JPH0316651A - 全血分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、全血を試料として用いて血液中の被検成分（
アナライト）の量又は活性値を軟式化学分析法により定
量分析するのに適した一体型多層分析要素に間する． ［従来技術とその欠点］ 体液中に存在する各種代謝成分、例えばグルコース、ビ
リルビン、尿素窒素、尿酸、ヌレステロール、乳酸脱水
素酵素、クレ７チンキナーゼ、ＡＬＴ（７ラニンアミノ
トランスフエラーゼ）、ＡＳＴ（アスバルテートアミノ
トランスフエラーゼ〉等の定量分析は、臨床医学上重要
で、疾患の診断、治療経過の追跡、予後の判定などに不
可欠である．血液等を試料とする臨床化学検査では、Ｗ
ｉ量の液体試料で、精度の高い検査をｊテうことができ
ることが望ましいｏｆ来、溶液試薬を用いる湿式法が広
く用いられているが、迅速性に欠ける． 轄式化学分析、すなわち実質的に乾燥状態の分析要素、
例えば、試験片や多層分析要素中に，分析試薬系を導入
した臨床分析法が知られている。乾式化学分析は湿式法
による化学分析（すなわち、溶１α中に試薬を用いろ方
法）より、６リえば匣川上の簡易性、経済上の節約及び
分析の迅速ざなとの点で優れている。乾式多層分析要素
は、漱量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うこ
とができる分析手段として、間発された．乾式多層分析
要素は、例えば、特公昭５３−　２１０７７．特開昭５
５−　１６４３５６、特開昭００−　２２２７６９等で
知られている．乾式多層分析要素の一例を挙げれば、透
明支持体、試薬層、光反射層、屓ｒｊ１層からｔｅＦｆ
ｃされている．透明支持体は、例えば下塗り処理を施し
た薄い有機ポリマーシ一トである。透明支持体の上に塗
布された試薬層には、液体試料中に含まれる被検成分と
反応し、その成分量に応した光学濃度に発色する試薬が
含まれる．光反射層は、試薬層に入射した光が展開層に
達するのを防ぎ、試薬層の光学測定の際展間層に点着し
た濱体試料の光学的影響を受けないようにする役割を持
つ。展開層は、点着された液体試料を均一（−ｔ！！）
に，ｉ夜の量にほぼ比例する面積に広げる．このような
乾式分析要素を用いて定量分析するには、液体試料、例
えば全血を展開層の表面に一定量点着する。＠間層で展
開ざれた血液は、光反射層を通って試薬層に達し、ここ
で試薬と反応し、発色する．点着後、化学分析スライド
を適当な時間、一定温度に保って（インクベーション）
発色反応を充分に進行させた後、透明支持体銅から照明
光を試薬ｒＩｌｉに照射し，特定波長域で反射光量を測
定して反射光学濃度を求め、予め求めておいた検量線に
基づいて定量分析を行う。

従来、湿式法、乾式化学分析いずれにおいても、赤血球
を除去した血漿又は血清を試料として分析が行なわれる
ことが多かった．しかし血液の池の成分から赤血球を分
離する操作には多くの労力と装置のコストを伴うので、
未稀釈の全血で分析できることが望ましい。

全血を試料として乾式化学分析を行うには．血球（赤血
球及び白血球）及び全血の他の高分子量成分を、分析要
素中で何らかの手段で分離しなければならない．特公昭
５３−２１６７７には、血球及び全血の高分子量成分を
、分析要素中で分離するために、濾過層を設けることを
間示している。しかし、特開昭６０−　１１１９６０に
記載されているように、乾式分析要素に設けｋ″第１ｉ
過屠により全血から血球成分を除去する場合には非常に
時間がかかり、また血漿又は血清中の被検成分の一部が
濾過層中で失われて、定量分析が不正確になる恐れがあ
った。

