JPH0240320B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の技術分野］ 本発明は、液体媒体中の、補酵素であるアデノ
シン三燐酸（ATP）とフラビンモノヌクレオチ
ド（FMN）のうちの一つを測定するための試験
方法に関する。特に、本発明は、フラビンアデニ
ンジヌクレオチド（FAD）合成酵素活性を有す
る製剤を用いてFADを生成せしめることに基づ
く、ATP又はFMNの酵素的試験法に関する。
FAD指示薬系は、検出可能であつて、通常は比
色法による応答を発生させるために用いられる。
FAD合成酵素は、酵素命名国際委員会（the
International Commitee of Enzyme Nomen−
clature）により、ATP：FMN アデニリルト
ランスフエラーゼ（EC2.7.2.2）と正式に命名さ
れている。 ［従来技術の説明］ ATPの生成は、嫌気性及び好気性代謝活性の
双方に共通する目標物である。ATPの測定は、
生命の直接的な証しとなるものであり、微生物の
バイオマス（生物体量）及び微生物学的活性の存
在の有益な指標となる。しかしながら、生物学的
液体中のATP濃度は、10^-9モル／（ナノモル）
から10^-12モル／（ピコモル）の範囲内でしか
ないか、又はそれよりも更に低濃度であるため、
その検出には高感度のATP分析が必要となる。
分光光度測定法によるピリジンヌクレオチドを用
いるアデノシンホスフエートの酵素的測定は、ろ
紙もしくはカラムクロマトグラフイー法と比較し
て簡便であるため、一般的に利用されるようにな
つてきている。 ATP測定のための周知の紫外線光度測定法は、
次の一連の反応を含む［Jaworek、D.、etal.、
“Methods of Enzymatic Analysis”、Section
Ｄ、2nd English Ed.、H.U.Bergmeyer Ed.、
Academic Press、New York 2097、（1974）］： ATP＋３−ホスホグリセリン酸ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ ―――――――――――――――――→ １，３−ジホスホグリセリン酸＋アデノシンジホスフ
エート（ADP） １，３−ジホスホグリセリン酸＋NADH＋H⁺グリセルアル
デヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ １，３−ジホスホグリセリン酸＋NADH＋H⁺グリセルアル
デヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ ―――――――――――――――――――――――――
――→ グリセルアルデヒド−3P＋無機リン酸（Pi）＋ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド 上記反応において、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（NADH）の吸光度の減少
は340ナノメーター（ｎｍ）でモニター（監視）
される。NADHの消失は、また、マイクロモル
（10^-6モル／）レベルのATPまで分析感度を向
上せしめるその自然螢光によつてモニターするこ
ともできる。しかしながら、その方法は、ATP
と同様に、グアノシントリホスフエート、イノシ
ントリホスフエート及びウリジントリホスフエー
トを初めとする他のヌクレオシドトリホスフエー
ト類も測定できるため、特異性が欠如している。 ヘキソキナーゼ／グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ法［Lamprecht、W.、et al.、
“Methods of Enzymatic Analysis”Section
Ｄ、2nd English Ed.、H.U.Bergmeyer Ed.、
Academic Press、New York 2101、（1974）］ は、ATPの酵素的測定に役立つことも証明され
ている。この方法によつて良好な特異性を得るた
めには、高度に精製された酵素が必要である。 他の興味ある研究には、分析対象物自体をサイ
クル役にして、分析対象物が循環する毎に化学量
論量の生成物を生成せしめ、蓄積せしめる反応メ
カニズムにより感度を向上させるものがある
［Campbell、Y.、et al.、Bioch.et Biophy.
