JPH0521918B2 - - Google Patents

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JPH0521918B2
JPH0521918B2 JP2033597A JP3359790A JPH0521918B2 JP H0521918 B2 JPH0521918 B2 JP H0521918B2 JP 2033597 A JP2033597 A JP 2033597A JP 3359790 A JP3359790 A JP 3359790A JP H0521918 B2 JPH0521918 B2 JP H0521918B2
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Wai Buronsutain Ireena
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Tropix Inc
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、１，２−ジオキセタン分子中の酵素
によつて切断しうる基の酵素性分解によつてもた
らされる光学的に検出可能な反応を用いて特異的
結合対の一員を検出し且つ定量化しうる検定法に
用いる有用な１，２−ジオキセタン類に関する。 ［従来の技術］ １，２−ジオキセタンとして知られる４員環の
有機ペルオキシドは既知化合物であるが、これま
でめつたに利用されたことのない化合物群であ
る。それらの化合物固有の化学的不安定性ゆえ
に、いくつかの１，２−ジオキセタンはある種の
条件下で（例えば酵素の作用により）化学発光分
解を示し、このことは“ジオキセタンの酵素性分
解を用いる物質の検出法”と題する係属中の米国
特許出願第889823号に開示されている（これらの
技術内容は参照によりここに引用される）。この
ような化学発光の間に放出される光線の量は発光
物質の濃度の尺度であり、ひいてはその前駆物質
（すなわち１，２−ジオキセタン）の濃度の尺度
である。従つて、発光の強度および持続時間を測
定することによつて、１，２−ジオキセタンの濃
度（それゆえに検定すべき物質、すなわち特異的
結合対に結合した物質、の濃度）を求めることが
できる。１，２−ジオキセタン環の置換基を適当
に選択すると、その分子の化学的安定性を調節す
ることができ、ひいては化学発光の開始をコント
ロールすることができ、それにより実施目的のた
めの、例えば上記出願明細書中にある化学発光イ
ムノアツセイにおける、この種の化合物の化学発
光作用の有用性を高めることができる。 オレフイン性二重結合の光酸化による１，２−
ジオキセタンの製造は知られている。しかしなが
ら、容易に入手しうる出発物質から扱いやすい中
間体を経て誘導されるオレフイン性不飽和前駆物
質からの置換１，２−ジオキセタン類の便利な一
般的合成法の必要性が存在する。これに関連し
て、次式： （式中、ＲはC1−C4アルキルであり；Ｍはア
ルカリ金属またはアンモニウムである）の置換
１，２−ジオキセタンをエノールエーテル型前駆
物質： から製造するための商業的に有用な方法の必要性
が特に存在する。 エノールエーテル化合物はいくつかの古典的方
法、例えばアセタールからのアルコールの酸触媒
除去（R.A.Whol，Synthesis，p.38（1974））、塩
基性媒体中でのアルコキシメチレンシランまたは
ホスホランとアルデヒドまたはケトンとのピータ
ーソン（Peterson）またはウイツチヒ（Wittig）
反応（Magnus，P.ら、Organometallics，１，
553（1982））、およびアルコキシ酢酸ジアニオンと
ケトンとの反応それに続くプロピオラクトンの形
成およびCO2の除去（Caron，G.ら、Can.J.
Chem.，51，981（1973））により製造することが
できる。ケトンエノラートアニオンのＯ−アルキ
ル化は可変量のα−アルキル化ケトンが付随して
形成されるために（その程度は溶媒、塩基、アル
キル化剤およびケトンの構造に左右される）、一
般的製造法としてあまり用いられない（H.O.
House，“Modern Synthetic Reactions”p.163
−215（Benjamin，1965）；およびJ.D.Robertsお
よびM.C.Caserio，“Basic Princuples of
Organic Chemistry”（Benjamin，1964）を参照
されたい）。発癌性溶媒として知られるヘキサメ
チルホスホルアミド（HMPA）を使用する場合
は、よく見積もつても、Ｏ−アルキル化生成物の
収率は70％以下である。その上、Ｃ−アルキル化
ケトンからのエノールエーテルの分離は非常に退
屈な作業である。 アダマント−２−イル−アリールケトンは1960
年代の末期から知られているが（Chem.Abst.
71：P80812V）、それらをＯ−アルキル化する試
みは文献に全く報告されていない。今や、極性非
プロトン性溶媒のジメチルスルホキシド
（DMSO）中でのエノラートとしてのこれらのケ
トンと“ハード（hard）”な離脱基を含む反応性
アルキル化剤（Fleming，I.，“Frontier
Orbitals and Organic Chemical Reactions”，
p.40（Wiley，1976）を参照されたい）との反応
はもつぱらＯ−アルキル化をもたらすことが見出
された。このようにして得られたエノールエーテ
ルは１，２−ジオキセタン合成における有利な中
間体として使用される。この種の中間体はシング
レツト酸素（化学的または光化学的に発生され
る）と反応して化学発光ジオキセタン分解に基づ
く検定法において有用な十分に安定性のある１，
２−ジオキセタンをもたらす物質を製造するため
に使用される。このＯ−アルキル化法は一般的で
あり、それ故に他のシクロアルキルアリールケト
ン物質にも応用できる。このシクロアルキルアリ
ールケトンは適当な第二シクロアルキルアルデヒ
ドとアリールグリニヤール試薬との反応、および
得られた第二アルコールのジヨーンズ試薬による
酸化によつて合成することができる。好ましく
は、グリニヤール試薬は第二シクロアルキルニト
リルと反応させ、続いて酸加水分解してイミン塩
を形成させる。すべての場合において、出発物質
および生成物はシクロアルキル系の第二炭素原
子、縮合ポリシクロアルキル（例えばアダマンチ
ル）系の場合には、両側にブリツジヘツド
（bridgehead）炭素原子が存在する第二炭素原
子、に結合された官能基を含有する。 発光を用いた従来の検定方法として代表的なも
のは、標識酵素としてPODを用い、基質とし
てH2O2及びルミノールを用いるEIA法、アク
リジンエステルを標識体として用い、H2O2で発
光させるCLEIA法が知られている。 ［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の方法のの場合、低濃度
のリガンド測定に対して定量性がなく、の場合
はラベル体自体の増幅ができない等の欠点を有し
ていた。そのため、高感度の測定を目指すにはよ
り多くの光量をもつた測定法の開発が望まれてい
た。 本発明は上述の如き従来方法の欠点を克服し得
た。 すなわち、本発明の目的は、１，２−ジオキセ
タンの化学発光分解に基づく検定法において有用
な１，２−ジオキセタン類を提供することであ
る。 本発明の目的及び利点は、以下の説明および特
