JPS63102690A - 補酵素ｑ↓１↓２の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物による補酵素（ｈ２の製造法に関する。

補酵素Ｑとは下記の構造式 で示される一群の化合物の総称である。これら一群の補
酵素Ｑの化合物は生体内では電子伝達系の一要素として
重要な役割を果しており、また従ってそれらは各種疾病
に対して秀れた薬理作用を示すものとして期待されてい
る。

上記構造で示される補酵素Ｑのうち、ｎ＝１２である補
酵素Ｑ１２はネズミあるいはある種の罎物中に存在する
ことが知られているが、いずれも工業的規模で補酵素Ｑ
１２を生産する原料として満足できるものではない。ま
たｎ：１３である補酵素Ｑ１ｓは従来その存在が現実に
は知られていなかった新規な物質である。

本発明者等は微生物の醗詳伝により補酵素Ｑ１２及び補
酵素Ｑ１ｓｔ生産することを目標として植種検討した結
果、ある種の細菌中にこれらの物質が蓄積さｎること全
見出し、不発明全完成するに至つ念ものである。

本発明の目的はシュードモナス属に属する細菌ま友はプ
ロタミノバクタ−属に属する細菌を用いることによシ効
率的に補酵素Ｑ１２及び補酵素Ｑ１３．を得る方法を提
供しようとするものである。

本兜明方法において便用さｎる菌株としては、シュード
モナスＮ８４２（微工研菌寄第３１５４号、％開昭５２
−４７９９０号参照）、シュードモナスＮ８４２−Ｍ１
６（微工研菌寄第３１５５号Ｓ％願昭５３−１５０５１
３号参照）、シュードモナスＣニー３６（微工研菌寄第
５２０９号、特願昭５４−１２４７２７号参照）、シュ
ードモナスＡＭ工（ＮＣより　９１３３）、シュードモ
ナスＭ２７□□□Ｃより　９６８６）　、プロタミノバ
クタ−・ルーバー〔「日本農芸化学会誌」第５２巻第４
７７頁（１９７８）参照〕などが適当である。なおプロ
タミノバクタ−・ルーパーは公定菌ではないが、保存研
究室よ、り入手しうるものである。

本発明方法において便用さｎる培養培地は特に制限はな
く、たとえば炭素源としてはグルコース等の含水炭素、
くえん酸等の有機酸、メタノール、グリセリン等のアル
コール類等が使用でき、窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、尿素、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、アンモニアガス等、無機物としては燐酸
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩１マンガン塩
、その他必要に応じて微量金属塩等が便用できる。更に
必要に応じて生育促進物質としてアミノ酸、ビタミン、
大豆蛋白加水分解物、酵母エキス、投プトン、カザミノ
酸等を使用することもできる。

培養に当ってはＩ）Ｈ５〜８で２０〜４０℃において２
〜１０日間程度好気的にＳ盪または攪拌培養する。培養
液から常法にょ９遠心法ま之は濾過法などで菌体を分離
する。ここで得られた菌体中には補酵素Ｑ１２またはＱ
１３またはその両方が含有されている。

補酵素Ｑ１２および補酵素Ｑｊ５の単離の几めの出発物
質である菌体は生菌体または乾燥菌体もしくは菌体処理
物のいずｎでも１更用できる。補酵素Ｑ１２および補酵
素Ｑ１５を単離する方法の一例を示すとＳまずけん化す
るためにメタノール、苛性ソーダおよびピロガロールの
混液を菌体含有液に添力りしそして６０〜９０℃におい
て１〜５時間還流加熱しつつ抽出する０次いで佃出液を
ｎ−ヘキサン等の浴娯で佃出し１溶媒層を水洗および脱
水後に１縮し、α縮収をシリカゲル等のカラムに添加し
、次いで吸着物をベンセンなどで展開すると補酵素Ｑ１
２ま几は補酵素Ｑ、１３もしくはその両方を含む画分が
溶出する。この画分ｔｄ縮乾固し、更に多孔性樹脂カラ
ムクロマトグラフィー、逆相薄看クロマトグラフィー等
によシ補酵素Ｑ１２ま念は補酵素Ｑ１３を単離する。

