JPS60111960A - 全血分析用多帯域要素及び全血の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は全血のアッセイ及び全血のアツセイに有用な多
帯域（ｍｕｌｔｉ　ｚｏｎｅ）要素に関する。さらに詳
しくは、本発明は全血中の過酸化物を発生する分析物質
、例えばグルコースまたはコレステロールの定量に有用
な方法及び要素に関する。

従来の技術 望ましい予防のためのまたは診断による健康管理を行な
うために、医師は患者の血液中の種々の分析物質のレベ
ルを測定しなければならないことが多い。例えば、血液
中のグルコース又はコレステロールのレベルは種々の疾
患、例えば糖尿病、低血糖症、肝ｌ＠ｉ障害、甲状腺障
害及びアテローム性動脈硬化症の有効な治療に重要であ
ることが多い。

一般に、このような分析物質は、全赤血球を除去後に血
清または血漿中において測定される。しかしながら、赤
血球を血液の他の成分から分離するのに必要な操作なら
びにそれに付随する労力及び装置のコストを避けるため
に、未希釈の全血中の分析物質を測定できることが望ま
しいであろう。

また、未希釈の全血を分析に用いれば、より簡易で迅速
なサンプルの入手及び処理が可能になるであろう。これ
は、アッセイ操作ができる限り簡易でなければならない
家庭で監視するアッセイに特に有用であろう。

「乾燥化学」アッセイは公知である。このアッセイは、
種々の実質的に「指触乾燥状態の」要素、例えば、試験
片及び多帯域分析要素中に化学試薬を入れた臨床分析法
である。また「乾燥化学」アッセイが「湿潤化学」アッ
セイ　（即ち、溶液中に試薬を用いる方法）よりも優れ
ている点も知られており、例えば使用上の簡易性、経済
上の節約及び分析の迅速さなどが挙げられる。しかしな
がら、乾燥化学アッセイを用いる全血のアッセイは重大
な問題を克服しなければならない。血球（赤血球及び白
血球）及び全血の他の高分子量成分は、正確なアッセイ
を行なうためにはサンプルから除去するかあるいは要素
が何らかの手段で収容しなけれはならない。従来の乾式
アッセイは、血清または血漿を要素に浸透させ且つ浸透
できない血球成分を拭き取ることによる血球成分の除去
を必要とする。あるいは、血球成分を収容する要素の場
合は、血液サンプルが接触する面内の気孔率及び気孔の
大きさが、分析要素を目詰りさせずにサンプルを完全に
吸収するのに十分なものでなければならない。同時に、
気孔の構造が要素の機械的不安定性（即ち、崩壊または
破砕）を引き起すほど大きくてはならない。

全血は、また、全血の大きな血球成分を捕捉すると同時
に血清または血漿を特定の分析物質の存在下で検出可能
な変化を起こさせるのに必要な試薬を含む分離した試薬
層まで通過させる多孔質塗布外層を有する要素によって
も分析できる。

米国特許第４．０４２．３３５号（１９７７年８月１６
日にフレメン）　（Ｃ１６ｍｅｎｔ　）に対して発行〕
は、多層分析要素を用いる全血アッセイについて記載し
ている。ここに記載された全血アッセイ要素は、支持体
の上に順に記録層、輻射線阻害層及び試薬層を含んでな
る。試薬層は多孔質塗布層として作用することができ、
輻射線阻害層は全血球を濾去して記録層から除く濾過層
として作用することができ、そのためヘモグロビンによ
る妨害を回避できる（上記米国特許の第１図参照）。

このような要素は全血中の分析物質を測定するのに使用
できるが、いくつかの問題を有する。その有用性は、全
血球濾過層を通って記録層まで急速に拡散でき且つ十分
に高い吸光係数を有する検出可能な物質の有無に大きく
依存している。しかしながら、必ずしも全ての検出可能
な物質（例えば染料、発色剤など）がこれらの要求を満
足させるわけではない。更に、全血中の血球成分から血
清または血漿を分離する必要性を回避するのが有利であ
ろう。゛濾過層を用いて血清または血漿から血球成分を
濾去するこの操作は時間のかかる工程である。さらにま
た、血漿または血清が濾過層を通過する時に分析物質の
一部分が濾過層中で失なわれて、分析が不正確になる可
能性がある。

発明の目的 本発明の目的は、全血中の分析物質の迅速な検出のため
の要素及びアッセイを提供することにある。

発明の構成 従って、本発明によれば、全血中の分析物質の検出用多
帯域要素は、過酸化物賦活活性を有する物質を含んでな
る分析物質に対する相互作用組成物を含み、全血球濾過
層域を含まず且つ該分析物質と相互作用した時に該相互
作用組成物が６００ｎｍまたはそれ以上の波長で分光光
度法によって検出され得る染料を生成できることを特徴
とする。

