JPH03123791A - １，２―ジオキセタン化合物の製造方法 - Google Patents

１，２―ジオキセタン化合物の製造方法

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JPH03123791A JP2033598A JP3359890A JPH03123791A JP H03123791 A JPH03123791 A JP H03123791A JP 2033598 A JP2033598 A JP 2033598A JP 3359890 A JP3359890 A JP 3359890A JP H03123791 A JPH03123791 A JP H03123791A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、■、２−ジオキセタン分子中の酵素によって
切断しうる基の酵素性分解によってもたらされる光学的
に検出可能な反応を用いて特異的結合対の一員を検出し
且つ定量化しうる検定法に用いる有用な１，２−ジオキ
セタン類の製法に関する。
［従来の技術］ １．２−ジオキセタンとして知られる４員環の有機ペル
オキシドは既知化合物であるが、これまでめったに利用
されたことのない化合物群である。
それらの化合物固有の化学的不安定性ゆえに、いくつか
の１，２−ジオキセタンはある種の条件下で（例えば酵
素の作用により）化学発光分解を示し、このことは“ジ
オキセタンの酵素性分解を用いる物質の検出法”と題す
る係属中の米国特許出願第８８９８２３号に開示されて
いる（これらの技術内容は参照によりここに引用される
）。このような化学発光の間に放出される光線の量は発
光物質の濃度の尺度であり、ひいてはその前駆物質（す
なわち１．２−ジオキセタン）の濃度の尺度である。従
って、発光の強度および持続時間を測定することによっ
て、■、２−ジオキセタンの濃度（それゆえに検定すべ
き物質、すなわち特異的結合対の１，２−ジオキセタン
貰子に結合した物質、の濃度）を求めることができる。
１．２−ジオキセタン環の置換基を適当に選択すると、
その分子の化学的安定性を調節することができ、ひいて
は化学発光の開始をコントロールすることができ、それ
により実施目的のための、例えば上記出願明細書中にあ
る化学発光イ・ムノアッセイにおける、この種の化合物
の化学発光作用の有用性を高めることができる。
オレフィン性二重結合の光酸化による１、２−ジオキセ
タンの製造は知られている。しかしながら、容易に入手
しうる出発物質から扱いやすい中間体を経て誘導される
オレフィン性不飽和前駆物質からの置換１．２−ジオキ
セタン類の便利な一般的合成法の必要性が存在する。こ
れに関連して、次式： （式中、ＲはＣ１−Ｃ４アルキルであり；Ｍはアルカリ
金属またはアンモニウムである）の置換１，２−ジオキ
セタンをエノールエーテル型から製造するための商業的
に有用な方法の必要性が特に存在する。
エノールエーテル化合物はいくつかの古典的方法、例え
ばアセタールからのアルコールの酸触媒除去（Ｒ，Ａ、
　Ｗｈｏｌ、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　ｐ、３８（１９
７４））、塩基性媒体中でのアルコキシメチレンシラン
またはホスホランとアルデヒドまたはケトンとのピータ
ーラン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）またはウィッチヒ（Ｗｉｔ
ｔｉｇ）反応Ｏｔａｇｎｕｓ、　Ｐ、ら、　Ｏｒｇａｎ
ＯＩＤｅｔａｌｌｉｅＳ、ｌ、　５５３（１９８２））
、およびアルコキシ酢酸シアニオンとケトンとの反応そ
れに続くプロピオラクトンの形成およびＣＯ２の除去（
Ｃａｒｏｎ、　Ｇ、　　ら、　Ｃａｎ。
Ｊ、　Ｃｈｅｗ、、　５Ｌ　１９８１（１９７３））に
より製造することができる。ケトンエノシートアニオン
のＯ−アルキル化は可変量の付随して形成されるα−ア
ルキル化ケトンゆえに（その程度は溶媒、塩基、アルキ
ル化剤およびケトンの構造に左右される）、一般的製造
法としてあまり用いられない（Ｉｌ、　Ｏ。
Ｈｏｕｓｅ、　’″Ｍｏｄｅｒｎ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ
　Ｒｃａｃｔｌｏｎｓ　　ｐ、１６３−２１５　（Ｂｅ
ｎｊａｍｌｎ、　１９６５）　；およびＪ、　Ｄ、　Ｒ
ｏｂｅｒｔｓおよびＭ、　Ｃ，Ｃａ５ｅｒｉｏ、　”Ｂ
ａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆＯｒｇａｎｉｃ
　Ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ”（Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　１９６
４）を参照されたい）。発癌性溶媒として知られるヘキ
サメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）を使用する場合は
、よく見積もっても、０−アルキル化生成物の収率は７
０％以下である。その−ヒ、Ｃ−アルキル化ケトンから
のエノールエーテルの分離は非常に退屈な作業である。
アダマント−２−イル−アリールケトンは１９６０年代
の末期から知られているが（Ｃｈｅｍ、　Ａｂｓｔ、　
７１：Ｐ８０８１２Ｖ）、それらをＯ−アルキル化する
試みは文献に全く報告されていない。今や、極性非プロ
トン性溶媒のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での
エノシートとしてのこれらのケトンと“ハード（ｈａｒ
ｄ）”な離脱基を含む反応性アルキル化剤（ＦＩｅｍｌ
ｎｇ、　１．、“Ｆｒｏｎｔｉｅｒ　０ｒｂ１ｔａｌｓ
　ａｎｄＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎｓ　　、　ｐ、４０　（Ｗｉｌｅｙ。
１９７Ｂ）を参照されたい）との反応はもっばらＯアル
キル化をもたらすことが見出された。このようにして得
られたエノールエーテルは１．２−ジオキセタン合成に
おける有利な中間体として使用される。この種の中間体
はシングレット酸素（化学的または光化学的に発生され
る）と反応して化学発光ジオキセタン分解に基づく検定
法において有用な十分に安定性のある１、２−ジオキセ
タンをもたらす物質を製造するために使用される。この
Ｏ−アルキル化法は一般的であり、それ故に他のシクロ
アルキルアリールケトン物質にも応用できる。このシク
ロアルキルアリールケトンは適当な第ニジクロアルキル
アルデヒドとアリールグリニヤール試薬との反応、およ
び得られた第二アルコールのジョーンズ試薬による酸化
によって合成することができる。好ましくは、グリニヤ
ール試薬は第ニジクロアルキルニトリルと反応させ、続
いて酸加水分解してイミン塩を形成させる。すべての場
合において、出発物質および生成物はシクロアルキル系
の第二炭素原子、縮合ポリシクロアルキル（例えばアダ
マンチル）系の場合には、両側にブリッジヘッド（ｂｒ
ｉｄｇｅｈｅａｄ）炭素原子が存在する第二炭素原子、
に結合された官能基を含有する。
発光を用いた従来の検定方法として代表的なものは、■
標識酵素としてＰＯＤを用い、基質としてＨＯ及びルミ
ノールを用いるＥＩＡ法、２ ■アクリジンエステルを標識体として用い、Ｈ２Ｏ２で
発光させるＣＬＥＩＡ法が知られている。
し発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の方法の■の場合、低濃度のリガン
ド測定に対して定量性がな（、■の場合はラベル体自体
の増幅ができない等の欠点を有していた。そのため、高
感度の測定を目指すにはより多くの光量をもった測定法
の開発が望まれていた。
本発明は上述の如き従来方法の欠点を克服し得た。
すなわち、本発明の目的は、１，２−ジオキセタンの化
学発光分解に基づく検定法において有用な１，２−ジオ
キセタン類の新規合成法を提供することである。
本発明の目的並びにそれらの利点は、以後の説明および
特許請求の範囲を参照することにより十分に理解される
であろう。
［課題を解決するための手段］ 前記の目的は、本発明に従って次式で表される１、２−
ジオキセタン類は下記反応工程によって合成される： （式中、ＲはＣ−Ｃアルキルであり；Ｍはア４ ルカリ金属またはアンモニウムである）本発明による１
、２−ジオキセタンの製法は以下の反応式で表される： ＯＲ ００Ｍ＋ ＯＲ Ｒ 式中、Ｒ１は独立してＲについて先に定義した置換基の