許請求の範囲を参照することにより十分に理解さ
れるであろう。 ［課題を解決するための手段］ 前記の目的は、本発明に従つて次式で表される
１，２−ジオキセタン類によつて達成される： （式中、ＲはC1−C4アルキルであり；Ｍはア
ルカリ金属またはアンモニウムである） 本発明の１，２−ジオキセタンは以下のように
製造される： 式中、R1は独立してＲについて先に定義した
置換基のいずれかであり得；W-はハロゲンイオ
ン（例えば塩素イオン）のような酸アニオンであ
り；そしてアルキル化剤は以下で定義する通りで
ある。 前記の反応式はそれぞれの反応生成物を単離し
ながら段階的に実施される。しかしながら、段階
（CN-または有機スルフイネートイオンのよ
うな求核酸性化アニオンによるアルキル基切断）
および段階（β−脱離反応を経る脱保護）は中
間体のリン酸エステル塩を単離することなく有利
に行われ、この種の中間体はその存在を確認する
ときのみ単離する必要がある。 前記の反応式の段階およびにおいて、段階
で用いられる塩のカチオンM+および段階で
用いられる塩基のカチオンM+はアルカリ金属イ
オン（例えばNa+）またはアンモニウムイオンで
ある。こうして段階およびの生成物は次の通
りである。 前記の合成経路内に、次式： で表される化合物と、アルキル−サルフエート、
トルエンスルホネート（トシレート）、メタンス
ルホネート（メシレート）、トリフルオロメタン
スルホネート（トリフレート）、およびクロロメ
チルエーテル並びにトリアルキルオキソニウム塩
より成る群から選ばれるアルキル化剤（Ｒの定義
と合致する）とを、塩基性、極性、非プロトン性
媒体（例えばジメチルスルホキシド中のアルカリ
金属アルコキシド）中で反応させることによつて （式中ＲおよびR1は先に定義した通りである）
で表される化合物が得られる。 本発明の１，２−ジオキセタン化合物を製造す
るための中間体は、次式： で表される化合物と次式： （式中Ｘはハロゲン（例えばクロロ）のような
電気陰性離脱基である）で表される化合物とを、
液状芳香族化合物（例えばベンゼン、トルエン）、
エーテル（例えばグリム、ジグリム）または環状
エーテル（例えばテトラヒドロフラン（THF）
のような非プロトン性有機溶媒中に溶解した第三
アミン（例えばトリエチルアミン）のようなルイ
ス塩基の存在下で反応させることによつて得られ
る次式： （式中Ｒは先に定義した通りである）で表され
る化合物を包含する。ハロホスフエートの使用に
代わるべきものとして、類似のハロホスフイツト
すなわちXPO2（CH2）2を使用しその後酸化および
照射をすることにより、直接ジオキセタンを形成
することもできる。 さらに、本発明の１，２−ジオキセタン化合物
を製造するための中間体は、上式： で表される化合物と式MCNとを反応させること
により合成される次式： （式中、ＲおよびＭは先に定義した通りであ
る）の化合物を包含する。 上述の酸化は光存在下にオレフインを一重項酸
素（1O2）で処理することによつて光化学的に実
施することが好ましい。1O2は二重結合に反応し
て下記のように１，２−ジオキセタン化合物を形
成することができる： 反応は−78℃、ハロゲン化溶媒（例、塩化メチ
レン）中で実施することが好ましい。1O2は光増
感剤を用いて発光させることができる。光増感剤
としては高分子結合ローズベンガル〔センシトツ
クス（Sensitox ）として市販されておりハ
ロドロン研究所（Hydron Laboratories，New
Brunswick，N.J.）から入手可能〕およびメチレ
ンブルー（有色な色素かつPH指示薬）などを使用
することができる。好適な増感剤はローズベンガ
ルである。 本発明の１，２−ジオキセタン化合物は光の発
生方法に使用できる。この方法は試料中の特定の
物質の存在または濃度を求めるために視覚的検定
方法として利用することができる。上記の１，２
−ジオキセタン類はこれらの検定法のいずれにも
使用しうる。こうした検定法の例には、抗体また
は抗原（例、αまたはβ−hCG，TSH，LH等の
ホルモン、AFP，CEAのような癌関連抗原）を
検出する免疫検定法（酵素免疫測定法）；酵素検
定法（例、アルカリホスフアターゼ）；カリウム
またはナトリウムイオンなどを検出する化学検定
法；およびウイルス（例、HSVI，HTLVもし
くはサイトメガロウイルス）または細菌（例、大
腸菌）などを検出するヌクレオチドプローブ法が
含まれる。 検出される物質が抗体、抗原または核酸である
場合には、１，２−ジオキセタン化合物−PO
（O-M+）2基（以下Ｚ基と略す） を切断可能な酵素、すなわち酸性又はアルカリ性
ホスフアターゼが、検出される物質に特異的な親
和性を有する物質（すなわち検出される物質に特
異的に結合する物質）（例、それぞれ抗原、抗体、
または核酸プローブ）に結合することが好まし
い。酵素を特異的親和性物質に結合させるために
常法（例、カルボジイミドカツプリング）が使用
される；結合はアミド結合を介することが好まし
い。 一般的に検定法は下記のように実施することが
できる。検出される物質を含む試料と、検出され
る物質（例えば抗原）に特異的親和性を有する物
質（例えば抗体）に結合した酵素を含む緩衝液に
接触させ更に特異的親和性を有するもう一つの物
質（例えば抗体）を結合した固相（例えば抗体結
合のビーズ）に接触させる。一定時間インキユベ
ーシヨンした後過剰の特異的親和性を有する物質
に結合した酵素を洗い流し、その酵素部分によつ
て切断されうるＺ基を有する１，２−ジオキセタ
ン類（基質）を添加する。酵素はＺ基を切断して
ジオキセタンを２つのケトンに分解する；ケトン
の１つに結合している発色団【式】は こうして励起されて発光する。この発光はキユベ
ツトまたはカメラルミノメーターなどに用いて、
試料中に検出される物質が存在することの指標と
して検出される。物質の濃度を求めるために発光
強度を測定することができる。 検出される物質が酵素である場合には、特異的
親和性物質（例えば抗体）は不必要である。その
代わりに検出される酵素によつて切断されうるＺ
基を有する１，２−ジオキセタン類（その酵素の
基質）を使用する。そこで、酵素の検出法は、酵
素−含有試料への１，２−ジオキセタン類の添
加、および酵素の存在と濃度の指標として得られ
る発光の検出を含むものである。 ［実施例］ 以下に本発明を詳細に説明するために実施例が
記載されるが、本発明は何らそれらに限定され
ず、その要旨を逸脱しない範囲での修飾および変
法を含むものと思われる。 参考例 １ ３−メトキシフエニルアダマント−２−イルケ
トン マグネシウム削り屑（1.64ｇ、0.067モイ）を
アルゴン雰囲気下で火炎乾燥フラスコに入れた。
ヨウ素の小さい結晶および乾燥テトラヒドロフラ
ン（THF）（水素化アルミニウムリチウム上で新
たに蒸留したもの）７mlを加えた。一定量（７
ml、0.055モル）の３−ブロモアニソールを注射
器から穏やかに攪拌した金属懸濁液に加えた。50
℃で短時間加熱後発熱反応が始まつた。フラスコ
を室温の水浴に入れ、その間THF（33ml）を滴下
ロートから細流として添加した。発熱反応がおさ
まつた後、この混合物を45分間還流した。その還
流しつつあるグリニヤール試薬へ乾燥THF50ml
中の２−シアノアダマンタン（8.7ｇ、0.054モ
ル；“Organic Synthesis”，57，８（Wiley，
1977）またはvan Leusen，A.M.ら、J.Org.