Acta、397、101−109（1975）］。 例えば、ATPは、二つの酵素触媒反応間を循
環させて生成物（例えば、ピルビン酸キナーゼ及
びヘキソキナーゼによるグルコース−６−リン
酸）を得、この生成物を第三の酵素反応によつて
測定することにより定量することができる： (b) モニター反応： グルコース−６−リン酸＋NADP⁺G6PDH ―――――→ ６−ホスホグルコノラクトン＋NADPH＋H⁺ しかしながら、必要とする操作は、日常的に
使用するには、非常にやつかいである。 生物学的液体中のアデノシンホスフエート濃
度は生物学的発光法によつて測定することもで
きる。特に、生物学的液体中のATPは次の反
応により生じる、放射光をモニターすることに
より測定できる： ATP＋ルシフエリンルシフアラーゼ／Mg⁺⁺ ―――――――――――――→ アデニルルシフエリン アデニルルシフエリン＋O²――――――→アデニルオキ
シルシフエリン＋光 このような生物学的発光法は、現在、その高感
度により、ナノモルからピコモルの範囲のATP
分析を可能にすることから、好ましいとされてい
る。しかし、従来技術の改良が行われているにも
かかわらず、専用の読取り装置が必要であつて、
しかも試料の自動処理装置が欠如しているという
二つの理由により、日常的に使用するには、放射
光測定法には限界がある。したがつて、ATP測
定のための改良法が必要となつてくるのである。 ホーンビー（Hornby）らの米国特許第
4238565号はFAD等の有機補欠分子族の使用を開
示しており、該有機補欠分子族はアポ酵素と結合
して（両者とも不活性な化合物）、特異的結合試
験における標識としてのホロ酵素（活性）を形成
する。 ［発明の概要］ 本発明は、ATP及びFMNが関与するFAD合
成酵素の作用によるFADの生成と、生成した
FADの検出（通常は酵素的手段による）とを結
合せしめたものである。水性液体試料中の補酵素
ATPもしくはFMNの濃度は、これらの補酵素の
うちの一つとFAD合成酵素活性を有する酵素系
を含む試験系に試料を接触せしめて、生成した
FADを測定することにより測定し得ることが見
出された。ATP及びFMNは多くの生物学的反応
に関与する補酵素であるため、それらが存在して
いると、試料中に生体系が存在していることの証
しとなる。更に、特異的な酵素反応においてそれ
らの生成もしくは消費を検出することは、特定の
臨床的状態を診断する上の介助となり得る。
FAD合成酵素活性を有する好ましい態様の酵素
系は、FAD合成酵素［EC2.7.7.2］と適切な金属
カチオンである。 生成したFADは、FADのアポ酵素を加え、し
かる後得られた活性酵素（ホロ酵素）の活性を測
定することによつて定量することが好ましい。酵
素を生成するFAD測定法によれば、他のFAD測
定方法よりも更に高感度のATP分析が行える。
生成した酵素の各々の分子は、適切な基質を酵素
的に変換して、数千の生成物分子を生成せしめる
ことができる。反応系は、生成した活性酵素が基
質に作用して、検出可能な応答が得られるように
選択することができる。この酵素的変換によつて
検出可能な応答が増大し、診断試験に必要とされ
る感度のATPもしくはFMN定量が可能となる。 グルコースオキシダーゼ活性の測定によつて
FADを検出するためにグルコースオキシダー
ゼ・アポ酵素を使用することが特に好ましい。グ
ルコースオキシダーゼ活性は、グルコース、ペル
オキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ様活性物
質［これらは総称して、過酸化物活性化物質
（peroxidatively active substance）とも言わ
れ、過酸化物、例えば、H₂O₂と被酸化性物質と
の反応の触媒となる］及び検出可能な応答を示す
指示薬によつて測定することができる。指示薬は
変色を呈するように選択することができる。 上記グルコースオキシダーゼ・アポ酵素又は他
の比色定量用のアポ酵素系と結合せしめてFAD
を検出することによつて便利な比色定量測定法に
よりナノモルの感度を有するATPもしくはFMN
の分析法が提供される。 本発明は、すなわち、１リツトル当りピコモル
程度の低濃度の、アデノシン三燐酸及びフラビン
モノヌクレオチドから選択される一方の補酵素を
