被検体ＤＮＡを有する
二重鎖 Ｄ Ｎ Ａとプライマーとして働く単鎖ＤＮＡ
断片とを、ｒｅｃ Ａ蛋白又はその類似蛋白及びＡＴＰ
の存在下で共存させて該単６１ Ｄ Ｎ Ａ断片を上記
二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位にＤルー
プの形で載せる（工程（ａ））。
二重鎖 Ｄ Ｎ Ａとプライマーとして働く単鎖ＤＮＡ
断片とを、ｒｅｃ Ａ蛋白又はその類似蛋白及びＡＴＰ
の存在下で共存させて該単６１ Ｄ Ｎ Ａ断片を上記
二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位にＤルー
プの形で載せる（工程（ａ））。
本発明においては、ＡＴＰの存在下ｒｅｃ Ａ蛋白又は
その類似蛋白の作用によってプライマーとなる単鎖ＤＮ
Ａ断片を二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位
にＤルーズの形で載せることができる。
その類似蛋白の作用によってプライマーとなる単鎖ＤＮ
Ａ断片を二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位
にＤルーズの形で載せることができる。
本発明において被検体ＤＮＡのベクターとなる二重鎖Ｄ
ＮＡとしては、従来からベクターとして知られている種
々の閉環状二重鎖ＤＮＡを制限なく用いることができる
。例えばｐＢＲ３２２の系統、Ｃｏ４２Ｅ１の系統、ｐ
ＭＢ９の系統、ｐＳＣｌｏｌの系統、Ｒ六にの系統、ラ
ムダ・ファージの系統を挙げることができる。また、該
二重鎖ＤＮＡへの被検体ＤＮＡのクローニングは、既知
の方法、例えばマニアティらの文献（Ｍａｎｉａｔｉｓ
。
ＮＡとしては、従来からベクターとして知られている種
々の閉環状二重鎖ＤＮＡを制限なく用いることができる
。例えばｐＢＲ３２２の系統、Ｃｏ４２Ｅ１の系統、ｐ
ＭＢ９の系統、ｐＳＣｌｏｌの系統、Ｒ六にの系統、ラ
ムダ・ファージの系統を挙げることができる。また、該
二重鎖ＤＮＡへの被検体ＤＮＡのクローニングは、既知
の方法、例えばマニアティらの文献（Ｍａｎｉａｔｉｓ
。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ”Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｆｔａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２）に
記載の方法に基いて行うことができる。ただし、この方
法に限定されるものではない。
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ： ａｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｆｔａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２）に
記載の方法に基いて行うことができる。ただし、この方
法に限定されるものではない。
尚本発明において被検体ＤＮＡの大きさについて特に制
限はないが１例えば約１００塩基対程度のＤＮＡ断片で
あることが好ましい。
限はないが１例えば約１００塩基対程度のＤＮＡ断片で
あることが好ましい。
本発明は従来の単鎖ＤＮＡであるＭ１３ベクターを用い
る方法と異なり、塩基配列を調べようとしている被検体
ＤＮＡをクローニングした二重鎖ＤＮＡをそのまま検体
として用いるものである。
る方法と異なり、塩基配列を調べようとしている被検体
ＤＮＡをクローニングした二重鎖ＤＮＡをそのまま検体
として用いるものである。
ここでｒｅｃ Ａ蛋白としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａＣＯＩＩ）のｒｅｃＡ蛋白を挙げることができ
、例えば柴田らの文献（Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ、
（１９１３３） ！Ｊｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ １００：１９７）の記載に基いて、入手
することができる。又、ｒｅｃ Ａ蛋白に類似の蛋白と
しては、Ｔ４ファージ由来のｕｖｓ Ｘ蛋白、枯草菌（
