JPH03502640A

JPH03502640A - 歯周囲病原体検出用オリゴヌクレオチドプローブ

Info

Publication number: JPH03502640A
Application number: JP1501810A
Authority: JP
Inventors: シユワルツ，デニス・イー; カネモト，ロイ・エイチ; ワタナベ，スーザン・エム; デイツクス，キム
Original assignee: マイクロプローブ・コーポレーシヨン
Priority date: 1988-01-11
Filing date: 1989-01-09
Publication date: 1991-06-20
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: WO1989006704A1; EP0395731A4; FI903485A0; JP2733700B2; DK162090D0; CA1339728C; EP0395731A1; DK162090A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】歯周囲病原体検出用オリゴヌクレオチドプローブ本発明の背景本発明の技術分野本発明は、ヒトの口の医学的疾患に関連した細菌の検出に使用するオリゴヌクレオチドプローブの組成物に関し、その際該プローブは、ハイブリッド形成条件下で上記細菌の１６５または２３ＳリポソームＲＮ＾［ｒＲＮ＾］と選択的にハイブリッド形成し得る核酸の断片から本質的になる。

検出方法並びにこれら細菌のアッセイ用診断キットも開示する。

ヒトの歯周病、特に歯肉炎および歯周囲炎の病因にプラク細菌が関与しているという証拠が十分ある。これらの疾病は研究されてきたので、特定の口内細菌並びに他の感染性ウィルスおよび微生物を検出し、定量しそして同定するためにますます精巧になった方法が開発されてきた。これらの改良された方法によって、歯周病の病因学で主要な役割を果たしている特定の病原性細菌が同定されてきた。

ヒト歯周病は米国における主要な健康管理問題となっている。疫学調査によって近年歯肉炎のアメリカ人の割合が減少していることが示されているが、該疾病の成る段階にある患者の数は高いままである。更に、歯周囲ポケットを有する１８〜７９才の成人の割合は相対的に変化していないように思われる。

１９７０年代の初期には、アメリカ人の３０％が５０才までに重大な歯周病問題を有しており、そして６０才までには全アメリカ人の３０から４０パーセントの者が主として歯周病によって歯を全て失っていた。現在では、重篤な歯周病を有する者の正確な割合は知られていないが、最近の推定では全アメリカ人口のｌＯ〜２０パーセントが歯をなくしてしまう程重篤な歯周病を有している。該疾病の開始および経過と同定可能な（疑わしい）病原性細菌種との間の有意な関係がこの疾病と一致している。

ヒト歯周炎の病原論に関わる正確で複雑なメカニズムは未だ不明であるが、歯周囲の歯肉溝領域でコロニーを形成する細菌が疫学的に第１に重要であると広範に了解されている。ここ千年の間に、幾つかの大学研究所の研究者達は、ヒト歯周囲溝またはポケットで見い出される多数の細菌属および種（約２５６種）のうち、比較的限られた数のものが歯周病と密接に関連しているように思われることを証明している。これらの微生物は［歯周囲病原体の疑いのあるものｊと称されている。特に重要なものは表１に示される微生物である。

情報の開示一定の歯周囲ポケット部位に存在する歯周囲病原性細菌の検出および特徴決定は、現在の方法では、時間がかかり且つ高価である（例えば、顕微鏡分析、培養分析、ガスクロマトグラフィー分析および代謝物分析）。更に、精巧な実験室装置に伴って高度な訓練を受けた人が必要である。ヒト歯周病の微生物学に関して発表された研究の大部分は、各歯周凹部位の微生物叢の個々の微生物を単離し特徴を決定するために為さなければならない膨大な仕事量によって解決されている。

その結果、患者当たりの試料採取部位の敢および検査される患者の数が制限される。明らかに、この方法では病原性細菌の存在について歯周病患者を定型的に試験することは可能にならない。

」二紀検出方法論の代替方法としてイムノアツセイが報告される。　アクチノバチルス　アクチノマイセテムコミタ　ンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｃｏｍｉｔａｎｇ）（Ａ、ａ、）、バクテロイデス　ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｇ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｂ、ｇ、）　　およびバクテロイデス　インターメディウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｇ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）　（Ｂ、ｉ、）に対する蛍光モノクローナル抗体が開発されている。チェノ（Ｃｈｅｎ）　　Ｐ。

等、生物学的試料中のバクテロイデス　ジンジバリスを検出するためにモノクローナル抗体の使用、＋ｒ＋ｆｅｃＬｉｏｎａｎｄ　１ｍａｕｎｉＬｙ、　５４：　７９ｇ〜８０３（１９８６）；　グムーア（Ｇｍｕｒ）Ｒ９等、モノクローナル抗体による歯周囲ポケット微生物叢の定ｍ的測定、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄｅｎｉａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ａａ巻＝１２０　（１９ｇ？、抄録）：ファイン（Ｆｉｎｅ）　Ｄ、　Ｉｌ、およびマンデル（Ｍａｎｄｅｌ）　１．Ｄ、、歯周病活性の指ＰＪ＝評価、ノ、　Ｃｌ１ｎ。

ＰｏｒｉｏｄｏｎＬａｌ、１３二５３３〜５４６　（１９８６）　、これらの抗体は顕微鏡スライド上のプラク塗抹標本に直接使用することができる。この試験には個々の顕微鏡スライド上の蛍光性細菌を計数するマニュアルが必要であり、この方法は非常に労働集約的であり、高価な蛍光顕微鏡を必要とする。

病原性細菌を検出するために核酸ハイブリッド形成技術を使用する可能性が知られており、更に詳細には、ハイブリッド形成アッセイにｒＲＩＩＡを使用することが知られている（カナダ特許第１．２１５，９０４号およびリポソームＲＮ＾の可変領域に相捕的なオリゴヌクレオチドプローブはマイクプラズマ種を識別する、Ｊ、　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９ｇ？）川、１９６９〜１９７４゜Ｕ、　　Ｂ、　ＧｏｂｅｌｌＡ、　Ｇｅ１ｓｅｒ、　　Ｅ。

Ｊ、　ＳＬａｎｂｒｉｄｇｅ）。ゲノムＤｌｌ＾プローブ全体は、報告によれば、歯周囲病原体を同定するために使用されているが（ヨーロッパ特許１９９，４３９）、これらの方法は開示された発明のハイブリッド形成特性を有していない。例えば、Ａ、ａ、、Ｂ、ｇ、またはＢ、　ｔ、ゲノムＤＩＩＡのフラグメントはｐｓＰ６４転写ベクター中にクローン化されている。チェンＬ等、口内微生物用Ｄ１１Ａプローブの開発、Ａｓ５ｏｃ、Ａｄｖ、［）１４ｎＬａｌ；Ｒｅｓ、　Ｍｅｅｔｉｎｇｓ、　１ａｓｈ、、　Ｄ、Ｃ，（１９８６）；　サビット（Ｓａｖｉｔｔ）Ｅｏ等、ＲＮＡプローブによるプラグ中の＾、アクチノマイセテムコミタンスの検出、　Ａｓ５ｏｃ、　Ａｄｖ、　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒａｇ。

Ｍｅｅｔｉｎｇｓ、冒ａｓｈ、、　Ｄ、Ｃ，（１９８６）。ｐＳＰ６４ベクターは＾、ａ９、Ｂ、ｇ、またはＢ、ｉ、のＩ？ＮＡ転写物を作るために使用される。

ｐｓｆ’６４ベクターはＡ、ａ、、Ｂ、ｇ、またはＢ、ｉ、を産生するために使用される。ｐＳＰ６４−Ａ、ａ、プローブは、純粋な培養物またはプラク試料に対して試験するとき、特異的であると報告された。しかし乍ら、ｐＳＰ６４−Ｂ、ｇ、およびｐｓＰ６４−１３．　ｉ。

プローブは、それぞれ成る種の非−Ｂ、ｇ、および非−〇、ｉ、細菌と僅かに交差ハイブリッド形成をした。非−病原性バクテロイデス種は歯肉下溝に１富に存在するので、これらの交差ハイブリッド形成は誤った陽性の同定を生じさせることがある。

歯周囲病原体を検出する上記方法の各々は定型的な診断アッセイに必要な下記規準の１つまたはそれ以上を欠いている＝　１）費用（安価）：　２）バッチ処理能カニ３）速度（日または週ではなくて時間）：　４）感度：５）特異性二　６）　１回の試験で多数の病原体同定ニア）単純性；　８）生存及び非生存生物の双方の検出能力。従って、当該技術分野には別の検出方法論の必要性がある。

本発明の要約本願発明は、ヒドロ内の医学的疾患に関係のある細菌の検出用オリゴヌクレオチドプローブの組成物に関し、その際該プローブは、ハイブリッド形成条件下で、細菌のリポソームＲＮ＾の超可変領域と選択的にハイブリッドを形成できる核酸の断片からなる。但し該断片と共有結合した任意の更に他のヌクレオチドは上記条件下ではヒトの口に通常見い出される細菌の核酸とハイブリッド形成しない。

機能的には、これらプローブは細菌ｒＲＮ＾または対応するゲノムＤＮ＾の固有の部分とハイブリッドを形成することができ、上記細菌の検出および同定が容易に可能になり他の細菌種との交差反応がない。更に、１６８および２３ＳのリポソームＲＩＩＡの不変領域に向けられたオリゴヌクレオチドプローブの組成物が記載されており、その際上記プローブはリポソームＲＮ＾または対応するゲノム配列用の特異的なプローブとして使用することができ、そしてリポソーム核酸の配列決定に使用することができる。

本発明はまた、式；ａ）Ｘはヒトの口に住みついている細菌に見い出される細菌核酸の不変または非不変領域と非相同性である０から１００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の配列であり：ｂ）Ｙはヒトの口に住みついている細菌のリポソームＲに＾の超可変領域とハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成できる　１ｏから１００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の配列であり、その際Ｙは上記細菌のうちの唯一の種、上記細菌の２つの種または上記細菌の３つの種とハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成できる下位配列からなることもできる：ｃ）ＺはＸと同一または異なるヌクレオチドの配列であり、その際該ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は住みついているヒトの口で見い出される細菌の核酸の不変または非不変領域と非相同性であり：そしてｄ）ｎは１〜５００またはそれ以上であり、　ｎが１より大きいときＹは上記ハイブリッド形成能を有するヌクレオチドと同一または異なる配列であることができる。プローブは遊離かまたはベタター配列（例えば、プラスミドまたは一重鎖ＤＮＡ　）　　内に含まれていることができる　、のプローブにも向けられている。

下記細菌は、それらが歯周病に関連して見い出されているので、特に重要である：　アクチノバチルス（ヘモフィルスを除く）アクチノマイセテムコミタンス：バクテロイデス　ジンジバリス；バクテロイデス　インターメディウス　タイプ１；バクテロイデス　インターメディウス　タイプ２：　エイケネラ　コロデンス　（Ｅｊｋｅｎａｌｌａｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）　；　　バクテロイデス　フォルシサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｏｒｓｙＬｂｕｓ　）　；フッバクテリウムヌクレアタム（ＦｕｓｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　ｒ＋ｕｃｌｅａＬｕｍ）　；フソバクテリウムベリオドンヂクム（ＦｕｓｏｂａｃＬｅｒｉｕ＠ｐｅｒｉｏｄｏｎＬｉｃｕｍ）；ストレプトコッカス　インターメディウス（５Ｌｒｅｐｔｏ −ｃｏｃｃｕｓ　１ｎｔｅｒ＊ｅｄｉｕｓ）　；　ヴオリネラ　レクタ（ｔｏｌｉｎｅｌｌａｒａｃｔａ）。本発明はこれら細菌のｒ　ＲＮ　Ａ　１　　特に１６Ｓおよび２３３　ｒＲＮＡの超可変領域とハイブリッドを形成できるポリヌクレオチドプローブからなる組成物を開示する。

各特異的プローブは唯一の微生物種またはタイプのｒＲＮＡとハイブリッドを形成することが好ましい。特に好ましいものは、表１に示したような１６ｓ　ｒＲｌｌＡの超可変領域に相補的な配列であるが、これらに限定しようとするものではない。別の配列は本明細書に開示した配列決定法を使用して容易に確認可能である。例えば、２３ＳリポソームＲＩＩＡの超可変領域用の配列は表２に示される配列付加プライマーを使用して決定することができよう。本明細書に開示した方法を使用すると、当該技術分野の熟練者は、本発明で使用するのに適切な特異性を有する別のｒＲＮＡ配列を容易に得ることができよう。