測定するための分析方法であつて、 (a) 液体試験試料を、 他方の該補酵素、 フラビンアデニンジヌクレオチド合成酵素、 グルコースオキシダーゼ・アポ酵素、 ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
様活性物質、 グルコース、 マグネシウムイオン、並びに 過酸化水素及びペルオキシダーゼもしくはペ
ルオキシダーゼ様活性物質の存在下で、検出可
能な光学的応答を与える発光原体 を含む単一の試薬溶液と一緒に合わせ、 (b) 該光学的応答を測定する 工程からなることを特徴とする方法を提供する
ものである。 ［好ましい態様の説明］ 本発明は、二つの主な段階：即ち、(1)補酵素
ATPもしくはFMNのうちの一つを含有する液体
試料におけるFADの生成と、(2)生成したFADの
測定を単一の試薬溶液を用いて行う。FADの生
成は、FAD合成酵素活性を有する酵素系と該補
酵素のうちの一つとを使用することにより行われ
る。FAD測定は、活性化のためにFADを必要と
するアポ酵素を利用した検出系を用い、しかる後
生成した酵素の活性を測定する。 この分析は、目的とする分析対象物として
ATPもしくはFMNを測定するか、あるいは
ATPもしくはFMNを生成又は消費する反応に関
与する分析対象ならば、いずれの測定にも用いる
ことができる。 診断への応用 多くの臨床的な応用例においては、試料中に存
在する物質として、又は組み合せ反応により生じ
たものとしてアデノシンヌクレオチドホスフエー
トの測定を行つている。 ATPモニタリングの診断への応用例２件につ
いて述べる：一つは試料中に存在するATPを直
接モニターするものであり、もう一つは組み合せ
反応により生じたATPを評価分析するものであ
る。その他の可能な応用例は一覧表に示した。 細菌尿のスクリーニング（直接的試験法） 重度の細菌尿とは、採取したばかりの排泄尿検
体中に、１ml当り10⁵の生育菌が存在しているも
のと定義される。尿検体の試験は通常の微生物研
究所における労働量の大部分を占めているため、
従来の培養法よりも迅速かつ安価に結果を得るこ
とができる迅速な細菌尿のスクリーニング試験の
開発には特別の注意が向けられるべきである。本
発明は、そのように迅速で安価なスクリーニング
試験法を提供するものである。 ATP試験の細菌尿への利用は、各の細胞型が
正常な状態において比較的一定のATPレベル
（約５×10^-18〜８×10^-17モル／cell）を有してい
るという事実に基づいている。多数の文献が、細
菌尿はATP含有量と相関関係があることを示し
ている。 クレアチンキナーゼ−イソ酵素Ｂ活性のモニター
（組合わせ試験） クレアチンキナーゼ（CK）は人体組織におい
て、三種の異なるイソ酵素：即ち、CK−MM（筋
肉型）、CK−BB（脳型）及びCK−MB（心筋型）
として存在している。ヒト血清中の総クレアチン
キナーゼ活性の分析は、急性心筋梗塞を検知し、
処置する上で実施される。より高い診断上の特異
性は、イソ酵素CK−MBを分析することにより
得られる。 ヒトCKのサブユニツトＭに対する阻害抗体は、
サブユニツトＢには影響を及ぼさず、CK−Ｂ活
性の紫外線分光光度測定分析を行う上で利用され
てきた。この方法は、従来方法（即ち、電気泳
動、イオン交感クロマトグラフイー等）よりも、
時間がかからず、日常作業により好適であると考
えられる。しかしながら、指示薬系（NADH）
の感度によつて免疫化学的UV法の適用は通常の
範囲の上限の数倍の総CKレベルを有する血清試
料に制限される。 より感度の大きいCK−Ｂサブユニツト分析は、
次式： クレアチンキナーゼ−Ｂサブ
ユニツト ADP＋クレアチンリン酸
ATP＋クレアチン によるATPの生成と、それに続く本発明による
ATP分析とによつて達成することができる。 このような方法を実施することによつて、提案
されたATP分析の本来の感度に基づき、健康な
個体の血清におけるサブユニツトＢの活性が分析
されるであろうし、これによつてさらに極めて微
細な心筋の損傷について早期に正確な診断を下す
ことができるようになる。

【表】 成

【表】 本明細書において用いられる“FAD合成酵素
活性を有する酵素系”という用語は、酵素を含
み、かつATP及びFMNの酵素的反応によつて
FADを生成する組成物という意味を有する。そ
のような系は、酵素の他に、縮合反応にとつて望
ましいものであるか、もしくは必要とされるいか
なる補助因子を含んでいてもよい。FAD合成酵
素活性製剤は、好ましくはブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス（Brevibacterium