Ｂａｃ ｉ １１ｕｓｓｕｂｔ ｉ １ ｉｓ）由来の
ｒｅｃ蛋白及び黒穂菌（ｔｌｓｔｉｌａｇｏ）由来のｒ
ｅｃ ｌ蛋白等を例示することができる。これらの蛋白
は、例えば［ｕｖｓ Ｘ ：Ｙｏｎｅｓａｋｉ ｅｔ
ａｌ、 （１９８５） Ｅｎｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
ｃｈｉａＣＯＩＩ）のｒｅｃＡ蛋白を挙げることができ
、例えば柴田らの文献（Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ、
（１９１３３） ！Ｊｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ １００：１９７）の記載に基いて、入手
することができる。又、ｒｅｃ Ａ蛋白に類似の蛋白と
しては、Ｔ４ファージ由来のｕｖｓ Ｘ蛋白、枯草菌（
Ｂａｃ ｉ １１ｕｓｓｕｂｔ ｉ １ ｉｓ）由来の
ｒｅｃ蛋白及び黒穂菌（ｔｌｓｔｉｌａｇｏ）由来のｒ
ｅｃ ｌ蛋白等を例示することができる。これらの蛋白
は、例えば［ｕｖｓ Ｘ ：Ｙｏｎｅｓａｋｉ ｅｔ
ａｌ、 （１９８５） Ｅｎｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
１４８：１２？ 、 ｒｅｃ蛋白； Ｌｏｖｅｔｔ ａ
ｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９８５） Ｊ、 Ｂｌｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２６０：３３０５ 、 ｒｅｃ １ ；
Ｋｍｉｅｃ ａｎｄ Ｈｏｌｌｏｍａｎ （１９８２）
Ｃｅ１ｌ ２９：３６７ Ｅの記載に基いて入手する
ことができる。
ｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９８５） Ｊ、 Ｂｌｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２６０：３３０５ 、 ｒｅｃ １ ；
Ｋｍｉｅｃ ａｎｄ Ｈｏｌｌｏｍａｎ （１９８２）
Ｃｅ１ｌ ２９：３６７ Ｅの記載に基いて入手する
ことができる。
プライマーとして働く単鎖ＤＮＡ断片は、挿入された被
検体ＤＮＡに隣接するベクター（二重鎖ＤＮＡ）の部位
の塩基配列と同一の塩基配列を有する単鎖Ｄ Ｎ Ａ
Ｉｒ片である。該単鎖ＤＮＡ断片としては化学的合成し
たＤＮＡ又は天然のＤＮＡから制限酵素等を用いて分離
したＤＮＡのいずれであってもよい。該ＤＮＡ断片の大
きさは例えば約１００塩基対であることが好ましい。
検体ＤＮＡに隣接するベクター（二重鎖ＤＮＡ）の部位
の塩基配列と同一の塩基配列を有する単鎖Ｄ Ｎ Ａ
Ｉｒ片である。該単鎖ＤＮＡ断片としては化学的合成し
たＤＮＡ又は天然のＤＮＡから制限酵素等を用いて分離
したＤＮＡのいずれであってもよい。該ＤＮＡ断片の大
きさは例えば約１００塩基対であることが好ましい。
尚、本発明においては、工程（ａ）においてｒｅｃ Ａ
蛋白又はその類似蛋白に加えて抗ｒｅｃ Ａ蛋白単クロ
ーン抗体（例えばＡＲＭ １９３ ；Ｍａｋｉｎｏら、
＜１９８５）、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
２６０ ：１５４０２）を存在させることが、Ｄル
ープの形成を容易にさせることができるために好ましい
。
蛋白又はその類似蛋白に加えて抗ｒｅｃ Ａ蛋白単クロ
ーン抗体（例えばＡＲＭ １９３ ；Ｍａｋｉｎｏら、
＜１９８５）、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
２６０ ：１５４０２）を存在させることが、Ｄル
ープの形成を容易にさせることができるために好ましい
。
次に本発明においては、前記工程Ｃａ）で得られた単鎖
ＤＮＡ断片を載せた二重鎖ＤＮＡ上の単鎖ＤＮＡ断片を
プライマーとし、該二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡを鋳
型とし、ＤＮＡ合成酵素を用い、かつ４種のｄ Ｎ Ｔ
Ｐおよび該ｄＮＴＰの１種の塩基に対応する２’
、 ３’ −ジデオキシヌクレオシド三リン酸類似体（
ｄｄＮＴＰ）の存在下行う相補的ＤＮＡの合成を、各ｄ
ＮＴＰに対応する４種のｄ ｄ Ｎ Ｔ Ｐについてそ