いずれかであり得；Ｗ−はハロゲンイオン（例えば塩素
イオン）のような酸アニオンであり；そしてＸおよび“
Ｒ化剤”は以下で定義する通りである。
前記の反応式はそれぞれの反応生成物を単離しながら段
階的に実施される。しかしながら、段階ＶＩ（ＣＮ−″
または有機スルフィネートイオンのような求核酸性化ア
ニオンによるアルキル基切断）および段階■（β−説離
反応を経る脱保護）は中間体のリン酸エステル塩を単離
することなく有利に行われ、この種の中間体はその存在
を確認するときのみ単離する必要がある。
前記の反応式の段階■および■において、段階■で用い
られる塩のカチオンＭ＋および段階■で用いられる塩基
のカチオ／Ｍ　はアルカリ金属イオン（例えばＮａ　　
）またはアンモニウムイオンである。こうして段階■お
よび■の生成物は次の通りである。
Ｒ さらに、第四アンモニウムカチオンは以下のようにその
四級化基の１つを介してポリマー主鎖へ結合することが
でき： あるいはそれ自体がポリ第四アンモニウム塩の一部であ
り得る。
前記の合成経路内に示されるように、本発明の方法は次
式： （式中Ｔはカルボニル基に対してα位の炭素原子にスピ
ロ結合されている）で表される化合物と、Ｒ−サルフェ
ート、トルエンスルホネート（トシレート）、メタンス
ルホネート（メシレート）、トリフルオロメタンスルホ
ネート（トリフレート）、およびクロロメチルエーテル
並びにトリアルキルオキソニウム塩より成る群から選ば
れるアルキル化剤（Ｒの定義と合致するより一般的な用
語では“Ｒ化剤”）とを、塩基性、極性、非プロトン性
媒体（例えばジメチルスルホキシド中のアルカリ金属ア
ルコキシド）中で反応させることによって、次式： （式中ＲおよびＲ１は先に定義した通りである）で表さ
れる化合物を得る工程を包含する。
本発明の方法はさらに、次式： で表される化合物と次式二 Ｘ （式中Ｘはハロゲン（例えばクロロ）のような電気陰性
離脱基である）で表される化合物とを、液状芳香族化合
物（例えばベンゼン、トルエン）、エーテル（例えばグ
リム、ジグリム）または環状エーテル（例えばテトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）のような非プロトン性有機溶媒中
に溶解した第三アミン（例えばトリエチルアミン）のよ
うなルイス塩基の存在下で反応させることから成る次式
：の使用に代わるべきものとして、類似のハロホスフィ
ツトすなわちＸＰＯ□　（ＣＨ２）２を使用しその後酸
化および照射をすることにより、直接ジオキセタンを形
成することもできる。
さらに、本発明の方法は次式： で表される化合物と式ＭＣＮとで表される化合物とを反
応させることから成る次式： （式中Ｒは先に定義した通りである）で表される化合物
の合成工程を包含する。ハロホスフェート（式中、Ｒお
よびＭは先に定義した通りである）の化合物の合成工程
を包含する。
上述の酸化は光存右下にオレフィンを一重項酸素（１０
゜）で処理することによって光化学的に実施することが
好ましい。１０　は二重結合して下記のようにジオキセ
タンを形成することができる： ＯＲ０ 反応は一７８℃、ハロゲン化溶媒（例、塩化メチ■ シン）中で実施することが好ましい。　０２は光増感剤
を用いて発生させることができる。光増感剤としては高
分子結合ローズベンガル〔センシトツクスＩ　（Ｓｅｎ
ｓｉｔｏｘ　Ｉ　）として市販されておりハイトロン研
究所（Ｈｙｄｒｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎ
ｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋ、　Ｎ、　Ｊ、）から入手可能
〕およびメチレンブルー（有名な色素かつｐＨ指示薬）
などを使用することができる。好適な増感剤はローズベ
ンガルである。
本発明の方法で製造した１、２−ジオキセタン化合物は
光の発生方法に使用できる。この方法は試料中の特定の
物質の存在または濃度を求めるために視覚的検定方法と
して利用することができる。
上記の１，２−ジオキセタン類はこれらの検定法のいず
れにも使用しうる。こうした検定法の例には、抗体また
は抗原（例、αまたはβ−ｈＣＧ。
ＴＳＨ，ＬＨ等のホルモン、ＡＦＰ、ＣＥＡのような癌
関連抗原）を検出する免疫検定法（酵素免疫測定法）；
酵素検定法（例、アルカリホスファターゼ）；カリウム
またはナトリウムイオンなどを検出する化学検定法；お
よびウィルス（例、Ｈ３ＶＩ、ＨＴＬＶＩ［Ｉもしくは
サイトメガロウィルス）−または細菌（例、大腸菌）な
どを検出するヌクレオチドプローブ法が含まれる。
検出される物質が抗体、抗原または核酸である場合には
、ジオキセタンの （以下Ｚ基と略す） を切断可能な酵素、すなわち酸性又はアルカリ性ホスフ
ァターゼが、検出される物質に特異的な親和性を有する
物質（すなわち検出される物質に特異的に結合する物質
）（例、それぞれ抗原、抗体、または核酸プローブ）に
結合することが好ましい。
酵素を特異的親和性物質に結合させるために常法（例、
カルボジイミドカップリング）が使用される；結合はア
ミド結合を介することが好ましい。
一般的に検定法は下記のように実施することができる。
検出される物質を含む試料と、検出される物質（例えば
抗原）に特異的親和性を有する物質（例えば抗体）に結
合した酵素を含む緩衝液に接触させ更に特異的親和性を
有するもう一つの物質（例えば抗体）を結合した固相（
例えば抗体結合のビーズ）に接触させる。一定時間イン
キュベーションした後過剰の特異的親和性を有する物質
に結合した酵素を洗い流し、その酵素部分によって切断
されうるＺ基を有する１、２−ジオキセタン類（基質）
を添加する。酵素はＺ基を切断してジオキセタンを２つ
のケトン（またはＸ基が水素の場合はアルデヒドとケト
ン）に分解する；ケうして励起されて発光する。この発
光はキュベツトまたはカメラルミノメータ−などを用い
て、試料中に検出される物質が存在することの指標とし
て検出される。物質の濃度を求めるために発光強度を測
定することができる。
検出される物質が酵素である場合には、特異的親和性物
質（例えば抗体）は不必要である。その代わりに検出さ
れる酵素によって切断されうるＺ基を有する１、２−ジ
オキセタン類（その酵素の基質）を使用する。そこで、
酵素の検出法は、酵素−含有試料への１，２−ジオキセ
タン類の添加、および酵素の存在と濃度の指標として得
られる発光の検出を含むものである。
［実　施　例］ 以下に本発明の詳細な説明するために実施例が記載され
るが、本発明は何らそれらに限定されず、その要旨を逸
脱しない範囲での修飾および変法を含むものと思われる
。
実施例　１ （Ａ）３−メトキシフェニルアダマント−２−イルケト
ン マグネシウム削り屑（１，６４ｇ、　０．０６７モル）
をアルゴン雰囲気下で火炎乾燥フラスコに入れた。
ヨウ素の小さい結晶および乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）（水素化アルミニウムリチウム上で新たに蒸留し
たもの）７ｍｌを加えた。一定量（７ｍｌ、　０．０５
５モル）の３−ブロモアニソールを注射器から穏やかに
撹拌した金属懸濁液に加えた。
５０℃で短時間加熱後発熱反応が始まった。フラスコを
室温の水浴に入れ、その間Ｔ　ＨＦ　（３３ｍｌ）を滴
下ロートから細流として添加した。発熱反応がおさまっ
た後、この混合物を４５分間還流した。その還流しつつ
あるグリニヤール試薬へ乾燥ＴＨＦ５０ｍｌ中の２−シ
アノアダマンタン（８，７ｇ、　０．０５４モル；　“
Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”　、　５７．８
　（Ｗｉｌｅｙ。
１９７７）またはｖａｎ　Ｌｅｕｓｅｎ、　Ａ、　Ｍ、
　ら、　Ｊ、　Ｏｒｇ。
Ｃｈｅｍ、、　　４２．３１１４　（１９７７）を参照
されたい）の溶液を１．５時間にわたって滴下した。こ
の反応混合物を還流温度で一晩加熱した後、黄色の＠濁
液を得た。フラスコとその内容物を水浴中で冷却してい
る間に、エーテル（５０ｍｌ）を加えた。濃塩酸（８ｍ
ｌ、　０．０９６モルＨＣ，Ｑ）を激しく撹拌シナ力ら
２０分間にわたり滴下した。沈殿物をン濾過により分離
し、エーテルで洗い、乾燥してケテンイミン塩２９ｇを
若干の残留マグネシウムを含む淡黄色の非吸湿性粉末と
して得た。この塩をエタノール９０ｍ１と濃塩酸９０ｍ
１との混合物中に懸局し、３時間還流した。その間に混
合物はかなり薄くなった。水浴で冷却後、得られた固形