ammoniagenes）より調整され、アール・スペン
サー（R.Spencer）ら、生化学（Biochemistry）、
第15巻、第５号、1044頁（1976）の方法により単
離・精製され。この特定の酵素製剤は、活性の為
にMg²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²:及びZn²⁺のグルー
プから選択されるカチオンを必要とするが、好ま
しいカチオンはMg²⁺である。更に一層純枠な酵
素製剤を提供するスペンサーらの方法の改良法、
本明細書中に参考文献として掲げられているが、
本出願と同日に出願され、マイルス・ラボラトリ
ーズ社に譲渡された、“フラビンアデニンジヌク
レオチド合成酵素の精製”と題する米国特許出願
の中に記載されている。 本発明にあつては、液体試料中のFADは、螢
光測定法［Burch et al、J.Biol.Chem.175：457
（1948）；Koziol、Methods in Enzymology 18
（Part Ｂ）；253（1971）；（and Mayhew and
Wassink、Methods In Enzymology 66−（Part
Ｅ）：217（1980）］、ポーラログラフイー法
［Knoblock、Methods in Enzymology 18（Part
Ｂ）：305（1971）］；分光光度測定法［Fazehus
and Kokai、Methods in Enzymology 18（Part
Ｂ）：385（1971）］を初めとして、利用し得るいか
なる手段及び一般的に当業者が利用し得る何らか
の方法であれば、いかなる利用可能な方法によつ
て定量もしくは測定してもよい。 生成したFADを定量するには、不活性なアポ
酵素と結合して検出可能なホロ酵素を生成せしめ
る能力を測定する。アポ酵素としては、グルコー
スオキシダーゼ・アポ酵素［Ellis et al.米国特
許第4268631号］が用いられる。 多くの方法が、得られた酵素（グルコースオキ
シダーゼ）の活性を測定するために使用すること
ができるが、本発明においては、酵素基質として
のグルコース、並びに指示薬系としてのペルオキ
シダーゼもしくはペルオキシダーゼ様活性物質
（過酸化物活性化物質）及び光学的シグナル（光
学的信号）を発する発光原体（Photogen）から
なる。 本発明の分析方法において生起する反応は： １ ATP＋FMNFAD合成酵素 ――――――――――→ マグネシウムイオンFAD＋ピロリン酸 ２ FAD＋グルコースオキシダーゼ・アポ酵素→グルコ
ースオキシダーゼ ３ グルコース＋H₂O＋O₂グルコースオキシダーゼ ―――――――――――――→ グルコン酸＋H₂O₂ ４ H₂O₂＋指示薬ペルオキシダーゼもしくはペルオキシ
ダーゼ様活性物質 ４ H₂O₂＋指示薬ペルオキシダーゼもしくはペルオキシ
ダーゼ様活性物質 ―――――――――――――――――――――――――
―――――→ 変色 で示される。 ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ様活性
物質（過酸化物活性化物質）は当業者において周
知であつて、各種の有機及び無機源からの物質が
ある。西洋わさびペルオキシダーゼもしくはじや
がいもペルオキシダーゼのような植物性ペルオキ
シダーゼを用いることができる。また、ヨウ化ナ
トリウム及びヨウ化アンモニウムのようなヨウ化
物、並びにモリブデン酸塩類を初めとするペルオ
キシダーゼ様活性（過酸化物活性化活性）を有す
る無機化合物を用いることができる。更に、ペル
オキシダーゼ様活性を有するウロヘミン及びその
他の多数のポルフイリン物質も用いることができ
る。酵素ではないが、ペルオキシダーゼ様活性を
有する他の物質としては、スルホシアン酸鉄、ア
ンニン酸鉄、フエロシアン化鉄及び硫酸クロムカ
リウム等の化合物がある。 同様に、過酸化水素及びペルオキシダーゼもし
くはペルオキシダーゼ様活性物質の存在下、もし
くはそれらとの反応により検出可能な光学的シグ
ナルを発する、多岐に亙る有用な発光原体が公知
になつている。そのような発光原体としては、例
えば、ｏ−トリジン、ベンジジン、シリングアル
ダジン（syring aldazine）、ジアミノフルオレ
ン、テトラメチルベンジジン及びそれらの関連誘
導体等の色原体又は色指示薬系染料があり、また