れぞれ行い、鎖長の異なるＤＮＡ分子を合成する（工程
（ｂ））。
ＤＮＡ断片を載せた二重鎖ＤＮＡ上の単鎖ＤＮＡ断片を
プライマーとし、該二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡを鋳
型とし、ＤＮＡ合成酵素を用い、かつ４種のｄ Ｎ Ｔ
Ｐおよび該ｄＮＴＰの１種の塩基に対応する２’
、 ３’ −ジデオキシヌクレオシド三リン酸類似体（
ｄｄＮＴＰ）の存在下行う相補的ＤＮＡの合成を、各ｄ
ＮＴＰに対応する４種のｄ ｄ Ｎ Ｔ Ｐについてそ
れぞれ行い、鎖長の異なるＤＮＡ分子を合成する（工程
（ｂ））。
諸工程（ｂ）は、ヂデオキシヌクレオチド法を応用する
ことにより行える。より詳しくは、工程（ａ）で得た二
重鎖 Ｄ Ｎ Ａを含む試料にＤＮＡ合成酵素を添加し
た後に、該試料を４分割し、各試料に４種のｄＮＴＰ
（ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、、ｄＣＴＰ。
ことにより行える。より詳しくは、工程（ａ）で得た二
重鎖 Ｄ Ｎ Ａを含む試料にＤＮＡ合成酵素を添加し
た後に、該試料を４分割し、各試料に４種のｄＮＴＰ
（ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、、ｄＣＴＰ。
ｄＡＴＰ）を加え、さらに各試料にｄｄＮＴＰとしてｄ
ｄＡＴＰ ：ｄｄＴＴＰＳｄｄＧＴＰ及びｄｄＣＴＰを
それぞれ加え、室温で１５〜２０分間反応させる。
ｄＡＴＰ ：ｄｄＴＴＰＳｄｄＧＴＰ及びｄｄＣＴＰを
それぞれ加え、室温で１５〜２０分間反応させる。
該反応において、ｄ ｄ Ｎ Ｔ Ｐとして例えばｄｄ
ＡＴＰを用いた試料については、ｄｄＴＴＰが取込まれ
た位置で補相的ＤＮＡの伸長反応は停止し、その結果鎖
長の異なるＤＮＡ分子が生成する。ｄｄＮＴＰとしてｄ
ｄＴＴＰ等を用いた場合にもそれぞれ同様の機構によっ
て、鎖長の異なるＤＮＡ分子が生成する。
ＡＴＰを用いた試料については、ｄｄＴＴＰが取込まれ
た位置で補相的ＤＮＡの伸長反応は停止し、その結果鎖
長の異なるＤＮＡ分子が生成する。ｄｄＮＴＰとしてｄ
ｄＴＴＰ等を用いた場合にもそれぞれ同様の機構によっ
て、鎖長の異なるＤＮＡ分子が生成する。
該工程（ｂ）において、ＤＮＡ合成酵素としては例えば
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ工大フラグメント（Ｋｌｅｎ
ｏｗ Ｆｒａｇｎ；ｅｎｔ）を挙げることができる。
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ工大フラグメント（Ｋｌｅｎ
ｏｗ Ｆｒａｇｎ；ｅｎｔ）を挙げることができる。
さらに本発明においては、ｄＮＴＰの少なくとも１種に
放射性同位元素（例えば３５３や３２Ｐ）を含むｄＮＴ
Ｐを用いることが、後の電気泳動法によるＤＮＡ配列決
定の際に好ましい。
放射性同位元素（例えば３５３や３２Ｐ）を含むｄＮＴ
Ｐを用いることが、後の電気泳動法によるＤＮＡ配列決
定の際に好ましい。
次いで本発明において、前記工程ｂ）で得られたＤＮＡ
分子を二重鎖Ｄ Ｎ Ａから分離し、次いでゲル電気泳
動法により該ＤＮＡ分子を展開し、各バンドに対応する
塩基を同定する（工程（ｃ））。
分子を二重鎖Ｄ Ｎ Ａから分離し、次いでゲル電気泳
動法により該ＤＮＡ分子を展開し、各バンドに対応する
塩基を同定する（工程（ｃ））。
工程（ｃ）におけるＤＮＡ分子の二重鎖ＤＮＡからの分
離は、工程（ｂ）において４分割されて得られたそれぞ
れの合成されたＤＮＡ分子を含む二重鎖ＤＮＡを熱処理
することで行うことができる。
離は、工程（ｂ）において４分割されて得られたそれぞ
れの合成されたＤＮＡ分子を含む二重鎖ＤＮＡを熱処理
することで行うことができる。
該熱処理は、９０〜１００℃で５〜１０分間の条件で行
うことができる。
うことができる。
次いで分離された相補的に合成された単鎖ＤＮＡ分子は
ゲル電気泳動によって各フラグメントに分離（展開）し
、各フラグメントをラジオオートグラフ等により検知し
て、その結果から塩基配列を求めることができる。
ゲル電気泳動によって各フラグメントに分離（展開）し
、各フラグメントをラジオオートグラフ等により検知し
て、その結果から塩基配列を求めることができる。