赤血球による定量分析の妨害を回避するために、全血中
の赤血球を分析要素中で全血から分離除去し、しかも血
漿中の被検成分の試薬層への拡散が速やかに行なわれる
、全血試料中の被検成分の定量分析に有用な乾式分析法
の一体型多層分析要素が、特開昭６２−　１３８７５６
で提案された。この分析要素は、第１の非繊維賞多孔性
層、第２の非繊維質多孔性層、繊維質多孔性層がこの順
に一体にｆＪＩＦＩされており、前記３層の多孔性層が
それぞれ隣接する面の間で、液体の均一（一様）透過が
実質的に妨げられないような漱少貫通部を形成するよう
に部分的に配置された接着剤により実質的に密着して接
着されて一体化ざれている，一体型多層分析要素であり
、発色を生ずる試薬組成物は前記３層の多糺性層のいず
れかに含まれ、第２の非繊維多孔性層の平均有効孔径を
０．８μ−から３０μｍとしたものである。しかし、こ
の多層分析要素を用いても全血中の被検成分の定量分析
を行うと、全血からの血球成分の分離除去が不充分で、
血液のへマトクリット値（血＋α中に占める血球の容積
百分率〉の大小により、血漿中の被検成分含量が同じ血
液でも分析結果にかなり差が出ることが経験された．［
解決しようとする技術的課ａ］ 本発明は、一体型多層分析要素で全血中の血球成分を血
漿から分離除去して赤血球による定量分析の妨害を回避
し、しかも血漿中の被検成分の試薬層への拡散が速やか
に行なわれ、全血試料中の被検成分を血液のへマトクリ
ット値に拘わらず高い精度で定量分析することができる
乾式分析要素の１！洪を技所的課題とする． 〔技術的課題の解決手段〕 本発明の前記ｒｓｕは、水不透過性光透過性支持体の上
に、少なくとも３層の多孔性層が一体に積層されており
、前記多孔性層がそれぞれ隣接する面の閏で、液体の均
一透過が実質的に妨げられない微少貫通部が形威される
よう、部分的に！！ｉ！置された接着剤により実質的に
密着して接着され一体化されている一体型多層分析要素
であって、前記少なくとも３層の多孔性層は前記支持体
銅から、第１の縁！ｔ′ＩＲ多孔性層、非繊！第１多孔
性層、第２０ｍ維質多孔性層がこの順に積層されており
、被検成分の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる試
薬組成物が前記３層の多孔性層の少なくとも１つに含ま
れることを特激とする一体型多層分析要素により、解決
された。前記試薬組成物は、第１の織碓質多孔性層に含
まれることが好ましい．本発明の前記課題はまた、水不
透過性光透過性支持体と、その上に一体に積層された、
少なくとも３層の多孔性層を有し、前記多孔性層がそれ
ぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実質的に妨げ
られない微少貫通部が形成されるよう、部分的に配置さ
れｋ接着剤により実質的に密着して接着され一体化され
ている一体型多層分析要素であって、支持体の上に親水
性ポリマーをバインダーとする実質的に無孔性の試薬層
を有し、前記少なくとも３層の多孔性層は、支持体の上
に前記無孔性試薬層を介して、第１のａ維質多孔性層、
非！４Ｉ質多孔性層、第２のｌｌｉ維質多孔性層がこの
順に一体に積層されており．＊検成分の存在下に検出し
得る光学的変化を生ずる試薬組成物が少なくとも前記無
孔性試薬層に含まれることを特徴とする一体型多層分析
要素によって、解決された。試薬組成物は、無孔性試薬
層と第１の繊維質多孔性層との両方に含まれてもよいし
、全部又は大部分が無孔性試薬層に含まれてもよい。

［発明の具体的構成の詳細］ 非繊維多孔性層として、特公昭５３−　２１６７７、米
国特許１　４２１　３４１等に記載のセルロースエステ
ル類、例えば、セルロース７セテート、セルロースアセ
テートブチレート、硝酸セルロースからなるブラッシュ
ポリマーの層が好ましい。６−ナイロン、６．６−ナイ
ロン等のボリアミド，ポリエチレン、ボリブロビレン等
の漱多孔性膜、特開昭６２−　２７００６に記載のボリ
スルホンからなる微多孔性膜も好ましい．その池、特公
昭５３−　２１６７７、特閏昭５５−　９０８５９等に
記載の、ポリマー小粒子、ガラス粒子、珪藻土等が親水
性又は非吸水性ポリマーて結合された連続空隙をもつ漱
多孔性層も用いることができる．非繊維多孔性層の有効
孔径は０．８μ−から３０μ爾であることが好ましい。

本発明で非繊維多孔性層の有効孔径は、ＡＳＴＭ　Ｆ３
１６−７０に準拠した限界泡圧法（バブルポイント法）
により測定した孔径て示す．非繊維多孔性層が相分離法
により作られたいわけるフラッシュ・ポリマーから成る
メンプランフィルターである場合、厚さ方向の液体通過
経路は、膜の製造の際の自由表面ｍ（光沢面）で最も狭
くなっているのが普通で、液体通過経路の断面を円に近
販したときの孔径は、自由表面の近くで最も小さくなっ
ている。単位の通過経路における厚さ方向に間する最小
孔径は、さらにメンプランフィルターの面方向について
分布を持っており、その最大値が粒子に対する濾過性能
を決定する。通常、それは限界泡圧法で測定ざれる。

上に述べたように、柑分離法により作られたプラッシュ
・ポリマーから成るメンプランフィルターでは、厚さ方
向の液体通過経路は膜の製造の際の自由表面ｆｉｌ１（
光沢面）で最も狭くなっている。本発明の分析要素の非
１ａ維多孔性層としてこの種の膜を用いる場合には、支
持体に近い側、すなわち第１の繊維質多孔性層に面する
銅にメンプランフィルターの光沢面を向けることが好ま
しい。

Ｉａ雄賀多孔性層を構成する材料としては、濾紙、不織
布、織物布地（例えば平織物布地），編物布地（例えば
トリコット編物布地〉、力゛ラスｗ４碓浦紙等を用いる
ことができる．これらのうち織物布地、編物布地が好ま
しい．布地等は特開昭５７−　６６３５９に記載のよう
なグロー放電処理等の物理化学的活性化処理をしてもよ
い． 非繊維多孔性層を第１の繊維質多孔性層の上に固定する
方法及び第２の！ｌｉ維賀多孔性層を非ｔａ維質多孔性
層の上に固定する方法としては、接着剤を用いることが
できるが、液体の均一（一様〉透過が実質的に妨げられ
ないようにする必要がある．そのためには、接着剤を部
分的に配置し、接着剤が存在しない部分に微少貫通部が
形成されるようにする．その方法として特開昭６２−　
１３８７５６に記載の、２つの多孔性層を網点印刷法（
例、グラビア印刷法、スクリーン印刷法）を利用した部
分接着法により接着一体化する方法が有効である．グラ
ビア印刷法を利用した部分祷着法の代表的な例は、高濯
に加熱し溶融状態のホットメルト型接着剤を、縁碓質多
孔性層か非繊維質多孔性層のどちらか一方の表面に、グ
ラビアローラーからの転写によりドット状に付着させた
直後に両者を重ねてラミネートローラーの間を通すこと
で接着一体化する方法である。