フエノール及び４−アミノアンチピリン等のよう
に従来からトリンダー（Trinder）試薬と称され
ているカツプリング染料系もある。他の有用な発
光原体としては、スコポレチン（６−メトキシウ
ンベリフエロン）、ｐ−ヒドロキシフエニル酢酸
及びジアセチルジクロロフルオレスセイン（米国
特許第4269938号）等の各種フルオレスセイン誘
導体のような螢光性のペルオキシダーゼ基質があ
る。ルミノール、イソルミノール、ピロガロー
ル、それらの各種誘導体及びそれらの類縁体のよ
うな化学発光物質も発光原体として用いることが
できる。 試験系には、更に、緩衝液、希釈剤及び安定剤
等のような他の成分を加えてもよい。好適な緩衝
剤としては、リン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸
（HEPES）、３−（Ｎ−モルホリン）プロパンス
ルホン酸（MOPS）、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（TRIS）、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アモノエタンスルホ
ン酸（TES）及び−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジンプロパンスルホン酸（EPPS）がある。ま
た、細胞を破壊し、又は細胞の破壊物を分解する
ことが分析を行う上で望まれる場合は、洗浄剤、
蛋白質分解酵素及びそれらの類似物質も試験系に
加えることができる。

【表】 I.U.／mlとは、原液について１ml当りの国際単
位と定義される。国際単位（I.U.）は酵素活性量
の単位であつて、1I.U.とは、特定のPH及び温度
条件下において、１分間につき１マイクロモル
（μmol）の基質を酵素的に変換するのに要する酵
素活性量のことである。ここに、使用されている
ような1I.U.のFAD合成酵素は、PH7.5及び37℃に
おいて、１分間につき1μmolのFMNを酵素的に
変換する。1I.U.のペルオキシダーゼは、PH6.9及
び25℃においては、１分間につき1μmolのペルオ
キシドの酵素的変換を触媒する。 ATP又はFMN感受性試験系は、試験キツト、
試験組成物混合体又は試験具のように、好適であ
ればいかなる形態であつてもよい。試験組成物混
合体又は試験キツトの成分は、液体、通常は水溶
液；乾燥粉末又は錠剤等であつてもよく、あるい
はゲル又はフイルム等の形態でもよい。好ましい
試験系の構造は、試験系が担体マトリツクスと一
体になつている試験片の試験具である。担体は、
水又は分析目的とする他の液体の中で不溶性であ
つて、しかもそれらに浸した際に構造的に損傷を
うけない、吸水性もしくは非吸水性でかつ多孔質
もしくは非多孔質のマトリツクスの形態をとつて
いてもよい。使用し得る好ましい吸水性マトリツ
クスとしては、吸収紙、高分子フイルム、高分子
ゲル、セルロース、木、合成樹脂製フリース、織
布及び不織布等が挙げられる。非吸水性のマトリ
ツクスには、ガラス繊維及びポリプロピレンの如
き有機プラスチツク製物質などがある。担体マト
リツクスは、液体試薬組成物の中に浸漬し、又は
それで噴霧もしくは印刷し、次いで担体マトリツ
クスを大気圧もしくは強制空気乾燥のような適切
な方法により乾燥して乾燥試薬／マトリツクス複
合体とすることができる。マトリツクスは、簡便
に使用できるようにするため、両面接着テープの
ような適切な手段により、ポリスチレン等の有機
プラスチツク片の如き非水溶性支持体に固着する
ことが有利である。 FAD生成／グルコースオキシダーゼ検出試験
具の形態の場合は、本発明の試験系はATPもし
くはFMNを検出するための簡便な手段を提供す
ることになる。従来技術とは対照的に、本試薬片
は試料との接触により分析結果を出すものであ
る。発生した光学的シグナルは、装置によつて容
易に読取られるか、あるいは変色が起こるような
好ましい場合には技術者によつて識別される。参
照シグナルは装置内に備えておくか、あるいはカ
ラーチツプ（色標）もしくはカラーチヤートのよ
うに識別可能な標準型としておくことができ、装
置内部においてもしくは人間の観察者によつて比
較が行われる。液体、特に生物学的液体中の
ATPもしくはFMNを検出するための、このよう
に簡便、直接的かつ迅速な方法は、以前には利用
されていなかつた。 本発明を次の実施例によつて、以下に説明する