尚、工程（ａ）においてＤループを作らせるにｒｅｃＡ
蛋白等の活性を用いずに、ただ高温（二重鎖ＤＮＡの融
解温度より幾らか低い温度）で保温する方法も有る。し
かし、ｒｅｃ Ａ蛋白等を用いると、反応を１０’〜１
０６倍と速くする事ができる。これは、プライマーの必
要量の削減１反応時間の短縮、またはＤループの収量の
増加につながる。また、ｒｅｃ Ａ蛋白等を用いると、
Ｄループ形成反応（第１図、工程〔ａ〕）をＤＮＡ合成
反応の行える条件下（常温、中性ｐＨ）で行う事ができ
るので、工程（ａ）とＤＮＡ合成反応（第１図、工程（
ｂ））とを組み合わせて１度で行い、操作の行程を簡単
にする事も可能である。
蛋白等の活性を用いずに、ただ高温（二重鎖ＤＮＡの融
解温度より幾らか低い温度）で保温する方法も有る。し
かし、ｒｅｃ Ａ蛋白等を用いると、反応を１０’〜１
０６倍と速くする事ができる。これは、プライマーの必
要量の削減１反応時間の短縮、またはＤループの収量の
増加につながる。また、ｒｅｃ Ａ蛋白等を用いると、
Ｄループ形成反応（第１図、工程〔ａ〕）をＤＮＡ合成
反応の行える条件下（常温、中性ｐＨ）で行う事ができ
るので、工程（ａ）とＤＮＡ合成反応（第１図、工程（
ｂ））とを組み合わせて１度で行い、操作の行程を簡単
にする事も可能である。
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例
（１）塩基配列゛を調べようとしている被検体Ｄ Ｎ
Ａをクローニングした閉環状二重鎖ＤＮＡ （ｐＢＲ３
２２）（１０ＰＭ；ヌクレオチド残基の濃度で）、被検
体ＤＮＡの挿入された部位に隣接するベクタ一部位の塩
基配列をもつ単鎖ＤＮＡ断片（０，４μＭ；ヌクレオチ
ド残基の濃度で）、ｒｅｃ Ａ蛋白（大腸菌由来； ０
．１μＭ） 、ＡＴＰ（１，３ｍ！、１ ） 、３１
ｍ！、１ ）リス・ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）
、１３ ｍＭ塩化マグネシウム、１．８ｍｓ！ ジチオ
スレイトーノベ８８μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンを２５
μβ程度の反応液として、３７°で３０分保温した。
Ａをクローニングした閉環状二重鎖ＤＮＡ （ｐＢＲ３
２２）（１０ＰＭ；ヌクレオチド残基の濃度で）、被検
体ＤＮＡの挿入された部位に隣接するベクタ一部位の塩
基配列をもつ単鎖ＤＮＡ断片（０，４μＭ；ヌクレオチ
ド残基の濃度で）、ｒｅｃ Ａ蛋白（大腸菌由来； ０
．１μＭ） 、ＡＴＰ（１，３ｍ！、１ ） 、３１
ｍ！、１ ）リス・ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）
、１３ ｍＭ塩化マグネシウム、１．８ｍｓ！ ジチオ
スレイトーノベ８８μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンを２５
μβ程度の反応液として、３７°で３０分保温した。
（２）保温後、反応液に”５−ｄＡＴＰ （１μＭ、６
００ロｉ／ｍｆｎｏβ）と、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
工大フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ
）（０，０６ｕｎｉｔ／ｍｆりとを加えた。
００ロｉ／ｍｆｎｏβ）と、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
工大フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ
）（０，０６ｕｎｉｔ／ｍｆりとを加えた。
（３）それを、５μβずつに、分割した（ａ、ｔ。
ｇ、ｃ）。
（４）ａにｄＧＴＰ（３０ＡＩＭ ） 、 ｄＴＴ
Ｐ（３０μ！、Ｉ ） 、 ｄＣＴＰ（３０μＭ
） 、 ｄｄＡＴＰ（７０ＰＭ ＞を、ｔにｃｌＧＴＰ
（５０μＭＡ ） 、 ｄＴＴＰ（２，５μＭ ）
、 ｄＣＴＰ（５０ＰＭ ） 、 ｄｄＴＴＰ（２
００μ；４）を、ｇにｄＧＴｐ （２，５μＭ ）
、 ｄＴＴＰ（５０μＭ ） 、 ｄＣＴＰ（５０
ＰＭ ） 、 ｄｄＴＧＰ＜１００μＭ）を、Ｃ（こｄ
ＣＴＰ（５０μ！、ｌ ）、 ｃｌＴＴＰ（５０μ
Ｍ ）、 ｄＣＴＰ（２，５μ７４ ） 、 ｄｄ