本発明はさらに、 （Ａ）全血のサンプルと前記多帯域要素とを接触させて
、６００ｎｍまたはそれ以上の波長において分光光度法
によって検出され得る染料を生成せしめ、 （Ｂ）該染料を６００ｎｍまたはそれ以上の波長におい
て検出する 工程を含んでなる全血中の分析物質のアッセイまたは検
出方法を提供す名。

発明の効果 本発明の分析方法及び要素は、前述の公知の全血アッセ
イに関連する問題を克服するものである。

即ち、この方法は簡易、迅速かつ正Ｍ［であり、しかも
未希釈の全血サンプルを分析するのに使用できる。本発
明によれば、過剰な血液（即ち、血球成分）を拭きとっ
たり、血液サンプルを希釈したりする必要がない。更に
、血漿または血清から血液の細胞成分を分離する必要が
なく、独立した全血球濾過の必要性が排除される。本発
明の要素は全血球を濾過する層を含まない。分析物質と
の相互作用によって生成される染料はＣＣ１００ｎまた
はそれ以上の波長で分光光度法によって検出され得るも
のなので、ヘモグロビンによる妨害は本発明には関係な
い。意外なことに、本発明のアッセイはまた、極めて迅
速である。即ち、通常２分もしくは３分またはそれ以下
で分析が可能である。別の思いがけない利点はサンプル
ごとのヘマトクリット及びヘモグロビン値の変動に対す
るその不感受性である。

実施例の説明 本発明は全血中の分析物質の定量に有用である。

例えば、本発明は測定可能な分析物質であると考えられ
る特定の抗体または抗原を用いたイムノアッセイとして
使用できる。このアッセイは過酸化物を発生する分析物
質、例えばグルコース、コレステロール、尿酸、グリセ
ロール、トリグリセリドなどの測定に特に有用である。

本発明のアッセイは希釈された、または未希釈の全血の
分析に適当である。しかし、本発明のアッセイの利点の
一つは、未希釈の全血を分析できることである。「未希
釈の」全血とは、生理的塩溶液、血清、血漿などで希釈
されていない全血を意味する。本発明の利点は２種の必
須帯域、即ち、全血サンプル（例えば、１〜２０μβ）
を収容または吸収でき、かつ過剰の血液を拭きとる必要
のない塗布／試薬帯域及び分析物質の存在に反応して形
成された染料が移動していく記録帯域を有する多帯域要
素の使用によって達成される。この要素は従来技術、例
えば、前述の米国特許第４．０４２．３３５号に教示さ
れた要素とは異なり、輻射線阻害帯域または濾過帯域を
有しない。

一般に、未希釈の全血サンプルを収容するために、本発
明の要素の試薬／塗布層の気孔率は、使用される材料に
応じて２５〜８０％、好ましくは４０〜６０％である。

平均気孔寸法は一般に少なくとも５マイクロメーターで
あり、より適当には使用する材料に応じて１５〜６５マ
イクロメーターである。

試薬／塗布帯域は、全血を収容できるならば、適当な気
孔率及び平均気孔寸法を有する任意の適当な繊維もしく
は非繊維材料またはそれらの混合物から調製できる。試
薬／塗布層はそれが液体接触している記録帯域に面した
面において単位面積当り均一の濃度の全血を提供するの
が有利である。

このような濃度の均一性は公知の濃度測定法または他の
分析法によって測定できる。

有用な試薬／塗布帯域は、米国特許第４．２９２，２７
２号（１９８１年９月２９日にキタジマらに対して発行
）中に記載されたように、適当な結合剤と混合したか又
は織物に織った繊維材料を用いて調製できる。

或いは、この帯域は等方性多孔質であり、米国特許第３
．９９２，１５８号（１９７６年１１月１６日にプルツ
ィビロビッツ（Ｐｒｚｙｂｙｌｏｓｎｉｃｚ）らに対し
て発行）の教示に従ってポリマーコンパウンド（例えば
プラッシュポリマー）を用いてｍｓできる。

等方性多孔質試薬／塗布帯域はまた、等方性多孔性が粒
子間の連続空隙によって作られる粒状物質を用いても調
製できる。種々の型の粒状物質が有用であり、それらは
全て全血液成分中で非膨潤性であり且つ全血液成分に対
して化学的に不活性であると共に不浸透性であることが
望ましく、その例としては顔料（例えば、二酸化チタン
、硫酸バリウムなど）、珪藻土、コロイド材料（例えば
、微品質セルロース）、樹脂またはガラスピーズなどが
挙げられる。選択された粒状材料が粘着性でない場合に
は、粒子が最も接近している隣接する粒子の表面積上で
粒子が互いに粘着するように処理して、全血中で非膨潤
性の凝縮性三次元格子を形成することができる。