Chem.，42，3114（1977）を参照されたい）の溶
液を1.5時間にわたつて滴下した。この反応混合
物を還流温度で一晩加熱した後、黄色の懸濁液を
得た。フラスコとその内容物を氷浴中で冷却して
いる間に、エーテル（50ml）を加えた。濃塩酸
（８ml、0.096モルHCl）を激しく攪拌しながら20
分間にわたり滴下した。沈殿物を過により分離
し、エーテルで洗い、乾燥してケテンイミン塩29
ｇを若干の残留マグネシウムを含む淡黄色の非吸
湿性粉末として得た。この塩をエタノール90mlと
濃塩酸90mlとの混合物中に懸濁し、３時間還流し
た。その間に混合物はかなり薄くなつた。氷浴で
冷却後、得られた固形物を砕き、過により分離
し、中性になるまで洗浄し、乾燥して薄い灰色の
ケトン13.65ｇ（２−シアノアダマンタンに基づ
いて収率93％）を得た（融点111〜114℃）。薄層
クロマトグラフイー（TLC）はこの生成物がそ
の後の操作によつて十分な純度であることを示し
た（Rf0.45；K5F−CH2Cl2：ヘキサン50：50）。
ヘキサンから再結晶してプリズム晶として表題化
合物を得た（融点113〜115℃）。IR（CH2Cl2）
2900cm-1，1670cm-1（Ｃ＝０）、1590cm-1，1575cm
-1により生成物の構造が次式の通りであることを
確認した。 参考例 ２ メトキシ（３−メトキシフエニル）メチレンア
ダマンタン 参考例１に従つて製造した一定量（11.3ｇ、
0.042モル）の３−メトキシフエニルアダマント
−２−イルケトンをモレキユラーシーブ乾燥（３
Å）ジメチルスルホキシド（DMSO）90mlに懸
濁した。懸濁固体を溶解するために加熱した。攪
拌しながら室温へ冷却すると、微細な懸濁液が得
られた。カリウムｔ−ブトキシド（8.5ｇ、0.070
モル）をアルゴン雰囲気下に加えた。５分後、ほ
とんど均質な橙色の溶液が得られ、これを50℃の
水浴に入れた。硫酸ジメチル（４ml、0.042モル）
を注射器から10分間にわたつて滴下した。さらに
15分撹拌した後、追加の硫酸ジメチル（3.3ml、
0.034モル）を同じやり方で加えた後、無色の溶
液を室温で一晩攪拌した。氷浴で冷却後、
K2CO30.5ｇおよび氷水125mlを加え、この混合物
を50mlずつ酢酸エチルで３回抽出した。合わせた
有機画分を水で３回、飽和NaCl水溶液50mlで１
回洗い、K2CO3上で乾燥した。溶媒を真空除去
して油状物を得た。その油状物をヘキサンに溶か
し、得られた溶液をセライトを通して過し、真
空濃縮して粘稠性のある淡黄色の油状物11.5ｇ
（収率96％）を得た。TLCは微量のケトン出発物
質を含むエノールエーテル（Rf0.68；E.Merck
Al2O3−CH2Cl2：ヘキサン50：50）へのきれいな
転化を示していた。IR（CH2Cl2）：2900cm-1，
1600cm-1，1590cm-1，1580cm-1，1570cm-1，1095
cm-1，1080cm-1；1H NMR（CDCl3）：δ1.5−２
（ｍ，12H），δ2.55（ｓ，1H），δ3.2（ｓ，1H），
δ3.25（ｓ，3H），δ3.75（ｓ，3H）、およびδ6.7−
7.3（ｍ，4H）。これらのデータにより、この生成
物の構造が次式の通りであることを確認した。 参考例 ３ メトキシ（３−ヒドロキシフエニル）メチレン
アダマンタン モレキユラーシーブ乾燥（3A）ジメチルホル
ムアミド（DMF）70ml中の参考例２に従つて製
造したメトキシ（３−メトキシフエニル）メチレ
ンアダマンタン（14ｇ、0.049モル）の溶液を、
アルゴン雰囲気下で同じ溶媒中のナトリウムチオ
エトキシド（7.4ｇ、0.88モル）の溶液に加えた。
この混合物を３時間還流した。攪拌しながら氷浴
で冷却後、この反応を水200ml中のNH4Cl62ｇで
停止させた。酢酸エチル（120ml）および少量の
氷水を加えた。氷層を分離し、酢酸エチル75mlで
抽出した。有機抽出物を100mlずつの水で４回、
次に飽和NaCl（100ml）で洗い、すばやく
Na2SO4上で乾燥させた。この溶液を過し、濃
縮して抽状物を得、それをヘキサン50mlで摩砕し
た。回転蒸発器で溶媒を除去すると固体が残り、
それを冷ヘキサンで細かくすりつぶし、過し、
ヘキサンで洗つた。粗製の灰白色フエノール系生
成物（13ｇは５％MeOH−CH3CNから再結晶し
て無色プリズム状結晶10ｇを得た（融点131〜133
℃）。IR（CH2Cl2）：3580cm-1、3320cm、2910cm
-1、1590cm-1、1580cm-1、1440cm-1により生成物
の構造が次式の通りであることを確認した。 参考例 ４ アンモニウムナトリウム３−（アダマンチリデ
ンメトキシメチル）フエニルホスフエート 参考例３に従つて製造したメトキシ（３−ヒド
ロキシフエニル）メチレンアダマンタン（1.1ｇ、
0.004モル）をアルゴン雰囲気下でモレキユラー
シーブ乾燥（３Å）ベンゼン15mlに溶解した。ト
リエチルアミン（0.57ml、0.004モル）を注射器
から加えた。この攪拌溶液を氷浴で０℃に冷却
し、２−クロロ−２−オキソ−１，３−ジオキサ
ホスホラン（0.37ml、0.004モル）を滴下した。
氷浴中で10分後、粘稠な混合物を室温へ徐々に温
め、3.5時間攪拌した。ベンゼンを真空除去し、
アルゴン下でエーテル60mlを加えた。この懸濁液
を不活性雰囲気下で過し、得られた固形物を20
mlずつのエーテルで３回洗つた。液を真空除去
してリン酸トリエステル1.6ｇを粘稠な無色の油
状物として得た。IR（CH2Cl2）：2900cm-1，1600
cm-1，1575cm-1，1300cm-1（Ｐ＝０）。フエノール
性OHの伸縮またはＣ＝０（1670cm-1）の吸収は
IRスペクトルに存在しなかつた。TLCで出発物
