JPH0413999B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物による補酵素Q₁₂の製造法に関
する。 補酵素Ｑとは下記の構造式 で示される一群の化合物の総称である。これら一
群の補酵素Ｑの化合物は生体内では電子伝達系の
一要素として重要な役割を果しており、また従つ
てそれらは各種疾病に対して秀れた薬理作用を示
すものとして期待されている。 上記構造で示される補酵素Ｑのうち、ｎ＝12で
ある補酵素Q₁₂はネズミあるいはある種の植物中
に存在することが知られているが、いずれも工業
的規模で補酵素Q₁₂を生産する原料として満足で
きるものではない。 本発明者等は微生物の醗酵法により補酵素Q₁₂
を生産することを目標として種種検討した結果、
ある種の細菌中にこれらの物質が蓄積されること
を見出し、本発明を完成するに至つたものであ
る。 本発明の目的はシユードモナス属に属する細菌
またはプロタミノバクター属に属する細菌を用い
ることにより効率的に補酵素Q₁₂を得る方法を提
供しようとするものである。 本発明方法において使用される菌株としては、
シユードモナスN842（微工研菌寄第3154号、特開
昭52−47990号参照）、シユードモナスN842−
M16（微工研菌寄第3155号、特願昭53−150513号
参照）、シユードモナスCI−36（微工研菌寄第
5209号、特願昭54−124727号参照）、シユードモ
ナスAMI（NCIB9133）、シユードモナスM27
（NCIB9686）などが適当である。 本発明方法において使用される培養培地は特に
制限はなく、たとえば炭素源としてはグルコース
等の含水炭素、くえん酸等の有機酸、メタノー
ル、グリセリン等のアルコール類等が使用でき、
窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、アンモニアガス等、無機物としては燐酸塩、
マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン
塩、その他必要に応じて微量金属塩等が使用でき
る。更に必要に応じて生育促進物質としてアミノ
酸、ビタミン、大豆蛋白加水分解物、酵母エキ
ス、ペプトン、カザミノ酸等を使用することもで
きる。 培養に当つてはPH５〜８で20〜40℃において２
〜10日間程度好気的に振盪または撹拌培養する。
培養液から常法により遠心法または過法などで
菌体を分離する。ここで得られた菌体中には補酵
素Q₁₂またはQ₁₃またはその両方が含有されてい
る。そこで以下本発明の補酵素Q₁₂の物性および
その製造方法と共に便宜上補酵素Q₁₃のそれらに
ついても説明する。 補酵素Q₁₂および補酵素Q₁₃の単離のための出
発物質である菌体は生菌体または乾燥菌体もしく
は菌体処理物のいずれでも使用できる。補酵素
Q₁₂および補酵素Q₁₃を単離する方法の一例を示
すと、まずけん化するためにメタノール、苛性ソ
ーダおよびピロガロールの混液を菌体含有液に添
加しそして60〜90℃において１〜５時間還流加熱
しつつ抽出する。次いで抽出液をｎ−ヘキサン等
の溶媒で抽出し、溶媒層を水洗および脱水液に濃
縮し、濃縮液をシリカゲル等のカラムに添加し、
次いで吸着物をベンゼンなどで展開すると補酵素
Q₁₂または補酵素Q₁₃もしくはその両方を含む画
分が溶出する。この画分を濃縮乾固し、更に多孔
生樹脂カラムクロマトグラフイー、逆相薄相クロ
マトグラフイー等により補酵素Q₁₂または補酵素
Q₁₃を単離する。これをエタノール等から結晶化
すると純粋な補酵素Ｑ結晶が得られるが、包接化
合物による分離、分子蒸留等を行うことも効果的
である。 補酵素Q₁₂は黄色結晶で融点は54.0℃である。
補酵素Q₁₂のエタノール溶液中での紫外部吸収ス
ペクトルは275nｍに吸収ピークを有し、この吸
収ピークはNaBH₄で還元すると290nｍにシフト
する。マススペクトルの分子イオンピークは998
であり、その他に主なフラグメントイオンピーク
983（M⁺−15）、235、197および69が存在する。薄
層クロマトグラフイー、逆相薄層クロマトグラフ
イーおよび高速液体クロマトグラフイーでの挙動
は第１表に要約されている。 補酵素Q₁₃のエタノール溶液中での紫外部吸収
スペクトルは275nｍに吸収ビークを有しこの吸
収ピークはNaBH₄で還元すると290nｍにシフト
する。マススペクトルの分子イオンピークは1066
であり分子式C₇₄H₁₁₄O₄に相当する。その他に主
なフラグメントイオンピーク1051（M⁺−15）、
235、197および69が存在する。薄層クロマトグラ
フイー、逆相薄層クロマトグラフイーおよび高速
液体クロマトグラフイーでの挙動は第１表に要約
されている。 次に掲げる表１において、薄層クロマトグラフ