特許請求したプローブの核酸配列には、特許請求したプローブに相補的な領域と実質的にハイブリッド形成する特許請求した配列と十分な同一性を有する合成由来または組換え体核酸配列が含まれる。［実質的にＪは、中程度の厳密さの標準的ハイブリッド形成条件下で、ハイブリッド形成パーセントが完全に相補的な核酸フラグメント間のハイブリッド形成の５０％を超えるように示され得ることを意味する。

「組成物Ｊは、細菌ｒＲＩｌ＾に相補的なプローブが純粋な状態でまたは他のプローブと組合わされていることができることを意味する。更に、プローブは塩または緩衝液と組合わせることができ、そして乾燥状態で、アルコール溶液中の析出物としてまたは水溶液であることができる。

細菌群に関する文脈中の［およびそれらの組み合わせ物ｊの語句は、記載した細菌種の１つまたはそれ以上を検出するように設計したプローブ組成物のことをいう。

プローブは、単一の種または２つ若しくはそれ以上の種を検出し得る異なるプローブの混合物、プローブの各々が１つまたはそれ以上の種を検出できる異なるプローブの混合物、或は単一プローブの同種組成物であることが−のオリゴヌクレオチド配列若しくは一定の配列の混合物の１つまたはそれ以上のコピーを含有することができる単一プローブのコピー組成物、或はプローブの一部として一定のオリゴヌクレオチド配列の１個または複数のコピーを含有することができるプローブ混合物のコピー組成物を言う。

用語オリゴヌクレオヂドまたはポリヌクレオチドプローブは、二重鎖および一重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの双方を含むように意味する。これらの用語はまた、本質的に非−核酸夾雑のない合成または組換え由来の配列を言う。

組成物の特許請求に加えて、ヒト患者の口から得た試料での、医学的疾患に関連した微生物細胞の検出方法を開示する。これらの方法は次の段階：＠生物細胞を溶解してリポソームＲにＡを遊離させ：　ハイブリッド形成条件下で上記リポソームＲＮＡを、上記微生物細胞のリポソームＲＮＡの超可変額域と選択的にハイブリッド形成し得るポリヌクレオチドプローブと接触させ：そして試料中の微生物細胞の存在の指標としてハイブリッド形成コンプレックスを検出する段階からなる。更に詳細には、検出される細菌を上記リストから選択する上記方法を本明細書に開示する。更に一層詳細には、少なくとも２つの異なるプローブ群（その際各群のプローブは単一の細菌のリポソームＲＩＩＡの異なる超可変額域と　ハイブリッド形成できる）を使用して試料をアッセイする上記のような方法を本明細書に開示する。

上記組成物および方法に加えて、ヒトの口内疾患に関連した微生物細胞のリポソームＲＮ＾の超可変額域に相補的な合成オリゴヌクレオチドプローブからなる、細菌の存在を測定する診断用キットを本明細書に開示する。

これら細菌の分類法は確定していない。菌培養物はメリーランド州ロックヒルの米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）から人手可能である。他の細菌は同定されるかまたは他のサブタイプは上記リストから分化されるので、開示した本発明によって、これら細菌の検出および同定に使用するのに十分特異的なプローブを製造する方法が容易に提供される。

隣接ヌクレオチドと二次的または三次的相互作用が最小である細菌リポソームＲＮＡ領域（開放領域）と選択的にハイブリッド形成し得る核酸の断片からなるポリヌクレオチドプローブの組成物も特許請求し、その際該プローブは開放領域とだけ実質的に結合する。「実質的に結合する」はプローブが、加熱した後でしかハイブリッド形成に利用できない領域、即ち二次的および三次的構造が有意な領域（閉鎖領域）に結合する有意な断片からがなっていないことを意味する。実際的な意味では、このようなプローブは一般的には、閉鎖領域に結合するであろう１０個以上の側面ヌクレオチド（５′かまたは３°のいずれか）からなっていない。

更に詳細には、開放領域に相補的で細菌ｒＲＦＩＡの超可変額域および不変領域の双方に相補的なポリヌクレオチドプローブの組成物を特許請求する。

細菌ｒＲＮＡの閉鎖された不変領域とハイブリッド形成するポリヌクレオチドプローブら特許請求する。

最後に、ヒト患者の口から得た試料中の微生物細胞の検出方法を開示する。本方法は次の段階：微生物細胞を溶解してリポソームＲＮＡを遊離させ：該すポソームＲＮＡをハイブリッド形成条件下で、上記微生物細胞のリポソームＲｊＩＡの開放領域と選択的にハイブリッド形成し得るポリヌクレオチドプローブと接触させ：そして試料中に微生物細胞が存在する指標としてハイブリッド形成コンプレックスを検出する段階からなっている。更に詳細には、検出される微生物を上記リストから選択する上記方法を本明細書に開示する。更に一層詳細には、上記したような方法、即ち各群のプローブが単一の細菌のリポソームＲＮ＾の異なる不変領域にハイブリッド形成し得る少なくとも２つの異なるプローブ群を使用して試料をアッセイする方法を本明細書に開示する。

詳細な説明本発明は歯周病および他の細菌介在口内疾病に関連した口内細菌種のｒＲＮＡと相補的な種特異的核酸プローブの開発に関する。これらのプローブは、それらの特異性および感受性の故にゲノム配列に相補的なプローブより優れている。これらのプローブは、非病原性細菌種との交差−ハイブリッド形成を避は得る該プローブの能力のために選択されている。これらプローブの優れた特性は、各細菌細胞中の何百〜何千ものコピー中に見い出されるｒＲＮＡの超可交配列とだけハイブリッド形成できることに拠っている。ｒＲＮＡの超可変額域は、特別の細菌種またはタイプに固有の配列である。ゲノムライブラリー全体に由来するプローブと比較するとき、ｒＲＮＡに対するプローブ、特にｒＲＮＡの超可変額域に相補的なプローブは有利な感受性であり、そして少数の細菌の検出能および細菌種、タイプおよびサブタイプとを区別する能力が特異的である。アッセイは同一細菌のリポソームＲＮＡの２つの異なる超可変額域に対する捕獲オリゴヌクレオチドからなることが好ましい。このような方式によって、選択された標的領域中の異種混交性による誤った陰性結果の発生が劇的に減少する。本明細書に開示した方法はアッセイが迅速であるという利点を有している。開示した方法は比較的単純に実施でき、そして口の細菌病原体に関してこれまで達成されなかった再現度および正確度を有している。

試料採集本発明に使用する微生物標本は、表！に示したいずれの細菌もＡＴＣＣから得ることができる。臨床的研究用には、試料は歯肉下プラクの歯かき取り物から得るかまたは歯周病を有すると思われるヒト患猾の歯周囲ポケットから紙魚を用いて採取した液体から得る。試料は、生物学的に適合する溶液を提供する緩衝液、例えば１５０ｍＭ　Ｎａｃｌ、２０ＩＩＭ　ト　リ　スー１１ＣＩ　　（ｐＨ７，５）、　１０自Ｍ　　ＥＤＴＡｌ　１０ｍＭ　　ＥＧＴＡ、　　または１５０＋ｓ）Ｉ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　ＩＩａｌ’０．　（ｐａｌ　７．５）、１０５Ｍ　ＥＤＴＡ、　１０ｄ　ＥＧＴＡ中に分散させ、そして使用するまで冷凍する。

アッセイ前に、細胞は、ツジンク（Ｄｚｉｎｋ）等、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｍｉｃｒｏ、、１９：５９９．１９８４に記載されているような標準的微生物学的技術に従って任意に培養する。細菌はトアセチルームラミダーゼ（リゾチーム）を含有する溶解緩衝液中で溶解する。溶解緩衝液は当該技術分野で既知である。

ヨーロッパ特許１９９，４３９．　　ボッ７　（ＰｏｔＬＩＩ）　　Ｔ、Ｖ、およびベリー（Ｂｅｒｒｙ）、Ｅｍ、　　Ｉｎｆｅｒｎａｌ、　Ｊ、　Ｓｙｓ、　１３ａｃｔｅｒ、、３３ニア６５〜７７１　（１９８３）：　ボンタ（ＢｏｎＬａ）　　Ｙ、等、　Ｊ、　Ｄｅｎｙ。

Ｒｅｓ　、、６４ニア９３〜７９８　（１９８５）。一般的には、これら緩衝液はｐｌ＋７．０から８．０の間であり、キレート剤および界面活性剤の双方を含有している。加熱変性は任意である。

或は、試料は、ハイブリッド形成溶液としても機能する溶解溶液、例えば３Ｍのグアニジウムチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）、５０ｍＭ　）リス（ｐＨ７，６）、ｌ０５Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（５ＤＳ）、および１％メルカプトエタノール中に分散させて直接集める　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎｕａ１．ニューヨーク州コールドスプリングハーバ−１１９８２）。溶解は６５℃で１０分間実施する。

口内病原性細菌のｒＲＮＡに相補的なプローブ本発明は、細菌種またはタイプ間で一定でないｒＲＮＡ配列の超可変領域と相補的なプローブに向けられており、それ故これらプローブは種またはタイプ間で識別可能である。　１６５　ｒＲＮＡ内の５個の配列はレーン（Ｌｉｎｅ）　　等、Ｐｒｏｃ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、＾０．８２４９５５〜６９５９　（１９８５）によって記載された普遍的なオリゴヌクレオチドプライマーおよび本発明者が開発した次の３つのオリゴヌクレオチドプライマー： υＰ４８ｊ　　５’ＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴｒＡＧＣＣＧコ１１ｔＪＰ８Ｂ＝　　５’ＣｋＣＧ入ＲＣＴＧｋＣＧｋＣｈＲＣＣｋＴＧＣコ’：　　ｆ、−２Ｂ−ＵＰ６Ｂ：　　５１ＴＡＣＧＧＮＴＡＣ（？ｒＧＴＴＡＣＧＡＣ。

を使用して誘導した。核酸配列中の完全には特定されない塩基の名称は、国際生化学連合で推奨されている名称、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＩＪ、Ｓ、＾、　８３：４　’−８（１９８６）であり、これは本明細書に参照文献として入れる。例えば、Ｒと指定されているヌクレオチドはグアノシン、アデノシンまたはそれらの類似体と交換可能であり：Ｎと指定されているヌクレオチドは任意の天然ヌクレオシドまたはその類似体を意味しこの位置で交換することができる。

Ｙと指定されているヌクレオチドはシトシンまたはチミンと交換可能であり、Ｗと指定されているヌクレオチドはアデノシンまたはチミンと置き換えることができ：Ｍと指定されているヌクレオチドはアデノシンまたはシトシンと置き換えることができる。

これらのオリゴヌクレオチドプライマーは原核生物の１６５　ｒＲＩｌ＾の不変領域に特異的であり、　そしてＤＩｌａｉｅで前処理することなくまたはＤＮＡからＲＮＡを物理的に分離することなく全核酸調製物に付加させるために使用することができる。逆転写酵素の市販製剤を電気泳動ゲルでの配列決定用の適当なプライマーエクステンシジン反応剤と共に使用して各病原性細菌の超可変領域に相補的なｃＤ）ＩＡの転写物を得る。好ましい配列決定法ではジデオキシヌクレオチドチェーンターミネータ−法が使用される。同様に、原核生物の２３Ｓ　ｒＲＮＡの不変領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー（表２）は既知の配列決定法を使用して核酸調製物の配列を決定するために使用されている。

表２に示されるオリゴヌクレオチドプローブは原核生物の１６３および２３ＳリポソームＲＮ＾の不変領域に相補的であり、　そしてハイブリッド形成条件下でリポソームＲＮＡおよびこれに対応するゲノムＤＮＡ配列とハイブリッド形成する。これらの普遍的なオリゴヌクレオチドプローブはまたＤＩＩＡ、特に全ての細菌のＲＮＡに対するシグナルオリゴヌクレオチドとして使用するのにも理想的に適している。複数の探索形！！！（以下参照）では、標的核酸は超可変領域に特異的なプローブで捕獲されるが、リポソームＲＮＡの不変領域に由来する唯一の普遍的なシグナルプローブだけが種々の全ての病原性細菌から核酸を検出するために使用可能である。更に、１つ以上のシグナルオリゴヌクレオチドプローブを使用してシグナルの強さを増加させることが可能である。