これをエタノール等から結晶化すると純粋な補酵素Ｑ結
晶が得らｎるが、包接化合物による分離、分子蒸留等を
行うことも効果的である０次に補酵素Ｑ１２および補酵
素Ｑ１５の物性につき述べる。

補酵素Ｑ１２は黄色結晶で融点は５４．０　℃である。

補酵素Ｑ１２のエタノール溶液中での紫外部吸収スはク
トルは２７５ｎｍに吸収ピークｔ−ＮＬ、この吸収ピー
クはＮａＢＨ４で還元すると２９０ｎｍにシフトする。

マススペクトルの分子イオンピ−りは９９８であり、そ
の他に主なフラグメントイオンピーク９８３（Ｍ−１５
）、２３５．１９７および６９が存在する。薄ｊクロマ
トグラフィー、逆相ｔｉｉｌ／ｍクロマトグラフィーお
よび高速液体クロマトグラフィーでの挙動は第１表に要
約されている◎ 補酵素Ｑ１５のエタノール溶液中での紫外部吸収スはク
トルは２７５ｎｍに吸収ピークを肩しこの吸収ピークは
ＮａＥＨ４で還元すると２９０ｎｍにシフトする。マス
スはクトルの分子イオンピークは１０６６でお９分子式
Ｃ７４Ｈ１１ａｏａに相当する０その他に主なフラグメ
ントイオンピーク１１０５１（＋−１５）、２３５．１
９７および６９が存在する０薄層クロマトグラフィー、
逆相薄島クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグ
ラフィーでの挙動は第１表に要約さｎている。

次に掲げる表１において、薄１クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）溶媒はベンゼン−クロロフォルム（４：１）でア
シ、逆相薄層クロマトグラフィー溶媒はアセトン−水（
９７，５：２．５）であり、そして高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）条件はμｍボンタパツクＣＩＢ　
４．５Ｘ３００ｍカラムおよびメタノール−イソフロビ
ルエーテル（８５：１５）溶媒を用いて流速１　ｍｌ　
／　ｍ　ｉ　ｎ％検出２７５　ｎｍとし九。

表　　　１ ＴＬＣのＲｆ値　　　　　　α４３　　　０．４５逆相
ＴＬＣのＲｆ値　　　　０．５２　　　０．４４ＨＰＬ
Ｃでの保持時間（分）　　　　２３．４　　　　３０．
６冥施例　１ グ／ｌ／　コース２％、Ｎａ２ＳＯ４ｎｏ　５　％、Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０α０１％、ＫＨ２ＰＯ４Ｑ、１％、
ｘ２ａｐｏ４Ｑ、１％、コーンステイープリカー０．３
％および残部は水からなる培地ＣＰＨ＆５　）　１５ｔ
に、シュードモナスＣニー３６（微工研菌寄第５２０９
号）をグルコース２％、はプトン１％、イーストエキス
１％および残ｉ・は水からなる培地（ｐＨ６，５）３０
０−で培養した層を液を種菌として接種し几。３０を容
ジャーファーメンタ−を用いて３０℃で毎分１ｓｔｏ空
気を通気して４日間攪拌培養した後、培養物を遠心分離
することによ９１１体ば一スト’２得た。

このは−ストは乾燥画体として７５２であ！ｌ１１この
菌体には乾物１２当り補酵素Ｑ、１２３６μｇおよび補
酵素Ｑ１３１．５μｇが含まれていた。

ジャーファーメンタ−４本分の湿面体を合わせ、これを
水ｔ　２　ｔ　１メタノール８ｔ１ピロガロール１６０
ｔおよび水酸化ナトリウム１．２　ｋＰと混合して８５
℃で１時間別熱還流した。放冷後８ｔのｎ−ヘキサンで
２回抽出し、ｎ−ヘキサン層を取υ、こｎ６水洗後芒硝
で乾燥しそして混縮乾固した。乾固物のアセトン可溶部
を取り、アセトンを留去しセして残渣ｉｎ−ヘキサンに
溶解した。この溶液金シリカゲルカラム上でエーテル−
ｎ−ヘキサン混合物でクロマトグラフ処理して補酵素Ｑ
１２および補酵素Ｑ１ｓ’ｒ含む画分全採取する。この
溶液より溶媒を留去し之後少童のイソフロビルエーテル
に溶解し、多孔性樹脂カラムに負荷し、次にメタノール
−アセトン混合物で展開して補酵素Ｑ１２および補酵素
Ｑ１５を含む画分をそｎぞｎ採取する。