物を砕き、ン濾過により分離し、中性になるまで洗浄し
、乾燥して薄い灰色のケトン１３．６５ｇ　（２−シア
ノアダマンタンに基づいて収率９３％）を得た（融点１
１１〜１１４℃）。
薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）はこの生成物が
その後の操作によって十分な純度であることを示した（
ＲｆＯ，４５；　Ｋ５Ｆ−ＣＨ２Ｃ１ｌ　：ヘキサン５
０　：　５０）。ヘキサンから再結晶してプリズム晶と
して表題化合物を得た（融点１１３〜ｃｍ−’　（Ｃ＝
０）　、　１５９０ｃｍ−１，１５７５ｃｍ−’により
生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
（Ａ）に従って製造した一定量（１１，３ｇ、　０．０
４２モル）の３−メトキシフェニルアダマント−２−イ
ルケトンをモレキュラーシーブ乾燥（３人）ジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳ　Ｏ）　９０ｍ１に懸濁した。
懸濁固体を溶解するために加熱した。撹拌しながら室温
へ冷却すると、微細な懸濁液が得られた。
カリウムｔ−ブトキシド（８，５ｇ、　０．０７０モル
）をアルゴン雰囲気下に加えた。５分後、はとんど均質
な橙色の溶液が得られ、これを５０℃の水浴に入れた。
硫酸ジメチル（４ｍｌ　、　０．０４２モル）を注射器
から１０分間にわたって滴下した。さらに１５分撹拌し
た後、追加の硫酸ジメチル（３，３ｍｌ、　０．０３４
モル）を同じやり方で加えた後、無色の溶液を室温で一
晩撹拌した。水浴で冷却後、Ｋ２ＣＯ３０，５ｇおよび
氷水１２５　ｍｌを加え、この混合物を５０ｍ１ずつの
酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機画分を水で３
回、飽和ＮａＣ４水溶液５０ｍ１で１回洗い、Ｋ２ＣＯ
３上で乾燥した。溶媒を真空除去して油状物を得た。そ
の油状物をヘキサンに溶かし、得られた溶液をセライト
を通してン濾過し、真空濃縮して粘稠性のある淡黄色の
油状物１１．５ｇ　（収率９６％）を得た。ＴＬＣは微
量のケトン出発物質を含むエノールエーテル（ＲｆＯ，
８８；　Ｅ、　ＭｃｒｃｋＡＩ　　Ｏ−ＣＨＣ，Ｑ　　
：ヘキサン５０　：　５０）へ２　３　　　　２　　　
２ のきれいな転化を示していた。ｔＲ（ＣＨ２Ｃ１ｌ　２
　）：２９００ｃｍ−１，１８００ｃｍへ１５９０ｃｍ
−１，１５８０ｃｍ−１，１５７０ｃｍ−１，１０９５
ｃｍ−’、　１０８１０８Ｏ’　；’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ
Ω３）：δ１．５−２（Ｉｌ、１２Ｈ）、　　δ２．５
５（ｓ、ＬＨ）、　　δ３．２（ｓ、ＨＩ）　。
δ３．２５（ｓ、３Ｈ）　、　δ３．７５（ｓ、３Ｈ）
、およびδ６．７−７．３（ｍ、４Ｈ）。これらのデー
タにより、この生成物の構造が次式の通りであることを
確認した。
モレキュラーシーブ乾燥（３人）ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）７０ｍｌ中の（Ｂ）に従って製造したメトキ
シ（３−メトキシフェニル）メチレンアダマンタン（１
４ｇ、　０．０４９モル）の溶液を、アルゴン雰囲気下
で同じ溶媒中のナトリウムチオエトキシド（７，４ｇ、
　０．８８モル）の溶液に加えた。この混合物を３時間
還流した。撹拌しながら水浴で冷却後、この反応を水２
００ｍ１中のＮＨ４ＣＮ６２ｇで停止させた。酢酸エチ
ル（１２０ｍｌ）および少母の氷水を加えた。水層を分
離し、酢酸エチル７５ｍ１で抽出した。有機抽出物を１
００ｍ１ずつの水で４回、次に飽和Ｎａ　ＣＤ　（ｌｏ
ｏｍｌ）で洗い、すばやくＮ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４上で乾
燥させた。この溶液を済過し、濃縮して油状物を得、そ
れをヘキサン５０ｍ１で摩砕した。回転蒸発器で溶媒を
除去すると固体が残り、それを冷へキサンで細かくすり
つぶし、ン濾過し、ヘキサンで洗った。粗製の灰白色フ
ェノール系生成物（１３ｇ）は５％Ｍ　ｅ　ＯＨＣＨｓ
　ＣＮから再結晶して無色プリズム状結晶１０ｇを得た
（融点１３１〜１３３℃）。■Ｒ（ＣＨ２０ｇ２）：３
５８０ｃｍ六３３２０ｃｍ−’、　２９１０ｃｍ−’、
　１５９０ｃｍ六１５８０ｃｍ−’１４４０ｃｍ−１に
より生成物の構造が次式の通りであることを確認した。
フェート （Ｃ）に従って製造したメトキシ（３−ヒドロキシフェ
ニル）メチレンアダマンタン（１，１ｇ。
０．００４モル）をアルゴン雰囲気下でモレキュラーシ
ーブ乾燥（３人）ベンゼン１５ｍ１に溶解した。トリエ
チルアミン（０，５７ｍ１．０．００４モル）を注射器
から加えた。この撹拌溶液を水浴で０℃に冷却し、２−
クロロ−２−オキソ−１，３−ジオキサホスホラン（０
，３７ｍ１．０．００４モル）を滴下した。水浴中で１
０分後、粘稠な混合物を室温へ徐々に温め、３．５時間
撹拌した。ベンゼンを真空除去し、アルゴン下でエーテ
ル６０ｍ１を加えた。この懸濁液を不活性雰囲気下でン
濾過し、得られた固形物を２０ｍ１ずつのエーテルで３
回洗った。ン戸液を真空除去してリン酸トリエステル１
．６ｇ−を粘稠な無色の油状物１−１ １６００ｃｍ　　、　１５７５ｃｍ　　、　１３００ｃ
ｍ−１（Ｐ＝Ｏ）　、フェノール性ＯＨの伸縮またはＣ
−０（１６７０ｃｍ−’）の吸収はＩＲスペクトルに存
在しなかった。ＴＬＣで出発物質のないことを確認した
。これらのデータは３−　（アダマンチリデンメトキシ
メチル）フェニルエチレンホスフェートの下記構造と一
致した。
上記の油状物はＤＭＦ７ｍｌに溶解し、ＤＭＦ中のシア
ン化ナトリウム（０，２１ｇ、　０．００４モル）を加
え、この混合物を室温で２４時間撹拌した。得られた黄
色の溶液を５０℃で真空除去し、２ｍｌずつのキシレン
で数回追い出し、残留物をエーテルで摩砕してガムを得
、そのガムをＣＨ２０ｇ２に取り、真空除去して淡黄色
の非晶質発泡体１．５ｇを得た。
１−１ １５９５ｃｍ　、　１５７０ｃｍ　　１４７５ｃｍ’、
　１２７５ｃｍ−’　（Ｐ　＝０）　、　１２３５ｃｍ
　　、　ｌ１００ｃｍ−’。これらのデータはナ１ トリウム３−　（アダマンチリデンメトキシメチル）フ
ェニル−２′−シアノエチルホスフェートの予測された
下記構造と一致した。
結し、１３０〜１３３℃で融解する）　０．９５ｇを得
た。
ＨＰＬＣ（逆相Ｃ１８−０，１％酢酸アンモニウム／Ｃ
Ｈ３ＣＮ勾配）は１つの主要なピークを示した。
ＩＲ（ヌジョール）　　：　１５９５ｃｍ−’　　１５
７５ｃｍ−’　　１２４５−１　　　　　　−１　　　
　　　−１ｃｍ　　、　１２００ｃｍ　　、　１０９５
ｃｍ　　、　１０８０ｃｍ−１８９０ｃｍ−１ＵＶ（２
０％ＭｅＯＨ−ジオキサン）λｍａｘ　２８０／ｎｍ　
；ε＝ｔｏ、ｏｏｏ。これらのデータにより生成物の構
造が次式の通りであることを確認した。
この塩（１，５ｇ、　０．００３５モル）は水５ｍｌに
溶解した。次いで、濃水酸化アンモニウム（５ｍｌ　）
を滴下した。この溶液を室温で一晩撹拌した。
得られた白色スラリーを水浴中で冷却し、アセトニトリ
ル３０ｍ１で処理した。ン濾過し、１５ｍ１ずつの冷ア
セトニトリルで２回洗浄して、短時間の減圧乾燥後に吸
湿性の白色固体（１１５℃で焼大きい培養試験管中で、
（Ｄ＞に従って製造したエノールエーテルホスフェート
塩０．０６５ｇ（０，０００Ｌ７モル）をＣＨＣΩｓ　
２５ｍ１に溶解した。シリカゲル上のメチレンブルー（
シリカゲル１ｇ当たり染料０．００２６ｇ）　０．２１
０ｇを増感剤として加えた。試験管は水冷した浸漬ウェ
ルの内部に２５０ワツトの高圧ナトリウムランプを含む
銀めっきしたデユワ−フラスコに入れた。−枚の５ミル
カプトン（Ｋａｐｔｏｎ；　ＤｕＰｏｎｔ社）をＵＶフ
ィルターとしてウェルの内部に置いた。この装置に氷水
をポンプで送り、試料の温度を１５０℃以下に保った。
乾燥酸素の連続流を毛細管を通して反応容器に送った。
気体流は固相増感剤の均一懸濁液を維持するように調節
した。２５分の照射時間後、出発物質のＵＶ（２６０ｎ
ｍ）吸収が消失した。淡黄色溶液を濾過し、蒸発させ、
水１０ｍ１で再調製した。この水性試料は０．４５ミク
ロンのナイロンフィルターを通してン濾過し、逆相Ｃ１
８分離用ＨＰＬＣカラムでクロマトグラフにかけ、水／
アセトニトリル勾配で溶出した。
２７７ｎｍで弱いＵＶ吸収を示す各画分を合わせ、凍結
乾燥してジオキセタンを白色の綿状吸湿性固体として得