１６８または２３ＳのｒＲＮＡについて病原体の配列決定分析が終了した後、その配列を市販で入手可能なコンピュータープログラム、例えばベックマン　インスッルメント（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｔｓｒｕｇ＋ｅｎＬｓ）　（カリフォルニア州バロアルト）が市販しているマイクロゼニープログラム（ｌｌｉｃｒｏ（ｉｅｎｉｅＰｒｏｇｒａｍ）によって比較することができる。現在のプログラムは一度に２つの配列しか比較できずそして全てのヌクレオチドが同等に重要である点で制限がある。更に複雑な比較が可能であるが、更に強力な　コンピューター（例えばクレイ（Ｃｒａｙ）コンピューター）が必要である。

ウォーターマン（冒ａｔｅｒｍａｎ）、　Ｍ、　Ｓ、コンセンサスによる配列の整列、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１４（１９８６）、９０９５〜９１０２゜好ましい選択方法には複数の配列の整列および不変ブロックの同定が必要である１次いで、最大の多様性（例えば、変異の代わりに挿入または欠失）を含むようにプローブを選択する。ＤＮＡプローブは化学的に合成できるので好ましいが、プローブはＤＮＡかＲＮＡかのいずれであってもよい。

病原性細菌のｒＲＮＡとの検出可能な結合に必要な相補性（相同性）の程度は、ハイブリッド形成媒体および／または洗浄媒体の厳密性によって変動する。相補性の程度は最適には１００パーセントであるが、以下に記載するハイブリッド形成媒体および／または洗浄媒体の厳密性を下げることによってｒＲＮＡの小さな変動を相殺することができると理解すべきである。かくして、厳密性が低下した条件下で相補性は１００パーセントではないけれども、ｒＲＮ＾ＲＮＡ少し塩基が異なっている機能性プローブが可能である。それ故、厳密性の低下したハイブリッド形成条件下で認容できる程度の特異性を維持し乍ら、一定のオリゴヌクレオチドプローブの６０％までを修飾することが可能である。更に、天然に生じるヌクレオシドをヌクレオシドの類似体で該プローブ内で置き換えることもできる。本発明は、ポリ核酸プローブと称するとき、上記の種に及ぶことを意図するものである。

大量のＤＮＡまたはＲＮＡを得るためには、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｇ）　Ｔ、等、分子クローニング：　実験室マニュアル、ニューヨーク州　コールドスプリングハーバ−１１９８２、に記載されたような伝統的なりローユング法を使用して所望の配列をクローニングするかまたは市販で人手可能なりＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成してプローブを製造することができる。クローニングの例は、リポソームＲＮＡ用のｅＤｌｌＡを複製ベクター、例えばｐＢＲ３２２、Ｍ１３に挿入するかまたはＳＰ６プロモーターを含有するベクターに挿入すること（例えばＳＰａ　ＲＮＡポリメラーゼを使用して一重鎖ＲＮＡの生成）、および細菌宿主を形質転換させることに関係があろう。ＤＮＡプローブは、溶解して核酸を抽出し、選択した制限酵素で処理し、そしてゲル電気泳動によって更に単離して宿主細胞から精製することができる。

ＤＮＡプローブは市販で入手可能な方法および装置を使用して化学的に合成することができる。例えば、固体相ホスホラミダイト法を使用して１５から５０個の間の塩基の短いプローブを製造することができる。本発明では、カリフォルニア州フォスターシティ−のアプライドバイオシステムズ（＾ｐｐｌｉａｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル３８０８　ＤＮＡシンセサイザーを使用し、同社から供給された試薬を使用して短いＤＮＡプローブを化学的に合成することが好ましい。プローブは天然のヌクレオチド塩基、または天然のヌクレオチド塩基の既知類似体からなることができ、標識部分に結合するように修飾した塩基も含まれる。

図１のオリゴヌクレオチド配列は特異的な１ＳＳ　ｒＲＮＡの特異的領域とハイブリッド形成してそれらを検出するプローブを表している。表３のオリゴヌクレオチド配列は特異的な２３Ｓ　ｒＲＮＡの超可変領域とハイブリッド形成してそれらを検出するプローブを表しているか、限定するものと考えるべきではない。

プローブは、それ自体結合用の単一ユニットである上記配列または等価の配列からなるか、または非病原性関連細菌への結合能を有していない追加的配列からなることができる０表１に提供した非常に短い配列からなるプローブは同一の配列の繰り返し単位（例えば、配列のコンカテマー）、細菌の１つの種に特異的な種々の配列の混合物、更１こは口内疾病に関連した亘つまたはそれ以上の細菌種に特異的である配列の混合物を有することができる。

このようなプローブが短い配列のコンカテマーを有し得る場合、上記の長いプローブは、例えば、僅か２０個のヌクレオチドしか有していない「短い」プローブに本来値わる高いハイブリッド形成特異性を示す。このコンカテナーブローブ配列はクローニングベクター配列内に含まれることができ、そして下記式で示される構造を有するであろう。或は、前記で定義した式［Ｘ　−Ｙ　−Ｚ　］ｎ。

を有するコンカテマーは、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いてクローニングベクターから切断することができよう。

プローブは、ハイブリッドポリヌクレオチドの存在を検出するために典型的に使用される幾つかの方法の任意の１つによって標識することができる。最も一般的な検出方法は、”Ｈ％　”ＳＴ、”ｓ　、　′４ｃ　＊　タハ”ｐ　テａｕｌｔ　したプローブ等を用いてオートラジオグラフィーを使用することである。放射性アイソトープの選択は選択されたアイソトープの合成の容易さ、安定性および半減期による研究での優先性に拠る。他の標識には、フルオロフォール、化学ルミネセンス剤および酵素で標識した抗体に結合するリガンドがある。或は、プローブは、フルオロフォール、化学ルミネセンス剤または酵素のような標識と直接抱合することができる。標識の選択は、必要な感受性、プローブとの抱合の容易さ、安定性要件および利用可能な設備に拠る。

標識の選択によって、該標識をプローブに結合させる方法が決定される。放射性プローブは典型的には、所望の放射性アイソトープを含有する市販で人手可能なヌクレオチドを使用して製造される。放射性ヌクレオチドは、例えばＤＩＩＡシンセサイザーを使用することによって、ＤＮＡポリメラーゼ　ｌによるニックトランスレージジンによって、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼでプローブ、の３°末端に放射性ＤＮＡ塩基を付加することによって、放射性デオキシヌクレオチド、ｄＮＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントで特異的な挿入物を有する一１１ｍ　旧３プラスミドを処理することによってか、または放射性リボヌクレオチド、ｒＮＴＰの存在下対応するＲＩＩＡポリメラーゼ（例えば、ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼ）を使用して特異的なＲＮＡウィルスプロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター）を含有するベクターからＲＮＡを転写することによって、プローブ内に導入することができる。

プローブは放射性ヌクレオチドを使用して標識することができる。その際、アイソトープはヌクレオチド分子の一部として存在しているか、または放射性成分は、無機酸のような放射性成分、例えばＩｌｐりん酸塩または１００有機酸にエステル化されているかまたは標識に結合基を提供するようにエステル化されている末端水酸基によってヌクレオチドに付加されている。求核性結合基、例えば１級アミノ基を有する塩基類似体もまた標識に結合できる。

非放射性プローブはしばしば間接的な方法で標識される０例えば、リガンド分子はプローブに共有結合する。

次いで、該リガンドは、本来的に検出可能であるかまたは酵素、フルオロフォールまたは化学ルミネセンス化合物のような検出可能なシグナル系に共有的に結合しているかのいずれかである抗−リガント分子に結合する。リガンドおよび抗− リガントは広範に変動することができる。リガンドが天然の抗−リガント、即ちビオチン、ヂロキシンおよびコルチゾールのようなりガントを有する場合、標識された天然生起の抗−リガントと一緒に使用することができる。或は、任意のハプテン化合物または抗原性化合物を抗体と組み合わせて使用することができる。

プローブは標識と直接組み合わせることによって標識することらできる。例えば、クローニングされたＤＮＡプローブは西洋ワサビのペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼに直接結合しており（Ｒｅｎｚ、　Ｍ、　　およびＫｕｒｚ、　Ｋ、、ＤＮ＾ハイブリッド形成用の比色法、　ｌ１ｕｃ。

＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３４３５〜３４４４．１９８４）、そして合成オリゴヌクレオヂドはアルカリフォスファターゼと直接結合している（　Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ、　Ｅ等、オリゴデオキシヌクレオチド−アルカリフォスファターゼ抱合物の調製およびハイブリッド形成プローブとしての使用、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｇ。

１４：６１１５〜６１２８．１９８６並びにＬｉ　Ｐ、等、酵素を結合した合成オリゴヌクレオチドプローブ：糞標本中の腸内毒素性大腸菌の非放射性検出、Ｎｕｃ、＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、■：５２７５〜５２ｇ？（１９ｇ？））。

標識として重要な酵素は第一義的には、フォスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼまたはオキシドリダクターゼのような加水分解酵素、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物にはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等がある。化学ルミネセンスにはルシフェリンおよび２．３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えばルミノールがある。

ハイブリッド形成条件約２０から６０８Ｍ１％まで、好ましくは３０％の極性６機溶媒からなる種々のハイブリッド形成溶液を使用することができる。１ｉ１ｉ常のハイブリッド形成溶液は約５０％（Ｖ／Ｖ）のホルムアミド、約０．５〜ＩＭの塩化ナトリウム、約０．０５〜ｏ、ｉＭの緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ピベス（ＰＩＦＥＳ）またはヘペス（ＩＩＥＰＥＳ）　（ｐＨ範囲、約６〜９）、約０．０５〜０．２％の洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、　または０．５〜２０ｍＷのＥＤＴＡ、フィニル（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）および血清アルブミンを使用する。

典型的なハイブリッド形成溶液には約０．１〜５　＠ｇ／ｍｌの非標識キャリヤー核酸、　フラグメント化した　核酸ＤＮＡ、例えばウシ胸腺若しくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ。

および任意に約０．５〜２％（曹／Ｖ）のグリシンも含まれる。

種々の極性の水溶性剤または膨潤剤、例えばポリエチレングリコールを含有する容積排除剤、ポリアクリレート若しくはポリメチルアクリレートのような陰イオン性ポリマー、および硫酸デキストランのような陰イオン性す・カロイドボリマーのような他の添加剤も含有することができる。

約２〜４滅、好ましく３ＭのＧｕＳＣＮ、約０．０１〜０．１Ｍのトリス（ｐＨ範囲、約６．０〜８．５）、約０．１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度のドデシル硫酸ナトリウムのような洗浄剤お上び０，０１〜０．１ＭのＥＤＴＡからなる別のハイブリッド形成溶液を使用することができる。他の添加剤、例えばキャリヤーＤＮＡ若しくはＲＮＡ、　または子ウシ血清アルブミン若しくはゼラチンのようなタンパク質を含有することらできる。ハイブリッド形成溶液の厳密性は約０−１０％、通常は５％のホルムアミドで調節することができる。

特別のハイブリッド形成技術は本発明には必須ではない。ハイブリッド形成技術は一般的には、核酸ハイブリッド形成：　プラクチカルアプローヂ　（ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ）、ヘーメス（ｆｌａｍｅｓ）　Ｂ、　Ｄ、およびヒギンス（ｌｌｉｇｇｉｎｓ）　Ｓ、　Ｊ、編、　ＩＲＬプレス、１９８７　、ガル（Ｇａ１１）およびパーデｓ　−（１’ａｒｄｕｅ）　（１９６９）、Ｐｒｏｃ、　１ｌａｔ１．＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、６３：３７８〜３８３並びにジョン（Ｊｏｈｎ）、バーンスタイル（ｌ１ｕｒｎｓＬｅｉｌ）およびジローンズ（Ｊｏｈｎｓ）（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ、　２２３：５８２〜５８７に記載されている。ハイブリッド形成技術で改良がなされるのに伴って、それら技術は容易に適用できる。このような改良の１つは１９８７年１２月９日に提出した出願番号第１３０．７５４号、本発明者の文書記録１１６５２〜１１６５５　（参照文献として本明細書に組み入れる）の主題であり、これはハイブリッド形成速度を高めるために超音波エネルギーを使用することに関するものである。この改良は本明細書に記載したプローブの特異性に影響を与えない任意の段階である。