他の有用な粒状材料Ｑ例としては、粒子同士がその接触
点において粒子中の反応性基を介して化学的に結合する
、ドイツ国特許出１９１公開第３．１５０゜１０２号公
報（１９８２年７月２９日公開、小西六写真に譲渡）に
記載されたポリマー粒子；及び低分子量の接着剤化合物
（例えば、ビスフェノール、ジカルボン酸及び／又はア
ミン化合物の反応生成物など）と接触点において化学的
に結合する、特開昭５７−１０１７６０号公報（１９８
２年６月２４日公開、小西六写真に譲渡）に記載された
ポリマー粒子が挙げられる。

特に有用な試薬／塗布帯域は、米国特許第４，２５ｓ、
ｏｏｉ号（１９Ｂ１年３月２４日にパース（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）らニ対して発行〕に記載された、オルガノポリマー
粒子及びこれらの粒子に対するポリマー接着剤によって
形成された粒状構造を有するものである。

このような構造の隣接する粒子の間の連続気孔は全血の
血球成分及び高分子量成分を収容し、全血中の分析物質
を輸送する。ポリマー接着剤によって粒状構造中のオル
ガノポリマー粒子の粒子結合性を保持することにより、
これらの材料の融合及び気孔への流れが防止される。隣
接する粒子に接するこの構造のこれらの粒子表面積にお
ける接着剤の濃度は、接着剤が気孔中に流れたり、気孔
を目詰りさせないことを保証するものである。

本発明の実施に好ましい試薬／塗布帯域を調製するのに
使用する材料はパースらの特許にかなり詳細に記載され
ている。試薬／塗布帯域の詳細及び定義はこの引例中に
記載されているので、本明細書の開示は本発明のいくつ
かの実施態様にふれながらこの帯域を一般的に記載する
ものとする。

記載した粒状構造の厚さは、オルガノポリマー粒子の寸
法及び測定される分析物質に応じて広範囲に変化させる
ことができる。しかしながら、厚さは一般に１０〜５０
０マイクロメーターである。

本発明の実施に有用な熱安定性オルガノポリマー粒子は
一般に、粒度が１〜２００マイクロメーターの球状ビー
ズである。

゛粒子は、必要な性質を有する天然及び合成ポリマーを
含む種々の有機ポリマーがら成ることができる。しかし
ながら、粒子は１種またはそれ以上のエチレン系不飽和
重合性モノマーがら形成された１ｍまたはそれ以上の付
加ポリマー、例えば単一モノマーの付加ホモポリマーま
たは２種またはそれ以上のこのようなモノマーがら形成
されたコポリマーから成るのが好ましい。これらのポリ
マーは種々の常用の重合方法（例えば、溶液重合、乳化
重治、分散重合、懸濁重合など）のいずれかによって製
造できる。所望ならば、そのポリマーは種々の相互作用
組成物を粒子に結合させる１個またはそれ以上の反応部
位を含むことができる。

有用な付加ポリマーは、１１ｆｆｉまたはそれ以上の下
記エチレン系不飽和重合性モノマーを重合させることに
よって形成されたものである（その詳細は前記のパース
らの特許に記載されている）：（ａ）パースらの特許に
記載されたスチレンモノマーを含む１ｗ！またはそれ以
上のアミン置換−遊離ビニル炭素環式芳香族モノマー並
びに同様なアミノ置換−遊離ビニルナフチルモノマー〇
−１００重量％、 （ｂ）１種またはそれ以上のアクリル酸エステル０〜２
５重量％、 （ｃ）ＩＪｆｆｉまたはそれ以上のメタクリル酸エステ
ル０〜１００重量％、 （ｄ）１種またはそれ以上のエチレン系不飽和カルボン
酸０〜３０重量％、 （ｅ）１種またはそれ以上のエチレン系不飽和ニトリル
０〜７５重量％、 （ｆ）パースらの特許に記載されたスチレンモノマーを
含む１種またはそれ以上のアミノ置換ビニル、炭素環式
芳香族炭化水素ならびに同様なアミノ置換ビニルナフチ
ル０〜２０重量％、（ｇ）ア今ンまたはゼラチン硬化剤
によって架橋させることのできるモノマー及び２個また
はそれ以上のエチレン系不飽和重合性基を有するモノマ
ーを含む１種またはそれ以上のエチレン系不飽和架橋性
モノマーθ〜２０重量％、 （ｈ）１種またはそれ以上の第三アミノアルキルアクリ
レートまたはメタクリレート０〜２０重量％、 （ｉ）１種またはそれ以上の重合性Ｎ−複素環式ビニル
モノマー０〜１００重量％、ならびに、（ｊ）１種また
はそれ以上のアクリルアミドまたはメタクリルアミド０
〜２０重量％。

本発明に有用なポリマー接着剤は、オルガノポリマー粒
子を互いに結合させて、試薬／塗布帯域中に凝着性三次
元格子を形成する。この接着剤の詳細は前記のパースら
の特許に記載されている。