ＣＴＰ（１００μ入１）を、それぞれ加えたく最終体積
、７μβ）。
Ｐ（３０μ！、Ｉ ） 、 ｄＣＴＰ（３０μＭ
） 、 ｄｄＡＴＰ（７０ＰＭ ＞を、ｔにｃｌＧＴＰ
（５０μＭＡ ） 、 ｄＴＴＰ（２，５μＭ ）
、 ｄＣＴＰ（５０ＰＭ ） 、 ｄｄＴＴＰ（２
００μ；４）を、ｇにｄＧＴｐ （２，５μＭ ）
、 ｄＴＴＰ（５０μＭ ） 、 ｄＣＴＰ（５０
ＰＭ ） 、 ｄｄＴＧＰ＜１００μＭ）を、Ｃ（こｄ
ＣＴＰ（５０μ！、ｌ ）、 ｃｌＴＴＰ（５０μ
Ｍ ）、 ｄＣＴＰ（２，５μ７４ ） 、 ｄｄ
ＣＴＰ（１００μ入１）を、それぞれ加えたく最終体積
、７μβ）。
（５）以下の操作を、ａ、ｔ、ｇ、ｃそれぞれの検体に
就いて、別々に行った。
就いて、別々に行った。
（６）検体を、室温で１５〜２０分保温した。
（７） ｄＡＴＰ（５０ＰＭ ） 、 ｄＧＴＰ（５
μλＩ ） 、 ｄＴＴＰ（５μＮｌ）。
μλＩ ） 、 ｄＴＴＰ（５μＮｌ）。
ｄＣＴＰ（５μＭ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■大フ
ラグメント（０，０１５ｕｎｉｔ／ｍｆ）の混合液を２
μｍ加え、更に１５〜２０分、室温で保温した。
ラグメント（０，０１５ｕｎｉｔ／ｍｆ）の混合液を２
μｍ加え、更に１５〜２０分、室温で保温した。
（８）０．３％キシレンシアノーノベ０．３ ％ブロモ
フェノールブルー、１０ｍ）。ｌ ＥＤＴＡの混合液を
７μ！加え、混合した。
フェノールブルー、１０ｍ）。ｌ ＥＤＴＡの混合液を
７μ！加え、混合した。
（９）１００° １０分、熱処理した。
α■ ４種の検体を、１枚の６％ポリアクリルアミドゲ
ルの平板の、異なるレーンで電気泳動により、展開し、
ラジオオートグラフによってＤＮＡ断片の位置を同定し
、塩基配列を読み取った。
ルの平板の、異なるレーンで電気泳動により、展開し、
ラジオオートグラフによってＤＮＡ断片の位置を同定し
、塩基配列を読み取った。
得られた結果を、鋳型にしたＤＮＡの塩基配列とともに
第３図に示す。
第３図に示す。
尚、（１）の反応と（２）〜（７）の反応とを同時に行
う事もできる。この時反応は、３７°で行わなければな
らない。反応時間、用いるＤ Ｎ 、４．ポリメラーゼ
１大フラグメントの量は、調節する必要がある。
う事もできる。この時反応は、３７°で行わなければな
らない。反応時間、用いるＤ Ｎ 、４．ポリメラーゼ
１大フラグメントの量は、調節する必要がある。
本発明のＤＮＡ塩基配列決定法は以下のような優れた効
果を有する。
果を有する。
被検体ＤＮＡをＭ１３ベクターにクローニングする必要
がない。その結果Ｍ１３ベクターへのクローニングの手
間を省くことができ、かつクローニングの際に生じる可
能性のある変異を避けることもできる。
がない。その結果Ｍ１３ベクターへのクローニングの手
間を省くことができ、かつクローニングの際に生じる可
能性のある変異を避けることもできる。
第１図は本発明のｒｅｃΔ蛋白によるＤループ生成反応
を利用した二重鎖Ｄ Ｎ Ａの塩基配列決定法のスキー
ムである。 第２図はＭ１３単鎖ＤＮＡファージベクターを利用した
塩基配列の決定法のスキームである。 第３図はゲル電気泳動による、ヂデオキシヌクレオチド
存在下で合成、標識したＤＮＡの解析と塩基配列読み取
りの例を示す。 尚第１図及び第２図中、Ｎ、Ｎ’ はＡ、Ｔ；Ｔ。 Ａ；Ｇ、ＣＴＣ，Ｇのいずれかの対を表わす。また間隔
が一定の２本の線は二重ラセンを表わす。 昭和 ４ し２ ８ 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２５４９９４
号２、発明の名称 ＤＮＡ塩基塩基配列性定法３正
をする者 事件との関係 出願人 名称 （６７９）理化学研究所 ４、代理人 ５、補正命令の日付 自 発 （１）特許請求の範囲を別紙の如（訂正する。 ０） 明細書中、下記個所の誤記を各々訂正する。 （３）第１図及び第２図を別紙の如く訂正する。 特許請求の範囲 （１） （ａ） 被検体ＤＮＡを有する二重鎖ＤＮＡ
と単鎖ＤＮＡ断片とを、ｒｅｃ Ａ蛋白又はその類似蛋
白及びＡＴＰの存在下で共存させて該単鎖ＤＮＡ断片を
上記二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位にＤ
ルーズの形で載せ、（ｂ）（ａ）で得られた単鎖ＤＮＡ
断片を載せた二重鎖ＤＮＡ上の単鎖Ｄ Ｎ Ａ断片をプ