ハイブリッド形成溶液中に存在する標識プａ−ブの量は、標識物の性質、標的細胞核酸に合理的に結合し得る標識プローブの量およびハイブリッド形成媒体および／または洗浄媒体の厳密性によって非常に広範に変動することができる。一般的には、標的核酸の化学量論的量を実質的に超えるプローブが、標的ＤＮＡへのプローブの結合速度を高めるために使用される。

ハイブリッド形成に関する種々の厳密度を使用することができる。ハイブリッド形成条件が厳しくなるにつれて、デュプレックスを形成させるためにはプローブと標的間の相補性の程度が大きくならなければならない。厳密度は温度、イオン強度、ｐＨおよびホルムアミドのような部分的変成溶媒の存在によって制御することができる。

例えば、ハイブリッド形成の厳密性は、ホルムアミドのＱ　ＩＫを０％から５０％までの範囲内で操作して反応溶液の極性を変えることによって好都合に変更される。使用する温度は一般に約２０＠から８０℃の範囲、通常は３０１から７５ ℃の範囲内である。５０％のホルムアミド中１５〜５０４［Ｉ　ノヌクレオチドプローブでは、最適温度範囲は２２１から６５℃まで変動することができる。定型的な実験では、満足のゆくハイブリッド形成を室温で可能にする条件を典型的に決定することができる。

本発明で使用するアッセイ試験プロトコールは核酸ハイブリッド形成の分野で慣用のらのであり、標的とプローブポリ核酸が共に溶液となっている単−相ハイブリッド杉成および標的かまたはプローブポリ核酸かのいずれかが固定支持体に固定されている混合相ハイブリッド形成の両者が含まれる。アッセイ試験プロトコールは変動するので本発明を限定するものとは考えられない。単−相ハイブリッド形成の一般的総説は核酸ハイブリッド形成：プラクチカルアブローチ、ヘーメスＢ、　Ｄ、およびヒギンスＳ、　Ｊ、編、ＩＲＬブレス、１９８５および固体支持体に固定した核酸のハイブリッド形成、メインコス（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ）　Ｊ、　　およびワー　（ｆａｈ）　Ｇ、、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｓｉｓＬｒｙ、　　２３８．２６７〜２８４頁、】９８４を読むことによって得られる。

細菌の培養コロニーはコロニーハイブリッド形成技術を使用してアッセイすることができ、その際口内病原性が疑われる細菌は標的ポリヌクレオチドに暴露する前にフィルター上に平らにおいて吸着させる（　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎおよびｌｌｏｇｎｅｓｓ％Ｃｏ１ｏｎｙ　ＩＩｙｂｒｉｄｉｚａＬｉｏｎ　ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒＥｎｚｙｓｏｌｏＨｙ％Ｒａｙ　Ｗｕ編、］９７９．６８巻。６８，３７９〜４０９頁、並びにＰｒｏｃ、　ＮａＬｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、υ 、Ｓ、Ａ、、７２巻、Ｎｏ、　１０：３９６１〜３９６５．１９７５）。　コロニーは、核酸を電気泳動で分離しそして病原性口内細菌の種を識別するために設計したプローブに分離した種を暴露することによって同定することもできる。リポソームＲＮ＾はアルウィン（＾１冑１ｎｅ）Ｊ、　Ｃ，等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、、７４（１２）巻：５３５０〜５３５４（１９７７）の方法を使用して検出することができる。　リポソームゲノム領域を有するＤ）ＩＡの電気泳動分離技術は１０２１３１０１０７：（に記載されている。

本来のハイブリッド形成法も本発明に適用可能である。・本来のハイブリッド形成とは、ポリヌクレオチドプローブを使用する細菌細胞の同定のことを言い、その際無傷細胞が固定化されて標的として提供される。下記の２つの総説：ジンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）　Ｒ，Ｈ，等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。

４（３）：　　２３０〜２５０（１９８６）および　ハーセ（Ｈａａｓｅ）等、ＭｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｖｊｒｏｌｏｇｙ、４巻、１８９〜２２６頁（１９８４）は本来のハイブリッド形成技術分野の概論を提供しており、本明細書に参照文献として入れる。

ＧｕＳＣＮ−溶解細菌から得た核酸はニトロセルロースまたはニドラン（Ｎｙｔｒａｎ）に直接固定化して適当なプローブとハイブリッドを形成させることができる。ＧｕＳＣＮ−溶解物はホルムアルデヒド含有緩衝液で希釈し、ニトロセルロース上に配ダリしく５ｌｏｔ）、そして８０℃で加熱して核酸を変性さ０る。

アッセイ試験プロトコールの使用に拘わらず、細菌細胞は中程度の温度で長時間ハイブリッド形成溶液に接触させたままにしておくべきである。単相アッセイでは、二！ｒ［鎖デュプレックスは、Ｓ１ヌクレアーゼ消化の後デュプレックス分子を析出させるかまたはヒドロキシアパタイトと結合させて一重鎖核酸から分離することができる。

混合相アッセイでは、支持体に固定した核酸を、ハイブリッド形成溶液で提供されたような、同様な濃度の塩化ナトリウム、緩衝液および洗浄剤を有する洗浄溶液中に入れる。洗浄溶液中で支持体を維持する時間は数分から３時間またはそれ以上まで変動させることができる。

ハイブリッド形成かまたは洗浄媒体かのいずれかが厳密であることができる。典型的には、混合相アッセイでは、最もしばしば厳密性を決定しそして誤った組み合わせのデュプレックスの解離を促進するのは洗浄溶液である。希釈した緩衝塩化ナトリウム溶液を用いて室温で支持体を１すいだ後、標識の性質に従ってデュプレックスの存在を支持体でアッセイすることができる。

標識が放射性である場合、プローブの存在はシンチレーシ９ンカウンター中で検出することができる。更に好都合には、混合相アッセイでは基質を乾燥して慣用のオートラジオグラフィープロトコールの任意の番号のＸ線フィルムに暴露することができる。。

標識が蛍光性である場合、試料を先ず特別の波長の光で照射して検出する。試料はこの光を吸収し、次いで検出器によってキャッチされる　別の波長の光を放つ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　Ｆｒｏｆｆｅｌｄｅｒ、　Ｄ、、ｙ、　ｎ。

Ｆｒｅｅｍａｌ　＆　　Ｇｏ、、　５３７〜５４２頁、　１９８２）。

標識がハプテンまたは抗原である場合、試料は抗体を使用して検出することができる。これらの系では、シグナルは蛍光分子または酵素分子を抗体に付加させて生じさ仕る；場合によっては抗体は放射性プローブで標識する＊　　　（Ｔｉｊｓｇｅｎ、　　Ｐ、、　ＰｒａｃＬｉｃｅ　　ａｎｄ　　Ｔｈｅｏｒｙ　　ｏｒ　　　εｎｚｙ＊ｅ１ｍｓｕｎｏａｓｓａｙｓ、生化学および分子生物学における実験室技術、Ｂｕｒｄｏｎ、　　Ｒ，Ｒ，ｖａｎ　　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、　　Ｐｈ、　Ｈ，、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ編、９〜２０頁、１９８５）。

１つの検出方法はビオチンと組み合わせた酵素検出である。蛍光は選択的標識であるが、ビオチン化したペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼのようなアビジンまたはストレプトアビジンと組み合わせた酵素標識が好ましい。酵素と抱合したアビジンまたはストレプトアビジンは酵素をプローブに直接結合させて使用することもできる（Ｉｌａａｓｅ等、上記）。好ましい酵素はペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼである。

特に好ましい方法ではプローブに直接抱合した酵素が使用される。好ましい酵素はアルカリフォスファターゼおよびペルオキシダーゼである。酵素をオリゴヌクレオチドと抱合させる方法は既知である。Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、１４：６１１５　””　６１２８８（１９８６）および１ｌｕｃ１．　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ＋＋、、１５：５２７５〜５２８７（１９８７）。

好ましいアブセイプロトコールは試料を培養しないで直接試験することに関するものである。これらのプロトコールは、本発明が特別の適用を有している感受性を更に必要とする。口の病原性細菌を有していると思われる試料は先ず、洗浄剤と２価金属キレート剤の緩衝溶液、または洗浄剤、還元剤および２価金属キレート剤を含有するカオトロピック塩緩衝溶液のような溶解溶液に付す。

この試料は直接支持体に固定するかまたは核酸を抽出するように更に処理することができる。放出されるかまたは抽出された細菌核酸（標的核酸を含有している）は、セルロース、ナイロン、ニトロセルロース、ジアゾベンジロキシメチルセルロース等のような固体支持体に固定する。

好ましい例では、　アブセイブロトコールは　サンドウィッチタイプのアッセイである。サンドウィッチタイプアッセイの主要な構成要素は固体支持体である。

固体支持体は、標識されておらずそしてｒＲＮ＾配列の１部分に相補的である固定化された核酸プローブを吸着しているかまたは共有結合している。表４に示したような、二次的および三次的相互作用が最小であるリポソームＲＮ＾の領域とハイブリッド形成するようなプローブが好ましい。

このようなプローブの利点は、ハイブリッド形成が試料核酸を加熱変性する追加的工程を用いないで実施できることである。次いで、口の病原性細菌を含有している疑いのある試験試料をハイブリッド形成媒体中の固体支持体と接触させる。

最後に、病原性細菌のｒＲＮＡの異なる配列と相補的な、可溶性の標識をした第２のプローブを固体支持体上の固定核酸プローブとハイブリッド形成デュプレックスを作っているｒＲＮＡとハイブリッド形成させる。

次いで、使用した標識に従って細菌の存在を測定する。第２のプローブを試験試料と同時にハイブリッド形成アッセイに添加することができることに注目すべきである。更に、第２のプローブはｒＲＮＡの不変領域かまたは超可変領域かのいずれかとハイブリッド形成することができる。二次的および三次的相互作用が最小であるリポソームＲＮＡ　（表４）、例えば１６ＳリポソームＲＮＡではＵＰ７ＢまたはＵＰ９＾、そして２３ＳリポソームＩＩＩＮＡではυＰＩ　２１１または２３［ＩＰＨの不変領域に由来するプローブが好ましい。　このようなプローブの利点は、核酸を加熱変性する工程を追加することなくハイブリッド形成が実施できることである。種々の検出方法の一般的な参照文献は、ヘーメスＢ、　Ｄ、およびヒギンズＳ、　Ｊ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉ− ｚａＬｉｏｎ、　　ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８５中に見ることができる。　ＤＮＡプローブを用いる　サンドウィッチアッセイの参照文献は　デュン（Ｄｕｎｎ）およびハラセル（ｔｌａｓｓｅｌｌ）、Ｃｅ１ｌ、　１２＠、２３〜２６頁、１９７７並びにランキ（Ｒａｎｋｉ）等、米国特許第４．４８６．５３９号である。

本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド酸プローブは、口の病原性細菌、特に表１に開示した種の存在または不存在を迅速に決定するために使用できるキット中に含めることができる。キットはこれら細菌の存在をアッセイするのに必要な全ての構成要素を有してハイブリッド形成用の乾燥形紡かまたは液体形態のハイブリッド形成溶液、並びに所望しないデュプレックスとなっていないポリヌクレオチドの洗浄および除去用の溶液、標識されたデュブプレクス検出用の基質、および任意に、標識検出用の器具を　有している。

本発明の更に特別の実施態様にはサンドウィッチアッセイの概念を利用するキットが包含される。このキットは、患者の口から試料を採集するための第１の成分、例えばかき取り器具または紙魚、収容用バイアル、並びに試料の分散および溶解用の緩衝液を有している。第２の成分は標的およびプローブポリヌクレオチドのハイブリッド形成用並びに所望でなくそしてデュップレクスとなっていない形態のものを洗浄によって除去するための乾燥状態かまたは液体状の媒体を打している。第３の成分は、試験される細菌種の１６３　ｒＲＮＡかまたは２３Ｓ　ｒＲＮＡかのいずれかの１部分に相補的である非標識核酸プローブが固定化されるかまたは抱合される固体支持体を有している。複数の標的分析の場合には、それぞれリポソームＲＮＡ自体に特異的である１つ以上の捕獲プローブは、探索棒の種々の非連続領域に適用される。第４の成分は、第３の成分の固定化され標識されていない核酸プローブがハイブリッド形成する同一のｒＲＮＡｌｌの第２の異なる領域に相補的である標識プローブを有している。本明細書に記載したプローブ成分は、凍結乾燥した核酸のような乾燥形襲若しくは、アルコール析出した核酸のような沈殿形態または緩衝液中のプローブの組み合わせ物を含んでいる。標識は上述した任意の標識が可能である。例えば、プローブは慣用の手段を使用してビオチン化することができ、ビオチン化したプローブの存在は、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素と抱合したアビジンを添加して検出することができ、次いで、該プローブは、ペルオキシダーゼと反応したときに目でモニターするか比色計または分光光度計による器具使用によってモニターすることができる基質と接触させることができる。この標識化方法および他の酵素タイプの標識は経済的であり、高感受性であり、そして放射性標識方法と比較して比較的安全であるという利点を存する。標識プローブを検出する種々の試薬並びに、指示、陽性および陰性対照、そして種々の成分を処理し、混合し、反応させる容器のようなキット用のその他の材料によってアブセイキットは完備されよう。

