JPH04190785A - 多糖類を生産するバチルス属ヘーテー１号及びこの菌株により生産される多糖類とその多糖類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （産業上の利用分野） 本発明は、熱に対する安定性があり熱可逆的にゲルを形
成する多糖類を生産する菌株バチルス属ヘーテー１号（
Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｈａｉｔａｉ　ｌ）及びこの
菌株により生産される上記特性を有する多糖類とその多
糖類の製造法に関する。

（従来の技術） 多糖類は水溶性ポリマー市場において相当な部分を占め
ている物質であり機能的特性が多様で様々な産業的応用
性が開発されている。

かかる多糖類は植物体の葉、茎、根、海藻類、動物、微
生物の菌体内外、昆虫の股部分に存在しており、今まで
多く利用されて来たものは、その大半が植物体や海藻類
から抽出された天然多糖類などであった。

すなわち、各種植物体の澱粉、植物体の根から抽出され
たグアーガム（Ｇｕａｒ　ｇｕｍ）　、ロカストビーン
ガム（Ｌｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ　ｇｕｍ　）　、海藻類
から抽出さされたアルギナート（Ａｌｇｉｎａｔｅ）　
、寒天、植物体の抽出物であるペクチン（Ｐｅｃｔｆｎ
）などを例として挙げられる。

この様な植物体から抽出された天然多糖類などは生産年
度の気候条件により生産量と質の変化が激しく、供給量
、価格、品質などが一定しておらず、継続的な増加傾向
にある天然多糖類の消費量を充足させていない。

かかる諸問題点を克服するため、関心が持たれる様にな
ったのか微生物か生産する多糖類であった。

微生物が生産する多糖類は、菌体外でカプセルやスライ
ム形態で存在する菌体外多糖と、菌体内のエネルギー貯
蔵物質の形態である菌体内多糖、そして細胞壁を構成す
る多糖と、大きく三通りの形態で生産されている。

最近、微生物が生産する多糖類のうちデキストランとザ
ンタンガム等が商業化に成功するにしたがって、微生物
による多糖類の製造に対する関心はさらに高くなった。

微生物が生産する多糖類は乳化能、増粘能、安定能、ゲ
ル化能、被膜形成能、生理活性能、凝集能などの機能特
性を有しているため、食品産業、化粧品産業、オイル産
業、医薬品産業などにおいて多様な用途への利用に関す
る研究が行われており、この様な利用性は多糖類の固有
の物性学的な特性により支配されている。

微生物の発酵により多糖類を生産する場合、その生産量
と質を調節することができる、発酵条件の調節により合
成程度を調節できる、安価で豊かな原料の使用が可能で
ある、連続培養による高収率生産が可能である、生産量
を市場の状況に合うよう調節できるなど、多大な利点を
伴う。

今まで知られた多糖類を生産する微生物としてはアブロ
バフタ−属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ）　、アリ力すゲネ
ス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　）　、アースロバフタ
−属（＾ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）　、アゾトバクタ−
属（＾ｚｏｔｏ−ｂａｃｔｅｒ）　、バチルス属（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）　、シュドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅ−１１ａ　
）等の細菌と、ハンセヌラ属（Ｆｌａｎｓｅｎｕｌａ　
）、ロードトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｌｕｒａ）等の酵
母と、ブルラリア属（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）　、リゾ
ビウム属（１？ｈｉｚｏ−ｂｌｕｇ）　、アスペルギラ
ス属（Ａｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓ　）等のかび類が知られ
ている。しかし、これらのうち工業的に応用されている
のはあまり無く、新たな構造と物性を有した多糖類が求
められているため、微生物による新たな多糖類の製造に
関する研究が引き続いて成されている。

微生物によって多糖類を生産するためには、まず目的と
する特性を有する微生物を自然界から分離し、分離され
た菌株をもって多糖類の生産のための培養条件を検討し
、培養液がらの多糖類の精製、多糖類の安定性、多糖類
の応用方法などに関して研究が成されなければならない
。

〔発明の詳細な説明〕

本発明者は産業的応用が可能で熱に対する耐性があり、
熱可逆的にゲルを形成する粘性多糖類を生産する新たな
微生物を韓国内の土壌から分離し、分離された微生物が
生産する多糖類が上記した特性を有しているだけでなく
、多糖類を構成している単糖の種類と構成比が既存の多
糖類などとは同一でないことを見い出し、本発明を完成
した。