第２の繊！１！多孔性層は、液体試料の展開層として機
能するので、液体計量作用を有する層であることが好ま
しい．液本計量作用とは、層の表面に点着供給された液
体試料を、その中に含有する成分を実質的に偏在させる
ことなく、層の面方向に単位面積当りほぼ一定量の割合
で広げる作用である．展間層には、展開面積、展開速度
等を調節するために特開昭６０−　２２２７７０、特開
昭６３−　２１９３９７、特開昭６３−　１１２９９９
、特開昭６２−　１８２６５２に記載のような親水性高
分子又は界面活性剤を含有してもよい。

第１の繊維質多孔性層の空隙体積（単位面積当たり：以
下同じ）は非ｍ維多孔性層と同じでもよいが、後者の２
分の１以下とするのが好ましい．両者の空隙率を同じに
して、前者の厚さを後者の２分の１以下としてもよいし
、両者の厚さを同じとして、前者の空隙率を後者の２分
のｉ以下としてもよい．厘さと空隙率の組み合わせで、
両者の空隙体積の関係を規制してもよい． 非ｍ維多孔性層と第２０繊ｌｕｌｌ多孔性層の空隙率は
同じでも、異なってもよい． 本発明の分析要素は種々の構成（層の配置）をとること
ができる．例えば、米国特許３　９９２　１５８、特閏
昭５５−　１６４３５６、特閏昭６２−　１３８７５６
、特開昭６２−１３８７５７、特間昭６２−　１３８７
５８の記載を参考にできる．実用的には例えば、 （１）支持体の上に、第第１維質多孔性増、非繊維多孔
性層、第２Ａｌｌ維實多孔性層をこの順に、（２〉支持
体の上に、接着層（又は吸水層）、第１１ａｌ維質多孔
性層、非繊維多孔性層、第２４１維質多孔性層を、この
順に、 （３〉支持体の上に、検出層、第ｌ繊維質多孔性層、非
繊維多孔性層、第２繊維質多孔性層を、この順に、（４
〉支持体の上に、試薬層、第Ｉ繊維質多孔性層、非繊維
多孔性層、第２繊維質多孔性層を、この噸に，（５）支
持体の上に、検出層、試薬層、第１繊維質多孔性層、非
繊維多孔性層、第２繊維質多孔性層を、この順に、 それぞれ有するものが、有用である．支持体は下塗り層
を有していてもよい。検出層は、一般に、被検成分の存
在下で生成した色素等が拡散し、光透過性支持体を通し
て光学的に検出ざれ得る層で、親水性ポリマーにより構
成することができる．媒染剤、例えばアニオン性色素に
対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい．吸水層は
、一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に
拡散しないような層を言い、膨潤しゃすい観水性ポリマ
ーにより構成することができる． 第１又は第２のＩｌｌ！Ｉｔ質多孔性層と非ｔＩＡ維多
孔性層の間には、さらに他の非Ｉ＃ｌ維またはＩｉ維賞
多孔性層を設けることができる． 試薬層と第ｌｍ維質多孔性層との間、又は検出層と第１
織維質多孔性層との間に、妨害物除去層、光反射層等を
設けてもよい． 光透過性水不透過性支持体く透明支持体）の材料として
好ましいものはポリエチレンテレフタレート、ボリスチ
レン、セルローストリアセテート等のセルロースエステ
ル類である。親水性層の吸水層、検出層、実質的に無孔
性の試薬層等を支持体に強固に接着させるために、通常
、支持体に下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。