以下の実施例は説明のために提供するものであって限定するものではない。

細菌細胞は溶解溶液（２０ｍｇ／ｓｌ　リゾチーム、２５％庶糖蔗糖０５Ｍ　トリス、ｐＨ８，１０＋＊Ｍ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ドデシル硫酸ナトリウム（１〜２％（Ｖ／Ｖ）　）およびプロナーゼＥ（ＩＢ／＋ｅｌ）またはブロテイナーゼＸ　（２００μｓ／ｍｌ）を加え、そして溶液を３７℃で３０分間インキュベートする。溶解物はフェーノール：クロロホルム（１：　ｌ、ｖ／ｖ）で　２回抽出し、次いでエタノールで析出させる。核酸はベレットにし、７０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールで洗浄し、　そしてｌ×丁Ｅ緩衝液（１０μＭ）リス、ｐｌ＋８、ｌ■Ｍ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁さけて約Ｉ−ｇ／ｍｌとする。　再懸濁核酸は一７０℃で貯蔵する。

１（、オリゴヌクレオチド配列付加プライマーｒＲＮＡ用の普遍的な配列付加ブライマー（Ｕｌ’）は、レーン等が記載した（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、＾１．８２．６９５５〜６９５７　（１９８５））とおりのものであった。本明細古でＬＩＰ４Ｂ１Ｕｒ’８ＢおよびＵＰ６Ｂと称し、そして下記配列ＵＰ４Ｂ：　ＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧＦＵＰ８Ｂ：　ＣＡＣＧＡＲＣＴＧＡＣＧＡＣＡＲＣＣＡＴＧＣ；ＵＰ６Ｂ：　　ＴＡＣＧＧＮＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ；を有する更に３つのプライマーを設計して配列決定用に使用した。

Ｃ２配列決定反応配列決定のプロトコールは、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、　Ｆ。

等によって記載され（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、Ｓ、＾４．７４．５４６３〜５４６７　（１９７７））、レーン等によってｒＲＮ＾鋳型用鋳型台させた　（Ｐｒｏｃ、　１ｌａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ 、Ｓ、Ａ、、８２．６９５５〜６９５９　（１９８５））、　ジデオキシヌクレオチド終結鎖伸長法を修正したものである。配列付加ブライマーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してａｌｐ−＾ＴＰで放射線的に標識した（５０μＣｉ　”Ｐ−＾丁Ｐ、　　３０００Ｃｉ／膳菖ｏ１．オリゴ３０１１１ｎｇおよびキナーゼ１０ユニツト当たり）、、放射線的に標識したプライマーはエタノールで析出させ水に再懸濁して３０μｇ／ｍｌとした。

標準的な配列決定反応は次のようにして行われる。プライ？−２ｕ（ｌを細菌核酸溶液（０，５〜２５ｍｇ／ｓｌ）　３　ｕ　（１゜５ＸＩＩＹＢｇ衝液（５００５Ｍ　ＫＣＩ、　２５０ｍＭ　トリス−Ｉｔｃｈ　ｐＨ８，５）２μｅおよびＨ，０３μＱ１に加える。混合物を１００℃で２分間加熱し、次いで室温まで冷却する。この混合物に、５ｘ　ＲＴａｌ衝液（２５ｈＭ　トリス−ｔｌＣＩ、　ｐＨ１１，３，２５（ｌｓＭ　ＫＣＩ、５０−Ｍジチオスレイトール、　５０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ）　４　ｐ（１，ＩＩ、０５ｕ（ｌおよび逆転写酵素（２００１Ｊ／ｌｔ　（２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｏａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　メリーランド州　ガイザースバーグ）２μｅを加える。３μｇの分別量をピペットで採取してデオキシヌクレオチド／ジデオキシヌクレオチド混合物（Ａ＋１７μＭ　ｄＡＴＰ、　３００ＢＭ　ｄＣＴＰ、　３３０ＢＭ　ｄＧＴＰ、　３３０ＢＭ　ＴＴＰ。

１２５８Ｍ　ｄｄＡＴＰ、　Ｃ：　３３０ＢＭ　ｄＡＴＰ、　ＩＴμＭ　ｄＣＴＰ、　３３０μＭｄＧＴＰ、　３３０ＢＭ　ＴＴＰ、　１２５μＭ　ｄｄＣＴＰ、　　Ｇ　：　３３０ＢＭ　ｄＡＴＰ。

３３０μ−ｄＣＴＰ、　１７μＭ　ｄＧＴＰ、　３３０ＢＭ　ＴＴＰ、　２５０ＢＭ　ｄｄＧＴＰ。

Ｔ：　　　３３０Ｂｌｉｄ＾丁Ｐ、　　３３０ＢＭ　　ｄＣＴＰ、　　３３０μ 　Ｍ　　ｄＧＴＰ、　　１７μ　ＭＴＴＰ、　＋２５μＭ　ｄｄＴＴＰ）　２μ Ｃ中に入れる。反応は４３℃で１５分間インキュベートする。チェイス（ｃｈａｓｅ）　（３３０μＭｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ％ｄＧＴＰ、　ＴＴＰプラス逆転写酵素４００ユニット）２μｅを各反応に加える。反応は更に４３℃で１５分間インキュベートして、負荷溶液　（９５％ホルムアミド、２．５％キシレンシアツール、　２．５％ブロムフェノールブルー）６μｇを添加して終結させる。反応生成物は８％のポリアクリルアミド変性ゲル上で電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーで視覚化した。配列決定反応はまた上述の方法と類似した反応条件下で非標識配列付加ブライマーおよび［′ｓＳ］ｄＡＴＰを使用して実施することもできる。

オリゴヌクレオチドは　β−ノンアノエチルホスフォールアミダイト化学よってアプライドバイオシステムのＤＮＡシンセサイザーモデル３８０Ｂで合成した。

オリゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲル電気泳動によってかまたは高圧液体クロマトグラフィーによって精製しアプライドバイオシステムのユーザーブレチン１３号：　［合成オリゴヌクレオチドの計価および精製Ｊ　、１９８４年１１月９日、に詳記されているようにして溶離した。好ましい配列は表１を参照。

次の方法がキューレットかき取り物かまたは培養細菌のいずれかに適用可能である。試料（−７０℃で貯蔵）５００μａは次の段階で解凍して直ちに処理する。

試料がプラク試料または希釈細菌試料である場合、非関連キャリヤーオリゴヌクレオチド（２４塩基）　１１００ｎを試料に加える。蔗糖溶解緩衝液（７５％（ｖ／ｖ）滅菌蔗糖、ｉｏ＋ｓＭ　ＥＤＴＡ。

１０■Ｍ　ＥＧＴＡ、　５０＠Ｍ　トリス−１１ＣＩ　（ｐＨ８，０））　２５０μＣを試料に加え手短にうず巻状に撹拌する。新たに作成したリゾチーム（０，２５Ｘ細菌庶糖溶解緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ、ＳｉｇｓａＣｈｅｍｉｃａｌ）　５０μｍ２を加え、そして試料を３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、１０％ＳＤＳ　７５μａを加え、試料を手短にうず巻状に撹拌する。プロナーゼＥ’（ｌｏｓｇ／ｍｌ。

Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ；　Ｍａｎｉａｔｉｓ等、分子クローニング：実験室マニュアルに従って自己消化した）７５μｇを加え、試料を手短にうず巻状に撹拌して、３７℃で３０分間インキュベートする。試料はフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：２４二１　、ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出して、水性相をとっておく。中間相が澄明でない場合、クロロホルムで再び抽出して水性相をとる。次いで、試料は凍結乾燥して３００Ｍｇにまで濃縮し、　これに７．５Ｍ　Ｆｌｌｌ、ＯＡｃＡｃ溶菌溶液１５０μ 加える。次いで試料を混合して一７０℃で３０分間またはそれ以上貯蔵して核酸を析出させ、そしてペレットは４℃で１０分間遠心して回収する。核酸ベレットは９５％エタノール１．５１で１度洗浄して手短に乾燥し、次いでＴＥ滅菌緩衝液（１０ｘＭ）リス−１１ＣＩ　ｐＨ７．５、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）　４００ｕ　Ｑに再懸濁する。

Ｆ．　ａ）核酸のニドラン膜への固定化抽出した細菌核酸は次のようにしてニドラン上に固定化する，　　ＴＥ中の核酸（　６　ｕ　ｇ／３８０ｓ１未満）３８０μｅおよび２００ｓｌｌピベス（ｐｌ’ｌ　７．４２）　２０μｅを混合してピペスの最終濃度を２０−關とする。試料を１００℃に９０秒間加熱し、氷／水浴中で速やかに冷却し、次いでンユライヒャーアンドシュウエル（　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　）にューハンプシャー州キーネ）のスロットプロット装置を使用してニドラン膜上に適用する。スロツティングは２０分間の加熱処理内に終了すべきである。スロットは１０ｘ　ＳＳＣ　（　１．５ＭＮａＣｌ、０．　１５１１クエン酸ナトリウムｐＨ７、Ｑ）　２００μ＋で洗浄し、固定化した核酸を有するニドラン膜は８０℃で１時間焼き、ニドラン膜は吸収紙の間で室温で貯蔵する。

ＦＪ）ニトロセルロース膜への細胞溶解物の直接的固定培養した細菌またはプラク検体の細胞ベレットは、３Ｍ　ＧｕＳＣＮ，　２％　（Ｗ／Ｖ）サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、５０ｄ　トリス−１１ＣＩ　（　ｐＨ７．６）　、１　０ｍＭ　ＥＤＴＡ，および１％（Ｖ／Ｖ）メルカプトエタノールの１００μｅに再懸濁し、そして室温で１０分間インキュベートする。この溶液に０．３容量の２０　Ｘ　ＳＳＣ。

次いで３７％ホルムアルデヒド０．２容量を加えて、５５℃で１５分間インキュベートする。　１５ＸＳＳＣ中で連続希釈し、そして核酸溶液をニトロセルロース（予め水で濡らし、５ｘｓｓｃ中に１０分間浸す）上にスロットする。このフィルターを真空下８０℃で２時間焼き、吸収紙の間で室温で貯蔵する。

プローブはマニアチスＴ９等、分子クローニング；実験室手引書、　ニューヨーク州　コールドスプリングハーバ−１１９８２によるポリヌクレオチドキナーゼ（　２００ｎｇのオリゴヌクレオチド、６０ｔＩＣｉ　”Ｉ’−ＡＴＰおよＵ２５μ（１Ｂ５に中４０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ）によって■ｐで標識し、エタノール析出およびエルチップ（　ＥＩｕＬｉＰ）　−　Ｄクロ？トゲラフ４　−　（　５ｃｈｌｅｉｄｈｅｒ　ａｎｄＳｃｈｕｅｌ　Ｉ　）によって精製する。或は、プローブはＮｌｌ５−ＬＣ−ビオチン（　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．イリノイ州ロックフォード　）でビオチン化した５° 末端のエチルアミン基で合成し、エルチップ−Ｄクロマトグラフィーで精製する。