ライマーとし、該二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡを鋳型
とし、ＤＮＡ合成酵素を用い、かつ４種のｄＮＴＰおよ
び該ｄ Ｎ Ｔ Ｐの１種の塩基に対応する２’ 、
３’ −ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄ
ＮＴＰ）の存在下で行う相補的ＤＮＡの合成を、各ｄＮ
ＴＰに対応する４種のｄｄＮＴＰについてそれぞれ行い
、鎖長の異なるＤＮＡ分子を合成し、 （ｃ） （ｃｌ）で得られたＤＮＡ分子を二重鎖ＤＮ
Ａから分離し、次いでゲル電気泳動法により該ＤＮＡ分
子を展開し、各バンドに対応する塩基を同定する、 諸工程を含むＤＮＡ塩基配列決定法。 （２） 工程（ａ）で用いるｒｅｃΔ蛋白が大腸菌ｒ
ｅＣＡ蛋白である特許請求の範囲第（１）項記載の決定
法。 （３）工程（ａ）で用いるｒｅｃ Ａの類似蛋白がＴ４
ファージ由来のｕｖｓ Ｘ蛋白、枯草菌由来のｒｅｃ蛋
白又は黒穂菌（Ｕｓｔ ｉ ｌａｇｏ）由来のｒｅｃｌ
蛋白である特許請求の範囲第（１〕項記載の決定法。 （４） 工程１ｌｌｂ）で用いるＤＮＡ合成酵素が大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１大フラグメントである特許請
求の範囲第（１）項記載の決定法。 （５）ｄＮＴＰの少なくとも１種に放射性同位元素を含
むｄＮＴＰを用いる特許請求の範囲第（１）項記載の決
定法。 （６）放射性同位元素が３５５又は３２ｐである特許請
求の範囲第（５）項記載の決定法。 〔７〕工程（５）を、工程（ａ）で得た二重鎖ＤＮＡを
含む試料にＤＮＡ合成酵素を添加した後に、該試料を４
分割し、各試料に４種のｄＮＴＰを加え、さらに各試料
にｄｄＮＴＰとして、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄ（
１，ＴＰ、、（］、ｄＣＴＰをそれぞれ加えることによ
って実施し、かつ得られた相補的ＤＮＡ分子を含む各試
料についてそれぞれゲル電気泳動法を行う特許請求の範
囲第〔１〕項記載の決定法。 （８）工程（ｃ）におけるＤＮＡ分子の二重鎖ＤＮＡか
らの分離を、工程（ｂ）において得られた合成されたＤ
ＮＡ分子を含む二重鎖ＤＮＡを熱処理することによって
行う特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。 （９）工程（ａ）においてｒｅｃΔ蛋白又はその類似蛋
白に加えて抗ｒｅｃ Ａ蛋白単クローン抗体を存在させ
る特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。
を利用した二重鎖Ｄ Ｎ Ａの塩基配列決定法のスキー
ムである。 第２図はＭ１３単鎖ＤＮＡファージベクターを利用した
塩基配列の決定法のスキームである。 第３図はゲル電気泳動による、ヂデオキシヌクレオチド
存在下で合成、標識したＤＮＡの解析と塩基配列読み取
りの例を示す。 尚第１図及び第２図中、Ｎ、Ｎ’ はＡ、Ｔ；Ｔ。 Ａ；Ｇ、ＣＴＣ，Ｇのいずれかの対を表わす。また間隔
が一定の２本の線は二重ラセンを表わす。 昭和 ４ し２ ８ 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２５４９９４
号２、発明の名称 ＤＮＡ塩基塩基配列性定法３正
をする者 事件との関係 出願人 名称 （６７９）理化学研究所 ４、代理人 ５、補正命令の日付 自 発 （１）特許請求の範囲を別紙の如（訂正する。 ０） 明細書中、下記個所の誤記を各々訂正する。 （３）第１図及び第２図を別紙の如く訂正する。 特許請求の範囲 （１） （ａ） 被検体ＤＮＡを有する二重鎖ＤＮＡ
と単鎖ＤＮＡ断片とを、ｒｅｃ Ａ蛋白又はその類似蛋
白及びＡＴＰの存在下で共存させて該単鎖ＤＮＡ断片を
上記二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位にＤ
ルーズの形で載せ、（ｂ）（ａ）で得られた単鎖ＤＮＡ
断片を載せた二重鎖ＤＮＡ上の単鎖Ｄ Ｎ Ａ断片をプ
ライマーとし、該二重鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡを鋳型
とし、ＤＮＡ合成酵素を用い、かつ４種のｄＮＴＰおよ