すなわち、本発明の目的は韓国内の土壌がら分離した熱
に対する耐性があり、熱可逆的にゲルを形成する粘性多
糖類を生産する新菌株の分離方法、この菌株を利用して
新たな構造の多糖類の製造方法を提供することにある。

以下、本発明の詳細な説明する。

門 本発明は国内の土壌から２％の澱粉と１％の大豆蛋白が
含有された培地より分離され、熱に対する耐性があり、
熱可逆的にゲルを形成する粘性多糖類を生産する菌株バ
チルス属ヘーテー１号（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｈａ
ｉｔａｉ　ｌ、韓国種菌協会に、寄託番号ＫＦＣＣ−１
０６７７として１９８９年８月８日に寄託されている）
とこの菌株か生産する多糖類、その多糖類の製造方法を
その特徴とする。

本発明について以下でさらに詳しく説明する。

本発明のバチルス属ヘーテー１号は次のような菌学的性
質を持っている。

（１）胞子形成能がある。

（２）液体培養時、熱に対する安定性があり熱可逆的に
ゲルを形成する新たな構造の多糖類を生産する。

（３）寒天平板上で上記特性を有する多糖類を生産する
。

（４）ｐＨ３，３−７，９の初期ｐＨ範囲で生育する。

上記のような特性を有するバチルス属ヘーテー１号の培
地としては炭素源、窒素源、各種の無機塩が含有された
通常の培地を使用することができる。炭素源としてはグ
ルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ　）　、ガラクトース（Ｇａ
ｌａｃｔｏｓｅ）、マンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ）、フ
ラクトース（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）　、キシロース（Ｘｙ
ｌｏｓｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅｏ）　％ラク
トース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、マルトース（ＭａＨｏｓｅ
）、澱粉（５ｔａｒｃｈ）等の炭水化物を使用すること
ができ、窒素源としてはコーンステイープリキュール（
Ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐｌｉｑｕｏｒ）、ペプトン（Ｐｅ
ｐｔｏｎ）　、酵母抽出液（Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ
　）　、乾燥酵母（Ｄｒｙ　ｙｅａｓｔ　）　、醤油、
大豆蛋白（Ｓｏｙ　ｂｅａｎ　５ｅａｌ　）などの有機
窒素源を使用することができ、無機質としては燐酸、カ
ルシウム、マンガン、ナトリウムなどの塩類が使用可能
である。

本発明によるバチルス属ヘーテー１号の培養温度は１０
℃−４０℃であり、２５℃−３７℃の温度範囲が適当で
、培養のための初期ｐＨは３．３−７．９で、なお通性
の好気性菌であるため培養中酸素の供給を十分行なうの
が好ましい。

上記バチルス属ヘーテー１号の分離方法に関して詳細に
説明すると次の通りである。

韓国各地域の土壌試料２，０００点余りを収集して土壌
試料１スプーンを滅菌した試験管に入れて８０℃で３０
分間熱処理し、生理食塩水３ｍｌを添加して懸濁した。

その後、澱粉２％、大豆蛋白１％、ＫＨ２ＰＯ４０，２
％、ＮａＣ１０，２％、Ｍｇ５Ｏ・７Ｈ２００，１％、
ＣａＣｌ２０．２％から組成された寒天平板培地に塗布
し、３０℃の培養器で２−３日間培養した後、粘性があ
る群落を形成する菌株を１次選別した。

これを上記と同様の組成の液体培地に接種し、３０℃振
盪培養器で２−３日間培養した。その後、粘性の有るも
のを集めて１００℃で５分間熱処理したのち、室温に冷
却してゲルを形成する粘性多糖類を生産する一菌株を選
別した。

選別された菌株の菌学的性質は以下のようである。

（１）形態学的性質 １、顕微鏡による観察 イ）栄養細胞形態：桿菌 口）運動性：有り ハ）大きさ：０．７Ｘ３．２−３．８μｍ二）ダラム染
色：陽　性 ホ）胞　子：胞子コート（Ｓｐｏｒｅ　ｃｏａｔ）が厚
く畝を形成して星状に見える胞子を形成。

（添付図面第１図（ｂ）参照） ２、培地における生育状態 イ）栄養寒天（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ、Ｄｉｒｃ
ｏ　）培養生育が貧困な状態。

