JPH0420648B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、プロテアーゼ固定化酵素膜の製造法
に関する。更に詳しくは、透水量低下防止用プロ
テアーゼ固定化酵素膜の製造法に関する。 従来、膜状物に酵素を固定化する方法として、
吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法、包
括架橋法などが知られている。 吸着法：単に膜材料と酵素との親和力によつて
結合される。 イオン結合法：膜に均一に存在するイオン交換
性基と酵素のアミノ基、カルボキシル基などとの
結合に依存する。 共有結合法：その工程上、膜に均一に酵素が結
合される 包括法：膜材料ポリマ−のマトリツクス中に均
一に酵素が分散固定化される。 包括架橋法：上記包括法でポリマ−マトリツク
ス中に固定化された酵素が、更に架橋試薬によつ
て補強固定化される。 これらの方法は、いずれも膜に酵素を均一に固
定化させる方法であり、得られる固定化酵素膜
は、酵素の作用とは無関係な部分に迄酵素が固定
化されているため、非効率的でコスト高となつて
いるばかりではなく、酵素の活性収率（仕込み酵
素量に対して実際に機能する酵素量の割合）をも
低下せしめている。 固定化酵素膜は、例えばセルフクリーニングメ
ンブレンなどに用いられるが、この場合膜が汚染
されるのはたん白質などの分離を行なう緻密層の
部分である。即ち、分離の際、膜の緻密層側に圧
力をかけるので、この層側に例えば高分子量のた
ん白質などが汚染物質として付着する。このよう
な汚染物質を分解し、膜面に付着しないようにす
るには、緻密層およびそれに隣接する部分に集中
的に酵素を固定化することが、膜中に酵素を均一
に分散固定化せしめるよりもはるかに効率的でか
つ有効である。 このような観点から、膜の特定部位に酵素を高
密度に集中せしめることはきわめて望ましいこと
であるが、従来法ではいずれもそれが不可能であ
る現状に鑑み、本発明者はかかる課題を解決すべ
く鋭意研究の結果、一方の面側に緻密層およびそ
れに続く中間層をそれぞれ有する限外ロ過膜をプ
ロテアーゼ酵素架橋試薬水溶液中に浸漬し、該水
溶液中から引き上げた限外ロ過膜を加熱処理した
後、プロテアーゼ酵素水性溶液中に浸漬し、該水
性溶液から引き上げた限外ロ過膜を通風乾燥させ
てプロテアーゼ固定化酵素膜を製造することによ
り、前記目的を達成し得ることを見出した。 一方の面側に緻密層およびそれに続く中間層を
それぞれ有する限外ロ過膜としては、一般に他方
の面にはフインガ−ストラクチヤー構造を有する
ポーラス層を有しているものが用いられ、かかる
膜状物は、ポリスルホン、ポリアクリロニトリ
ル、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリフツ化ビニリデン、ポリアミ
ド、ポリイミド、ポリカーボネートなどの重合体
のドープ液をガラス板、金属板などの基質上に流
延し、製膜した後、基質ごと逆浸透水中に浸漬す
ることにより製造される。得られた膜状物の他方
の面のポーラス層はフインガ−ストラクチヤー構
造を有しており、この構造の肉部は同時に多数の
連続孔を有しており、これら連続孔の存在が本発
明方法に大きく寄与しているので、フインガ−ス
トラクチヤー構造を必ずしも有しなくとも、ポー
ラス層側に多数の連続孔が穿接されていれば、か
かる膜状物も同様に用いることができる。 このように、一方の面側に緻密層およびそれに
続く中間層をそれぞれ有する限外ロ過膜は、酵素
架橋試薬水溶液中に浸漬される。酵素架橋試薬と
しては、例えばグリオキザール、マロンジアルデ
ヒド、サクシンジアルデヒド、グルタルアルデヒ
ド、アジピンジアルデヒド、マレインジアルデヒ
ド、フタルアルデヒド、イソフタルアルデヒド、
テレフタルアルデヒド、ジアルデヒドでん粉など
のジアルデヒド化合物が用いられ、特にグルタル
アルデヒドおよびシアルデヒドでん粉が好まし
い。これらのジアルデヒド化合物は、約１〜50％
の濃度の水溶液に調整され、限外ロ過膜はこの水
溶液中に約１分間乃至約24時間程度浸漬される。 浸漬された限外ロ過膜は、この酵素架橋試薬か
ら引き上げられた後、加熱処理される。加熱処理
は、オーブンを用い、約100〜120℃の温度で、約
１分間乃至24時間程度行われる。この加熱処理に
よつて、膜中に含浸された架橋試薬は、ポーラス
層のフインガ−ストラクチヤー構造を伝わつて中
間層および緻密層の部分に集積される。 この加熱処理された膜は、次いでプロテアーゼ
酵素水性溶液中に浸漬される。プロテアーゼ酵素
としては、例えばウレアーゼ、クレアチニナー