た。この固体は融点を示さずに１４５°〜１５０℃で分
解してアダマンタノンを生成して昇華し、部分的に分解
して残留した固体は２７０℃以下では融解しない。’Ｈ
ＮＭＲ（Ｄ２０．ｐｐｍ）　：０．８９−１．８５（＋
ａ、１２Ｈ）　；　２．１０（ｓ、ＩＨ）　；　３．１
５（ｓ、　３１１）　　；ＩＲ（ヌジョールマル、　ｃ
ｍ−１）　：　３１２０．１９７０−１７９０　（弱い
２幅広−ＮＨ４）　、１６４０（幅広）　、　１６００
（弱い）　、　１５８０．１２８４．１２７３．１１２
２．９８０．８９５゜この生成物の構造は上記ＩＲおよ
びＮＭＲスペクトルにより次式の通りであると確認した
。
実施例　２ メトキシ（３−ホスホリルオキシフェニル）メチレンア
ダマンタンナトリウムアンモニウム塩（３，３ｇ）を１
滴のピリジンを含有する１５ｍ１の水に溶解させた。こ
の溶液（該化合物をピリジニウム塩の形で含む）をアン
バーライトＩ　Ｒ１２０（プラス）イオン交換樹脂（ア
ルドリッチケミカル社製）の３　ｃｍ　Ｘ　２５ｃｍの
カラムにゆっくり通した。蒸留水でこのカラムを溶出す
ると、２８０ｒｖに吸収を示すフラクションが得られ、
これらをいっしょにして凍結乾燥した。得られたモノピ
リジニウム塩（１ｇ、２．３ミリモル）の１部を１００
　ｍｌのＣＨＣｇ３（Ａｇ２０３で乾燥）に溶解した。
得られた溶液を大きなシリンダー状の試験管に入れ、５
，１０．１５゜２０−テトラフェニル−２１１１，２３
１１−ポルフィン（２ｍｇ、　　１ｍｌ　　ＣＨＣＩＩ
　Ｂ中）で処理した。得られた均一な緑色の溶液を０℃
に冷却し、スパージャ−管を通して酸素ガスで前置って
飽和した。この混合物を銀デユワーフラスコ中で一定の
０２流下に照射した。このフラスコはデュポンのカプト
ン（Ｋａｐｔｏｎ）ポリイミドフィルムの単一シート（
５ミル）で露光された２５０ワツトナトリウム蒸気ラン
プの周りを囲む冷却された浸漬壁をも含んでいる。
デユワ−フラスコ中の温度は、１２分間の照射の間００
〜５℃に維持された。溶媒を真空で除去し、続いて５０
０ｗａｇのＮａ　　ＨＣＯｓを含有する１００　ｍｌの
蒸留水を添加した。得られた淡いピンク色の溶液を冷却
し、０．４５　ミクロンのテフロン膜を通してン濾過し
た。得られたジオキセタンの水溶液を、ポリスチレンカ
ラム中ＣＨ３−ＣＮ−０，５％Ｎ　ａ　ＨＣ０３勾配を
使用した調製用逆相ＨＰＬＣに付した。続いて２回口は
、ＣＨＣＮ−Ｈ２Ｏ２ 勾配を使用してカラムに通した。得られた溶液（無機塩
を含まない）を凍結乾燥して８００　ｍｇの粒状のかす
かに黄色がかった白色固体を得た。この固体は融点を示
さずに１４５°〜１５０℃で分解してアダマンタノンを
生成して昇華し、部分的に分解して残留した固体は２７
０℃以下では融解しない。
’ＨＮＭＲ（Ｄ２０）：δ０．８５−δ１．７５（ｍ、
１２Ｈ）；δ２．１５（ｓ、１ｌＩ）　；δ２．７５（
ｓ、ＨＩ）　；δ３．１０（ｓ、３１１）　；δ７．１
０−δ７．３５（１，４１１）。ＩＲ（ヌジョールマル
）　　：１０００ｃｍ　　（弱い）　、１５８０ｃｍ−
’、１２８５ｃｍ−’１ １２７５ｃｍ’、Ｌ１２０ｃｍ−’　（幅広）　、９８
０ｃｍ−’、８９５ｃｓｎ−’。
使用例　１ ビーズ形式ｈＣＧ検定（血清または尿）抗ｈＣＧ抗体被
覆ビーズおよび抗ｈＣＧ抗体：アルカリ性ホスファター
ゼコンジュゲートはハイブリチク・タンデム・アッセイ
・キット（Ｉｌｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｔａｎｄｅｍ　Ａｓ
５ａｙ　Ｋｌｔ）から得られた。
以下に実施例２で合成した１、２−ジオキセタン（ＡＭ
ＰＰＤ）ジナトリウム塩（以下の使用例ではこの塩をＡ
ＭＰＰＤと略記した。）をアルカリホスファターゼの基
質として用いた場合のｈＣＧの検定を示した。比較のた
め、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として比色定量検
定した。
■、ビーズから過剰の緩衝液を吸い取った後、各試験管
（１２Ｘ７５＋ａ＋ａ）に１個のビーズを入れた。
２、各試験管に抗ｈＣＧ抗体ホスファターゼコンジュゲ
ート１００μｇを加えた。
３、各試験管に試料１００μｇを加えた。別の試験管に
以下のものを準備した： ａ）対照ゼロ試料（男性の血清または尿）ｂ）　２５ｍ
　Ｉ　Ｕ／ｍｌ　　ｈ　ＣＧ標品（血清または尿）ｃ）
　２００ｍ　Ｉ　Ｕ／ｍｌ　　ｈ　ＣＧ標品（血清また
は尿）ｄ）患者試料（血清または尿） ４、混合後、試験管にカバーをかぶせて３７℃で９０分
間インキュベートした。
５、コンジュゲートおよび試料を含む反応液を吸引除去
した。
６、ビーズを０．１％ツイーン２０を含むリン酸緩衝溶
液（１）Ｈ７，４）　２．０ｍＭで３回洗った。
比色定量検定 ７゜ ８、０．１　Ｍグリシン、 １＋ＭＭｇＣΩ２ （ｐＨ１０，４）中の１ｍｇ／ ｍｌ　　ｐ−ニトロフェ ニル−ホスフェート （ＰＮＰＰ）２００μｇ 化学発光検定 ７、０．０５Ｍ炭酸塩、 １ｍＭＭｇＣＱ２ （ｐＨ９，５）で１回 洗った。
８、０．０５Ｍ炭酸塩、 １　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ（１２ （ｐＨ９，５）中の０．４ ｍＭＡＭＰＰＤ ２５０μｇを加えた。
を加えた。
９、室温で３０分インキュ　９．３０℃で２０分インベ
ートした。　　　　　　　キュベートした。
ｌＯ０発色を止めるべく１０゜ ０．１Ｍグリシン、１０ ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ９，５）１．５ｍＭを
加えた。
１１、分光光度計で４０５ｎｍ　　１１．ターナ−２０
Ｅルミでの吸光度を測定　　　ツメ−ターで８試した。
　　　　　　　　　　装管の発光の１０秒間積分値を測
定 した。
１２、両検定のデータはｈＣＧの各濃度でのシグナルを
ゼロｈＣＧでのシグナルで割った値をｈＣＧの濃度に対
してプロットした。代表的なデータを第１図に示す。こ
こでＰＮＰＰは比色定量検定を、そしてＡＭＰＰＤは化
学発光検定を表す。化学発光検定は比色定量検定よりも
４倍以上高感度であった。
使用例　２ 市販のタンデムＩＣ０Ｎ　　ＩＩ検定キットを使用した
。緩衝液および抗体はすべてこのキットの中に含まれて
いるものを使用し、アルカリホスファターゼの基質は実
施例２で合成したジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）を使用し
た。
方法 ■、被検試料として使用するために、対照陰性（雄）尿
で希釈した０、　５．１０．５０ｍ　Ｉ　Ｕ／ｍｌのｈ
ＣＧ標品を用意した。
２、ＩＣ０Ｎメンプラン容器の中央に、１度５滴の試料
を滴下した。
３、各容器の中央に３滴の酵素抗体コンジュゲートを加
えた。
４．１分インキュベートした。
５、装置にハイブリチクＩ　ＣＯＮ洗液洗液２壱ｌえ、
排出させた。
６、０．１Ｍ　）リス、１ｍＭ　　ＭｇＣΩ２　（ｐＨ
９，８）中の０．１％Ｂ　Ｓ　Ａ　５００Ｍｇを加えた
。排出させた。
７．５０Ｍｇ／　ｍｌ　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄ　、　　０
．１％ＢＳＡ、１ｍＭＭｇＣ，Ｑ２を含むＯ，１Ｍ）リ
ス緩衝液（ｐＨ９，８）、２００Ｍｇを加えた。
８、ＩＣ０Ｎ膜をとり出し１枚のマイラーに移行させ、
フィルムを露光すべく暗箱に入れた（ポラロイド型６１
２）。
９、フィルムを３０秒間露光した。代表的な検定の結果
を第２図に示す。陽性試料では強い化学発光が３０秒の
反応時間内に起こった。
使用例　３ アルカリ性ホスファターゼの検定 アルカリ性ホスファターゼ検定は次の方法で実施した。
成分 緩衝液：　０．０５Ｍ炭酸塩、１ｍＭＭｇＣΩ２　　（
ｐ）１９．５） 基　質：　０．４ｍＭ濃度の３−（２’−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキ
シ）フェニル−１，２−ジオキセタンジナトリウム塩（
ＡＭＰＰＤ） アルカリ性ホスファターゼ：緩衝液中１．１６８Ｍｇ／
ｍｌのアルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試
験管内で次の最終酵素濃度となるように行った： ４．１７ｘｌＯ”　Ｍ　　　１．６７Ｘ１０−１５Ｍ８
．３４ｘｌＯ−１２Ｍ　　　８．３４ｘｌＯ−１６Ｍ１
．６７ｘｌＯ−１２Ｍ　　　４．１７Ｘ１０−１６Ｍ３
．３４Ｘ１０−１３Ｍ　　　２．０９Ｘ１０”　Ｍ６．
６８ｘ　１０”　Ｍ １．３４Ｘ　１０”　Ｍ ３．３４Ｘ　ｔｏ−１５Ｍ 手順： 上記濃度のアルカリ性ホスファターゼを含みさらに０．