試薬組成物には、被検成分の存在下に、光学的に検出し
得る物質、例えば染料を生成し得る組成物を含む，ロイ
コ色素の酸化によって染料を生成する組成物く例、米国
特許４　０８９　７４７等に記載のトリアリールイミダ
ゾールロイコ色素，特開昭５９−１９３３５２等に記載
のジアリールイミダゾールロイコ色素〉、ジアゾニウム
塩、酸化されたときにカプラー化合物とのカブリングに
より染料を生成する色原体化合物を含む組成物（例、４
−７ミノ７ンチビリン第１ｉ（色原体化合物）と、フェ
ノール類またはナフ｝一ル類（カブラー）との朝合せ）
、還元型補酵素と電子伝達剤の存在下で染料を生成する
ことのできる染料前駆体化合物からなるもの等を用いる
ことができる。試薬組成物は酵素を含むものでもよく、
特開昭６２−　１３８７５６明細書■８〜２０頁に記載
の試薬組成物等を用いることができる．また、酵素活性
を測定する分析要素の場合には、例えば、ｐ−ニトロフ
ェノール、ｐ−ニトロフェニルホスフエートのような有
色物質を遊離しろる自己顕色性基質を、試薬層、第１織
維質多孔性層、又は非繊維多孔性層に含むことができる
． 被検成分の存在下に発色を生ずる試薬組成物を前記３層
の多孔性層の少なくとも１層に含有させるには、試薬組
成物の適当な溶液又は分散液を予め含漫又は塗布した多
孔性層を、他の水浸透性層、例えば試薬層の上に接着一
体１ヒする方法で接着させる方法が有用である。適用し
うる接着方法の例として、特開昭５５−１６４３５６に
記載のように、親水性ポリマーバインダーを含む層く接
着層又は試薬層）の表面全面を水又は界面活性剤含有水
でほぼ一様に湿潤させておき、その表面に多孔性層を重
ねあわせ軽く一様に圧力をかけて接着一体化する方法が
ある．また、多孔性層を他の水浸透性層（例、下塗り層
、接着層、吸水層）の上に特開昭５５−１６４３５６に
記載のような方法で接着させた後、試薬組成物のｆａ液
又は分散液を多孔性層に塗布してもよい．多孔性層に試
薬組成物を含浸又は塗布するには公知の方法を利用でき
る．塗布には、例えば、ディップ塗布、押し出し塗布、
ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布等を適宜選
択して用いることができる． 試薬組成物は総てを一つの多孔性層、例えば第１の繊維
質多孔性層に含んでもよく、複数の多孔性層に分けて含
有させてもよい。試薬組成物の一部又は全部を、多孔性
層より支持体に近く設けられた親水性ポリマーを結合剤
とする実質的に均一なく一様な）無孔性の層（無孔性試
薬層）に含ませてもよい．ｌ！水性ポリマーとして、例
えば、ゼラチン及びこれらの誘導体く例、フタル化ゼラ
チン）、セルロース誘導体く例、ヒト口キシプ口ビルセ
ルロース）、アガロース、アクリルアミド重合体、メタ
アクリル７ミド重合体、アクリルアミド又はメタアクリ
ルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体等が利用
できる。

親水性ポリマーを結合剤とし試薬紹成物を含む均一な無
孔性の層を塗布した後、試薬組成物を含まないａｉＩｔ
質多孔性層を特開昭５５−１６４３５６に記載のように
、親水性ポリマーを含む試薬層の表面を水で一様に湿潤
させておき、その上に多孔性層を重ねて軽くほぼ一様に
圧力をかけて接着させる方法で接着させることによって
も、試薬組成物を第ｌのａ維多孔性層に実質的に含有さ
せることができる． 試薬組成物には、必要に応じ、活性化剤、ｐＨ第１ｆｔ
ｉ剤、架橋剤（硬膜剤又は硬化剤）、界面活性剤等を含
有させることができる．本発明の分析要素の試薬層又は
試薬層と液体接触しろる層に含有させることができるｐ
Ｈ緩衝剤の例としては、炭酸塩、硼酸塩、燐酸塩やｒＢ
ｉｏｃｈｅｗｉｓｔｒｙＪ　５巻く２号）、４６７−　
４７？頁（１９６６年〉に記載のＧｏｏｄのｐＨｌｉ衝
剤などがある．これらのｐＨｌｉ衝剤は『蛋白質・酵素
の基礎実験法１（堀尾武一ほか著、南江堂，１９８１年
）、ｒ　Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅ＋ｓ　ｉ　ｓ　ｔｒｙＪ５巻
等の文献の記載を参考にして選択することができる． 第１の繊維質多孔性層を接着し積層するための接着層を
、支持体、下塗り層，吸水層、検出層等の層の上に設け
てもよい。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着
することができるような親水性ポリマー、例えば、ゼラ
チン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、諏粉等か
らなることが好ましい。

第１の１ａ維質多孔性層は、検出層、試薬層等に生じた
検出可能な変化（色変化、発色等）を透明支持体銅から
反射測光する際に、全血中の赤血球のヘモグロビンの赤
色を遮蔽するとともに、光反射層又は背景層として機能
する。ｉＪ！１の繊維質多孔性層に親水性ポリマーをバ
インダーとして分散された二酸化チタン、Ｕバリウム等
の光反射性微粒子を含有させてもよい。バインダーとし
てはゼラチン，ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等
が好ましい．さらに，実質的に無孔性試薬層、非ｗＡ碓
質多孔性層のいずれか又は両方に、光反射性微粒子を含
ませてもよい． 本発明の全血分析要素は，全血中のグルコース、尿素、
尿酸、クレアチニン等の低分子成分の定量は勿論、総蛋
白、アルプミン、各種酵素等の高分子成分、ビリルビン
等の蛋白質と結合した成分、コレステロール、グリセリ
ド等の疎水性成分の定量に特に有用である．多孔性層に
抗原又は抗体の少なくとも一方を含有させて、免疫学的
方法による抗原又は抗体の定量に用いることもできる．
［発明の効果］ 本発明の全血分析要素は、全血及び血漿を試料として、
血液のへマトクリット値が０％から５５％の広い範囲に
わたり、種々の被検成分についてヘマトクリット値に左
右されない分析値を得ることができる． 【θわ ［実施例！］ 総コレステロール定量用一体型多層分析要素トｌロイコ
色素分散ｉｆｆのｍｕ ■ロイコ色素溶液 下記組或のロイコ邑素溶液を調製した．２−（４−ヒド
ロキシ−３．５−ジメトキシフエニル）−４−［４−（
ジメチルアミノ）フエニル］一５−フェネチルイミダゾ
ール酢酸塩　５．７８２・（４−ヒドロキシ−３．５−
ジメトキシフェニル〉−４−［４−（ジメチルアミノ）
フエニル］一５−フエネチルイミダゾール塩酸塩　０．
８８Ｎ，Ｎ・ジエチルラウリルアミド　　　　１０４ｇ
■ゼラチン水溶液 下記組成のゼラチン水溶液を作成した．，アルカリ処理
ゼラチン　　　　　　３００８水　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　貫９００８ビス［（ビニルスルホニルメチル力ルボニ
ル）ーアミノコメタン　　　　　　　　　　　３．０ｇ
■ロイコ色素乳化液の調製 ゼラチン水溶液をＴＫオートホモミキサー（特殊機械工
業社製乳化器）で約５７００回転／分で撹拌しながらロ
イコ邑素溶液を添加し、約３０分間分散して、ロイコ色
素乳化液を調製した． ト２発色試薬層の塗布 上記の工程■で得られた乳化液を、ゼラチン下塗りされ
ている厚さ１８０μ情で平滑な表面の無色透明ポリエチ
レンテレフタレー｝（ＰＥＴ）シート（支持体）の上に
ｌＩｌ２当たり１　５０ｇの割合で塗布し、乾燥させて
、無孔性の発色試薬層（乾燥厚さ約２０μ一、被覆量約
２６３／ａ＋２）を形成した． １−３第ｌ繊ｉ第１賞多孔性層の積層と処理上記発色試
薬層の表面を約２５℃の水で一様に湿らせ（約３０ｇ／
ｍ２の割合）、５０デニール相当のＰＥＴ紡績糸を３６
ゲージ編みしたトリコット編物布地（厚さ約２５０μ膳
）を重ね合わせ、乾燥させて発色試薬層に布地を接着さ
せた． 次にこのトリコット編物布地の上から、下記の試薬組成
物水溶液を、布地ｌＩ１２当り下記の成分被覆量（ｄｉ
ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ）になるよ
うに塗布し、乾燥させて、第１繊ｍ＊多孔性層とした。