口）栄養液体（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｒ
ｃｏ＞培養上部に被膜を形成せず。

ハ）肉汁ゼラチン（Ｎｕｔｒｌｅｎｔ　ｇｅｌａｔｉｎ
、Ｄｌｆ’ｃｏ）培養 液化が早く進行される。

二）プレインハートインフュージョン（Ｂｒａｌｎｈｅ
ａｒｔ　１ｎｆｕｓｉｏｎ、Ｄｊｆ’ｃｏ）生育状態が
良好である。

ホ）ＮａＣ１含有培地における生育状態二〇％・・・生
育 ２％・・・生育 ５％・・・生育に困る ７％・・・生育に困る １０％・・・生育に困る （ｎ）生理学的性質 １、生育温度：　１０℃−４０℃ ２、生育最適温度＝２７℃ ３、生育ｐＨ：　　３．３−７．９ ４、生育最適ｐＨニア、４ ５、酸素要求性二連性の好気性 ６、澱粉分解能：陽　性 ７、カゼイン分解能：　　陽　性 ８、デキストラン分解能：陰　性 ９、セルロース分解能：　陽　性 １０、ザンタン分解能：　　陽　性 １１、マンナン分解能：　　陽　性 １２、インドール生成能：　陰　性 １３、メチルレッド試験：　陰　性 １４、カタラーゼ試験：　　陽　性 １５、オキシダーゼ試験：　陽　性 １６、ウレアーゼ試験：　　陰　性 １７、ジヒドロキシアセトン生成能：陽　性１８、タイ
ロシン分解能：　陰　性 １９、ＶＰ試験：　陰　性 ２０、フェニルアラニンジアミナーゼ生成能：陰性 ２１、レシティナーゼ生成能：　陰　性２２、ナイトレ
ート還元性試験：陽　性２３、ヘモリシス：　陽　性 （ｍ）炭水化物の発酵性 ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ）　１％〜ＫＨ２ＰＯ４０，
２％、ＮａＣ１０，２％、ＭｇＳＯ４０，０５％、ブロ
モクレゾールパープル（ＢｒｏｒＡｏ−ｃｒｅｚｏｌ　
ｐｕｒｐｌｅ　）　０．　００６２５％の溶液に各糖を
１％となるように添加してデユーラム（Ｄｕｒｈａａ＋
）管を入れた試験管に母株して滅菌した後、選別された
菌株を接種し、３７℃の培養器で１４日間ガス発生の有
無及び酸生成の有無を観察した。

その結果を次の表に示した。

アラビノース　　　＋　　　　　＋ セロビオース　　　＋　　　　　＋ フラクトース　　　＋　　　　　十 ガラクトース　　　＋　　　　　＋ グルコース　　　　＋　　　　　＋ グリセロール　　　＋　　　　　＋ イノシトール　　　−　　　　　− ラクトース　　　　＋　　　　　＋ マルトース　　　　＋　　　　　＋ マニトール　　　　＋　　　　　十 マンノース　　　　＋　　　　　＋ メリビオース　　　士　　　　　士 うピノース　　　　＋　　　　　＋ サリシン　　　　　＋　　　　　＋ ソリビトール　　　−− ソルボース　　　　−− 澱　　粉　　　　　　　＋　　　　　　　＋シュクロー
ス　　　＋　　　　　十 キシロース　　　　＋　　　　　＋ 上記の特性にもとづき、微生物分類体系のバーゲーマニ
ュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓ
ｙｓｔｅｍｅ−ｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第
１版（１９８６）によって分類した場合、本発明によっ
て分離された菌株はバチルス属に同定され、胞子の形態
が星状でグルコースから酸とガスを生成する点などから
推してみれば、バチルス属ポリミキシャ（Ｂａｅｉ　ｌ
　ｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ）に近いものと推定される。

しかし、セルロースを強力に分解してｐＨ５以下でも生
育する点などから推して見れば、本発明の上記菌株はバ
チルス属に属する新菌株として同定され、これをバチル
ス属ヘーテー１号（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、Ｈａｉｔ
ａＩＮｏ、　１）と命名し、韓国種菌協会（Ｋ　Ｆ　Ｃ
Ｃ）に１９８９年８月８日ＫＦＣＣ−１０６７７号とし
て寄託した。また、１９９０年７月１日付で韓国微生物
保存センター（Ｋｏｒｅａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｅｎ
ｔｅｒ　ｏｆＭｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓＩｌｓ　）に
寄託番号ＫＣＣＭ−１０００１として国際寄託（特許手
続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条
約下に）した。

多糖類 一方、本発明の菌株が生産する新たな多糖類の生産方法
について説明すれば下記の通りである。

まず上記菌株を発酵培地で培養しなければならないか、
発酵に使用される培地としては、微生物に利用され得る
各種炭素源と窒素および生育に必要な各種無機塩類など
を含有するものか利用され得る。