ニドランまたはニトロセルロース器上に固定した核酸は０、６Ｍ　ＮａＣ１，　　９０ｍＭ　）リス−１１ＣＩ　（　ｐＨ８．０）、１０ｘＭ　ＥＤＴＡ、５Ｘデンハルト（　ＤｅｎｈａｒｄＬ）溶液、３０％脱イオン化ホルムアミド、　０．１％ＳＤＳおよび１００μｍ／１のフラグメント化した酵母ＲＮＡ中４２℃または０．９Ｍ　ＮａＣ１，　９０ｓｋｌナリスー１１ｃＩ（ｐＨ８．ｏ）、１０５Ｍ　ＥＤＴＡ，　５　Ｘデンハルト溶液、０．１％ＳＤＳおよび１００μｍ／ＩＩのフラグメント化した酵母ＲＮＡ中５０℃で５　Ｂ／ｍｌのオリゴヌクレオチドプローブと　ハイブリッド形成させる。ハイブリッド形成は５０−１のポリプロピレン管中または密封した「ミクロシール（　ｒ　Ｍｉｃｒｏ−３ｅａｌ　Ｊ　）プラスチックバッグ（　Ｄａｚｅｙ　Ｃｏｒｐｌ、カンザス州インダストリアルエアポート）を用いて回転振とう器上適当な温度で１時間またはそれ以上実施した。膜は先ず０．０９Ｍ１ｔａｃ１，　　９ｍＭ　トリス−ＲＣＩ　（　ｐ［、ｏ）、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳ中室温で洗浄し、次いで同一の洗浄緩衝液中５０℃で洗浄した（厳密な洗浄）。別の厳密な洗浄は３．１Ｍテトラエチルアンモニウムブロマイド、５０廁滅トリス−ＩＩＣＩ（ｐｌ＋８．０）、２　ｍＷ　ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＯＳを用いて２９℃で実施することができる（この方法では、テトラエチルアンモニウムブロマイド洗浄に先立って，　０．９１１　１１ａＣ１，　９０　ｖｈＭトリス−１１ｃＩ　（　ＰＩＩ８．０）、１０■關ＥＤＴ＾による前洗浄が必要である）。

方法Ｂ膜上に固定化した核酸は、　３　Ｍ　ＧｕＳＣＮ，　５％ホルムアミド、５ＧＩＩＭトリス（　ｐＨ７．６）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，　２％サルコシル中で方法Ａで記載したようにして０．５〜２４時間５　ｎｇ／＠１のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させる。この膜は、０．０９Ｍ　ＮａＣｌ、’Ｊ＋Ｍ）リス−〇ＣＩ　（　ｐＨ８．０）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液を用いて室温で２分間２回洗浄する。”ｐａａプローブを使用したとき、核酸はオートラジオグラフィーで視覚化した。ビオチン化したプローブを使用するとストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼまたはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼとのインキュベージタン、次いで実施例２に記載する発色が必要である。

Ｈ．ハイブリッド形成プローブの検出ａｌｐで標識したハイブリッド形成プローブはオートラジオグラフィーで検出した。ビオチン化プローブはブチクーアルク（　Ｄａｔｅｋ−ａｌｋ）キット（アビジン−アルカリフォスファターゼ；　Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅ鵬、ニューヨーク州ニューヨーク）またはＤＮＡ検出キット（　ストレプトアビジン／ビオチン化アルカリフォスファターゼポリマー：ＢｅＬｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、メリーランド州ガイザースバーグ）で検出した。

■、二次的および三次的相互作用が最小の領域に相補的１６Ｓおよび２３ＳリポソームＲＮ＾の予測される二次構造によるヌクレオチドの化学的および酵素的利用可能性を観察した。モアズド（Ｍｏａｚｅｄ）　Ｄｏ等（１９Ｈ）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

１８７：３９９〜４１６゜ノラー（ｌｌｏｌｌｅｒ）　Ｉｆ、　Ｆ、等（１９８１）ＮｕｃＪｅｉｃ＾ｃｉｄｇ　Ｒｅｓ、　９：６１Ｂ７〜６１８９゜　しかし乍ら、相補的オリゴヌクレオチドプローブに対するこれら領域の利用可能性は予測可能でない。　ラザスタ−（Ｌａ５ａｔｅｒ）　　Ｌ、　Ｓ、等（１９８ｇ）　ＢｉｏｅｈｅｍｉｓＬｒｙ　２８：４６８７〜４６９５゜二次的および三次的相互作用が最小であるリポソームＲＮＡ　Ｑ′）領域は溶液ハイブリッド形成およびサンドウィッチ　アッセイ法によって特定される。例えば、精製したリポソームＲＮＡ（１〜５　ｕ　ｇ）　１．ｔ　Ｏ，０９Ｍ　ＮａＣ１，９１ＩＩＩ）　’）　ス−１１ｃＩ（ｐｌ＋８．０）およびＩ　ｍＷ　ＥＤ丁＾、または３　Ｍ　ＧｕＳＣＮ、　２％サルコシル、５゜−關　トリス−＋１ＣＩ　（ｐＨ７，６）、ｌ０ｍＭ　ＥＤＴＡ１１％メルカプトエタノールおよび５％ホルムアミド中、ｔａｐで棹識した表１および表２のような相補的オリゴヌクレオチドプローブ（５〜１Ｏ＊ｇ）とハイブリッド形成させた。

１５分間から１時間ハイブリッド形成さゼた後、試料をアガロースゲル電気泳動に付して１６Ｓおよび２３ＳリポソームＲＮＡサブユニツトを分離し、　そしてオートラノオグラフィーでオリゴヌクレオチドプローブ：　ｒＲＮＡハイブリッドを視覚化させた。それぞれのリポソームＲＮＡサブユニットに特異的なハイブリッド形成を示したオリゴヌクレオチドプローブはサンドライブチアッセイ方式で更に試験した。この方式では試験オリゴヌクレオチドプローブは固体支持体に共存結合させた。標的リポソームＲＮ＾は試験オリゴヌクレオチドおよび０Ｐでｖ！Ａ識したシグナルオリゴヌクレオチドプローブ、例えば１６ＳリポソームＲＮＡではＵｒ’７Ｂ若しくはＵＰ９Ａまたは　２３ＢリポソームＲＮ＾ではＵＰ１２Ｂ若しくは２３ＵＰＨの存在下、上記方法Ｂで記載したＧｕＳＣＮハイブリッド形成溶液を使用してハイブリッドを形成させた。２〜１５時間ハイブリッド形成させた後、固体支持体からハイブリッド形成していない核酸を洗い流し、そして試験オリゴヌクレオチドプローブによって捕獲されたリポソームＲＮＡの量を液体シンヂレーシジン計数で定量した。

実施例２オリゴヌクレオチドプローブにアルカリフォスファターゼが直接抱合すると、酵素と間接的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ビオチン化したプローブ）を使用するアッセイ法に必要な幾つかの段階か省略される。

短いプローブへのアルカリフォスファターゼの直接的抱合には異種二官能性試薬による抱合がかかわっている。

合成プローブは、末端５°−ヒドロキシルに付加するリンカ−アーム試薬を用いて本明細書に記載したようにして合成する。

末端アミノ基を有するアミノヘキシルリンカ−アームは、自動ＤＮＡシンセサイザーでの合成最終段階として合成オリゴデオキシヌクレオチドの５゛−ヒドロキシルに結合される。リンカ−アーム導入に使用される試薬は６−（メトキシトリチルアミノ）へキシル−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルフォスフオールアミダイトであり、これはＢ、　Ａ、　　コノリー（Ｃｏ１ｎｏｌｌｙ）、Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓＲｅｓ　、、１５：３１３１　（１９８７）が記載した、３−（メトキシトリチルアンミノ）プロピルメチル−１１，Ｎ−ジイソプロピルフォスフオールアミダイトの合成と同様にして６−アミノヘキサノールから製造する。リンカ−アームをプローブに結合させ、保護基を外したプローブはコノリー参照文献に記載された方法と同じようにして精製する。

オリゴヌクレオチドは先ず、チオール反応性剤トサクンンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｒｓｌＡＢＪ　）を用いてアミノリンカ−アームから誘導する。５ＩＡＩ３−オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド３００ μｇに５ＩＡＢ　１．２Ｂを添加し、室温で１時間インキュベートし、そして２０ｍＭりん酸すＩ・リウム（ｐＨ６，０）、５ａＭＥＤＴＡで平衡化させたＧ− ２５カラムで脱塩して製造する。このプローブ誘導体はアルカリフォスファターゼとカップリングさせることができ、以下に記載するようにして修飾される。

アルカリフォスファターゼはジチオビス（サクシンイミジルブロビオネート）　（ｒＤｓＰＪ　）を用いて　アルカリフォスファターゼ４ｍｇにＤＳＰ　８（ＩＱμｇを加えてチオール化する。室温で３０分間反応を進行させる。次いで、反応混合物は、ジスルフィドを還元するために室温で１５分間ジチオスレイトールで処理し、そして２０ｍ＋）ｌりん酸ナトリウム（ｐ）１６．０）で平衡化したＧ〜２５カラムで脱塩する。

５ＡＩＢ−オリゴヌクレオチドは、４：１のオリゴヌクレオチド：アルカリフォスファターゼ比でＤＳＰ−アルカリフォスファターゼと混合する。、５ＭＮａＣｌを反応に加えてＮａＣ１の最終濃度を３旧こし、　Ｉ）Ｈは　０．１容量のＩＭ）リス（ｐｒ（７，５）で７．５に調整する。カップリング反応は一夜（１６時間）進行させ、次いでＮ−エチルマレイミド（１Ｏ＊ｇ／■１を２μＱ）で停止させる。抱合体はＰｉｃｏカラムでゲルろ過によって遊離のオリゴヌクレオチドから分離し、そして遊離のアルカリフォスファターゼはＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーで除去する。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は先ずＮａ１Ｏ＊（１０４：　）ＩＲＰ、　１６０　：　１　）と処理して糖ジオールを酸化する。室温で１５分後、セファデックスＧ−２５でゲルろ過して１０、を除去し、これを１　園ｌｌ　ＩＩａＯＡｃ　（ｐＨ４，５）中２０ｍｇ／ｍ１未満にまで濃縮する。次いで、濃縮したＨＲＰを使用してダーヘキシルアミンリンカーアームを存する　オリゴヌクレオチドのベレットを再懸濁する。再懸濁した後、反応混合物のｐＨは炭酸塩緩衝液を用いて９．５に調整し、ＮａＢＬＣＮを加えて５０鵬旧こする。反応は室温で１６〜２０時間進行させ、生成物はＧＦ−２５０カラム（Ｄｕｐｏｎｔ）を使用してＩＩＰＬＣで分離する。プローブ−酵素抱合体は以下のようにして試験する。フッバクテリウム　ヌクレアタム（ＦｕｓｏｂａｃＬｅｒｉｕ層ｎｕｃｌｅａＬｕｓ）またはバクテロイデス　ジンジバリスのゲノムＤＮ＾を連続希釈してヒト胎盤ＤＮＡ中に入れ、加熱変性し、そしてニドラン膜上にスロブ）・状にして適用したｅ　　Ｂｇ−１Ｂ：ＩＩＲＰ　Ｃ３０％　ホルムアミ　ド、０．６Ｍ　ＮａＣｌ、　９Ｇ−Ｍ　　）　リＸ　−ＩＩＣＩ　（ａｌｌ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡおよヒ０．１％　　ＳＯ３中　１１００ｎ／ｍｌ）は　固定化したＤＮＡと室温で１時間ハイブリッド形成させ、ソＬ、　テ０．４５Ｍ　ＮａＣｌ、　４５ｍＭ　）すＸ　−ｆｌｃｌ　（ｐＨ８，０）、５μＭ　ＥＤＴＡ　（ＰＨ８，０）および０．１％ＳＤＳ中、５０℃テ２０分間洗浄した。洗浄溶液を除去し、基質溶液（１００−舅へペス　クエン酸−りん酸緩衝液（ｐＨ６，５）、９０ＭＭ３−メチルー２−ベンゾチアゾリノン　ヒドラゾン、６５Ｍ４−メトキシナフトールおよび４８Ｍ　ＬＯ＊または１９ｍＭ　９−アミノエチルカルバゾール、　１１００ａ　１ｔａＯＡｃ　（ｐＨ４，５）および７μＭｒｒ＊Ｏｘ）を加えた。ハイブリッド形成したプローブはバクテロイデス　ジンジバリスＤＮＡスロット上で　それぞれ青色または褐色の析出物として検出した。

Ｆｎ−ＩＢ：アルカリフォスファターゼまたはＢｇ−ＩＢ：アルカリフォスファターゼは、上記のようにして室温で１時間ニドラン膜とハイブリッド形成させた。この膜を上記のようにして洗浄し、基質溶液（７０％ジメチルホルムアミド中０．６ｎＭのニトロブルーテトラゾリウム、　Ｏ，１Ｍ　トリス−ＩＩＣＩ（ｐＨ９，５）中０．６＠菖の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート、　Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　ｌｌｌｇｃＬ）を加えた。ハイブリッド形成したプローブは、それぞれＰ、ヌクレアタムまたはＢ、ジンジバリスのＤＩ＾スロット上で青色析出物として検出した。