ゼ、グルタミナーゼ、ペニシリナーゼ、カラター
ゼ、パーオキシダーゼ、インベルターゼ、ムタロ
ターゼ、アミラーゼ、パパイン、トリプシン、ア
ルカリプロテアーゼなどのポロテアーゼなどが挙
げられる。これらの酵素は、一般に所定のPHに調
整した緩衝液などの水性溶液の約0.001〜0.1％溶
液として調整され、この水性溶液中に加熱処理膜
が、約１分間乃至24時間程度浸漬される。 酵素の水性溶液中に浸漬された膜は、そこから
引き上げられた後、通風乾燥させる。通風乾燥
は、一般に約20〜40℃で行われる。この浸漬およ
び通風乾燥は、くり返して行なうこともできる。
かかる処理により、酵素はポーラス層のフインガ
−ストラクチヤー構造を伝わり、架橋試薬と反応
して、中間層および緻密層の部分に高密度に架
橋、固定化される。 本発明方法で得られるプロテアーゼ固定化酵素
膜は、膜の中間層および緻密層のそれぞれに酵素
が高密度に固定化され、固定化されたプロテアー
ゼ酵素はそれとの反応物質である各種基質に顕著
に作用し、それの生物活性効果を十分に発揮させ
るので、このような作用および効果を有効に利用
して、たん白質による汚染のために生ずる限外ロ
過膜の透水量低下防止用プロテア−ゼ固定化酵素
膜、いわゆるセルフクリーニングメンブレンに効
果的に用いられる。 次に、実施例について本発明を説明する。 実施例 １〜２ 限外ロ過膜の製造 ポリスルホン（UCC社製品Ｐ−1700）15gをジ
メチルホルムアミド75gに溶解させ、Ｂ型粘度計
（東京計器製）を用いて20℃で測定した粘度が
270cpsのドーブ液を調整した。このドーブ液を、
ガラス板上に流延し、ガラス棒を用いて製膜し
た。得られた膜を、ガラス板ごと温度20℃、相対
湿度60％の雰囲気に30秒間放置した後、25℃の逆
浸透水中に浸漬し、ゲル化させて、限外ロ過膜を
製造した。 限外ロ過膜の性能 ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロ
リドンを検体として用い、この膜の限外ロ過性能
を、試験圧力1Kg／cm²で測定した。測定に際して
は、全有機炭素計（島津製作所製TOC−10B）
が用いられ、膜透過前後の水溶液中の検体濃度が
測定された。その結果、分画分子量は15000、ま
た透水量は0.5cm²／cm²・hr・atmの値がそれぞれ
得られた。 〔分画分子量の測定法〕 分子量既知のポリエチレングリコールまたはポ
リビニルピロリドンの0.5〜１重量％水溶液を膜
に流し、その分離率が90％の分子量を分画分子量
とする。 分離率（％）＝膜透過後の水溶液濃度／膜透過前の水
溶液濃度×100 〔透水量の測定法〕 限外ロ過膜用セルに膜を取り付け、セルの一方
の膜面側から１Kg／cm²に加圧された水を流し、セ
ルの他方の膜面側の浸透液中に流れ出た水の量を
測定し、それをcm²／cm²・hr・atm単位に変換す
る。 限外ロ過膜の膜構造 乾燥状態で膜厚約190μmの限外ロ過膜の膜表面
部を、走査型電子顕微鏡（日立−明石製MSM−
７）を用いて観察したところ、10000倍の倍率で
膜表面部分には孔の存在が認められなかつた。 次いで、軟Ｘ線装置（ソフテツクス社製
SOFTEXESM型）を用い、95V，2.5mA，５分
間の軟Ｘ線照射条件で、その断面部を観察した。
上記表面部側から順次緻密層および中間層が合計
40μmの厚さで形成されており、次いで裏面部と
なるポーラス層が150μmの厚さで形成されてい
る。このポーラス層には、最大横幅約60μm、縦
方向長さ150μmに近いフインガ−ストラクチヤー
構造が、膜面１mm²当り約230個の割合で存在して
いた。 固定化酵素膜の製造 このポリスルホン限外ロ過膜を、酵素架橋試薬
としてのジアルデヒドでん粉（半井化学製品）の
10％水溶液中に10分間浸漬し、その後この水溶液
中から引き上げた限外ロ過膜を、100℃のオーブ
ン中に30分間放置し、加熱処理した。この加熱処
理によつて、膜中に含浸された架橋試薬は、ポー
ラス層のフインガ−ストラクチヤー構造を伝わつ
て中間層および緻密層の部分に集積される。この
加熱処理による膜性能への影響を調べるために、
105℃のオートクレーブ内に膜を20分間入れて加
熱したが、それによる分画分子量および透水量へ
の影響はみられなかつた。 次いで、この加熱処理された膜を、0.01％のプ
ロテアーゼ酵素（長瀬産業製品）を含むPH7.0の
リン酸緩衝液中に１時間浸漬し、この緩衝液中か
ら引き上げた限外ロ過膜を30℃で通風乾燥させ
た。これにより、酵素はポーラス層のフインガ−
ストラクチヤー構造を伝わり、架橋試薬と反応し
て中間層および緻密層の部分に高密度に架橋、固