４＋ａＭ　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄを含む２通りの試験管は
３０℃で２０分インキュベートした。インキュベーショ
ン後、ターナ−２０Ｅルミノメータ−で３０秒間の発光
積分量を測定した。アルカリ性ホスファターゼの検出限
界を表Ｉに示す。第３図には、０．４ｍＭ　ＡＭＰ　Ｐ
　Ｄを用いたアルカリ性ホスファターゼの検出データを
示す。発光は、０−１４〜１０”　Ｍ酵素の間で直線状
であった。
表　　　　Ｉ （１，１２） １、緩衝液：　０．０５Ｍ炭酸塩、１　ｍＭ　　Ｍ　ｇ
　ＣＩ　２、ｐＨ＝９．５゜温度二３０℃。化学発光化
合物濃度：　０．４ｍＭ。
２、かっこ内の数字は表示濃度でのバックグラウンドレ
ベルの倍数である。
使用例　４ 検定 アルカリ性ホスファターゼ検定は次の方法で実施した。
成分 １１１Ｍ：０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、１　ｍＭ　　Ｍ
　ｇ　Ｃ（１２（ｐＨ９，５） 基　質：　０，４ｍＭ濃度の３−（２’−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキ
シ）フェニル−１，２−ジオキセタンジナトリウム塩（
ＡＭＰＰＤ） アルカリ性ホスファターゼ：緩衝液中１．１６８Ｍｇ／
ｒｎｌの原液 条件： １、緩衝液のみ（対照） ２、緩衝液＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３、緩衝液
子ＢＳＡ−フルオレセイン（ＢＳＡ対フルオレセインの
比１：３） ４、緩衝液＋ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチル
−アンモニウムクロライド’））（ＢＤＭＱ）５、緩衝
液＋ＢＤＭＱ＋フルオレセイン　（ＢＤＭＱｌ　ｍｌと
混合したフルオレセインジナトリウム塩０．０１ｍｇ） アルカリ性ホスファターゼ原液の段階的希釈は試験管中
で次の最終酵素濃度となるように行った：ここで条件２
〜５の緩衝液以外のエンハンサ−成分は系全体の０．１
重量％存在する。
４．１７Ｘ　１０″″”　Ｍ　　　　１．６７ｘ＋０−
１５Ｍ８．３４Ｘ１０　　　Ｍ　　　　８．３４Ｘ１０
−１６Ｍ１２ １．６７ＸｌＯＭ　　　４．１７Ｘ１０−１６Ｍ１２ ３．３４Ｘ　１０　　Ｍ　　　　２．０９Ｘ　１０−１
６Ｍ１３ ６．６８ｘｌＯＭ　　　　１．ＯｘｌＯ−１６Ｍ１４ １．３４Ｘ１０　　　Ｍ　　　　５．ＯＸｌ０−１７Ｍ
１４ ３．３４ＸｌＯＭ　　　　２．５　ＸＩＯ”　Ｍ１５ 手順： いろいろな条件において、上記各種濃度のアルカリ性ホ
スファターゼに０．４ａ＋Ｍ　　ＡＭＰＰＤを加えた２
通りの試験管を３０℃でインキュベートした。
条件１，４および５は２０分インキュベートし、条件２
および３は９０分インキュベートした。
インキュベーション後、ターナ−２０Ｅルミノメータ−
で３０秒間の発光積分量を測定した。アルカリ性ホスフ
ァターゼの検出限界に対するＢＳＡ。
ＢＤＭＱおよびフルオレセインの効果を第４図および表
■に示す。第４図中−ローは上記条件１、−−−■−−
−は条件２、−ｍ−〇−−−は条件３、−ｍ−・−−−
は条件４、−一一△−−−は条件５を各々示す。
表　　　■ 添加 なし ０．１％ＢＳＡ バックグラウンドの ２倍のカウント量を 示すアルカリ性ホス ファターゼの濃度 １．０Ｘ１０”　Ｍ ９．５ＸｌＯ−１５Ｍ アルカリ性ホスファ ターゼの最低検出濃度 １．８７ＸｌＯ−１５Ｍ（１，１２）’８．３４ＸｌＯ
−１６Ｍ（１，０６） ０．１％ＢＤＭＱ ４．０Ｘ１０”　Ｍ １．０ＯＸ１０”　Ｍ（１，０７） １、かっこ内の数字は表示濃度でのバックグラウンドレ
ベルの倍数である。
使用例　５ 膜：ジーン・スクリーン・プラス社（ＧｅｎｅＳｃｒｅ
ｅｎ　Ｐｌｕｓ）、の陽性荷電したナイロン膜緩衝液：
変性緩衝液：０．５Ｍ　　ＮａＯＨ中和緩衝液：　０．
４Ｍ　　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ２，０） 負荷緩衝液：変性緩衝液　１部 中和緩衝液　１部 膜湿潤緩衝液：　０．４Ｍ）リス（ｐ）１７．５）膜プ
レハイブリダイゼーション緩衝液：最終濃度 ０．５ｍｌ　　１００ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’Ｓ溶液　　
　５％０．５ｍｌ　　１０％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　　　　　　
　　　０．５％２．５ｍｌ　　２０ｘＳＳＰＥ　　　　
　　　　　５％２、ｈｇ　　変性、超音波処理サケ　　
２００μｇ／ｍｌ精子ＤＮＡ ｄｄＨｚ０ ０ｍ１ ０．５ｍ１ Ｏ，５ｍ１ ２．５ｍ１ ２、ｈｇ ２．０ｍ１ １００　Ｘ　Ｄｃｎｈａｒｄｔ　’ｓ溶液１０％　　５
ＤＳ ２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ サケ精子ＤＮＡ ５０％硫酸デキストラン ｄｄＨｚ０ ０ｍｌ 洗浄緩衝液Ｉ： １ｘＳＳＰＥ１０．１％ ２０ｍ１　２０ｘＳＳＰＥ ４ｍｌ　　１０％　ＳＤＳ ３７６ｍｌ　　ｄｄＨｚ　Ｏ ００ｍ１ 洗浄緩衝液■： 洗浄温度に予備加温した０、１× Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅｌｏ、１％　５ＤＳ ２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ １０％　ＳＤＳ ＳＤＳ ００ｍ１ （加温） ５％ ０．５％ ５％ ２００μｇ／ｍ１ １０％ 洗浄緩衝液■： ０．ＩＸ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　１０．１％　ＳＤＳ２０ｍ
ｌ　　２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ ４ｍｌ　　１０％　ＳＤＳ ３９４ｍｌ　　ｄｄＨ２０ ００ｍ１ 洗浄緩衝液■： ３ｍＭ　　トリス−ＨＣＮ　（ｆ）Ｈ９，５）０．６ｍ
ｌ　　ＬＭ　　トリズマ塩基（Ｔｒｌｚｍａ　Ｂａ５ｅ
）１９９．４ｍｌ　　ｄｄＨ２０ ２００，０ｍ１ １００　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　’ｓ溶液：分子量４０
にのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−４０）２ｇおよび
フィコール２ｇを６５℃以上の沸点以下の温度で溶解し
た。この溶液を約４０℃に冷却し、ＢＳＡ２ｇを加え、
ｄｄＨ２０で最終容量を１００ｍ１とした。アリコート
に分けて、−２０’Ｃで貯蔵した。
２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ ２ＯＸＳＳＣ（全量１００ｍ１） ３．０Ｍ　塩化ナトリウム　　　　１７．４ｇ０．３Ｍ
　クエン酸ナトリウム　　　８．８ｇ容量を１００ｍ１
となし、０．４５−ニトロセルロースフィルターを通し
て濾過し、室温で貯蔵した。
２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ ２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　（ｐ）１７．４）　（全量１
ｇ）３．６Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ（１２１０，２４ｇ２００
ｍＭ　　リン酸ナトリウム　　２３ｇ二塩基性５．９２
ｇ−塩基性 ２０ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　　　７．４４ｇ溶
解し、５Ｎ　　ＮａＯＨでｐＨ７，４に調整し、容量を
Ｉｎとし、０．４５如ニトロセルロースフイルターを通
してン濾過した。
　ＸＴＥ ＩＸＴＥ緩衝液　　　１０硅トリス（ｐｔ１７．０）１
ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ オートクレーブ処理 方法： ■、膜を湿潤緩衝液で１５分間前もって湿らせた。
２、膜を真空マニホールド装置に挿入した。
３、ＤＮＡ試料（既知コピー数のＨ５ＶＩ　　ＤＮＡを
含む）５０ｇｇを変性緩衝液２００μｇに加えることに
よりＤＮＡ試料を変性した。室温で１０分インキュベー
トした。氷冷した中和緩衝液２５０μｇを加え、変性Ｄ
ＮＡを氷上に保持した。