一般に、接着剤は粒子中に含まれる特殊なポリマーとは
異なる有機ポリマーから成るが、接着剤は粒子のポリマ
ー組成中に存在する反復単位のいくつかと同一のまたは
類似した多くの反復単位を含むポリマーであるのが極め
て普通である。

接着剤は、１種またはそれ以上のエチレン系不飽和重合
性モノマーから形成された１種またはそれ以上の付加ポ
リマー、例えば２種またはそれ以上のこのようなモノマ
ーから形成された付加コポリマーから成ることができる
。粒子と同様に、接着剤は種々の常用の重合方法のいず
れかによって製造できる。

一般に、粒状構造中に含まれる接着剤の量は粒子の重量
に基づき１０％未満である。

接着剤として使用される特に有用な付加ポリマーは、以
下に記載するブレンドから選択されるエチレン系不飽和
重合性モノマーのブレンドを重合させることによって形
成される（詳細は前記パースらの特許に記載されている
）： Ａ、前述の１種またはそれ以上のアミノ置換−遊離ビニ
ル炭素環式芳香族炭化水素１〜３５重量％と１種または
それ以上のアクリル酸アルキル又はメタクリル酸アルキ
ル６５〜９９重量％を含むブレンド、 Ｂ、１種またはそれ以上のアミノ置換−遊離ビニル炭素
環式芳香族炭化水素、アクリル酸エステル又はメタクリ
ル酸エステル及びエチレン系不飽和重合性架橋性モノマ
ー２０〜９５重量％と活性水素を有する１種またはそれ
以上のエチレン系不飽和重合性モノマーまたはそれらの
塩５〜８９重量％を含むブレンド、並びに Ｃ，１−ビニルイミダゾール、ビニルベンジルアルコー
ル、アクリル酸エチル並びにアクリルアミド及びメタク
リルアミドから成る群から選ばれた１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和モノマー１５〜１００重量％と１種
またはそれ以上のエチレン系不飽和重合性架橋性モノマ
ー０〜８５重量％を含むブレンド。

一般に、接着剤ポリマーは、粒子中のオルガノポリマー
のガラス転位温度（Ｔｇ）よりも少なくとも２０℃低い
Ｔｇを有する。接着剤は通常、８０”Ｃ未満のＴｇ（高
い相対湿度条件下、即ち、相対湿度８０％以上において
測定）を有する。本明細書中において、「ガラス転位温
度」とは、ポリマーがガラス状ポリマーからゴム状また
は流動性ポリマーに変化する温度であると定義する。Ｔ
ｇは、例えば、［ポリマー評価の技術と方法ＩＴｅｃｂ
ｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙ
ｍｅｒ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　）　Ｊ　、第１巻、マ
ーセル・デツカ−社（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　
Ｉｎｃ、　）、ニューヨーク（１９６６年）に記載され
ているような任意の適当な方法で測定できる。

本明細書中に記載した要素の試薬／塗布帯域は１種また
はそれ以上の相互作用組成物を含む。これらの組成物は
、分析物質を含む全血のサンプルと試薬／塗布帯域とが
接触した時に分析物質または分析物質の反応生成物もし
くは分解生成物とまたは互いに相互作用する１種または
それ以上の活性成分を含んでなる。本発明のアッセイに
は、このような相互作用によって６００ｎｍまたはそれ
以上の波長において分光光度法によって検出され得る染
料が生成されることが必須である。即ち、このような染
料は６００ｎｍまたはそれ以上の波長において有意義な
光学濃度が観察できるように充分高い吸光度を有するも
のでなければならない。染料は、染料生成性物質との相
互作用によって又は前もって形成された染料からの染料
遊離によって生成できる。「相互作用」なる用語は、化
学活性、酵素−基質複合体の形成におけるような触媒活
性、抗原−抗体反応におけるような免疫原活性、並びに
染料の濃度が直接的または間接的に特定の分析物質の存
在または濃度を示すような検出可能な染料を遊離、形成
または生成できる他の全ての型の電気的、化学的または
物理的相互作用を指すものとする。

試薬／塗布帯域内に分布できる特定の相互作用組成物は
、選択されるアッセイによって決まる。

特に有用な相互作用組成物は過酸化物賦活活性（後に定
義する）を有する物質を含んでなる。多くの分析物質の
場合は、酵素、例えばグルコースオキシダーゼまたはコ
レステロールオキシダーゼのようなオキシダーゼ物質を
このような酵素に対する基質である分析物質の分析用の
試薬／塗布帯域に含ませることができる。

一般に、相互作用組成物は、また、染料生成性組成物を
含む。このような組成物は、酸化された時に分子内でま
たはその還元型とカップリングして染料を生成すること
のできる化合物を含む。このような自己カップリング化
合物としては、種々のヒドロキシル化化合物、例えば。