質のないことを確認した。これらのデータは３−
（アダマンチリデンメトキシメチル）フエニルエ
チレンホスフエートの下記構造と一致した。 上記の油状物はDMF7mlに溶解し、DMF中の
シアン化ナトリウム（0.21ｇ、0.004モル）を加
え、この混合物を室温で24時間撹拌した。得られ
た黄色の溶液を50℃で真空除去し、２mlずつのキ
シレンで数回追い出し、残留物をエーテルで摩砕
してガムを得、そのガムをCH2Cl2に取り、真空
除去して淡黄色の非晶質発泡体1.5ｇを得た。IR
（CH2Cl2）：2240cm-1（弱い、CN）、1595cm-1，
1570cm-1，1475cm-1，1275cm-1（Ｐ＝０）、1235cm
-1，1100cm-1。これらのデータはナトリウム３−
（アダマンチリデンメトキシメチル）フエニル−
2′−シアノエチルホスフエートの予測された下記
構造と一致した。 この塩（1.5ｇ、0.0035モル）は水５mlに溶解
した。次いで、濃水酸化アンモニウム（５ml）を
滴下した。この溶液を室温で一晩攪拌した。得ら
れた白色スラリーを氷浴中で冷却し、アセトニト
リル30mlで処理した。過し、15mlずつの冷アセ
トニトリルで２回洗浄して、短時間の減圧乾燥後
に吸湿性の白色固体（115℃で焼結し、130〜133
℃で融解する）0.95ｇを得た。HPLC（逆相C18−
0.1％酢酸アンモニウム／CH3CN勾配）は１つの
主要なピークを示した。IR（ヌジヨール）：1595
cm-1，1575cm-1，1245cm-1，1200cm-1，1095cm-1，
1080cm-1，890cm-1。UV（20％MeOH−ジオキサ
ン）λnax260／nm；ε＝10000。これらのデータ
により生成物の構造が次式の通りであることを確
認した。 実施例 １ ３−（2′−スピロ−アダマンタン）−４−メトキ
シ−４−（3″−ホスホリルオキシ）フエニル−
１，２−ジオキセタン、ナトリウムアンモニウ
ム塩 大きい培養試験管中で、参考例４に従つて製造
したエノールエーテルホスフエート塩0.065ｇ
（0.00017モル）をCHCl325mlに溶解した。シリカ
ゲル上のメチレンブルー（シリカゲル１ｇ当たり
染料0.0026ｇ）0.210ｇを増感剤として加えた。
試験管は水冷した浸漬ウエルの内部に250ワツト
の高圧ナトリウムランプを含む銀めつきしたデユ
ワーフラスコに入れた。一枚の５ミルカプトン
（Kapton；DuPont社）をUVフイルターとして
ウエルの内部に置いた。この装置に氷水をポンプ
で送り、試料の温度を150℃以下に保つた。乾燥
酸素の連続流を毛細管を通して反応容器に送つ
た。気体流は固相増感剤の均一懸濁液を維持する
ように調節した。25分の照射時間後、出発物質の
UV（260nm）吸収が消失した。淡黄色溶液を
過し、蒸発させ、水10mlで再調製した。この水性
試料は0.45ミクロンのナイロンフイルターを通し
て過し、逆相C18分離用HPLCカラムでクロマ
トグラフにかけ、水／アセトニトリル勾配で溶出
した。277nmで弱いUV吸収を示す各画分を合わ
せ、凍結乾燥してジオキセタンを白色の綿状吸湿
性固体として得た。この固体を融点を示さずに
145゜〜150℃で分解してアダマンタノンを生成し
て昇華し、部分的に分解して残留した固体は270
℃以下では融解しない。1H NMR（D2O，ppm）：
0.89−1.85（ｍ，12H）；2.10（ｓ，1H）；3.15（ｓ，
3H）；4.65（ｓ，HOD−NH+ 4）；7.10−7.36（ｍ，
4H）。IR（ヌジヨールマル、cm-1）：3120，1970−
1790（弱い、幅広−NH+ 4）、1640（幅広）、1600（弱
い）、1580，1284，1273，1122，980，895。この
生成物の構造は上記IRおよびNMRスペクトルに
より次式の通りであると確認した。 実施例 ２ ３−（２−スピロ−アダマンタン）−４−メトキ
シ−４−（3″−ホスホリルオキシ）フエニル−
１，２−ジオキセタン、ジナトリウム塩 メトキシ（３−ホスホリルオキシフエニル）メ
チレンアダマンタンナトリウムアンモニウム塩
（3.3ｇ）を１滴のピリジンを含有する15mlの水に
溶解させた。この溶液（該化合物をピリジニウム
塩の形で含む）をアンバーライトIR120（プラス）
イオン交換樹脂（アルドリツチケミカル社製）の
３cm×25cmのカラムにゆつくり通した。蒸留水で
このカラムを溶出すると、260nmに吸収を示すフ
ラクシヨンが得られ、これらをいつしよにして凍
結乾燥した。得られたモノピリジニウム塩（１
ｇ、2.3ミリモル）の１部を100mlのCHCl3（Al2O3
で乾燥）に溶解した。得られた溶液を大きなシリ
ンダー状の試験管に入れ、５，10，15，20−テト
ラフエニル−21H，23H−ポルフイン（２mg、１
ml CHCl3中）で処理した。得られた均一な緑色
の溶液を０℃に冷却し、スパージヤー管を通して
酸素ガスで前以つて飽和した。この混合物を銀デ
ユワーフラスコ中で一定のO2流下に照射した。
このフラスコはデユポンのカプトン（Kapton）
ポリイミドフイルムの単一シート（５ミル）で露
光された250ワツトナトリウム蒸気ランプの周り
を囲む冷却された浸漬壁をも含んでいる。デユワ
ーフラスコ中の濃度は、12分間の照射の間0゜〜５
℃に維持された。溶媒を真空で除去し、続いて
500mgのNaHCO3を含有する100mlの蒸留水を添
加した。得られた淡いピンク色の溶液を冷却し、
0.45ミクロンのテフロン膜を通して過した。得
られたジオキセタンの水溶液を、ポリスチレンカ
ラム中CH3−CN−0.5％NaHCO3勾配を使用した
調製用逆相HPLCに付した。続いて２回目は、
CH3CN−H2O勾配を使用してカラムに通した。
得られた溶液（無機塩を含まない）を凍結乾燥し