４、各ウェルに負荷緩衝液２００μｇを加え、膜を通し
て吸引した。
５、各ウェルに変性ＤＮＡ試料を加え、膜を通して吸引
した。
６、ステップ４を繰り返した。
７、マニホールドを解体し、膜を取り出した。
８、ＵＶトランスイルミネーターを使ってＤＮＡを膜へ
５分間ＵＶ固定した。
９、膜をプレハイブリダイゼーション緩衝液中７０℃で
１時間インキュベートした。
１０、膜ハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したＨ８
ＶＩに特異的なアルカリ性ホスファターゼ標識５ＮＡＰ
プローブを加えた。７０℃で３〜５時間時間インキ−ベ
ート。
１１、膜をハイブリダイゼーション緩衝液から取り出し
、洗浄緩衝液Ｉ　４００ｍ１中室温で撹拌しながら１０
分間インキュベートした。
１２、洗浄緩衝液ＩＩ　４００ｍ１で５０℃、３０分洗
浄した。
１３、洗浄緩衝液ｍ　４００ｍ１で室温、１０分洗浄し
た。
１４、洗浄緩衝液ＩＶ　２００ｍ１で室温、１０分洗浄
した。
１５、膜を１枚のＷｈａｔｍａｎブロッティングペーパ
ー上に置いた。
１６、３００μｇ／　ｍｌ　　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄを含
む０．１Ｍ　）リス、１ｍＭ　　ＭｇＣ！！　２　（ｐ
Ｈ９，８）　２ｍｌを加え、膜を通過させた。
１７、その膜を１枚のマイラーへ移行させ、その後６１
２型ポラロイドフイルムを含む暗箱へ入れた。
１８、フィルムを３０分露光した。代表的な結果を第５
図に示す。ここで第５Ａ図は６０ｇｇ／ｒｎｌＡＭＰＰ
Ｄでの結果を示し、第５Ｂ図は３００μｇ／ｍｌ　　Ａ
ＭＰＰＤでの結果、そして第５Ｃ図は３００μｇ／ｍｌ
　　ＡＭＰＰＤでの初めの３０分の反応後の結果を示す
。
使用例　６ 抗ＡＦＰ抗体被覆ビーズおよび抗ＡＦＰ抗体：アルカリ
ホスファターゼコンジュゲートはハイプリチク番タンデ
ム・アッセイ・キットから得られた。
■、各試験管に試料２０μｇを加えた。試料は０．２５
゜５０、１００．および２００ｍｇ／　ｍｌ　　Ａ　Ｆ
　Ｐであった。
２、各試験管に１個のビーズを入れた。
３、各試験管に抗ＡＦＰ抗体アルカリホスファターゼコ
ンジュゲート２００μｇを加えた。
４、ラックを振って試験管の内容物を混合した。
５、試験管にカバーをかけた。
６．３７℃で２時間インキュベートした。
７、抗体および試料を吸引除去した。
８、ビーズをリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）中の０．１
％ツイーン２０　２．Ｏｍｌで３回洗った。
比色定量検定 ９゜ １０、０．１Ｍグリシン、 １　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　ＣＩＩ　２ （ｐＨ１０，４）中の１ｍｇ／ ｍｌ　　ｐ−ニトロフェ ニル−ホスフェート （ＰＮＰＰ）２００Ｉｇ を加えた。
１１、室温で３０分インキュ ベートした。
１２、発色を止めるべく ０．１Ｍグリシン、１１ ０１Ｉ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ）１９．５）１．５ｍ
ｌを加えた。
１３、分光光度計で４１０Ｉｍ での吸光度を読み 化学発光検定 ９、０．０５Ｍ炭酸塩、 １ｍＭＭｇＣΩ２ （ｐＨ９，５）で１回 洗った。
１０、０．０５Ｍ炭酸塩、 １ｍＭＭｇＣΩ２ （ｐＨ９，５）中の０．４ ｍＭ　　ＡＭＰＰＤ ２５０Ｉｇを添加した。
１１、３０℃で２０分イン キュベートした。
１２゜ １３、ターナ−ルミノ メータ−で各試験 取った。　　　　　　　　管の１０秒間積分を読み取っ
た。
１４、再検定のデータはＡＦＰの各濃度でのシグナルを
ゼロＡＦＰでのシグナルで割った値をＡＦＰの濃度に対
してプロットした。第６図に示すように、比色定量検定
の結果はＰＮＰＰ曲線で表され、そして化学発光検定の
結果はＡＭＰＰＤ曲線で表される。後者の検定は前者の
検定の約１０倍の感度であることが分かる。
使用例　７ 甲状腺刺激ホルモン（Ｔ　Ｓ　Ｈ）検定物質： 被分析体捕獲用の１／８インチビーズを、マウスモノク
ローナル抗ＴＳＨ−β抗体で被覆した。
マウスモノクローナル抗ＴＳＨ抗体はアルカリ性ホスフ
ァターゼと結合させて、検出用抗体（抗体酵素コンジュ
ゲート）として使用した。
ＴＳＨはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社カタログ番号８０９３
９６から得られ、ＢＳＡ（Ｖ型−脂肪酸不含）はＳｉｇ
ｍａ社カタログ番号Ａ　６００３から得られた。
被検液および抗体酵素コンジュゲートに用いた緩衝液は
０．１Ｍ　）リス−ＨＣ，Ｑ、ｌｄＭｇＣ，Ｑ２および
２重量％Ｂ　Ｓ　Ａ　（ｐＨ７，５）である。
基質緩衝液は０．１Ｍ　）リス、０．１ｍＭ　　ＭｇＣ
ρ２（ｐＨ９，５）および基質ＡＭＰ　Ｐ　Ｄ　（５０
Ｉｇ／ｍｌ）を含んでいた。
手順： ＴＳＨ含有被検溶液（１５μＱ）は抗体酵素コンジュゲ
ート溶液１３５μｇと混合した。この溶液に上記のよう
に被覆した１／８インチビーズ２個を加え、２３℃で２
時間インキュベートした。その後、ビーズをＯ，１Ｍ　
）リス（ｐＨ７，５）で４回洗い、反応試験管へ移した
。上記の基質を含む緩衝液２００μｇを試験管に加えた
。２０分インキュベーション後、ベルトールド・クリニ
ルマット・ルミネッセンス・アナライザー（Ｂｃｒｔｈ
ｏｌｄ　ＣｌｉｎｉｌｕｍａｔＬｕｍｉｎＣ１１ｎｉｌ
ｕ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使って１０秒間のカウント数
として発光出を記録した。
第７図（下記表■のデータのプロットである）は所定の
ＴＳＨ濃度に対する発光強度を示す。１μＵ／ｍｌと８
μＵ／ｍｌのＴＳＨの間で直線性を示した。
表　　　　■ ０．２５ ０．４９ １．１ 比較のために、ＢＳＡの不存在下で同じくＴＳＨ検定を
行った。第８図に示すように、ＢＳＡ含有試料（曲線Ａ
）はＢＳＡを含まない試料（曲線Ｂ）よりも所定のＴＳ
Ｈ濃度に対して強い発光強度を示した。
使用例　８ ビーズ形式による癌胎児性抗原（ＣＥＡ）検定抗ＣＥＡ
被覆ビーズおよび抗ＣＥＡ抗体：アルカリ性ホスファタ
ーゼコンジュゲートはハイブリチク・タンデム・アッセ
イ・キットのものを使用した。
１、各試験管に試料２０μｇを加えた。試料は０゜２．
５．　５．１０．２０および５０ｎｇ／　ｍｌ　　ＣＥ
　Ａの標準を使用した。
２、各試験管に１個のビーズを入れた。
３、各試験管に抗ＣＥＡ抗体酵素コンジュゲート２００
μｇを加えた。
４、ラックを振って試験管の内容物を混合した。
５、試験管にカバーをかけた。
６．３７℃で２時間インキュベートした。
７、反応液を吸引除去した。
８、ビーズを０．１％ツイーン２０を含むリン酸緩衝溶
液（ｐＨ７，４）　２．０ｍｌで３回洗った。
９、０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、１ｍＭ　　ＭｇＣΩ２
（ｐｔ１９．５）で１回洗った。
１０、０．４ｍＭ　　ＡＭＰＰＤを含有する０、０５Ｍ
炭酸ナトリウム、１　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　ＣＤ　２　（ｐ
Ｈ９，５）　　２５０μＱを加えた。
１１、３０℃で２０分インキュベートした。
１２、ターナ−２０Ｅルミノメータ−で各試験管の発光
を１０秒間の積分値としてカウントした。
１３、ＣＥＡの各濃度でのシグナルをゼロＣＥＡでのシ
グナルで割った値をＣＥＡの濃度に対してプロットした
。ＡＭＰＰＤを用いたＣＥＡ検定の代表的データを第９
図に示す、Ｏｎｇ／　ｍｌと２０ｎｇ／ｍｌのＣＥＡ濃
度の間で直線性を示した。
使用例　９ ヒト黄体ホルモン（ｈＬＨ）の検定 直径的３ｆｆ１ｍのナイロン膜（ボールイムノダイン（
Ｐａｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ）製、孔サイズ０．４
５ミクロン）を、リン酸塩緩衝液中に固相用の捕捉モノ
クローナル抗ＬＨ抗体（メディックス（Ｍｃｄｉｘ）よ
り市販、カタログ＃　Ｌ　−４６１−０９）　１　ｕｇ
／　ｍｌの溶液５．ｃｄ２で感作した。続いて、上記膜
をｐＨ７，３のリン酸塩緩衝液添加生理塩水中２％カゼ
イン溶液でブロックした。次いでこの膜を第１０図に示
した装置（プロッティングペーパー層を含む）にセット
した。
第１０図中ａはプレフィルタ−カップを示し；ｂはプレ
キシグラストップを示し；Ｃはポールイムノダインメン
ブレム（孔サイズ０．４５μ）を示し；ｄはポリプロピ