−アミノフェノール類、４−アルコキシナフトール類、
４−アミノ−５−ピラゾロン類、クレゾール類、ピロガ
ロール、グアヤコール、オルシノール、カテコール、ク
ロログルシノール、ｐ−ジヒドロキシジフェニル没金子
酸、ピロカテキン（ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｉｃａｃｉ
ｄ）及びサリチル酸が挙げられる。この型の化合物は公
知であり、文献に、例えばザ・セオリー（Ｍｅｅｓ）及
びジェームズ（Ｊａｎ＋ｅｓ　）著、第３版（１９６６
年）中に特に第１７章に記載されている。

別の例としては、染料はロイコ色素化合物の酸化によっ
て生成できる。ロイコ色素の例としては、米国特許第４
．０８９．７４７号（１９７８年５月１６日にブルシ（
Ｂｒｕｓｃｈｉ　）に対して発行〕に記載されたように
トリアリールイミダゾールロイコ色素及び他のロイコ色
素ならびに当業界で公知のトリアリールメタンロイコ色
素のような物質を挙げることができる。

更に別の例としては、染料は被酸化性化合物と発色剤と
の縮合生成物を含む染料生成性組成物によって形成され
る。被酸化性化合物の例としてはベンジジン及びその同
族体、ｐ−フェニルジアミン類、ｐ−アミノフェノール
類、アミノアンチピリン、例えば４−アミノアンチピリ
ンなどを挙げることができる。多数の自己カップリング
化合物を含む広範囲のこのような発色剤は文献に、例え
ば前記のミーグ及びジェームズの文献並びにコザー（Ｋ
ｏｓａｒ　）著、ライト・センシティブ・システムズ（
Ｌｉｇｈｔ　５ｅｎｓｉｔｉｖｃｒ　５ｙｓｔｅ＋ｍｓ
　）　、１９６５年、２１５〜２４９ページに記載され
ている。

染料は一般に拡散性であって、試薬／塗布帯域から浸透
性記録帯域へ移動できる。

本発明のアッセイの一実施態様において、試薬／塗布帯
域は全血中のグルコースの定量的検出に必要な相互作用
組成物を含んでなる。基本的には、この相互作用組成物
は、分析物質グルコースと相互作用するグルコースオキ
シダーゼ、過酸化物賦活物質（例えばペルオキシダーゼ
または当業界で公知の他の物質）１、アミノアンチピリ
ン被酸化性化合物（例えば４−、アミノアンチピリン）
、使用条件下において（即ち、全血サンプルと接触させ
る時に）　ｐＨを４〜７に保持する適当な緩衝剤、及び
酸化状態においてアミノアンチピリンと反応するであろ
う発色剤を含んでなる。これらの試薬は、例えば米国特
許第４，０９８，５７４号（１９７８年７月４日にダッ
ペン（Ｄａｐｐｅｈ）に対して発行〕中に記載されてい
るように、当業界で公知である。

適当な被酸化性化合物と一緒になって６００ｎ＋＋＋よ
り大きい波長において検出され得る染色を生成できるな
らば、多数の発色剤（例えばフェノール類、ナフトール
類、置換アニリン類など）のいずれも本発明の実施に使
用できる。

過酸化水素が発生する分析定量の実施に有用な発色剤と
しては、米国特許第４，２５１．６２９号（１９８１年
２月１７日にヤマニシらに対して発行）、同第４．２６
０．６７９号（１９８１年４月７日にラダらに対して発
行）及び同第４．３９６．７１４号（１９８３年８月２
日にマエダらに対して発行）、特公昭５Ｂ−２２２００
号公報（１９８３年５月７日に公告）、ヨーロッパ特許
出願第６８，３５６号（１９８３年１月５日に公開）、
英国特許第２．１０７．８６３号（１９８１年１０月２
２日に公告）、並びに特開昭５８−８９８号公報（１９
８３年１月６日に公開）に記載されているようなトルイ
ジン類を挙げることができる。このような有用なトルイ
ジン化合物の例としては次のものが挙げられる：Ｎ−エ
チルーＮ−２−スルホエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−２−カルボキシエチル−■１−Ｉ・ルイジン
、Ｎ−２−カルボキシエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−ス
ルホメチル−ｐ−トルイジン、Ｎ−メチル−Ｎ−（２，
３−ジヒドロキシプロピル）−ｍ−トルイジンなど。

他の有用な発色剤としては、ジしドロインドール類、テ
トラヒドロキノリン類、置換アニリン化合物、例えば８
−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸及びＮ−メチル
−Ｎ−スルホプロピルアニリン、１，７−シヒドロキシ
ナフタレン並びに当業界で公知の他の化合物を挙げるこ
とができる。