て800mgの粒状のかすかに黄色がかつた白色固体
を得た。この固体は融点を示さずに145゜〜150℃
で分解してアダマンタノンを生成して昇華し、部
分的に分解して残留した固体は270℃以下では融
解しない。1H NMR（D2O）：δ0.85−δ1.75（ｍ，
12H）；δ2.15（ｓ，1H）；δ2.75（ｓ，1H）；δ3.10
（ｓ，3H）；δ7.10−δ7.35（ｍ，4H）。IR（ヌジヨー
ルマル）：1600cm-1（弱い）、1580cm-1、1285cm-1、
1275cm-1、1120cm-1（幅広）、980cm-1、895cm-1。 使用例 １ ビーズ形式hCG検定（血清または尿） 抗hCG抗体被覆ビーズおよび抗hCG抗体：アル
カリ性ホスフアターゼコンジユゲートはハイブリ
テク・タンデム・アツセイ・キツト（Hybritech
Tandem Assay Kit）から得られた。 以下に実施例２で合成した１，２−ジオキセタ
ン（AMPPD）ジナトリウム塩（以下の使用例で
はこの塩をAMPPDと略記した。）をアルカリホ
スフアターゼの基質として用いた場合のhCGの検
定を示した。比較のため、ｐ−ニトロフエニルリ
ン酸を基質として比色定量検定した。 １ ビーズから過剰の緩衝液を吸い取つた後、各
試験管（12×75mm）に１個のビーズを入れた。 ２ 各試験管に抗hCG抗体ホスフアターゼコンジ
ユゲート100μを加えた。 ３ 各試験管に試料100μを加えた。別の試験
管に以下のものを準備した： (a) 対照ゼロ試料（男性の血清または尿） (b) 25mIU／mm hCG標品（血清または尿） (c) 200mIU／mm hCG標品（血清または尿） (d) 患者試料（血清または尿） ４ 混合後、試験管にカバーをかぶせて37℃で90
分間インキユベートした。 ５ コンジユゲートおよび試料を含む反応液を吸
引除去した。 ６ ベーズを0.1％ツイーン20を含むリン酸緩衝
溶液（PH7.4）2.0mlで３回洗つた。比色定量検定 化学発光検定 ７ ７ 0.05M炭酸塩、 1mM MgCl2 （PH9.5）で１回洗つた。 ８ 0.1Mグリシン、 ８ 0.05M炭酸塩、 1mM MgCl2 1mM MgCl2 （PH10.4）中の１mg／ （PH9.5）中の0.4 ml ｐ−ニトロフエ mM AMPPD ニル−ホスフエート 250μを加えた。 （PNPP）200μ を加えた。 ９ 室温で30分イン
９ 30℃で20分イン キユベートした。 キユベートした。 10 発色を止めるべく 10 0.1Mグリシン、10 mM EDTA（PH9.5） 1.5mlを加えた。 11 分光光度計で405nm 11 ターナー20Eルミ での吸光度を測定 ノメーターで各試 した。 験管の発光の10秒 間積分値を測定 した。 12 両検定のデータはhCGの各濃度でのシグナル
をゼロhCGでのシグナルで割つた値をhCGの
濃度に対してプロツトした。代表的なデータ
を第１図に示す。ここでPNPPは比色定量検
定を、そしてAMPPDは化学発光検定を表
す。化学発光検定は比色定量検定よりも４倍
以上高感度であつた。 使用例 ２ タンデムICON hCGの検定（フイルム露
光による） 市販のタンデムICON 検定キツトを使用し
た。緩衝液および抗体はすべてこのキツトの中に
含まれているものを使用し、アルカリホスフアタ
ーゼの基質は実施例２で合成したジオキセタン
（AMPPD）を使用した。 方 法 １ 被検試料として使用するために、対照陰性
（雄）尿で希釈した０，５，10，50mIU／mlの
hCG標品を用意した。 ２ ICONメンブラン容器の中央に、１度５滴の
試料を滴下した。 ３ 各容器の中央に３滴の酵素抗体コンジユゲー
トを加えた。 ４ １分インキユベートした。 ５ 装置にハイブリテクICON洗液２mlを加え、
排出させた。 ６ 0.1Mトリス、1mM MgCl2（PH9.8）中の0.1
％BSA500μを加えた。排出させた。 ７ 50μｇ／mlAMPPD、0.1％BSA、
1mMMgCl2を含む0.1Mトリス緩衝液（PH9.8）、
200μを加えた。 ８ ICON膜をとり出し１枚のマイラーに移行さ
せ、フイルムを露光すべく暗箱に入れた（ポラ
ロイド型612）。 ９ フイルムを30秒間露光した。代表的な検定の
結果を第２図に示す。陽性試料では強い化学発
光が30秒の反応時間内に起こつた。 使用例 ３ アルカリ性ホスフアターゼの検定 アルカリ性ホスフアターゼ検定は次の方法で実
施した。 成 分 緩衝液：0.05M炭酸塩、1mM MgCl2（PH9.5） 基 質：0.4mM濃度の３−（2′−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（3″−ホスホリルオ
キシ）フエニル−１，２−ジオキセタンジナトリ
ウム塩（AMPPD） アルカリ性ホスフアターゼ：緩衝液中1.168μ
ｇ／mlのアルカリ性ホスフアターゼ原液の段階的
希釈は試験管内で次の最終酵素濃度となるように
行つた： 4.17×10-11 1.67×10-15M 8.34×10-12M 8.34×10-16M 1.67×10-12M 4.17×10-16M 3.34×10-13M 2.09×10-16M 6.68×10-14M 1.34×10-14M 3.34×10-15M 手 順： 上記濃度のアルカリ性ホスフアターゼを含みさ
らに0.4mM AMPPDを含む２通りの試験管は30
℃で20分インキユベートした。インキユベーシヨ
ン後、ターナー20Eルミノメーターで30秒間の発
光積分量を測定した。アルカリ性ホスフアターゼ
の検出限界を表に示す。第３図には、0.4mM
AMPPDを用いたアルカリ性ホスフアターゼの検
出データを示す。発光は10-14〜10-11M酵素の間