Ｂｇ−ＩＢ：ＩＩＲＰプローブとのサンドウィッチハイブリッド形成は次のようにして行った。ＰＢＳ　（ｌ５０−Ｍ　１ｌａｃｌ、ｌＯ勇關りん酸ナトリウム、ｐＨ７，０１）中のＢｇ−５Ｂ：５ＩＡＢプローブの濃度を変えて、システアミンで誘導したパル（Ｐａ１ｌ）イムノアワ４−１−ティー膜（Ｐａ１ｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｒ＋、ニューヨーク州イーストヒルズ）に固定した。この膜は、ＰＢＳ中パルイムノアフィニティー膜（０，２μの孔サイズ）をｌＯ鵬にのシスタミンと抱合させた後洗浄し、シスタミン−誘導膜をＤＴＴで処理（ｌｏｍｌｌｌ、　２５℃で３０分間）してシステアミン−誘導膜を作った。非−共有的に固定化したプローブは、ＰＢＳ中９０℃で加熱して上記膜から除去した。パル：Ｂｇ−５Ｂｌｌ！は、ＤＮＡ標的（Ｂｇ−５Ｂに相補的）およびＢｇ−Ｉ　Ｂ：ｌ　ＲＰ　　（Ｂｑ−ＩＢ：　５　’　ＧＡＡＴＡＡＣＧＧＧＣＧＡＴＡＣＧＡＧＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＡＴＧＴＡＣＣＧＴコー、ＡＧ）ゝ高P；ゝ゛ＴＡＡＧＣＡＴＣＧＧ１；ゝ゛ＴＡＡＧＣＡＴＣＧＧコ１％ホルムアミド、９１）＋ｋｌ　　トリス−ＩＩＣＩ　（ａｌｌ　８．０）　、１Ｇ＋ａｋｌ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＤＳ中４２℃で３０分間ハイブリッド形成させた。コンプレックスは、　　０．０９Ｍ　ＮａＣ１，９ｓＭ）リス（ａｌｌ８．０）、ｌ　ｍＭ　ＦＤＴＡ中５０℃で２０分間洗浄した。洗浄溶液を傾瀉し、４−クロロ−メトキンナフトール基質を加えた。室温で１５分間インキュベートした後、ハイブリッド形成したＢｇ−１＋１：ＩＩＲＰは、パル：　８ｇ５１３１１：ｌ上で青色析出物として検出した。同様にしてハイブリッド形成した精製Ｂｇ　１６ｓ　ｒＲＮ＾も、Ｂｇ−ＩＢ：ＨＲＰおよびパル：Ｂｇ５Ｂとのサンドウィッチハイブリッド形成によって検出した。

実施例３日、ジンジバリスの種々の濃縮物は３　Ｍ　ＧｕＳＣＮ、　５％ホルムアミド、５０＠Ｍ　トリス−ｎｃｌ　（ｐＨ７，６）、１０＋ＩＭ　ＥＤＴＡ。

２％サルコシルおよび１％メルカプトエタノールで溶解した。固定化したＢｇ− ５Ｂオリゴヌクレオチド０．１μｇを存するパル膜は溶解物中に浸し、室温で０．５〜２４時間ハイブリッド形成させた。膜は０．０９ｋｌ　ｌ１ａＣ１，９ｍＭ　）リス−ＴＩＣＩ（ｐＨ８，０）、１腸Ｍ　ＥＤＴＡおよびｏ、ｉ％ＳＤＳを含有する溶液で洗浄した。パル：　Ｂｇ−５Ｂ：ｒＲｌｌＡａは、ビオチン化したシグナルオリゴヌクレオチド１０〜１１００ｎ／ｇｉ１を含有するＧｕＳＣＮ／ホルムアミド溶解溶液中で再変ハイブリッド形成させ、０．５〜２４時間ハイブリッド形成させた。　使用したビオチン化したシグナルオリゴヌクレオチドはＵＰ７Ｂ、υＰ９＾およびＵＰ３Ａであった。膜は、０．０９　Ｍ　ＮａＣ１，９１１Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１８Ｍ　ＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳを含有する溶液で洗浄１．　タ。次イテ、膜は、（Ｊ、１８Ｍ　ＮａＣＬ　１ｇａｌｌトリｘ　−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、２　ｓＭ　ＥＤＴＡ、　０．５％ＳＤＳおよびＯ，１％ゼラチン中、アルカリフォスファターゼ（または西洋ワサビベルオキンダーゼ）のストレプトアビジン抱合体と共に室温で１５〜６０分間インキュベートした。インキュベージ２ン後、膜は３回、各回０．ＬＳＩ　ＮａＣ１，１８ｓｋｌ）リス−ｒｌｃＩ　（ｐＨ８，０）、２　ｍＷ　ＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳで１分間洗浄し、次いで２回、各回０．１８Ｍ　ＮａＣ１，１８ｓＭ）リス−〇ＣＩ　（ｐＨ８，０）および２−滅ＥＤＴＡで１分間洗浄し、そして最後に適当な基質緩衝液で１回洗浄した。実施例２に記載したようにして２つの酵素に対して発色させた。ハイブリッド形成したシグナルプローブはアルカリフォスフ１ターゼおよび西洋ワサビに対してそれぞれ褐色および青色スポットとして検出した。酵素およびハイブリッド形成条件によって、１×Ｊ（１’個のＢ、ジンジバリス細胞の検出が観察された。シグナルの強さは使用したビオチン化したシグナルオリゴヌクレオチド数に依存し、そしてアッセイ中に僅か１つのシグナルオリゴヌクレオチドしか存在しないときには１／３になる。

実施例４０の病原性細菌検出用の試験キットは、数個の試料の採集、処理および評価並びに関係のある指示および患者データ収集カードに必要な全ての構成要素を有している。

製品添付文書。　製品添付文書は患者の試料採集および評価に関する書面による完全な指示を含んでいる。その指示は実施例３の方法に従っている。

データカード。　データカードは、患者の識別、採集部位および試験結果のような各患者の最低基線データを記録するために入れられている。

キュレット。　かき取りによる試料採集用キュレット。

横内治療点。　試験すべき　各試料の採集用歯肉治療点（紙点）も含める。ガーゼで拭いて歯肉上部表面を清浄化した後、上記紙点を使用して試料採取すべき歯の歯肉下表面から細菌をふき取り、唾液、歯肉液および歯肉プラクから吸収して細菌を採集した。

溶解試薬。　採集した試料を有する各紙点は、細菌を溶解して細１核酸を放出する溶解試薬の番号付き管中に直ちに入れる。

プローブ／酵素試薬。　酵素試薬を有するかまたは該試薬と直接抱合したりガントによってＷ識されたプローブの標準的分別物を溶解試薬の容管に加えて、病原性核酸標的と、リポソームＲＮ＾配列の不変領域に由来するシグナルオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリッド形成反応を開始させる。

探索棒デバイス。　固体支持体に共有的に固定化された病原体−特異性のＤＮＡプローブのついた部位を有し且つ試料採取した歯の各部位に印をつけて識別するための空間を有する個々の探索棒デバイスは、ハイブリッド形成混合物を含有する容管に直ちに挿入しそして室温でインキュベートする。