同様に、本発明の別の一実施態様において、コレステロ
ールアッセイは、分析物質コレステロールと相互作用す
るコレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステ
ルヒドロラーゼ、過酸化物賦活物質（例えばペルオキシ
ダーゼ又は当業界で公知の他の物質）、アミノアンチピ
リン被酸化性化合物（例えば４−アミノアンチピリン）
、使用条件下においてｐｉを４〜７に保持する適当な緩
衝剤及び適当な発色剤（例え）ば前述の発色剤）を含む
試薬／塗布帯域を用いる。

本発明の乾式分析要素は必須帯域を二つだけ、即ち、前
述の相互作用組成物を含む試薬／塗布帯域及び相互作用
組成物と分析物質との相互作用によって生じる染料を受
容する記録帯域を有する。

これらの帯域は自立性である（即ち、保全性を有する）
こともできるが、適当な支持体上に支持されるのが好ま
しい。このような支持体は、２００〜９００ｎｍの波長
の輻射線を透過する寸法安定性で好ましくは透明の（即
ち、輻射線透過性の）任意の適当な材料であることがで
きる。個々の要素に対して選択される支持体は、実施す
る検出法（反射、螢光または透過分光分析法）と適合す
るものでなければならない。記録帯域は支持体に直接に
接していてもよいし、所望ならば、間に下塗り帯域を置
いてもよい。要素の帯域は互いに液体接触する。

これは、液体並びに液体中の試薬及び反応生成物が隣接
する帯域の重ね合わさった領域の間を通過できることを
意味する。即ち、液体接触とは液体接触している帯域の
間において液体の成分を輸送できる能力を指す。

要素の記録帯域は試薬／塗布層において形成または遊離
された反応生成物を受容する。この帯域の成分は、例え
ば要素配置及び材料に関する後述の特許に概ね記載され
ているように公知である。

本発明の要素は場合によっては、更に特殊な機能を有す
る、例えば要素の調製をより便利にする追加の非必須帯
域を含むことができる。例えば他の帯域間の接着を促進
または調節する追加帯域を用いることはよく行なわれる
ことである。このような帯域は通常、「結合剤」（；シ
域又は「下塗り」帯域と称され、当業界では公知である
。このような下塗り帯域は一般に、ゼラチンもしくは他
の天然コロイドまたはホモポリマー及びコポリマーを含
む天然または合成の高分子材料を１種またはそれ以上含
む。

しかしながら、本発明のアッセイの利点は、アッセイに
使用する要素が反射帯域または層としても知られる輻射
線阻害帯域または層を有しないことにある。この帯域は
全血球を濾過するかまたはその拡散を停止させるだけで
なく、多くの染料の拡散を遅延させたりそれを保持した
りする傾向があり、このため、アッセイを遅延させたり
より不正確にする。いく・つかの染料は全くこの帯域を
通って拡散しないであろう。例えば、アミノアンチピリ
ン及び８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸を含む
グルコース測定用要素中で形成される染料は認め得るほ
どには輻射線阻害帯域を通って拡散しない。

前述の相互作用組成物中の各成分又は試薬の量は測定さ
れる分析物質に応じて広範囲に変化させることができる
。これらの量は当業者ならば容易に決定できる。例えば
、全血中のグルコースのアッセイ用要素においては、グ
ルコースオキシダーゼは一般に４０，０ＯＯＵ／ｒｒｒ
以下の量で存在する。過酸化物賦活物質（例えば、ペル
オキシダーゼ）は一般に４０，０ＯＯＵ　／　ｒｒｆ以
下の量で存在する。アミノアンチピリン被酸化性化合物
は一般に２　ｇ　／　ｎｒ以下の量で存在する。緩衝剤
（例えば３，３−ジメチル−グルタル酸）は一般に２０
ｇ／■ｆ以下の量で存在する。アミノアンチピリンと反
応する発色剤（例えばトルイジン又は８−アニリノ−１
−ナフタレンスルホン酸）は一般に５　ｇ　／　ｎｒ以
下の量で存在する。

本発明の要素の１種またはそれ以上の帯域（又は層）は
、１種またはそれ以上の他の種々の望ましいが任意の成
分、例えば界面活性剤、増粘剤、酵素活性化剤、発色剤
溶剤、緩衝剤、結合剤、硬化剤などを含むことができる
。これらの成分は当業者に知られた量で存在できる。代
表的な要素成分は、例えば米国特許第４，２５８，００
１号、第３，９９２＋１５８号、第４，０４２，３３５
号及び第４，１４４，３０６号（全て前に記載した）、
第４，１３２．５２８号（１９７９年１月２日にアイケ
ンベリー（Ｅｉｋｅｎｂｅｒｒｙ）らに対して発行〕、
第４，０５０，８９８号（１９７７年９月２７日にゴソ
フェ（Ｇｏｆｆｅ　）らに対して発行〕、並びに第４，
２７５，１５２号（１９８１年６月２３日にエスダーズ
（Ｅｓｄｅｒｓ）らに対して発行〕中に記載されている
。