が、それにより本発明がそれによつて格別制限さ
れるものではない。 ［発明の実施例］ 試料としてATP水溶液を用い、完全な反応系
で試験を実施した。３，５−ジクロロ−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホン酸／４−アミノフエナゾ
ン色原系がグルコースオキシダーゼ活性の動力学
的モニター用として信頼できることが証明され
た。 物 質 FAD合成酵素：ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネスから単離し、前述のスペンサーらの方
法により精製 グルコースオキシダーゼ・アポ酵素：エリスらの
米国特許第4268631号により調整 ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ） 溶液No.１ FAD合成酵素 リン酸緩衝液、PH7.0； 50ｍＭ MgCl₂； ８ｍＭ フラビンモノホスフエート； 0.05ｍＭ FAD合成酵素； 1.0I.U.／ml 溶液No.２ グルコースオキシダーゼ・アポ酵素 （FAD結合部位0.8mol／ml） 66μｇ／ml リン酸緩衝液、PH7.0； 50ｍＭ 溶液No.３ 色原系 リン酸緩衝液、PH7.0； 50ｍＭ ４−アミノフエナゾン； 0.08ｍＭ ペルオキシダーゼ； 0.5I.U.／ml ３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスル
ホン酸； ２ｍＭ グルコース； 0.2M 溶液No.４ ATP水溶液（検体） 使用したATP溶液は、最終反応容積において、
９；27；54；90；135；180；及び360pmol／の
濃度であつた。 単位：国際単位／ミリリツトル（I.U.／ml）；ミ
リモル（ｍＭ）、マイクロモル（μM）、マイク
ログラム／ミリリツトル（μｇ／ml） 試験方法 三つの段階からなる方法を採用した：第一に水
溶液試料中のATPを、フラビンモノホスフエー
トの存在下、FAD合成酵素によりFADに変換し
た（0.9mlのNo.１に異なるATP濃度を有する0.1ml
の溶液No.４を加え、次いで18時間室温で暗所保存
した）。；第二に、第一段階で生成したFADをア
ポ酵素と一緒に保温し、グルコースオキシダーゼ
活性を復元させた（0.2mlの第一段階の混合物を
0.2mlの溶液No.２に加え、室温で30分間放置し
た）。；第三に、グルコースオキシダーゼ活性を動
力学的にモニターした（0.02mlの第二段階の溶液
を２mlの色原溶液No.３に加え、正確に25℃で15分
間経た後、510nｍの吸光度を測定した）。 第一段階において、ATP溶液No.４の代わりに
蒸留水0.1mlを用いて、対応する試薬ブランクを
調整し、しかる後同様の操作を続けた。試料の吸
光度から試薬ブランクの吸光度を差し引いた。 得られたデータでは、試験した全てのATP濃
度について直線的な応答がみられた。ここに報告
した方法は複数の段階からなるが、本発明方法に
おいては、試薬と酵素とが適合するので、一試薬
系一段階試験法を用いることができる。 他の色原系、即ち３，3′，５，5′−テトラメチ
ルベンジジン（TMB）が、グルコースオキシダ
ーゼ活性の動力学と終点のモニターの双方を行う
にあたつて、信頼できることが判明した。試験
は、FADの水溶液を用いて行つた。 次の溶液を使用した： 溶液No.１ グルコースオキシダーゼ・アポ酵素 （FAD結合部位3.1モル／ml） 0.26mg／ml リン酸緩衝液、PH7.0； 50ｍＭ 溶液No.２ 色原系 ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
（MES）PH6.0 70ｍＭ テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB・2HCl）
0.5ｍＭ ペルオキシダーゼ； 0.5I.U.／ml グルコース； 0.2M トリトン（Triton）Ｘ−100 0.15％（ｗ／ｖ） （登録商標）界面活性剤； （ローム＆ハース社、フイラデルフイア、PA） 溶液No.３ 停止剤 HCl； ４規定 溶液No.４ FAD水溶液（検体） 使用したFAD溶液は、最終反応混合物の容積
において、17；34；68；136；205；341；及び
478pmol／の濃度であつた。 試験方法 一段階からなる方法を採用した。溶液No.１、No.