洗浄試薬。　各探索棒デバイスをハイブリッド形成混合物から取り出し、提供された瓶を使用して洗浄試薬で洗浄する。

酵素基質試薬。　探索棒デバイスは酵素基質試薬瓶に集めて入れ、そして室温で数分間から１時間発色させる。

各探索棒デバイスは洗浄試薬で再度洗浄して過剰のバックグランドの色を除去する。

対照カード。　発色は目で見て、陽性のシグナルを与える病原体を示す対照カードと比較する。

表１　　歯周病に関連した細菌に特異的なオリゴヌクレオチドＢｇ−３Ｂ　５′ ＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＧＴＡＴＡＴＣＧ３’　　　　ＵＰ２Ｂアクチノバチルス（ヘモフイルスヲ除＜）Ａａ−２Ｂ　５’　ＣＴＴＣＧＧＧＣＡＣＹＡＧＧＧＣＴＡＡＡＣＣＣＣ３’　　　　　ＵＰ２ＢＡａ−４Ｂ　５’ＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧ３’　　　　　ＵＰ８ＢＡａ−５８５’ＧＴＧＧＴＡＡＡＣＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＣＧＧＴＴ３’　　　　　ＵＰ６ＢＡａ−１０Ｂ　５’ＴＧＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＣＡＣＡＣＣＡＡＣＣ３ ’　　　　ＵＰ４Ｂ／ＩＢＢｉ　−３Ｂ　５’　ＣＡＣＧＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＴＡＣＴＣＣＣＣＡＡ３’　　　　ＵＰ４Ｂ／ＩＢＢｉ−６８５’　ＴＡＧＣＣＧＣＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＴＡＡＣ３’　　　　ＵＰ２ＢＢｉ　−２Ｂ　５’ＣＣＣＴＡＧＧＹＧＣＧＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＴＴＡ３’　　　　ＵＰ６ＢＢｔ　−５８５”ＧＡＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴＡＴＣＣＴＧＣＧ３’　　　　ＵＰ８ＢＢｉ−４Ｂ中５’ＴＴＧＣＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣＴＣＣＴＣＧＣＧＧＴ３’　　　　　　　ＵＩ’６Ｂ２Ｂｉ−Ｉ　Ｂ　５’　ＡＴＧＡＧＧＴＡＣＡＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＣＡＣＡ３’　　　　ＵＰ４Ｂ２Ｂｉ−２Ｂ　５′ＣＧＴＧＣＧＣＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＣＡＣＡＴＡ３’　　　　ＵＰ４ＢＢｆ−２Ｂ　　５’ＣＧＴＡＴＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴ’Ｉ’ＣＣＣＣＴＧＴＡ３′ＵＰ４ＢＢｆ−５８５’　ＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＧＴＣＧＴＣＴＡＣＡ３’　　　　　ＵＰ４ＢＥｆ−６８５’ＡＡＴＡＣＡＣＧＴＡＴＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＣＣ３’　　　　　ＵＰ４Ｂ旧−３Ｂ　５’ＧＡ、ＡＧＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＣＣＧＴＣＧ３’　　　　ＵＰ８ＢＢｆ−４Ｂ　５’　ＣＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＡＣＡＣＴＡＴＡＴＣＧＣＡ３’　　　　　ＵＰ２ＢＥｉｋ−２８５’ 　ＧＣＡＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＡＣＡ３’　　　　ＵＰ４Ｅｉｋ−３Ｂ　　５’　ＴＡＣＣＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣＴＴＧＣ３’　　　　　ＵＰ６ＢＥｉｋ−５８５’　ＣＴＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＡＣ３’　　　　ＵＰ８ＢＦｎ−２Ｂ　　Ｓ’　ＧＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣ３’　　　　　ＵＰ４ＢＦｎ−３Ｂ　　５’ＡＧＧＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＡＡＡＣ３’　　　　　ＵＰ８ＢＷｒ− ２Ｂ　　５’ＧＧＡＣＣＡＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＴＧ３’　　　　　ＵＰ６ＢＷｒ−３Ｂ　　５’ＧＣＡＴＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＡＣＴＡにＣＧＡＡＧ３’　　　　　ＵＰ２ＢＷｒ−６Ｂ　５′ＣＴＴＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＣ３′　　　ＵＰ４ＢＳｔ−２Ｂ　　５’　ＴＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＡＣ３’　　　　　ＵＰ４ＢＳｔ−３Ｂ　　　５’ＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＡＣＴＣＧＴＴＣＴＴ’Ｃ３’　　　　　　　　　ＵＰ４Ｂ表２　　配列付加用の普遍的プライマーおよび不変シグナルオリゴヌクレオチドＵＰ４Ｂ　　５’ＧＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＣＧ３’　　　　　　　５０４−５２２ＵＰ７Ｂ　　５’ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ３’　　　　　　　　５１９−５３６ＵＰ２Ｂ中　５’　ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴ３’　　　　　　　　　　　９０７−９２６ＵＰ２Ｄ　　５’ＣＣＣＧＴＣＷＡＴＴＣＭＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴ３’　　　　　９０６−９２７ＵＰ２Ａ　　５’ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴ３’　　　　　９０６−９２７ＵＰ３Ｂ市　５’　ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ３’　　　　　　　　　　　　　　　　１３９２−１４０６ＵＰ３Ａ　　５’　ＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡ３’　　　　　　　１３９０−１４０８ＵＰ９Ａ　　５’ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ３’　　　　　　３３８− ３５７ＵＰ１５Ｂ　５″ＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＫＧＴＴＹＧＣＴＣＣ３’ 　　　　　７７５−７９７ＵＰ２０Ｂ　５’　ＧＡＣＴＡＣＹＭＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ３’　　　　　　７８５−８０５ＵＰ２１Ａ　５’　ＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＹＴＣＣＷＣＣＧＣＴＴＣ３’　　　　９６３−９５９ＵＰ１３Ｂ　５’ＧＧＧＧＴＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＣ３’　　　　　　４６８−４８７２３ＵＰＡ　５’　ＣＴＴＡＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣ３’　　　　　　　　　２７４４−２７５９２３ＵＰＢ　５’　ＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＧＴＡＣＴＡ３’　　　　　　　　２６５３−２６６９２３ＵＰＣ５’ＧＧＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＣＴ３’　　　２５８７−２６１１２３ＵＰＩ）　５’　ＧＡＣＣＧＣＣＣＣＡＧＴＣＡＡＡＣＴ３′２２４１−２２５８２３ＵＰＥ５’　ＣＣＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＴＣＧＣ３’　　　　　　　　１９３３−１９５０２３ＵＰＦ　５′ＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＴＴＡＣＧＧ３’　　　　　　　１６８５−１７０３２３ＵＰＧ　５’　ＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣ３″　　　　　　１０９１−１１０９２３ＵＰＨ５’　ＴＴＣＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＡ３’　　　　　　　　８０３−８２０２３ＵＰＪ　５’　ＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＴ３’　　　　　　　　　２４１−２５６２３ＵＰＭ　５’　ＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＣ３ ’　　　　１８９７−１９２０中　レーン等が記載したリポソームＲＮＡ配列付加プライマート等価表３２３８リポソームＲＮＡ配列から誘導される細菌特異性オリゴヌクレオチドプローブ表４　二次的および三次的相互作用のない１６Ｓおよび２３Ｓ！ｊボソームＲＮＡの超可変および不変領域から誘導されるプローブ１６Ｓ　ｒＲＮＡ　超可変額域Ａａ−４Ｂ　　５’　ＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧ３’ 　　　９９０−１０３０Ｅｉｋ−２８５’ＧＣＡＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＡＣＡ３’　　　４４５−４７５Ｆｎ−４Ｂ　　５’　ＴＣＡＧＡＣＴＣＴＣＧＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡ３’　　　４４５−４７５Ｆｎ−６８５’ 　ＡＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＡＡＧ３’　　　９９０（０３０Ｗｒ−１Ｂ５′ＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＡＡＧ３′４４５−４７５Ｗｒ−６８５’ＣＴＴＧＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＡ、ＡＴＴＣＴＴＴＣＣ３’　　４４５４７５２３Ｓ　ｒＲＮＡ　超可変額域Ｂｇ２３−２５’　ＧＴＡＣＧＧＧＴＡＡＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＧＣＴ３’　　　　１５７０−１６２０Ｂｇ２３−４５’ＧＡＣＴＡＴＡＴＡＣＣＴＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＴＴ３’　　　　１８０叶１８３゜Ｂｇ２３−６５′ＣＣＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＡＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＡ３’　　　２０８５−２１２０１６Ｓ　ｒＲＮＡ　不変領域ＵＰ２Ｄ　　５’　ＣＣＣＧＴＣＷＡＴＴＣＭＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴ３’　　　　９０６−９２７ＵＰ３Ａ　　５’　ＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡ３’　　　　　　１３９０−１４０８ＵＰ７Ｂ　　５’ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ３’　　　　　　　５ｉ９−５３６ＵＰ９Ａ　　５’ＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＣＴ３’　　　　　　３３８−３５７ＵＰ２０Ｂ　５’　ＧＡＣＴＡＣＹＭＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ３’　　　　　７８５−８０５ＵＰ２１Ａ　５’ＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＹＴＣＣＷＣＣＧＣＴＴＧ３’ 　　　９３６−９５９２３Ｓ　ｒＲＮＡ　不変領域ＵＰ１２Ｂ　５’　ＴＹＧＡＴＴＧＧＣＭＴＴＴＣＡＣＣＣＣ３’　　　　　　７７５−７９３２３ＵＰＢ　５’ＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＧＴＡＣＴＡ３’　　　　　　　２６５３−２６６９国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトの口の医学的疾患に関連した細菌検出用ポリヌクレオチドプローブの組成物であって、その際上記プローブはハイブリッド形成条件下で細菌のリボソームＲＮＡの超可変領域と選択的にハイブリッド形成し得る核酸の断片からなる、但し上記断片と共有的に結合した任意の他のヌクレオチドはヒトの口で見い出される細菌の核酸と上記条件下でハイブリッド形成しない。
２．式：［Ｘ−Ｙ−Ｚ］ｎ式中：ａ）Ｘはヒトの口に住みついている細菌に見い出される細菌核酸の領域と非相同的である０から１００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の配列であり；ｂ）Ｙはヒトの口に住みついている細菌のリポソームＲＮＡの超可変領域とハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成し得る１０から１００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の配列であり、その際該Ｙはハイブリッド形成条件下で上記細菌の唯一の種、上記細菌の２っの種または上記細菌の３つの種とハイブリッド形成し得る下位配列からなることもできる；ｃ）ＺはＸと同一または異なるヌクレオチドの配列であり、その際該ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体はヒトの口に住みついている細菌の核酸と非相同性である：ｄ）ｎは１〜５００であり、そしてｎが１より大きいとき、Ｙは上記ハイブリッド形成能を有するヌクレオチドと同一または異なる配列であることができる、で示されるポリヌクレオチドプローブ。
３．上記細菌がアクチノバチルス（ヘモフィルスを除く）アクチノマイセテムコミタンス、バクテロイデスジンジバリス、バクテロイデスインターメディウスタイプ１、バクテロイデスインターメディウスタイプ２、エイケネラコロデンス、バクテロイデスフォルシサス、フソバクテリウムヌクレアタム、フソバクテリウムペリオドンチクム、ストレプトコッカスインターメディウス、ヴォリネラレクタおよびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
４．リボソームＲＮＡが１６Ｓまたは２３Ｓの沈降係数を有するリボソームＲＮＡの群から選択される請求項１に記載の組成物。
５．プローブが１５から５０個までのヌクレオチドからなる請求項１に記載の組成物。
６．上記細菌がバクテロイデスジンジバリスである請求項３に記載の組成物。
７．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項６に記載の組成物。
８．上記細菌がアクチノバチルス（ヘモフィルスを除く）アクチノマイセテムコミタンスである請求項３に記載の組成物。
９．上記オリゴヌクレオチド配列が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項８に記載の組成物。
１０．上記細菌がバクテロイデスインターメデイウスタイプ１である請求項３に記載の組成物。
１１．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項１０に記載の組成物。
１２．上記細菌がバクテロイデスインターメディウスタイプ２である請求項３に記載の組成物。
１３．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項１２に記載の組成物。
１４．上記細菌がバクテロイデスフォルシサスである請求項３に記載の組成物。
１５．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項１４に記載の組成物。
１６．上記細菌がエイケネラコロデンスである請求項３に記載の組成物。
１７．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項１６に記載の組成物。
１８．上記細菌がフソバクテリウムヌクレアタムである請求項３に記載の組成物。
１９．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項１８に記載の組成物。
２０．上記細菌がウォリネラレクタである請求項３に記載の組成物。
２１．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項２０に記載の組成物。
２２．上記細菌がストレプトコッカスインターメディウスである請求項３に記載の組成物。
２３．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；および【配列があります】．からなる群から選択される請求項２２に記載の組成物。
２４．ヒト患者の口から得られた試料中で医学的疾患に関連した細菌を検出する方法であって、その際該方法は、次の段階：上記試料中の徴生物細胞を溶解してリボソームＲＮＡを遊離させ；上記リボソームＲＮＡをハイブリッド形成条件下で、上記細菌のリボソームＲＮＡの超可変領域と選択的にハイブリッド形成し得るポリヌクレオチドプローブと接触させ；そして上記試料中の微生物細胞の存在の指標としてハイブリッド形成コンプレックスを検出する、からなる。
２５．上記プローブが、アクチノバチルス（ヘモフィルスを除く）アクチノマイセテムコミタンス、バクテロイデスジンジバリス、Ｂ．インターメデイウスタイプ１、バクテロイデスインターメディウスタイプ２、エイケネラコロデンス、バクテロイデスフォルシサス、フソバクテリウムヌクレアタム、フソバクテリウムペリオドンチクム、ストレプトコッカスインターメディウスおよびヴォリネラレクタ並びにそれらの組み合わせ物からなる群から選択される細菌のリボソームＲＮＡとハイブリッド形成し得る請求項２４に記載の方法。
２６．試料が、各群か単一細菌のリボソームＲＮＡの異なる超可変領域とハイブリッド形成し得る少なくとも２つの異なる群のプローブを使用してアッセイされる請求項２５に記載の方法。
２７．特異的ポリヌクレオチド配列の存在の測定に使用する診断キットであって、その際該キットはヒトの口の医学的疾患に関連した細菌のリボソームＲＮＡの超可変領域とお相補的な合成オリゴヌクレオチドプローブからなる。
２８．溶解試薬、プローブ／酵素試薬、探索棒デバイス、洗浄試薬、酵素基質試薬および対照カードから更になる請求項２７に記載の診断キット。
２９．ヒトの口の医学的疾患に関連した細菌を検出するためのポリヌクレオチドプローブ組成物であって、その際上記プローブは隣接ヌクレオチドとの二次的または三次的相互作用が最小である細菌のリボソームＲＮＡの開放領域とハイブリッド形成条件下で選択的にハイブリッド形成し得る核酸の断片からなり、そして該プローブは実質的に開放領域とだけしか結合しない。
３０．上足プローブがリボソームＲＮＡの不変領域と選択的にハイブリッド形成する請求項２９に記載の組成物。
３１．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項３０に記載の組成物。
３２．上記プローブがリボソームＲＮＡの超可変領域と選択的にハイブリッド形成する請求項２９に記載の組成物。
３３．上記核酸断片が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項３２に記載の組成物。
３４．ヒト患者の口から得られる試料中で医学的疾患に関連した細菌を検出する方法であって、該方法は次の段階：上記試料中の微生物細胞を溶解してリボソームＲＮＡを遊離させ；上記リボソームＲＮＡをハイブリッド形成条件下で、隣接するヌクレオチドとの二次的および三次的組互作用が最小であるリボソームＲＮＡの開放領域と選択的にハイブリッド形成し得るポリヌクレオチドプローブと接触させ；そしてハイブリッド形成コンプレックスを試料中の微生物細胞の存在の指標として検出する、からなる。
３５．上記プローブが、アクチノバチルス（ヘモフィルスを除く）アクチノマイセテムコミタンス、バクテロイデスジンジバリス、Ｂ．インターメディウスタイプ１、バクテロイデスインターメディウスタイプ２、エイケネラコロデンス、バクテロイデスフォルシサス、フソバクテリウムヌクレアタム、フソバクテリウムペリオドンチクム、ストレプトコッカスインターメデイウスおよびウォリネラレクタ並びにそれらの組み合わせ物からなる群から選択される細菌のリボソームＲＮＡとハイブリッド形成し得る請求項３４に記載の方法。
３６．上記試料が、各群か単一細菌のリボソームＲＮＡの異なる不変領域とハイブリッド形成し得る少なくとも２つの異なる群のプローブを使用してアッセイされる請求項３５に記載の方法。
３７．ヒトの口の医学的疾患に関連した細菌の検出用ポリヌクレオチドプローブの組成物であって、その際該プローブはハイブリッド形成条件下で細菌のリボソームＲＮＡの不変領域と選択的にハイブリッド形成し得る核酸の断片からなっている、但し上記断片に共有結合した任意の追加的なヌクレオチドは上記条件下ではヒトの口の中に見い出される細菌の核酸とはハイブリッド形成しない。
３８．上記核酸配列が【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；およびそれらの組み合わせ物からなる群から選択される請求項３７に記載の組成物。