本発明のアッセイは手動及び自動のいずれであることも
できる。一般に、全血中の分析物質の量は、供給用巻取
、チップパケット又は他の供給源から要素を引き取り、
それを全血のサンプルと物理的に接触させることによっ
て測定する。このような接触は任意の適当な方法で、例
えば要素をサンプル中に浸漬することによって、または
好ましくは、要素の試薬／塗布帯域にピペット又は他の
適当な計量分配手段を用いて１ａのサンプルを手動また
は機械でスポットすることによって実施できる。

サンプル適用後、試験結果を早く又は容易に得るために
望ましいであろう任意の状態調製、例えばインキュベー
ション、加熱などを要素に対して行なう。

分析物質が存在するならば、次いでサンプル中の分析物
質の濃度に基づく速度で分析物質が相互作用組成物と相
互作用し、染料の形成速度が測定される。或いは、終点
アッセイの場合には、染料を検出するための適当な装置
が設けられた帯域に要素を通すことによって、分析物質
濃度に正比例して形成された染料の量が測定される。例
えば染料は当業界において公知の適当な分光光度装置及
び分光光度法を用いて検出できる。

以下の例中において、ゾニル（Ｚｏｎｙｌ　）　Ｆ　Ｓ
　Ｎ”はデュポン（ＤｕＰｏｎｔ＋プラウエア州ウィル
ミントつン）から入手し、ペルオキシダーゼはマイルズ
・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、インディアナ州エルクハート）から購入し、グル
コースオキシダーゼはシグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｒｐ
、＋ミズーリ州セントルイス）から入手し、コレステロ
ールエステルヒドロラーゼはエンザイム・ディベロプメ
ント社（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏ
ｒｐ、、ニューヨーク州ニューヨーク）から購入し、そ
してコレステロールオキシダーゼはアップジョン社（Ｕ
ｐｊｏｈｎ　Ｃｏｒｐ、。

ミシガン州力うマズー）から購入した。他の全ての試薬
及び材料はイーストマン・コダソク・カンパニ（Ｅａｓ
ｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋＝ニーヨーク
州ロチェスター）ハロチェスタ一 本発明の詳細な説明するために以下の例を記載する。

例１ これは、グルコースを測定するための本発明のアッセイ
と従来技術のグルコースアッセイとを比較する比較例で
ある。

未希釈の全血中のグルコース定量用分析要素を本発明に
従って次のようにして調製した。ポリ（エチレンテレフ
タレート）フィルム支持体上に順に下記の成分材料を有
する記録層及び試薬／塗布層を塗布した。

（以下余白） この分析要素の数種のサンプルの各々に、種々の量のグ
ルコース（０〜６００　ｍｇ／　ｄｉ）を含む未希釈の
全血の１０μｌのサンプルをスポットした。各要素サン
プルを室温で５分間以内の時間、インキュベートし、イ
ンキュベーション時間内の種々の時点で常用の分光光度
針を用いて６６０ｎ’ｍにおいて反射濃度を読み取った
。

第１図に記した分光光度計の読みは、本発明のアッセイ
によれば、グルコース濃度間を非當によく区別でき、し
かも分析が迅速である（即ち、２〜３分間以内）ことを
示している。

この例において評価した従来技術のアッセイは米国特許
第４，０４２，３３５号（前記）に従って調製した下記
の分析要素（対照Ａ及びＢとして記載）を用いた。

（以下余白） 対照Ａ及びＢはまた、前記米国特許第４，２５８，００
１号の実施例４及び前記特公昭５７−１０１７６０号公
報の実施例２中に記載された要素と同様である。

これらの要素のいくつかのサンプルの各々に、種々の量
のグルコース（６０〜６５０　ｍｇ／　ｄｉ）を含む未
希釈の全血のｌＯμβのサンプルをスボットシた。

各要素サンプルを室温で５分間以内の時間、インキュベ
ートし、インキュベーション時間内の種々の時点で富用
の分光光度針を用いて５６５ｎｍにおいて反射濃度を読
み取った。

対照要素Ａ及びＢについての分光光度針の読みを各々第
２図及び第３図に記した。第２図及び第３図の結果は、
対照Ａ及びＢを用いたアッセイが本発明のアッセイに比
べて、比較的高いグルコース濃度において、特にかなり
遅いことを示している。反応曲線は、５分後でさえ終点
に達していないことを示している。この結果はまた、比
較的高いグルコース濃度においては濃度レベル間の区別
が極めてしにくいことを示している。

肛 トルイジン発色剤を用いた本発明のグルコースこれは８
−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸の代わりにトル
イジン発色剤を用いた以外は前記例１と同様な比較例で
ある。