試薬組成物の成分被覆量（１ａ＋２当り゛〉メチルセル
ロース　　　　　　　　　３．０８二酸化チタン微粒子
（平均粒子径０．３μｍ）２４８ リボプロテインリバーゼ　　　　　２０｛）ＯＩＵコレ
ステロールエステラーゼ　　２５００１Ｕコレステロー
ルオキシダーゼ　　２５００１Ｕベルオキシダーゼ　　
　　　　　２５００１Ｕ燐酸二水素カリウム　　　　　
　　　７．３８フエ口シアン化カリウム　　　　　７０
０＋ｗｇ（ＩＵは酵素国際単泣〉 ！−４第２繊維質多孔性層の含浸処理 別に、第２繊維賞多孔性層とするための５０デニール相
当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコット編物
布地（厚さ約２５０μｍ）を下記組成の水溶液に漫潰し
、空隙に液を満たした後、取り出して乾燥させた． ポリエチレングリコール（分子量約５万〉２．０８ 四硼酸ナトリウム　　　　　　　　　２，Ｏｇ精製水　
　　　　　　　　　　　　　９６ｇト５第２織維質多孔
性層と非繊維質多孔性層の積層 次に含浸処理済みのトリコット編物生地を温度８０℃に
予熱した表面に、温度１３０℃に加熱して溶解したホッ
トメルト型接着剤を、グラビア印劇法を利用してグラビ
アローラーからの転写により、点状に付着させた．グラ
ビアローラーは円形のドットの直径０．３　＋＋ｎ，ド
ット中心間距Ｊ第１０．６＋ｕ＋，ドット面積率約２０
％のものを用いた．付着した固形成分の量は約３ｇ／ｗ
＋２であった。

接着剤が転写された直後の高温の布地の表面に、有効孔
径３μ箇、厚さ１４０μＬ空隙率約８０％のセルロース
アセテートメンプランフィルター（富士写真フイルム（
株）製ミクロフィルターＦＭ３００）の非光沢面とを向
かい合わせてラミネートローラーの間を通し、両者をラ
ミネート（接着一体化）した。