び該ｄ Ｎ Ｔ Ｐの１種の塩基に対応する２’ 、
３’ −ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄ
ＮＴＰ）の存在下で行う相補的ＤＮＡの合成を、各ｄＮ
ＴＰに対応する４種のｄｄＮＴＰについてそれぞれ行い
、鎖長の異なるＤＮＡ分子を合成し、 （ｃ） （ｃｌ）で得られたＤＮＡ分子を二重鎖ＤＮ
Ａから分離し、次いでゲル電気泳動法により該ＤＮＡ分
子を展開し、各バンドに対応する塩基を同定する、 諸工程を含むＤＮＡ塩基配列決定法。 （２） 工程（ａ）で用いるｒｅｃΔ蛋白が大腸菌ｒ
ｅＣＡ蛋白である特許請求の範囲第（１）項記載の決定
法。 （３）工程（ａ）で用いるｒｅｃ Ａの類似蛋白がＴ４
ファージ由来のｕｖｓ Ｘ蛋白、枯草菌由来のｒｅｃ蛋
白又は黒穂菌（Ｕｓｔ ｉ ｌａｇｏ）由来のｒｅｃｌ
蛋白である特許請求の範囲第（１〕項記載の決定法。 （４） 工程１ｌｌｂ）で用いるＤＮＡ合成酵素が大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１大フラグメントである特許請
求の範囲第（１）項記載の決定法。 （５）ｄＮＴＰの少なくとも１種に放射性同位元素を含
むｄＮＴＰを用いる特許請求の範囲第（１）項記載の決
定法。 （６）放射性同位元素が３５５又は３２ｐである特許請
求の範囲第（５）項記載の決定法。 〔７〕工程（５）を、工程（ａ）で得た二重鎖ＤＮＡを
含む試料にＤＮＡ合成酵素を添加した後に、該試料を４
分割し、各試料に４種のｄＮＴＰを加え、さらに各試料
にｄｄＮＴＰとして、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄ（
１，ＴＰ、、（］、ｄＣＴＰをそれぞれ加えることによ
って実施し、かつ得られた相補的ＤＮＡ分子を含む各試
料についてそれぞれゲル電気泳動法を行う特許請求の範
囲第〔１〕項記載の決定法。 （８）工程（ｃ）におけるＤＮＡ分子の二重鎖ＤＮＡか
らの分離を、工程（ｂ）において得られた合成されたＤ
ＮＡ分子を含む二重鎖ＤＮＡを熱処理することによって
行う特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。 （９）工程（ａ）においてｒｅｃΔ蛋白又はその類似蛋
白に加えて抗ｒｅｃ Ａ蛋白単クローン抗体を存在させ
る特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。
Claims (9)
- （１）（ａ）被検体ＤＮＡを有する二重鎖ＤＮＡと単鎖
ＤＮＡ断片とを、ｒｅｃＡ蛋白又はその類似蛋白及びＡ
ＴＰの存在下で共存させて該単鎖ＤＮＡ断片を上記二重
鎖ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡと隣接する部位にＤループの
形で載せ、 （ｂ）（ａ）で得られた単鎖ＤＮＡ断片を載せた二重鎖
ＤＮＡ上の単鎖ＤＮＡ断片をプライマーとし、該二重鎖
ＤＮＡ上の被検体ＤＮＡを鋳型とし、ＤＮＡ合成酵素を
用い、かつ４種のｄＮＴＰおよび該ｄＮＴＰの１種の塩
基に対応する２′，３′−ジデオキシヌクレオシド三リ
ン酸類似体（ｄｄＮＴＰ）の存在下で行う相補的ＤＮＡ
の合成を、各ｄＮＴＰに対応する４種のｄｄＮＴＰにつ
いてそれぞれ行い、鎖長の異なるＤＮＡ分子を合成し、 （ｃ）（ｂ）で得られたＤＮＡ分子を二重鎖ＤＮＡから
分離し、次いでゲル電気泳動法により該ＤＮＡ分子を展
開し、各バンドに対応する塩基を同定する、 諸工程を含むＤＮＡ塩基配列決定法。 - （２）工程（ａ）で用いるｒｅｃＡ蛋白が大腸菌ｒｅｃ
Ａ蛋白である特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。 - （３）工程（ａ）で用いるｒｅｃＡの類似蛋白がＴ４フ
ァージ由来のｕｖｓＸ蛋白、枯草菌由来のｒｅｃ蛋白又
は黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）由来のｒｅｃ１蛋白であ
る特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。 - （４）工程（ｂ）で用いるＤＮＡ合成酵素が大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ大フラグメントである特許請求の範囲