レンアセテートの羽毛状層を示し；ｅはプロッティング
ペーパーを示し；ｆはプレキシグラスを示す。
使用された検出抗体は、メディックスより市販のマウス
モノクローナル抗ＬＨ抗体（カタログ＃Ｌ　−４６１−
０３）を用いた。この抗体を、グルタルアルデヒドカッ
プリング法（Ｖｏｌｌｅｒ、　Ａ　ｅｔ、　ａｔ。
Ｂｕｌｌ、　Ｗｏｒｌｄ　ｌ１ｅａｌｔｈ　Ｏｒｇ、、
　５３．５５　（１９７６））によリアルカリ性ホスフ
ァターゼ（バイオザイム（Ｂｉｏｚｙｍｅ）より市販、
カタログ＃ＡＬＰ　Ｉ　−ＩＬＧ）と結合させて抗ＬＨ
抗体アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートを調製し
た。
方法 ５０μｇの上記検出抗体コンジュゲートを下記濃度のｈ
ＬＨ溶液２００μｇを含有する試験管に添加した：ｈＬ
Ｈ濃度（ｎｇ／　ｍｌ　（Ｐ　Ｂ　Ｓ　））各試験管の
内容物を捕捉抗体（前述）であらかじめ感作しておいた
４枚のナイロン膜に加えた。
５分間インキュベーション後、プレフィルタ−カップを
取り除き、上記膜を、リン酸塩緩衝液添加生理塩水中０
．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０溶液４００μ
ｇで洗った。続いて、０．０５Ｍ炭酸塩、１１１１ＭＭ
ｇＣ４，０，１重量％Ｂ　Ｓ　Ａ　（ｐＨ９，５）中０
．４ｍＭ（３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メ
トキシ−４（３′−ホスホリルオキシ）フェニル−１，
２−ジオキセタンジナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）溶液１
００μｇを加えた。上記ナイロン膜をタイプ６１２ポラ
ロイドインスタント白黒フイルムを入れたカメラルネミ
ノメーターに入れ、１分間露光した。
フィルムに画像形成した検定結果を第１１図に示す。
次に、上記画像の反射濃度を、トビアスＲＢＰポータプ
ル白黒反射デンシトメーター（Ｔｏｂ　１　ａｓＲＢＰ
　Ｐｏｒｔａｂｌｅ　Ｂｌａｃｋ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ
　ＲｅｆｌｅｃｔｌｏｎＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）　
　（ペンシルバニア州１８９７４−０３４７アイビ一ラ
ンド私書箱２６９９インダストリアルドライブ５０のト
ビアスアソシエーツ（Ｔｏｂ　ｉ　ａｓＡｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ）製）を使用して測定した。反射濃度をＬＨ濃度
に対してプロットして第１２図に示すようなｈＬＨにつ
いての標準曲線を得た。
４、　〔図面の簡単な説明〕 第１図は基質としてＰＮＰＰおよびＡＭＰＰＤを用いた
ｈＣＧ検定の結果の比較を示す図であり；第２図はタン
デムＩＣ０Ｎ　　ｎ　　ｈＣＧ検定の結果を示す写真で
ある； 第３図は０．４ｍＭ　　ＡＭＰＰＤを用いたアルカリ性
ホスファターゼ検定の結果を示す図であり：第４図はウ
シ血清アルブミンおよび／または螢光物質の存在下にア
ルカリ性ホスファターゼ検定を行なった結果を示す図で
あり； 第５Ａ図は６０μｇ／ｍｌ　　ＡＭＰＰＤを用いたＨ８
ＶＩ　　ＤＮＡプローブ検定の結果を示す写真であり、
第５Ｂ図は３００μｇ／　ｍｌ　　Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄ
での結果を示す写真であり、そして第５Ｃ図は３００μ
ｇ／ｍｌ　　ＡＭＰＰＤでの初めの３０分の反応の後の
結果を示す写真であり； 第６図は基質としてＡＭＰＰＤおよびＰＮＰＰを用いた
ＡＦＰ検定の結果の比較を示す図であり；第７図は基質
としてＡＭＰＰＤを用いたＴＳＨ検定の結果を示す図で
あり； 第８図はＢＳＡの存在下および不存在下でのＴＳＨ検定
の結果の比較を示す図であり；第９図は基質としてＡＭ
ＰＰＤを用いたＣＥＡ検定の結果を示す図であり； 第１Ｏ図はｈＬＨ検定に使用した装置の構成を示す図で
あり； 第１１図はｈＬＨ検定に使用したフィルム上の画像を示
す写真であり； 第１２図はｈＬＨ検定に使用したｈＬＨＬＨ濃度準曲線
を示す図であり、縦軸は反射濃度である。
第　１　図 ｈｃＧ＃友 遍１１としての　ＰＭＰＫ！〆ＡＭＰｐｏｔｐｒｒｔ＊
ｈ　ＣＧ、　ｍｌＵ７ｍｌ 士１父のズホ０ット′＋陽・左メ１゛ど弐第 図 ；Ｌ’ｔｔ（−ｒＡＭＰＰＤ２Ｍｋ−ｂＴｓＨ＊讐乙丁
ＳＨｙ　”Ｕ／ｍ！ 第 ｑ 凹 一＆ＷとしてＡＭＰＰＤ左下（・るＣＥＡ掩大。
０ ０ ０ ０ ０ ＣＥＡ、　　ｎｑ／ｍ） 第１０凹 しＨ才＋定 構成： ） し ↑ 第７２図 ポラロイ）′ダイゾロ／２フィルム１；・鄭健＠成Ｌｆ
：ｈＬＨ掩定ノ禮長！ ０ ００ ｈＬＨ。
ｎｑ　／ｍｌ 手 続 補 正 書（方式） 明細書の図面の簡単な説明の項を次のように（号１訣し
） 訂正する。
１、事件の表示 平成２年特許願第３３５９８号 ２、発明の名称 １．２−ジオキセタン化合物の製造方法３゜ 補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　トロピックス・インコーホレーテッド４、代
理人 住所 東京都千代田区大手町二丁目２番１号 新人手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　　（１シ成　２年　６月２６日　
（発送臼）６、補正の対象 出願人の名称及び発明者の氏名を正確に記載した願書明
細書の〔図面の簡単な説明〕の欄を正確に記載した書面
Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、１１ 二股Ｊスボ・・）−→ 陽、注村照、

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって： 式▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） の化合物を式ＨＷ（式中Ｗはハロゲン）の酸の存在下に
    式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＾１はＣ＿１−Ｃ＿４アルキルである）の化合
    物と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中Ｒ＾１およびＷは上記定義のとおりである）の化
    合物を形成し、これを式ＨＷ（式中Ｗは上記定義と同じ
    である）の酸と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中Ｒ＾１は上記定義のとおりである） の化合物を形成し、式（III）の化合物を塩基性極性非
    プロトン性溶媒中でアルキル化剤と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中ＲおよびＲ＾１は上記定義のとおりである）の化
    合物を生成し、式（IV）の化合物に非プロトン性溶媒中
    ナトリウムチオエトキシドを加えて還流して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（Ｖ）の化合物を式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲンである） の化合物と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（VI）の化合物を式 Ｍ′ＣＮ（Ｍ′はアルカリ金属である）の化合物と反応
    させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VII）の化合物を水酸化アンモニウム
    で処理して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VIII）の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。２、Ｒはメチルである
    請求項１の製法。 ３、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって：式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中Ｒ＾１はＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり、Ｗはハ