！−６一体型多層分析要素の完成 この重層物（展開層及び第２多孔質層）を上記と同じ点
状接着法により前記第１多孔性層の面の上に接着し、一
体化させた．すなわち上記重層物のメンプランフィルタ
ー面に、加熱したホットメルト型接着剤を、グラビア印
刷法を利用してグラビアローラーからの転写により、点
状に１寸着させた後、直ちに前記第第１ａ維質多孔性層
（支持体及び発色試薬層の上にある）の面と向かい合わ
せ、両者をラミネートローラーの間を通し、ラミネート
（接着一体化）した． ？うして完成した総コレステロール定量用多層分析要素
は、支持体、実質的に無孔性の発色試薬層、第１！ｌｌ
Ｉ維質多孔性層、非１ａ維質多孔性層、第２繊維質多孔
性層の順に一体に積層されている．第２繊維質多孔性層
と非ａ維質多孔性層とは協同して血球濾過層として作用
する。第１繊維質多孔性層は、コレステロ■ールの存在
下に第２鉄イオンを生成する反応層として作用する．発
色試薬層は、コレステロールの存在下に第ｌｍ維貿多孔
性層で生成した第２鉄イオンにより色素を形成し、色素
は透明支持体を通して光学的に検出される． １−６分析スライドの製作 得られた総コレステロール定量分析用多層分析要素を一
辺ｌ５第１第１ｌの正方形チップに裁断し、特開昭５７
−　６３４５２に記載のスライド枠に収めて総コレステ
ロール定量用生化学分析スライドを完成した．［比較例
ｌ］ 実施ｌ７１ｌの第１繊維質多孔性層に用いたトリコット
編物布地の代わりに、有効孔径１．２μｍ、厚さ１４０
μ讃、空隙率約８０％のセルロースアセテートメンブラ
ンフィルター（富士写真フイルム（株）ａミクロフィル
ターＦＭ１２０）を用い、光沢面を発色試薬層に向ける
随は、実施例ｌと同様にして、総コレステロール定量用
生化学分析スライドを完成した．［性能評価試験ｌ］ 多層分析要素の全血中総コレステロールによる発色を、
下記のようにして評価した． 総コレステロール１４５ｍｇ／ｄＬを含むヒト血漿と、
同し総コレステロール含有量でヘマトクリット値が２５
％、４０％、５５％のヒト全血試料を用意し、各２０μ
Ｌを実施例１及び比較例１０分析スライドの第２！！第
１ｉＥ質多孔性層上にそれぞれ点着し、３７℃で３分及
び６分インクベーションした後、中心波長６　４　０　
ｎａ＋の可視光でＰＥＴ透明支持体銅から反射測光によ
り、分析スライドの発色光学濃度を測定した．結果を第
１表に示す． 第　　１　　表 第１表のデータでは、実施例ｌの分析要素ではヘマトク
リット値０％（血漿）から５５％の全血にわたり、ヘマ
トクリット値にかかわらずほぼ同じ発色光学濃度が得ら
れている．一方、比較例ｌの従来技術による分析要素で
は、ヘマトクリット値が高くなるにつれて発色光学濃度
が著しく低下している。本発明の全血用多層分析要素で
は、血漿からヘマトクリット［５５％の全血にわたり、
ほぼ同じ精度で総コレステロールを定量分析できること
が明らかである。

［性能評囮試験２］ 全血中総コレステロールによる多層分析要素の発色の、
総コレステロール濃度依存性を、下記のようにして評価
した． 検定された総コレステロール濃度が６３ｎ＋ｇ／ｄＬか
ら３１９＋ｗｇ／ｄＬの範囲に、ヘマトクリット値が１
９％から４４％の範囲にあるヒト全血８検体を用意し、
各四μＬを実施例ｌで作製した分析スライドの第２＊碓
質多孔性層上にそれぞれ点着し，３７℃で６分インクベ
ーションした後、中心波長６４０ｎｍの可視光でＰＥＴ
透明支持体銅から反射測光により、分析スライドの発色
光学濃度を測定した．結果を第２表及び第１図に示す．
なお総コレステロール濃度Ｏｔａｇ／ｄＬの試料として
は、生理食塩水を用いた．第　　２　　表 方？去で調べた． ヘマトクリット値を４０％に調整した全血２０μＬを、
実施例１の分析スライドと比較例１の分析スライドそれ
ぞれの第２繊維賀多孔性層の上に点着し、３５℃に６分
保った。その後各層を剥離し、それぞれの層の上面と下
面を中心波長５４０ｎｍの可視光で反射測光し、光学濃
度を測定した．結果を第３表に示す． 数値は、測定された反射光学濃度から同も点普していな
い時に測定ざれた反射光学濃度をブランクとして差し引
いた値を示している． 第　　３　　表 第２表のデータ及び第１図のグラフから、ｉα体試料（
全血及び血漿）のへマトクリット嬢の相違があっても、
本発明の多層分析要素の発色光学濃度が液体試料中の総
コレステロール濃度と良好相関を示すことが認められる
． ［参考実験］ 実施＠ｌと比較例ｌの分析スライドについて、全血から
の血球成分を分離除去する能力を下記の第３表のデータ
から、第１繊維質多孔性層より上側の多孔性層て全血か
ら血球成分が完全に分離除去されていることが明らかで
ある． ［実施例２］ ２−１発色試薬層の塗布 ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μ鋼で平滑な表面
の無色透明ＰＥＴシ一ト（支持体）の上に下記の発色試
薬層組成物水溶液をｌｍ”当たり１５６ａ＋Ｌの割合で
塗布し、乾燥させて、無孔性の発色試薬層（乾燥厚さ約
１５μｍ、被覆量約２０ｇ／ｍ”）を形成した。

発色試薬層組成物水溶液の組或 ゼラチン　　　　　　　　　　　　１９０ｇノニルフエ
ノキシボリグリシドール （平均ｌＯグリシドール単位含有）　　　　８ｇベルオ
キシダーゼ　　　　　　　　　ｌ５万ＩＵＦＡＤ（フラ
ビン・アデニン・ジヌクレオチド）２４０Ｂ ＴＰＰ（チアミン●ビロホスフェート）１０００ｍｇ ビルビン酸オキシダーゼ　　　　　　１５万ＩＵ２−（
３．５−ジメトキシ−４・ヒドロキシフエニル）−４−
フェネチル−５−［４−（ジメチルアミノ）フエニル］
ーイミダゾール（ロイコ色素）　　　　　　３．０ｇ水
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３６
０ｇ（希ＮａＯＨ水溶液でｐＨ６．５に調整する〉２−
２接着層の塗布 発色試薬層の上に下記の接着層組成物水溶液をＬｍ２当
たり（３０ｎ＋Ｌの割合で塗布し、乾燥させて、接着層
（乾燥厚さ約３μｒａ．′ｍ覆量約４ｇ／ｍ２）を形成
した。