そｎぞａｔ″磯縮乾固しｔ後、更に逆相薄層クロマトグ
ラフィーにより精製して純粋な補酵素Ｑ１２４■および
純粋な補酵素Ｑ１３０．１５ｍｇを得た。

実施例　２ 実施例１と同様の培地を用い、実施例１と同様の操作で
シュードモナスＮ８４２−Ｍ１６（微工研菌寄第３１５
５号）全培養して湿園体は−ストを得之にｎは乾燥菌体
として８０２であり、この菌体には乾物１７当シ補酵素
ｑ、１２１ｓμｇおよび補誦素Ｑ１５０．７５μｇ含ま
ｎていた。

ジャーファーメンタ−４本分の湿菌体で会わせて実施例
１とＰ１憬の操作で抽出精製を行って補酵素Ｑ１２２’
Ｍ９および補酵素Ｃｈ　３０−　Ｉ　Ｒ９’ｌｒ：　得
ｆ−０実施例　６ 実施例１と同様の培地を用い且つ実施例１と同様の操作
でシュードモナスＮ８４２（微工研菌寄第３１５４号）
を培養して湿菌体ペーストを得た〇こｎは乾燥Ｎ体とし
て８６２でめジ、この（至）体には乾物１２桶ジ補酵素
Ｑ１２０．２μｇが含まれてい念。

ジャーファーメンタ−４本分の湿菌体貴台わせて実施例
１と同様の方法で抽出精製を行い補酵素Ｑ１２０．０３
ＪＩ９を得た。

実施例　４ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４０，４％、ＫＨ２ＰＯ４０，２％、Ｎ
ａ　２　ＨＰＯ４・１２ｉ（２００，３％、ＭｇＳＯ４
−７Ｈ２００，０２％、ＣａＣ２２”２Ｈ２００，００
１％、　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，０００５％、ＭｎＳ
Ｏ４”ｎＨ２Ｏ０，０００５％、Ｃ！０ＳＯ４−７Ｈ２
００，０００１％、メタノール１％そして残部は水より
なる培地（ｐＨ７，２）　１００ｍにシュードモナスＡ
Ｍ工’ｉ接種しそして５００−三角コルベンを用いて５
日間培養した。菌体に含有される補酵素Ｑ１２の定量値
は乾燥菌体１？当り０．２μｇであり、そして補酵素Ｑ
１３の定量イＬ１は乾燥Ｎ体１２当す０，０１μｇであ
つ之。

実施例　５ 実施例４と同様の培地を用い且つ夷柿例４と同様の操作
でシュードモナスＭ　２７を培養した。

菌体に含Ｍさｎる補酵素Ｑ１２の定量値にだ燥函体１２
当９１．１μｇ１そして補酵素Ｑ１３の定量値は乾燥Ｎ
体１９　当；　ｃｌ、１５μｇテＳ　ツ７’Ｃ６実施例
　６ 実施例４と同様の培地を用い且つ実施例４と同様の操作
でプロタミノバクタ−・ルーバーを珊養し念。菌体に含
有てれる補酵素Ｑ１２の定量値は乾燥Ｎ体１１当ジα３
６μｇであり、そして補酵素Ｑ１３の定量値は乾燥函体
１２当シα０２μｇでるつ九〇 特許出Ｊへ　日清製粉株式会社 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 シュードモナス属又はプロタミノバクター属に属する細
   菌を培養して一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表わされる補酵素Ｑ＿１＿２を菌体内に蓄積せしめ、
   かくして蓄積された補酵素Ｑ＿１＿２を菌体より採取す
   ることを特徴とする、前記一般式 I で表わされる補酵
   素Ｑ＿１＿２の製造方法。