二の様に培養に必要な炭素源としては澱粉、マンノース
、ラクトース、マルトース、グルコース、フラクトース
、ガラクトースなどを利用することかでき、窒素源とし
てはコーンステイープリキュール（Ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ
　１ｉｑｕｏｒ）　、ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎ）、乾燥
酵母（Ｄｒｙ　ｙｅａｓｔ　）醤油、大豆蛋白（５ｏｙ
ｂｅａｎ　ｍｅａｌ）などを利用することができ、無機
塩としては燐酸塩、ナトリウム塩、マンガン塩、カルシ
ウム塩等が使用され得る。

本発明によれば、上記本発明菌株の培養は初期ｐＨ５，
５−６，５で実施し、培養温度は２５℃−３７℃で実施
し、通常２−３日培養するのか良い。

本発明の菌株は通性の好気性菌株であり、培養時に通気
を施すのが望ましい。

この様な条件で培養された培養液には本発明の目的とす
る多糖類が含有されており、培養液中がら多糖類を精製
するためには菌体と不溶性物質を除去しなければならな
い。

例えば、培養液に３倍量の水を加えて粘性を減少させた
後、遠心分離を行って菌体と不溶性物質を除去した後、
ここにイソプロピルアルコールなどの溶媒を添加し多糖
類を析出させる。これを乾燥させた後、改めて水に溶か
してイソプロピルアルコールなどの溶媒を添加し、多糖
類を再度析出させる。

この様な方法を数回繰り返した後、真空乾燥させ、上記
菌株が生産した多糖類を精製された形態で得た。

この様に行って得られた多糖類の性質を分析した結果は
、次の通りであった。

（１）−膜組成成分 粗蛋白質：１０．０６ 灰　　分：４．０２ 粗脂肪：０．４３ 炭水化物：８５．４９ （２）ＵＶ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　　（第２図参照）λｌ
ｌ１ａｘ　　：　１９０ｎｍ （３）赤外線吸収スペクトル（第３図参照）（４）溶媒
に対する溶解性 水に溶性でありイソプロピルアルコール、エタノール、
メタノール、アセトンなどの有機溶媒には不溶性である
。

（５）発色反応 糖の一般的な定色反応である硫酸反応、Ｍｏｌ　ｊｓｈ
反応は陽性で、３％Ｆ　ｅ　Ｃ１３、ヨード反応、＾ｎ
ｌ　ｌ　１ｎｅ−ｐｈｔｈａｌａｔｅ反応は陰性であっ
た。

（６）物質の色 白　　色 （７）粘　　度 本多糖の１％溶液に作った後、ハーケ （Ｈａａｋｅ　）粘度計５Ｖ−Ｉシリンダーを使用して
１６ｒｐ１１で測定した。多糖溶液に熱を加えない状態
は１２５３　ｍｐａ、ｓを示し、熱処理した場合には２
２１９　ｍｐａ、ｓを示した。

（８）元素分析 Ｃ：３Ｂ、６％、Ｈ：４．９８％。

Ｎ：１．２０％ （９）熱安定性およびゲル形成能（第４図参照）（ｌＯ
）構成糖の分析 分離された多糖１０ａ＋ｇを２Ｎ　Ｈ２Ｓ０４１ｍ１に
溶かし、１００℃で６時間加水分解した後、ウォータス
ＨＰＬＣで単糖分析を行った。

その結果、構成糖はグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）、マ
ンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ）、ガラクトース（Ｇａｌａ
ｃｔｏｓｅ　）　、キシロース（Ｘｙｌｏｓｅ）　、ア
ラビノース（Ａｒａｂｉ−ｎｏｓｅ）であり、これらの
構成モル比は９．８：６，４：３．６：１．２：１であ
った（第５図参照）。グルコース、ガラクトース及びマ
ンノースの構成モル比は、１．５−７．３：１　：　０
．９−４．８であった。

本発明による多糖類は上記のような特徴以外にも水を保
水する能力が有り、フィルム形成能、乳化能などの性質
を有している。

かかる特徴を有する本多糖類は食品産業においてだけで
なく、化粧品産業、オイル産業、医薬品産業などで単独
あるいは他の多糖類などと複合的に使用し、色々な目的
で応用が可能であろう。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を詳細に説明すると、次の通りで
ある。