イー（TLC）溶媒はベンゼン−クロロフオルム
（４：１）であり、逆相薄層クロマトグラフイー
溶媒はアセトン−水（97.5：2.5）であり、そし
て高速液体クロマトグラフイー（HPLC）条件は
μ−ボンダパツクC₁₈4.5×300mmカラムおよびメ
タノール−イソプロピルエーテル（85：15）溶媒
を用いて流速１ml／min、検出275nｍとした。

【表】 実施例 １ グルコース２％、Na₂SO₄0.05％、MgSO₄・
7H₂O0.01％、KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、コ
ーンステイーブリカー0.3％および残部は水から
なる培地（PH6.5）15に、シユードモナスCI−
36（微工研菌寄第5209号）をグルコース２％、ペ
プトン１％、イーストエキス１％および残部は水
からなる培地（PH6.5）300mlで培養した培養液を
種菌として接種した。30容ジヤーフアーメンタ
ーを用いて30℃で毎分15の空気を通気して４日
間撹拌培養した後、培養物を遠心分離することに
より湿菌体ペーストを得た。このペーストは乾燥
菌体として75ｇであり、この菌体には乾物１ｇ当
り補酵素Q₁₂36μｇおよび補酵素Q₁₃1.5μｇが含ま
れていた。 ジヤーフアーメンター４本分の湿菌体を合わ
せ、これを水1.2、メタノール８、ピロガロ
ール160ｇおよび水酸化ナトリウム1.2Kgと混合し
て85℃で１時間加熱還流した。放冷後８のｎ−
ヘキサンで２回抽出し、ｎ−ヘキサン層を取り、
これを水洗後芒硝で乾燥しそして混縮乾固した。
乾固物のアセトン可溶部を取り、アセトンを留去
しそして残渣をｎ−ヘキサンに溶解した。この溶
液をシリカゲルカラム上でエーテル−ｎ−ヘキサ
ン混合物でクロマトグラフ処理して補酵素Q₁₂お
よび補酵素Q₁₃を含む画分を採取する。この溶液
より溶媒を留去した後少量のイソプロピルエーテ
ルに溶解し、多孔性樹脂カラムに負荷し、次にメ
タノール−アセトン混合物で展開して補酵素Q₁₂
および補酵素Q₁₃を含む画分をそれぞれ採取す
る。 それぞれを濃縮乾固した後、更に逆相薄層クロ
マトグラフイーにより精製して純粋な補酵素
Q₁₂4mgおよび純粋な補酵素Q₁₃0.15mgを得た。 実施例 ２ 実施例１と同様の培地を用い、実施例１と同様
の操作でシユードモナスN842−M16（微工研菌寄
第3155号）を培養して湿菌体ペーストを得た。こ
れは乾燥菌体として80ｇであり、この菌体には乾
物１ｇ当り補酵素Q₁₂15μｇおよび補酵素Q₁₃0.75μ
ｇ含まれていた。 ジヤーフアーメンター４本分の湿菌体を合わせ
て実施例１と同様の操作で抽出精製を行つて補酵
素Q₁₂2mgおよび補酵素Q₁₃0.1mgをあ得た。 実施例 ３ 実施例１と同様の培地を用い且つ実施例１と同
様の操作でシユードモナスN842（微工研菌寄第
3154号）を培養して湿菌体ペーストを得た。これ
は乾燥菌体として86ｇであり、この菌体には乾物
１ｇ当り補酵素Q₁₂0.2μｇが含まれていた。 ジヤーフアーメンター４本分の湿菌体を合わせ
て実施例１と同様の方法で抽出精製を行い補酵素
Q₁₂0.03mgを得た。 実施例 ４ NH₄H₂PO₄0.4％、KH₂PO₄0.2％、
Na₂HPO₄・12H₂O0.3％、MgSO₄・7H₂O0.02％、
CaCl₂・2H₂O0.001％、FeSO₄・7H₂O0.0005％、
MnSO₄・nH₂O0.0005％、CoSO₄・7H₂O0.0001
％、メタノール１％そして残部は水よりなる培地
（PH7.2）100mlにシユードモナスAMIを接種しそ
して500ml三角コルベンを用いて５日間培養した。
菌体に含有される補酵素Q₁₂の定量値は乾燥菌体
１ｇ当り0.2μｇであり、そして補酵素Q₁₃の定量
値は乾燥菌体１ｇ当り0.01μｇであつた。 実施例 ５ 実施例４と同様の培値を用い且つ実施例４と同
様の操作でシユードモナスM27を培養した。菌体
に含有される補酵素Q₁₂の定量値は乾燥菌体１ｇ
当り1.1μｇ、そして補酵素Q₁₃の定量値は乾燥菌
体１ｇ当り0.15μｇであつた。 実施例 ６ 実施例４と同様の培地を用い且つ実施例４と同
様の操作でプロタミノバクター・ルーバーを培養
した。菌体に含有される補酵素Q₁₂の定量値は乾
燥菌体１ｇ当り0.36μｇであり、そして補酵素Q₁₃
の定量値は乾燥菌体１ｇ当り0.02μｇであつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シユードモナス属に属する細菌を培養して一
   般式 で表わされる補酵素Q₁₂を菌体内に蓄積せしめ、
   かくして蓄積された補酵素Q₁₂を菌体より採取す
   ることを特徴とする、前記一般式で表わされる
   補酵素Q₁₂の製造方法。