で直線状であつた。 表 ２×バツクグラウンド の２倍の発光を示すア アルカリ性ホス 添加 ルカリ性ホスフアター フアターゼの ゼの濃度 最低出濃度 なし 1.0×10-14 1.67×10-15M （1.12） １ 緩衝液：0.05M炭酸塩、1mM MgCl2、PH
9.5。温度：30℃。化学発光化合物濃度：
0.4mM。 ２ かつこ内の数字は表示濃度でのバツクグラ
ウンドレベルの倍数である。 使用例 ４ ウシ血清アルブミンおよび／またはフルオレセ
インの存在下でのアルカリ性ホスフアターゼ検
定 アルカリ性ホスフアターゼ検定は次の方法で実
施した。 成 分 緩衝液：0.05M炭酸ナトリウム、1mM MgCl2
（PH9.5） 基 質：0.4mM濃度の３−（2′−スピロアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（3″−ホスホリルオ
キシ）フエニル−１，２−ジオキセタンジナトリ
ウム塩（AMPPD） アルカリ性ホスフアターゼ：緩衝液中1.168μ
ｇ／mlの原液 条 件： １ 緩衝液のみ（対照） ２ 緩衝液＋ウシ血清アルブミン（BSA） ３ 緩衝液＋BSA−フルオレセイン（BSA対
照フルオレセインの比１：３） ４ 緩衝液＋ポリ〔ビニルベンジル（ベンジル
ジメチル−アンモニウムクロライド）〕
（BDMQ） ５ 緩衝液＋BDMQ＋フルオレセイン
（BDMQ1mlと混合したフルオレセインジナ
トリウム塩0.01mg） アルカリ性ホスフアターゼ原液の段階的希釈は
試験管中で次の最終酵素濃度となるように行つ
た：ここで条件２〜５の緩衝液以外のエンハンサ
ー成分は系全体の0.1重量％存在する。 4.17×10-11M 1.67×10-15M 8.34×10-12M 8.34×10-16M 1.67×10-12M 4.17×10-16M 3.34×10-13M 2.07×10-16M 6.68×10-14M 1.0×10-16M 1.34×10-14M 5.0×10-17M 3.34×10-15M 2.5×10-17M 手 順： いろいろな条件において、上記各種濃度のアル
カリ性ホスフアターゼに0.4mM AMPPDを加え
た２通りの試験管を30℃でインキユベートした。
条件１，４および５は20分インキユベートし、条
件２および３は90分インキユベートした。 インキユベーシヨン後、ターナー20Eルミノメ
ーターで30秒間の発光積分量を測定した。アルカ
リ性ホスフアターゼの検出限界に対するBSA，
BDMQおよびフルオレセインの効果を第４図お
よび表に示す。第４図中−□−は上記条件１、
…■…は条件２、…〇…は条件３、…●…は条件
４、…△…は条件５を各々示す。 【表】 ルオレセイン
1. かつこ内の数字は表示濃度でのバツ
クグラウンドレベルの倍数である。
使用例 ５ HSVI DNAプローブ検定 物質および緩衝液： 膜：ジーン・スクリーン・プラス社（Gene
Screen Plus）、の陽性荷電したナイロン膜 緩衝液：変性緩衝液：0.5M NaOH 中和緩衝液：0.4M NaH2PO4（PH2.0） 負荷緩衝液：変性緩衝液 １部 中和緩衝液 １部 膜湿潤緩衝液：0.4Mトリス（PH7.5） 膜プレハイブリダイゼーシヨン緩衝液： 最終濃度 0.5ml 100×Denhardt's溶液 ５ ％ 0.5ml 10％ SDS 0.5％ 2.5ml 20×SSPE ５％ 2.0ml 変性、超音波処理サケ精子DNA
200μｇ／mlddH2O 10ml 膜ハイブリダイゼーシヨン緩衝液： 最終濃度 0.5ml 100×Denhardt's溶液 ５ ％ 0.5ml 10％ SDS 0.5％ 2.5ml 20×SSPE ５ ％ 2.0mg サケ精子DNA 200μｇ／ml 2.0ml 50％硫酸デキストラン 10 ％ddH2O 10ml 洗浄緩衝液： １×SSPE／0.1％ SDS 20ml 20×SSPE ４ml 10％ SDS 376ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液：洗浄温度に予備加温した0.1×
SSPE／0.1％ SDS ２ml 20×SSPE ４ml 10％ SDS 394ml ddH2O 400ml （加温） 洗浄緩衝液： 0.1×SSPE／0.1％ SDS 20ml 20×SSPE ４ml 10％ SDS 394ml ddH2O 400ml 洗浄緩衝液： 3mM トリス−HCl（PH9.5） 0.6ml 1M トリズマ塩基（Trizma Base） 199.4ml ddH2O 200.0ml 100×Denhardt's溶液： 分子量40Kのポリビニルピロリドン（PVP−
40）２ｇおよびフイコール２ｇを65℃以上の沸点
以下の温度で溶解した。この溶液を約40℃に冷却
し、BSA2ｇを加え、ddH2Oで最終容量を100ml
とした。アリコートに分けて、−20℃で貯蔵した。 20×SSC 20×SSC（全量100ml） 3.0M 塩化ナトリウム 17.4ｇ 0.3M クエン酸ナトリウム 8.8ｇ 容量を100mlとなし、0.45μｍニトロセルロ
ースフイルターを通して過し、室温で貯
蔵した。 20×SSPE 20×SSPE（PH7.4）（全量１） 3.6M NaCl 210.24ｇ 200mM リン酸ナトリウム 23ｇ二塩基性 5.92ｇ一塩基性 20mM EDTA 7.44ｇ 溶解し、5N NaOHでPH7.4に調整し、容
量を１とし、0.45μｍニトロセルロース
フイルターを通して過した。 １×TE １×TE緩衝液 10mM トリス（PH7.0） 1mM EDTA オートクレーブ処理 方 法： １ 膜を湿潤緩衝液で15分間前もつて湿らせた。 ２ 膜を真空マニホールド装置に挿入した。 ３ DNA試料（既知コピー数のHSVI DNAを
含む）50μを変性緩衝液200μに加えること
によりDNA試料を変性した。室温で10分イン
キユベートした。氷冷した中和緩衝液250μ