多糖類の生産のため使用された培地は次の通りである。

（培地組成） Ａ培地：澱粉（Ｓｔａｒｃｈ）　２％、大豆蛋白（Ｓｏ
ｙｂｅａｎ　ｍｅａｌ）　１％、燐酸カリウム（ＫＨ２
ＰＯ４）０．１％、塩化ナトリウム（ＮａＣ１）０．１
％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０） ０．０５％ （ｐＨ５，８，１２１℃で１５分間加圧蒸気滅菌） Ｂ培地ニドリブトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）　１％、塩化
ナトリウム（ＮａＣ１）１％、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ
　ｅｘｔｒａｃｔ　） （ｐＨ７，０，１２１℃で加圧蒸気滅菌）Ｂ培地を１０
０ｍ１の三角フラスコに２５ｍ１を入れ、生産菌株であ
るバチルス属ヘーテー１号（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
Ｈａｉｔａｉ　１）を接種し、３２℃、２３　Ｏｒｐｍ
で１６時間培養した。その後、１７５ｍ１のＢ培地が入
った三角フラスコに上記培養液２５ｍ１を接種し、３２
℃、２３０　ｒｐｌｌで８時間培養した。これを３．５
１のＡ培地が入っている７１の発酵槽に接種し、３２℃
、２４時間、培地内の溶存酸素を５０％に維持させつつ
培養した。

上記培養液３．５１に脱イオン蒸留水７１を添加して４
０℃で攪拌した後、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分
離して除菌した上、ここに５倍量のイソプロピルアルコ
ールを添加して多糖類を析出させた。

イソプロピルアルコールの析出法を３回繰り返して真空
乾燥させて粗精製された多糖類２２．４３ｇを得た。収
率は３２％であった。

この様にして得られた多糖類は上記した特性を有してお
り、この構成糖について分析を行った結果、グルコース
（Ｇｌｕｃｏｓｅ　）　、マンノース（Ｍａｎ−ｎｏｓ
ｅ）　、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｅｓ　）　、キ
シロース（Ｘｙｌｏｓｅ）　、アラビノース（Ａｒａｂ
ｉｎｏｓｅ　）から構成されていた。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）は本発明のバチルス属ヘーテー１号の電子
顕微鏡による生物の形態写真、第１図（ｂ）は走査顕微
鏡による上記菌株の胞子横断面を示した生物の形態写真
、 第２図はバチルス属ヘーテー１号が生産した多糖類を粗
精製して０．０１−０．００６２５％の溶液に作った後
、これを分光高度計で３７Ｏｎｍから１９Ｏｎ−までス
キャニングした結果を示したグラフ、 第３図は第２図の多糖類のＩＲスペクトルを示したグラ
フ、 第４図はそれぞれ右から第１図のバチルス属ヘーテー１
号の培養チューブを熱処理したもの、熱処理していない
もの、本菌株の接種前の培地を入れたチューブをさかさ
まにして撮った、それぞれ生物の形態を示す写真、 第５図は第２図の多糖類を酸加水分解してＨＰＬＣで構
成糖を分析した結果を示したグラフである。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 図面の序！Ｆ（内容に変更なし） ＦＩＧ　　＋ 階唄優 ＦＩＧ　４ ＦＩＧ　　５ フル１ ）０３号 寺別市瑞草区盤浦洞新盤浦４次アノ（−トメ手　続　補
　正　書　（方式） 平成　３年　４月２３日 平成　２年特許願第２６７５４６号 ３　補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 発送口　　平成　３年　３月　１２日 ６　補正の対象 図面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、土壌から分離された菌株として粘性を有し、保水力
   、フィルム形成能、乳化力があり、熱に対する安定性が
   あり、熱可逆的にゲルを形成する多糖類を生産する菌株
   である、バチルス属ヘーテー１号（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
   ｓｐ．Ｈａｉｔａｉ　１：ＫＦＣＣ−１０６７７）。 ２、バチルス属ヘーテー１号（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ
   ．Ｈａｉｔａｉ　１：ＫＦＣＣ−１０６７７）が生産す
   る多糖類であって、粘性を有し、保水力、フィルム形成
   能、乳化力があり、熱に対する安定性があり尚かつグル
   コース、マンノース、ガラクトース、キシロース及びア
   ラビノースをモル比９．８：６．４：３．６：１．２：
   １で含有し、グルコース、ガラクトース及びマンノース
   をモル比１．５−７．３：１：０．９−４．８で含有す
   る、多糖類。 ３、粘性を有し、フィルム形成能、保水力、乳化力、熱
   に対する安定性があり尚かつ熱可逆的にゲルを形成する
   多糖類を生産する菌株であるバチルス属ヘーテー１号（
   Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ｈａｉｔａｉ　１：ＫＦＣＣ
   −１０６７７）を用いる多糖類の製造法。