第（１）項記載の決定法。 - （５）ｄＮＴＰの少なくとも１種に放射性同位元素を含
むｄＮＴＰを用いる特許請求の範囲第（１）項記載の決
定法。 - （６）放射性同位元素が＾３＾５Ｓ又は＾３＾２Ｐであ
る特許請求の範囲第（５）項記載の決定法。 - （７）工程（ｂ）を、工程（ａ）で得た二重鎖ＤＮＡを
含む試料にＤＮＡ合成酵素を添加した後に、該試料を４
分割し、各試料に４種のｄＮＴＰを加え、さらに各試料
にｄｄＮＴＰとして、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧ
ＴＰ、ｄｄＣＴＰをそれぞれ加えることによって実施し
、かつ得られた補相的ＤＮＡ分子を含む各試料について
それぞれゲル電気泳動法を行う特許請求の範囲第（１）
項記載の決定法。 - （８）工程（ｃ）におけるＤＮＡ分子の二重鎖ＤＮＡか
らの分離を、工程（ｂ）において得られた合成されたＤ
ＮＡ分子を含む二重鎖ＤＮＡを熱処理することによって
行う特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。 - （９）工程（ａ）においてｒｅｃＡ蛋白又はその類似蛋
白に加えて抗ｒｅｃＡ蛋白単クローン抗体を存在させる
特許請求の範囲第（１）項記載の決定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25499486A JPS63109800A (ja) | 1986-10-27 | 1986-10-27 | Ｄｎａ塩基配列決定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25499486A JPS63109800A (ja) | 1986-10-27 | 1986-10-27 | Ｄｎａ塩基配列決定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63109800A true JPS63109800A (ja) | 1988-05-14 |
| JPH0528118B2 JPH0528118B2 (ja) | 1993-04-23 |
Family
ID=17272732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25499486A Granted JPS63109800A (ja) | 1986-10-27 | 1986-10-27 | Ｄｎａ塩基配列決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63109800A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991017267A1 (en) | 1990-05-07 | 1991-11-14 | Sri International | Process for nucleic acid hybridization and amplification |
| EP1386006A4 (en) * | 2001-04-20 | 2004-09-15 | Penn State Res Found | METHOD FOR MANIPULATING NUCLEIC ACIDS |
-
1986
- 1986-10-27 JP JP25499486A patent/JPS63109800A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991017267A1 (en) | 1990-05-07 | 1991-11-14 | Sri International | Process for nucleic acid hybridization and amplification |
| EP1386006A4 (en) * | 2001-04-20 | 2004-09-15 | Penn State Res Found | METHOD FOR MANIPULATING NUCLEIC ACIDS |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0528118B2 (ja) | 1993-04-23 |
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