も加え、変性DNAを氷上に保持した。 ４ 各ウエルに負荷緩衝液200μを加え、膜を
通して吸引した。 ５ 各ウエルに変性DNA試料を加え、膜を通し
て吸引した。 ６ ステツプ４を繰り返した。 ７ マニホールドを解体し、膜を取り出した。 ８ UVトランスイルミネーターを使つてDNA
を膜へ５分間UV固定した。 ９ 膜をプレハイブリダイゼーシヨン緩衝液中70
℃で１時間インキユベートした。 10 膜ハイブリダイゼーシヨン緩衝液に溶解した
HSVIに特異的なアルカリ性ホスフアターゼ標
識SNAPプローブを加えた。70℃で３〜５時間
インキユベートした。 11 膜をハイブリダイゼーシヨン緩衝液から取り
出し、洗浄緩衝液 400ml中室温で攪拌しな
がら10分間インキユベートした。 12 洗浄緩衝液 400mlで50℃、30分洗浄した。 13 洗浄緩衝液 400mlで室温、10分洗浄した。 14 洗浄緩衝液 200mlで室温、10分洗浄した。 15 膜を１枚のWhatmanブロツテイングペーパ
ー上に置いた。 16 300μｇ／ml AMPPDを含む0.1Mトリス、
1mM MgCl2（PH9.8）２mlを加え、膜を通過さ
せた。 17 その膜を１枚のマイラーへ移行させ、その後
612型ポラロイドフイルムを含む暗箱へ入れた。 18 フイルムを30分露光した。代表的な結果を第
５図に示す。ここで第５Ａ図は60μｇ／ml
AMPPDでの結果を示し、第５Ｂ図は300μｇ／
ml AMPPDでの結果、そして第５Ｃ図は300μ
ｇ／ml AMPPDでの初めの30分の反応後の結
果を示す。 使用例 ６ α−フエトプロテイン（AFP）のためのビー
ズ形式AFP検定 抗AFP抗体被覆ビーズおよび抗AFP抗体：ア
ルカリホスフアターゼコンジユゲートはハイブリ
テク・タンデム・アツセイ・キツトから得られ
た。 １ 各試験管に試料20μを加えた。試料は０，
25，50，100、および200mg／ml AFPであつ
た。 ２ 各試験管に１個のビーズを入れた。 ３ 各試験管に抗AFP抗体アルカリホスフアタ
ーゼコンジユゲート200μを加えた。 ４ ラツクを振つて試験管の内容物を混合した。 ５ 試験管にカバーをかけた。 ６ 37℃で２時間インキユベートした。 ７ 抗体および試料を吸引除去した。 ８ ビーズをリン酸緩衝溶液（PH7.4）中の0.1％
ツイーン20 2.0mlで３回洗つた。比色定量検定 化学発光検定 ９ ９ 0.05M炭酸塩、 1mM MgCl2 （PH9.5）で１回洗つた。 10 0.1Mグリシン、 10 0.05M炭酸塩、 1mM MgCl2 1mM MgCl2 （PH10.4）中の１mg／ （PH9.5）中の0.4 ml ｐ−ニトロフエ mM AMPPD ニル−ホスフエート 250μを添加した。 （PNPP）200μ を加えた。 11 室温で30分インキユ 11 30℃で20分イン ベートした。 キユベートした。 12 発色を止めるべく 12 0.1Mグリシン、10 mM EDTA（PH9.5） 1.5mlを加えた。 13 分光光度計で410nm 13 ターナールミノ での吸光度を読み メーターで各試験 取つた。 管の10秒間積分を 読み取つた。 14 両検定のデータはAFPの各濃度でのシグナ
ルをゼロAFPでのシグナルで割つた値を
AFPの濃度に対してプロツトした。第６図
に示すように、比色定量検定の結果はPNPP
曲線で表され、そして化学発光検定の結果は
AMPPD曲線で表される。後者の検定は前者
の検定の約10倍の感度であることが分かる。 使用例 ７ 甲状腺刺激ホルモン（TSH）検定 物 質： 被分析体捕獲用の1/8インチビーズを、マウス
モノクローナル抗TSH−β抗体で被覆した。マ
ウスモノクローナル抗TSH抗体なアルカリ性ホ
スフアターゼと結合させて、検出用抗体（抗体酵
素コンジユゲート）として使用した。 TSHはCalbiochem社カタログ番号609396から
得られ、BSA（Ｖ型−脂肪酸不含）はSigma社カ
タログ番号A6003から得られた。 被検液および抗体酵素コンジユゲートに用いた
緩衝液は0.1Mトリス−HCl、1mMMgCl2および
２重量％BSA（PH7.5）である。基質緩衝液は
0.1Mトリス、0.1mM MgCl2（PH9.5）および基質
AMPPD（50μｇ／ml）を含んでいた。 手 順： TSH含有被検溶液（15μ）は抗体酵素コンジ
ユゲート溶液135μと混合した。この溶液に上
記のように被覆した1/8インチビーズ２個を加え、
23℃で２時間インキユベートした。その後、ビー
ズを0.1Mトリス（PH7.5）で４回洗い、反応試験
管へ移した。上記の基質を含む緩衝液200μを
試験管に加えた。20分インキユベーシヨン後、ベ
ルトールド・クリニルマツト・ルミネツセンス・
アナライザー（Berthold Clinilumat
Luminescence Analyzer）を使つて10秒間のカ
ウント数として発光量を記録した。 第７図（下記表のデータのプロツトである）
は所定のTSH濃度に対する発光強度を示す。
1μU／mlと8μU／mlのTSHの間で直線性を示し
た。 表 TSH濃度（μU／ml） （カウント数／10秒×10-4） １ 0.25 ２ 0.49 ４ 1.1 比較のために、BSAの不存在下で同じくTSH
検定を行つた。第８図に示すように、BSA含有
試料（曲線Ａ）はBSAを含まない試料（曲線Ｂ）
よりも所定のTSH濃度に対して強い発光強度を
示した。 使用例 ８ ビーズ形式による癌胎児性抗原（CEA）検定 抗CEA被覆ビーズおよび抗CEA抗体：アルカ
リ性ホスフアターゼコンジユゲートはハイブリテ
ク・タンデム・アツセイ・キツトのものを使用し
た。 １ 各試験管に試料20μを加えた。試料は０，
2.5，５，10，20および50ng／ml CEAの標準