    ロゲンである） の化合物を式ＨＷ（式中Ｗは上記定義と同じである）の
    酸と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中Ｒ＾１は上記定義のとおりである） の化合物を形成し、式（III）の化合物を塩基性極性非
    プロトン性溶媒中でアルキル化剤と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中ＲおよびＲ＾１は上記定義のとおりである）の化
    合物を生成し、式（IV）の化合物に非プロトン性溶媒中
    ナトリウムチオエトキシドを加えて還流して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（Ｖ）の化合物を式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲンである） の化合物と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（VI）の化合物を式 Ｍ′ＣＮ（Ｍ′はアルカリ金属である）の化合物と反応
    させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VII）の化合物を水酸化アンモニウム
    で処理して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VIII）の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。４、Ｒはメチルである
    請求項３の製法。 ５、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって：式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中Ｒ＾１はＣ＿１−Ｃ＿４アルキルである）の化合
    物を塩基性極性非プロトン性溶媒中でアルキル化剤と反
    応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中ＲおよびＲ＾１は上記定義のとおりである）の化
    合物を生成し、式（IV）の化合物に非プロトン性溶媒中
    ナトリウムチオエトキシドを加えて還流して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（Ｖ）の化合物を式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲンである） の化合物と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（VI）の化合物を式 Ｍ′ＣＮ（Ｍ′はアルカリ金属である）の化合物と反応
    させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VII）の化合物を水酸化アンモニウム
    で処理して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VIII）の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。６、Ｒはメチルである
    請求項５の製法。 ７、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって：式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中Ｒは上記定義のとおりであり、Ｒ＾１はＣ＿１−
    Ｃ＿４アルキルである） の化合物に非プロトン性溶媒中ナトリウムチオエトキシ
    ドを加えて還流して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（Ｖ）の化合物を式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲンである） の化合物と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（VI）の化合物を式 Ｍ′ＣＮ（Ｍ′はアルカリ金属である）の化合物と反応
    させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VII）の化合物を水酸化アンモニウム
    で処理して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VIII）の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。８、Ｒはメチルである
    請求項７の製法。 ９、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって：式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲンである） の化合物と反応させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を生成し、式（VI）の化合物を式 Ｍ′ＣＮ（Ｍ′はアルカリ金属である）の化合物と反応
    させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VII）の化合物を水酸化アンモニウム
    で処理して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VIII）の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。１０、Ｒはメチルであ
    る請求項９の製法。 １１、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって：式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） （式中Ｒは上記定義のとおりである） の化合物を式 Ｍ′ＣＮ（Ｍ′はアルカリ金属である）の化合物と反応
    させて、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VII）の化合物を水酸化アンモニウム
    で処理して、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VIII）の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。１２、Ｒはメチルであ
    る請求項１１の製法。 １３、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって：式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは上記定義のとおりであり、Ｍ′はアルカリ金
    属である） の化合物を水酸化アンモニウムで処理して、式▲数式、
    化学式、表等があります▼（VIII） （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、式（VIII）の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。１４、Ｒはメチルであ
    る請求項１３の製法。 １５、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿４アルキルであり；Ｍはアル
    カリ金属またはアンモニウムである） の化合物の製造方法であって：式 ▲数式、化学式、表等があります▼（VIII） （式中Ｒは上記定義のとおりであり、Ｍ′はアルカリ金
    属である） の化合物を酸素で処理して式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を生成し、必要ならばこのアンモニウム塩をアルカリ
    金属炭酸塩の水溶液および調製用逆相高速液体クロマト
    グラフィーで処理して、式▲数式、化学式、表等があり
    ます▼ （式中ＲおよびＭ′は上記定義のとおりである）の化合
    物を形成することからなる方法。１６、Ｒはメチルであ
    る請求項１５の製法。
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