８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸の代わりに０
．５〜５ｇ／ｎ＋のＮ−エチル−Ｎ−２−スルホエチル
−ｍ−）ルイジンを発色剤化合物として用いた以外は前
記例１に記載した要素と同様に本発明に従って要素を調
製した。

対照要素Ｃは、試薬／塗布層と記録層の間に輻射線阻害
／濾過層をはさんだ以外は同様に調製した。この追加層
は前記例１の対照Ａ及びＢの場合ど同様に調製した。対
照Ｃは、米国特許第４，０４２゜３３５号（前記）の軟
水に対応する。

各要素のいくつかのサンプルの各々に、種々の量のグル
コース（０〜５９０　ｍｇ／　ｄｉ）を含む未希釈の全
血の１０μｌのサンプルをスポットし、例１において要
素サンプルを評価したのと同様にして評価した。本発明
の要素はヘモグロビン妨害を回避するために６６０ｎｍ
で評価し、一方、対照Ｃは輻射線／濾過層がヘモグロビ
ン妨害を阻害するので５６５ｎｏ＋において評価した。

トルイジン発色剤を用いて遊離した染料は、いずれの波
長においても分光光度法によって検出できるが、λａ＋
ａｘは、５６５　ｎｍの方に近い。本発明の要素及び対
照Ｃ要素についての分光光度針の読みを各々第４図及び
第５図に記した。

これらの結果は、本発明のアッセイでは対照Ｃアッセイ
より迅速なアッセイが可能なことを示している０本発明
の反応曲線が非密に速く（３分未満で）平らになるのに
対して、対照Ｃに関する反応曲線は、比較的高いグルコ
ース濃度において特に５分後でもまだ上昇している。更
に、対照Ｃ要素の場合には特に比較的高いグルコース濃
度レベルにおいて区別が難しい。

註 コレステロール 全血中のコレステロール定量用分析要素を以下のように
して製造した。ポリ　（エチレンテレフタレート）フィ
ルム支持体上に順に以下の成分材料を含む記録層及び試
薬／塗布層を塗布した。

（以下余白） この分析要素のいつくかのサンプルの各々に、種々の量
のコレステロール（１６６、２２６，２８７及び３６９
　ｍｇ／　１２　）を含む未希釈の全血の１０μｌのサ
ンプルをスポットした。各要素サンプルを３７℃で５分
間以内の時間、インキュベートシ、インキュベージジン
時間の終りに各コレステロール濃度に関して６３０ｎｍ
において反射濃度を読み取った。観察した反射濃度の読
みをコレステロール濃度の関数としてプロットして、第
６図に示した検量線を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々の量のグルコースを含む未希釈の全血サ
ンプルの本発明によるアッセイに関する、６６０　ｎｍ
において測定した反射濃度を時間（分）に対してプロッ
トしたグラフ図であり； 第２図及び第３図は、種々の量のグルコースを含む未希
釈の全血サンプルＱ従来技術の教示によるアッセイに関
する、５６５ｎｍにおいて測定した反射濃度を時間（分
）に対してプロットしたグラフ図であり； 第４図は、グルコースアッセイを別の発色剤を用いて実
施した以外は第１図と同様なプロットを示すグラフ図で
あり； 第５図は、グルコースアッセイを従来技術の教示に従っ
て実施した以外は第４図と同様なプロ・ノドを示すグラ
フ図であり； 第６図は、種々の量のコレステロールを含む未希釈の全
血サンプルの本発明によるアッセイに関する、６３０ｎ
ｍにおいて測定した光学濃度（Ｄｒ）をコレステロール
濃度（ｍｇ／ｄｉ）に対してプロ・ノドしたグラフ図で
ある。 （以下余白） １２３４５６　時間（剣

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、過酸化物賦活活ｊ生を有する物質を含んでなる全血
   中の分析物質に対する相互作用組成物を含む、全血中の
   分析物質の検出用多帯域要素であって、全血球濾過帯域
   を含まず且つ該分析物質と相互作用した時に該相互作用
   組成物が６００ｎｍまたはそれ以上の波長において分光
   光度法で検出され得る染料を生成できることを特徴とす
   る多帯域要素。 ２、全血中の分析物質の検出方法であって、（Ａ）過酸
   化物賦活活性を有する物質を含む全血中の分析物質に対
   する相互作用組成物を含む全血中の分析物質の検出用多
   帯域要素であって、全血球濾過帯域を含まず且つ該分析
   物質と相互作用した時に該相互作用組成物が６００ｎｍ
   またはそれ以上の波長において分光光度法で検出され得
   る染料を生成できる多帯域要素と全血のサンプルとを接
   触させて、６００ｎｍまたはそれ以上の波長において分
   光光度法で検出され得る染料を生成せしめ、そして、 （Ｂ）該染料を６００ｎｍまたはそれ以上の波長におい
   て検出する 工程を含んでなる検出方法。