を使用した。 ２ 各試験管に１個のビーズを入れた。 ３ 各試験管に抗CEA抗体酵素コンジユゲート
200μを加えた。 ４ ラツクを振つて試験管の内容物を混合した。 ５ 試験管にカバーをかけた。 ６ 37℃で２時間インキユベートした。 ７ 反応液を吸引除去した。 ８ ビーズを0.1％ツイーン20を含むリン酸緩衝
液（PH7.4）2.0mlで３回洗つた。 ９ 0.05M炭酸ナトリウム、1mM MgCl2（PH9.5）
で１回洗つた。 10 0.4mM AMPPDを含有する0.05M炭酸ナト
リウム、1mM MgCl2（PH9.5）250μを加え
た。 11 30℃で20分インキユベートした。 12 ターナー20Eルミノメーターで各試験管の発
光を10秒間の積分値としてカウントした。 13 CEAの各濃度でのシグナルをゼロCEAでの
シグナルで割つた値をCEAの濃度に対してプ
ロツトした。AMPPDを用いたCEA検定の代
表的データを第９図に示す、0ng／mlと20ng／
mlのCEA濃度の間で直接性を示した。 使用例 ９ ヒト黄体ホルモン（hLH）の検定 直径約３mmのナイロン膜（ポールイムノダイン
（Pall Immunodyne）製、孔サイズ0.45ミクロ
ン）を、リン酸塩緩衝液中に固相用の捕捉モノク
ローナル抗体（メデイツクス（Medix）より市
販、カタログ＃Ｌ−461−09）1μｇ／mlの溶液5μ
で感作した。続いて、上記膜をPH7.3のリン酸
塩緩衝液添加生理塩水中２％カゼイン溶液でブロ
ツクした。次いでこの膜を第１０図に示した装置
（ブロツテイングペーパー層を含む）にセツトし
た。 第１０図中ａはプレフイルターカツプを示し；
ｂはプレキシグラストツプを示し；ｃはポールイ
ムノダインメンブレム（孔サイズ0.45μ）を示
し；ｄはポリプロピレンアセテートの羽毛状層を
示し；ｅはブロツテイングペーパーを示し；ｆは
プレキシグラスを示す。 使用された検出抗体は、メデイツクスより市販
のマウスモノクローナル抗LH抗体（カタログ
＃Ｌ−461−03）を用いた。この抗体を、グルタ
ルアルデヒドカツプリング法〔Voller，Ａ et.
al.Bull.World Health Org.，53，55（1976）〕に
よりアルカリ性ホスフアターゼ（バイオザイム
（Biozyme）より市販、カタログ＃ALPI−11G）
と結合させて抗LH抗体アルカリ性ホスフアター
ゼコンジユゲートを調製した。 方 法 50μの上記検出抗体コンジユゲートを下記濃
度のhLH溶液200μを含有する試験管に添加し
た：試験管＃ hLH濃度（ng／ml（PBS）） １ ０ ２ １ ３ 10 ４ 100 各試験管の内容物を捕捉抗体（前述）であらか
じめ感作しておいた４枚のナイロン膜に加えた。
５分間インキユベーシヨン後、プレフイルターカ
ツプを取り除き、上記膜を、リン酸塩緩衝液添加
生理塩水中0.05％トウイーン（Tween）20溶液
400μで洗つた。続いて、0.05M炭酸塩、
1mMMgCl2、0.1重量％BSA（PH9.5）中0.4mM
（３−（2′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ
−４（3′−ホスホリルオキシ）フエニル−１，２
−ジオキセタンジナトリウム塩（AMPPD）溶液
100μを加えた。上記ナイロン膜をタイプ612ポ
ラロイドインスタント白黒フイルムを入れたカメ
ラルネミノメーターに入れ、１分間露光した。フ
イルムに画像形成した検定結果を第１１図に示
す。 次に、上記画像の反射濃度を、トビアスRBP
ポータブル白黒反射デンシトメーター（Tobias
RBP Portable Black and White Reflection
Densitometer）（ペンシルバニア州18974−0347
アイビーランド私書箱2699インダストリアルドラ
イブ50のトビアスアソシエーツ（Tobias
Associates）製）を使用して測定した。反射濃度
をLH濃度に対してプロツトして第１２図に示す
ようなhLHについての標準曲線を得た。
【図面の簡単な説明】
第１図は基質としてPNPPおよびAMPPDを用
いたhCG検定の結果の比較を示す図であり；第２
図はタンデムICON hCG検定の結果を示す
写真である；第３図は0.4mM AMPPDを用いた
アルカリ性ホスフアターゼ検定の結果を示す図で
あり；第４図はウシ血清アルブミンおよび／また
は螢光物質の存在下にアルカリ性ホスフアターゼ
検定を行なつた結果を示す図であり；第５Ａ図は
60μｇ／ml AMPPDを用いたHSVI DNAプロ
ーブ検定の結果を示す写真であり、第５Ｂ図は
300μｇ／ml AMPPDでの結果を示す写真であ
り、そして第５Ｃ図は300μｇ／ml AMPPDでの
初めの30分の反応の後の結果を示す写真であり；
第６図は基質としてAMPPDおよびPNPPを用い
たAFP検定の結果の比較を示す図であり；第７
図は基質としてAMPPDを用いたTSH検定の結
果を示す図であり；第８図はBSAの存在下およ
び不存在下でのTSH検定の結果の比較を示す図
であり；第９図は基質としてAMPPDを用いた
CEA検定の結果を示す図であり；第１０図は
hLH検定に使用した装置の構成を示す図であ
り；第１１図はhLH検定に使用したフイルム上
の画像を示す写真であり；第１２図はhLH検定
に使用したhLH濃度の標準曲線を示す図であり、
縦軸は反射濃度である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中、ＲはC1−C4アルキルであり；Ｍはア
    ルカリ金属またはアンモニウムである）で示され
    る化合物。 ２ Ｒがメチルである請求項１の化合物。
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