定化された。なお、この際、架橋試薬が緩衝液中
に溶出するか否かを調べるために、架橋試薬集積
膜を緩衝液中に１時間放置し、ジアルデヒドでん
粉溶出の有無を全有機炭素計で測定したが、それ
の溶出を認めることはできなかつた。また、この
酵素固定膜中の未反応アルデヒド基は、
0.005M／濃度のNaBH₄水溶液中に膜を１分間
浸漬し、還元させた。 膜に固定化されたプロテアーゼ酵素は、分子量
が約26000で19種、275個のアミノ酸で形成されて
おり、その中アルデヒド基と結合可能性を有する
アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、グルタ
ミンおよびリジンである。固定化の確認は、得ら
れた膜を前記緩衝液中に24時間浸漬し、酵素溶出
の有無を紫外および可視吸光光度計（島津製作所
製UV−190）を用い、280nmの波長の吸光度を
測定することにより行われた。その結果、酵素の
溶出を認めることができなかつた。また、固定化
酵素量を、ケルダール窒素分析装置（三菱化成製
KN−10）を用いて測定したところ、膜1g当り
0.05gの酵素が固定されていることが判つた。 固定化酵素膜の性能 酵素基質として牛血清ヘモグロビン（シグマ社
製品）を用い、それの0.002％緩衝液（PH7.0）を
調整し、これを供給液に用いて、固定化酵素膜の
限外ロ過試験を、壱Kg／cm²の圧力で行なつた。試
験時間に対する透水量の減少は、図面の曲線に
示される。曲線は、酵素を固定化していない唯
のポリスルホン限外ロ過膜を用いた場合を対照例
として示したものである。この結果から、プロテ
ア−ゼ酵素固定化膜は、、膜面に付着するヘモグ
ロビンを分解するので、ヘモグロビンによる膜の
汚染によつてもたらされる透水量の低下を有効に
防止し得ることが判る。また、試験時間５時間後
における酵素の残存活性率（試験後の膜中酵素の
活性／試験前の膜中酵素の活性×100）の値は、
73.8％であつた。なお、酵素の活性は、アンソン
−萩原氏変法によつて測定された。 同様に、牛血清ヘモグロビン緩衝液の代りに、
ミルクカゼイン（メルク社製品）の0.01％緩衝液
（PH 7.0）を供給液に用いて、透水量の経時変化
を測定した。結果は、図面の曲線によつて表わ
され、酵素を固定していない唯のポリスルホン限
外ロ過膜を用いた対照例の場合の曲線よりも、
透水量の低下の割合が少ないことを示している。
また、試験時間５時間後における酵素の残存活性
率は、70.0％の値を示した。なお、ミルクカゼイ
ンは、プロテア−ゼ酵素によつて、約２〜３時間
のうちにほぼ完全に分解されることが、ゲルクロ
マトグラフ（ウオーターズ社製）によつて確かめ
られている。 このように、本発明方法により、膜の中間層お
よび緻密層に固定化された酵素は、酵素との反応
物質である各種基質に顕著に作用し、その酵素作
用が十分に発揮される。 比較例 １〜２ 実施例において、オーブンによる加熱処理を行
なうことなく、固定化酵素膜が製造された。この
膜について、実施例１〜２と同様にして、血清ヘ
モグロビンまたはミルクカゼインによる汚染実験
を行なつた。測定された透水量低下率および残存
活性率は、次の表に示される。

【表】 図面の数値から算出

【図面の簡単な説明】

図面は、実施例１〜２およびこれらの対照例に
係る膜を限外ロ過膜に用いた場合の血清ヘモグロ
ビンまたはミルクカゼインによる汚染防止効果を
経時的に示したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一方の面側に緻密層およびそれに続く中間層
   をそれぞれ有する限外ロ過膜をプロテアーゼ酵素
   架橋試薬水溶液中に浸漬し、該水溶液中から引き
   上げた限外ロ過膜をオーブン中で約100〜120℃で
   加熱処理した後、プロテアーゼ酵素水性溶液中に
   浸漬し、該水性溶液から引き上げた限外ロ過膜を
   通風乾燥させることを特徴とする透水量低下防止
   用プロテアーゼ固定化酵素膜の製造法。 ２ 限外ロ過膜として、緻密層、中間層およびフ
   インガーストラクチヤー構造を有するポーラス層
   をそれぞれ有する膜が用いられる特許請求の範囲
   第１項記載の透水量低下防止用プロテアーゼ固定
   化酵素膜の製造法。 ３ プロテアーゼ酵素架橋試薬としてジアルデヒ
   ド化合物が用いられる特許請求の範囲第１項記載
   の透水量低下防止用プロテアーゼ固定化酵素膜の
   製造法。 ４ 通風乾燥が約20〜40℃で行われる特許請求の
   範囲第１項記載の透水量低下防止用プロテアーゼ
   固定化酵素膜の製造法。