２及びNo.４を混合した。グルコースオキシダー
ゼ・アポ酵素とFADとの再結合により復元され
たグルコースオキシダーゼ活性を、650nｍにお
ける色原体の吸光度増加分を読取る動力学的な手
法によるか、あるいは正確に25℃で30分間反応を
続けた後に塩酸（溶液No.３）を加えて450nｍに
おける色原体の吸光度を読取る終点法によつて、
直接的にモニターした。動力学的手法もしくは終
点法のいずれにおいても、グルコースオキシダー
ゼ・アポ酵素を反応開始のために用いる。 平行して試験する試薬ブランクは、FAD試料
中のFADを蒸留水に代えることによつて行われ、
かくして得られた試薬ブランクの読取値を試料の
吸光度から差引いた。 二つの方法によつて得られたデータは、試験し
て全てのFAD濃度について直線的な応答を示し
た。 加えて、ATPを生成することができる結合反
応に関与する。他のアデニンヌクレオチドホスフ
エートの試験にも同一の原理が適用し得る。例え
ば、アデノシン二燐酸（ADP）は、まずそれを
ピルビン酸キナーゼを触媒とする反応： ADP＋ホスフエノールピルビン酸ピルビン酸キナーゼ ――――――――――→ Mg²⁺ATP＋ピルビン酸 によつてATPに変えることにより試験すること
ができる。 試験具の調整 本発明方法に用いる試験組成物を包含した試験
具を調整し、血液もしくは尿等の体液中に存在す
るATP又はFMNについての試験に供した。 浸漬用の溶液を以下の組成のように調整した： FAD合成酵素 1.0I.U.／ml MgCl₂ ８ｍＭ グルコースオキシダーゼ・アポ酵素 66μｇ／ml ４−アミノフエナゾン 0.08ｍＭ ペルオキシダーゼ 0.5I.U.／ml ３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスル
ホン酸 ２ｍＭ グルコース 2M リン酸緩衝液PH7.0 100ml 数枚のワツトマン（Whatman）No.17ろ紙（ワ
ツトマン社、クリフトン、ニユージヤージー）
を、上記溶液を飽和するまで含浸せしめ、60℃で
乾燥した。 もう一つの方法では、二つの溶液、即ち、
FAD合成酵素、MgCl₂、グルコースオキシダー
ゼ・アポ酵素、ペルオキシダーゼ及びリン酸緩衝
液からなる第一の水溶液と、指示薬、４−アミノ
フエナゾン及び３，５−ジクロロ−２−ヒドロキ
シベンゼンスルホン酸を適切な有機溶媒に溶かし
た第二の有機溶液を含浸せしめた。第一の溶液を
含浸せしめた後、ろ紙を60℃で乾燥し、次いで第
二の含浸を行つた。最終的な乾燥も60℃で行つ
た。 いずれの場合においても、含浸溶液の乾燥残留
物を含むワツトマン紙を2.5mm×2.5mmに裁断し、
試験具を型取りした。試験具を、次いで、両面接
着テープにより裏打ちし、それによつてプラスチ
ツク性の把持具に固着した。 試験具は、それを試料（例えば、ATPもしく
はFMN水溶液又は体液の試料）中に瞬間的に浸
すか、あるいは担体マトリツクス上に試料をのせ
ることにより使用することが最も有利である。検
出可能な色の変化は、ATP又はFMNが存在する
場合に生じる。発色した色の度合いはATP又は
FMNの濃度に依存するため、半定量的試験が、
適切なカラーチヤートを用いることにより可能と
なり、また定量的な試験は適切な反射型読取り装
置を用いることにより可能となる。 上記の説明は、主にATPの検出に関するもの
であるが、FMNを検出するためには、補酵素と
してATPを用いることにより同様の結果を得る
ことができる。 本発明はある程度の具体性をもつて記載されて
いるけれども、本願の開示は例示によつてのみ行
われており、細部については、本発明の範囲を逸
脱することなく多くの変更を加えうることが理解
される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ １リツトル当りピコモル程度の低濃度の、ア
   デノシン三燐酸及びフラビンモノヌクレオチドか
   ら選択される一方の補酵素を測定するための分析
   方法であつて、 (a) 液体試験試料を、 他方の該補酵素、 フラビンアデニンジヌクレオチド合成酵素、 グルコースオキシダーゼ・アポ酵素、 ペルオキシダーゼもしくはペルオキシダーゼ
   様活性物質、 グルコース、 マグネシウムイオン、並びに 過酸化水素及びペルオキシダーゼもしくはペ
   ルオキシダーゼ様活性物質の存在下で、検出可
   能な光学的応答を与える発光原体 を含む単一の試薬溶液と一緒に合わせ、 (b) 該光学的応答を測定する 工程からなることを特徴とする方法。