接着層組成物水溶液の組成 ゼラチン　　　　　　　　　　　　　４０ｇノニルフエ
ノキシボリグリシドール （平均ｌＯグリシドール単位含有）　　　　１．６ｇ水
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０
０ｇ（希ＮａＯＨ水ｆａ液ｔ’ｐ｝１を７．０Ｃ．ｌ：
ｉｌｌ！！する）２−３．第１繊維質多孔性層の積層と
処理接着層の上に約２５℃の水を約３０ｇ／＋ａ２の割
合で全面にほぼ一様に供給して湿潤させた後、ＰＥＴＩ
！のプロード織物布地（空隙体積９．８μＬ／ｍ２）を
軽く圧力をかけてラミネートし、乾燥して接着させｋ．
次にこのブロード織物布地の上から、下記組成の試薬組
成物水溶液をＩＯＯｗＬ／ｍ２の割合で塗布し、乾燥さ
せ、第１繊維質多孔質層とした．試薬組成物水溶液の組
成 トリスくヒドロキシメチルアミノ）メタン２．２８ 燐酸！カリウム　　　　　　　　　　　４．５８α−ケ
トグルタル酸ナトリウム　　　　４．０ｇし−アラニン
　　　　　　　　　　　　２７．５ｇヒドロキシブロビ
ルメチルセルロース （メトキシ基２８〜３０％、ヒドロキシブロボキシ基７
〜１２％含有、２％水溶液の２０℃での粘度５０ｃｐｓ
）（信越化学（株）製メトローズ９０　ＳＨ　１００）
８．７８ ４．４′−モノメチンビスー［１−（ｐ−スルブオフエ
ニル）一３−メチル−５−ビラゾロン］オキソノール（
染料〉７００Ｉ１８ ρ−オクチルフェノキシボリエトキシエタノール２７ｇ 二酸化チタン微粒子（ルチル型）７０ｇ塩化マグネシウ
ム　　　　　　　　　２・４ｇ水　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８８０ｇ（希ＮａＯＨ水溶
液でｐＨ７．５に調整する）２−４第２１１ｉ維質多孔
性層の含浸処理第２Ｊｉｌ繊維質多孔性層とするための
５０デニール相当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みした
トリコット編物布地（厚さ約２５０Ｉｌｌｍ）を下記絹
成の水溶液に浸漬し、空隙に液を満たした後、取り出し
て乾燥させた． ポリエチレングリコール（分子量約５万）２．０ｇ 四硼酸ナトリウム　　　　　　　　　２．０　ｇＩｇ！
製氷　　　　　　　　　　　　　９６ｇ２−５第２繊維
質多孔性層と非繊維質多孔性層の積層 次に含漫処理済みのトリコット編物生地を温度８０℃に
予熱した表面に、温度１３０℃に加熱して溶解したホッ
トメルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用してグラビ
アローラーからの転写により、点状に付着させた．グラ
ビアローラーは円形のドットの直径０．３　ｍｍ、ドッ
ト中心間距離０．６ｍｍ、ドット面積率約２０％のもの
を用いた。付着した固形成分の量は約３ｇ／膳２であっ
た。

接着剤が転写された直後の高温の布地の表面に、有効孔
径３μ−、厚さ１４０μＬ空隙率約８０％のセルロース
７セテートメンブランフィルター（富士写真フィルム（
株）製ミクロフィルターＦＭ３００）の非光沢面とを向
かい合わせてラミネートローラーの間を通し、両者をラ
ミネート（接着一体化）した。

２−６一体型多層分析要素の完成 この重層物（ｒｆＡ間層及び第２多孔質層〉を上記と同
じ点状接着法により前記第１多孔性層の面の上に接着し
、一体化させた．すなわち上記重層物のメンプランフィ
ルター面に、加熱したホットメルト型接着剤を、グラビ
ア印刷法を利用してグラビアローラーからの転写により
、点状に付着させた後、直ちに前記第１繊維質多孔性層
（支持体及び発色試薬層の上にある）の面と向かい合わ
せ、両者をラミネートローラーの間を通し、ラミネート
（接着一体化）した． こうして完成したＡＬＴ（アラニン７ミノトランスフエ
ラーゼ）活性定量用多層分析要素は、透明支持体、実質
的に無孔性の発色試薬層、第１繊維質多孔性層、非繊維
質多孔性層、第２繊＄Ｉ［多孔性層の順に一体に積層さ
れている．第２繊維質多孔性層と非＄６１！Ｉ質多孔性
層とは協同して血球濾過層として作用する．第１繊１１
ｉ１ｊ多孔性層は、ＡＬＴの存在下にビルビン酸を生成
する反応層として作用する．ｍ孔性の発色試薬層は、Ａ
ＬＴの存在下に′ｌ４１織維質多孔性層で生成したビル
ビン酸を過酸化水素を経て色素に変換し得る層として作
用する．色素は透明支持体を通して光学的に検出される
．２−７分析スライドの製作 得られたＡＬＴ活性定量用多層分析要素を一辺１５＋ｕ
＋の正方形チップに裁断し、特開昭５７−　６３４５２
に記載のスライド枠に収めてＡＬＴ活性定量用生化学分
析スライドを完成した． ［性能評価試験３］ ＡＬＴ活性定量用分析スライドの全血中のＡＬＴによる
発色を下記のようにして評価した。

ヒト全血を遠心分離した後、得られた血漿の適当量を再
び血球部分に添加、混合することにより、それぞれへマ
トクリット第１Ｉが２５％．４０％，５５％の全血試料
を用意した．この再混合に先立ち、７％ＨＳＡ水溶液に
ＡＬＴを加えてＳｌｌ第１！シたＡＬＴ含有ＨＳＡ水溶
液で、血漿の一部を置き換え、得られた全血が８００Ｕ
ｎｉｔ／ＬのＡＬＴ活性値を有するよう置換の割合を調
節した．血漿についても同様に一部をＡＬＴ含有ＩＳＡ
水溶液で置換し、全血と同じＡＬＴ活性値を持つように
調整した． こうして調製された全血試料各２０μＬを実施例２０分
析スライドの第２　縁！ｔ　！多孔性層にそれぞれ点着
し、各分析要素を密閉インクベータ中で３７℃に保ちつ
つ点着後２．５分から４分までの反射光学濃度を波長６
４０ｎｍの可視光で測定して、１秒当りの光学濃度変化
を求めた．測定結果を第４表に示す。

第　　４　　表 第４表のデータでは、実施例２の多層分析要素ではへマ
トクリットＷＯ％（血漿〉から５５％にわたり、ヘマト
クリット値にかかわらずほぼ一定の光学濃度変化が得ら
れている．このことから、本発明の全血用多層分析要素
では、血漿からヘマトクリット（ｌ［５５％の全血にわ
たり、ほぼ同じ精度でＡＬＴ活性値を定量分析できるこ
とが明らかである。

［性能評ｌＩｉ試験４コ 得られたＡＬＴ活性定量用分析スライドの、発色光学濃
度とＡＬＴ活性値との相関を下記のようにして評価した
． ７％ＩＳＡ水溶液に異なる量のＡＬＴを加えて調製した
活性値の異なるＡ　Ｌ　．Ｔ含有ＩＳＡ水溶液を調製し
た．ヒト全血を遠心分離し、得られた血漿の一定量を前
記のＡＬＴ含有ＨＳＡ水溶液で置き換えた後に、これを
再び血球部分と混合することにより、ヘマトクリット値
４０％の全血試料を調製した． こうして調製された全血試料各２０μＬを実施例２の分
析スライドの第２繊維質多孔性層にそれぞれ点着し、各
分析要素を密閉インクベータ中で３７℃に保ちつつ点着
後２．５分から４分までの反射光学濃度を波長（３４０
ｎｍの可視光で測定して、１秒当りの光学濃度の変化速
度を求めた。測定結果を第５表及び第２図に示す。

第５表の最後の行の数値は、遠心分離前のもとの血液に
ついての測定結果である． 第５表のデータ及び第２図のグラフから、本発明の多層
分析要素の発色光学濃度の変化速度が全血試料中のＡＬ
Ｔ活性１直とほぼ直線で表される良好な相間関係を示す
ことが認められる。従ってく本発明の全血用多層分析要
素では、広い活性値範囲にわたり、ほぼ同し精度で全血
中のＡＬＴ活性１直を定量分析できることが明らかであ
る．咀工至亘 第　　５　　表 第１図

【図面の簡単な説明】

第１図は全血試料に含まれる総コレステロール濃度と実
施例１０分析スライドの発色の反射光学濃度との関係を
示すグラフである． 第２図は全血試料中のＡＬＴ酵素活性と実施例２の分析
スライドの発色の反射光学濃度の変化速度との関係を示
すグラフである．

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）水不透過性光透過性支持体の上に、少なくとも３
   層の多孔性層が一体に積層されており、前記多孔性層が
   それぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実質的に
   妨げられない微少貫通部が形成されるよう、部分的に配
   置された接着剤により実質的に密着して接着され一体化
   されている一体型多層分析要素であって、前記少なくと
   も３層の多孔性層は前記支持体銅から、第１の繊維質多
   孔性層、非繊維質多孔性層、第２の繊維質多孔性層がこ
   の順に積層されており、被検成分の存在下に検出し得る
   光学的変化を生ずる試薬組成物が前記３層の多孔性層の
   少なくとも１つに含まれることを特徴とする一体型多層
   分析要素。（２）前記試薬組成物が第１の繊維質多孔性
   層に含まれる請求項１に記載の分析要素。 （３）水平透過性光透過性支持体と、その上に一体に積
   層された、少なくとも３層の多孔性層を有し、前記多孔
   性層がそれぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実
   質的に妨げられない微少貫通部が形成されるよう、部分
   的に配置された接着剤により実質的に密着して接着され
   一体化されている一体型多層分析要素であって、支持体
   の上に親水性ポリマーをバインダーとする実質的に無孔
   性の試薬層を有し、前記少なくとも３層の多孔性層は、
   支持体の上に前記無孔性試薬層を介して、第１の繊維質
   多孔性層、非繊維質多孔性層、第２の繊維質多孔性層が
   この順に一体に積層されており、被検成分の存在下に検
   出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物が少なくとも前
   記無孔性試薬層に含まれることを特徴とする一体型多層
   分析要素。 （４）前記試薬組成物が前記無孔性試薬層及び第１の繊
   維質多孔性層に含まれる請求項３に記載の分析要素。 （５）前記試薬組成物が前記無孔性試薬層に含まれる請
   求項３に記載の分析要素。 以下余白