JPH01503787A - ホリニン酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ホリニン酸の分離方法 本発明は（６Ｓ）−ホニリン酸又はその塩、特にそのホリニン酸−カルシウム、 −マグネシウム、−カリウム及び−ナトリウムの製造方法に関する。

ホリニン酸はＮ−（５−ホルミル−（６Ｒ，５）−５，６，７，８−テトラヒド ロ−プテロイル）−Ｌ−グルタミン酸（５−ＣＨ，０−（６Ｒ，Ｓ　）　−Ｈ。

ＰｔｅＧｌｕ）　）である。Ｎ−（５−ホルミル−（６Ｓ）−５，６，７，８− テトラヒドロプテロイル）−Ｌ−グルタミン酸（５ＣＯＯ（６Ｓ　）　Ｈ４Ｐｔ ｅＧｌｕ）はシトロボルム−因子（＝リューコストツクーシトロボルムに関する 増殖因子）である。

ホリニン酸は２個の不斉中心を有する。その際葉酸、すなわちＮ−（プテロイル ）−Ｌ−グルタミン酸からホリニン酸を合成することに基づきグルタミン酸−残 基中に含有する光学的に活性なＣ−原子はＬ−型で存在する。一方プテロイルー 残基の５．６−位にある二重結合を水素化することによって生じる光学的に活性 なＣ−原子は６−位にラセミ性の（６Ｒ，Ｓ）−型で存在する。したがって合成 ホリニン酸（＝ロイコボリン）は２個のジアステレオマーの１：１−混合物から 成る。

ロイコボリンは巨大赤芽球性葉酸欠乏−貧血の処置用薬剤として、癌治療（ロイ コボリン救済）に於ける葉酸−拮抗剤、特にアミノプテリン及びメトトレキセー トの相客性の及び自己免疫疾患、たとえば乾聞及びリュウマチ性関節炎の処置の 増強用解毒剤として並びに特定の駆虫剤、たとえば化学療法に於けるトリメトプ リム−スルファメトキサゾールの相容性の増強用解毒剤としてますます重要にな っている。

自然に存在するものの中で、たとえば肝臓中にホリニン酸はＳ−型でしか存在し ない。葉酸補因子としてロイコボリンの生化学作用は、その５−ＣＨＯ−（６Ｓ ）　ＨａＰｅＧｌｕ含有率に基づいている。これに対して反対の（Ｒ）−型−５ −Ｃ）１０−　（６Ｒ）　−Ｈ。

ＰｅＧＩｕは全く物質代謝をせずかつ徐々にウリンによって沈澱する。これは生 化学的に有効でない。Ｊ、Ａ。

ストロウ（Ｓｔｒａｗ）等、癌研究４４．３１１４（１９８４）。

したがって５−ホルミル−（６Ｒ，５）−５，６゜７．８−テトラヒドロプテロ イル−し−グルタミン酸の分離に及び５−ホルミル−（６Ｓ）−５，６゜７．８ −テトラヒドロプテロイル−Ｌグルタミン酸の不斉合成に及び生理学的に活性な 型の単離に数倍の努力が払われている。Ｄ、コスリヒ（Ｃｏｓｕｌｉｃｈ）等、 Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、７４．４２１５−１６　（１９５２）、米国 特許第２．６８８．０１８号明細書には、水性溶液から５−ホルミル−（６Ｒ， ５）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイル−し−グルタミン酸のアルカリ 土類−塩、たとえばカルシウム−又はストロンチウム−塩の分別結晶による分離 を行うことが述べられている。

Ｂ、コスリヒ等によって開示された条件下で所望される分離は、実現できない。

ｐＨ７−８で水からたとえば５−ホルミル−（６Ｒ，５）−５，６，７，８−テ トラヒドロプテロイル−し−グルタミン酸のカルシウム−塩の晶出で常に再び純 粋な６Ｒ，Ｓ−型が得られる。たとえばこれはキラルＨＰＬＣ−カラムのクロマ トグラフィー分析によって並びに旋光度によって定量的に検出することができる 。その際５−ＣＨＯ（６Ｒ、Ｓ　）　Ｈ４ＰｔｅＧＩｕの粗製又は純粋なカルシ ウム−塩を結晶化に使用するかどうかは重要でなく、常に光学的に純粋な（６Ｒ ，Ｓ）−型に戻る。

（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸アルカリ土類塩の過飽和水性溶液に純正な（６Ｓ）− ホリニン酸アルカリ土類塩を結晶種として加えた場合、（６Ｓ）−型の分離及び 増加を達成することもできない。したがって今日まで不斉合成はＮ−（５−ホル ミル−（６Ｓ）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイル）−Ｌ−グルタミン 酸を得るための唯一の可能性として残る。しかしく６Ｓ）−ホリニン酸の不斉合 成の従来公知の方法は、工業的規模でこの化合物の製造に不適当である。したが って今日まで（６Ｓ）−ホリニン酸を収得するための工業的に使用できる方法は ない。

したがって（６Ｓ）−ホリニン酸及びその塩の簡単な工業的に使用できかつ経済 的方法を得ることが課題である。

本発明者は驚くべきことに（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸のアルカリ土類塩、たとえ ばカルシウム−、マグネシウム−又はストロンチウム−Ｎ−（５−ホルミル−（ ６Ｒ，５）−５，６，７，８−テトラヒドロプテロイル）−Ｌ−グルタミン酸ト （＝（６Ｒ。

Ｓ）−ホリニン酸アルカリ土類塩）を好ましくは水から、無機又は有機塩基の存 在下にアルカリ性媒体中で再結晶した場合先ず主に（６Ｓ）型が晶出し、この際 結晶形の（６Ｓ）−型含有率が８５％及びそれ以上で得られうることを見い出し た。

（６Ｓ）−型が著しく増加された、高い（６Ｓ）−型含有率を有するホリニン酸 アルカリ土類塩を、場合により好ましくは水からほぼ中性ｐＨで更に再結晶゛し て光学的に純粋な（６Ｓ）−ホリニン酸アルカリ土類塩に変えることができる。

結晶化にあたり収率をアルカリ土類−イオン、たとえば塩化−カルシウム、−マ グネシウム又は−ストロンチウムの添加によって改善することができる。

したがって本発明の対象は、（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸のアルカリ土類塩を再結 晶し、場合によりホリニン酸アルカリ土類塩から酸を遊離する及び（又は）場合 によりそのアルカリ塩に変えることによって（６Ｓ）−ホリニン酸又はその塩を 製造するにあたり、再結晶を塩基の存在下に実施することを特徴とする上記化合 物の製造方法である。

更に本発明の対象は、得られた結晶を塩基の存在下に又はほぼ中性ｐＨ−値で少 なくとももう一回再結晶する方法である。好ましい実施形態によれば、再結晶を 付加的にアルカリ土類−イオンの存在下に実施する。

本性に関する出発材料として純粋な（６Ｒ，Ｓ）−ホニリン酸アルカリ土類塩及 び粗製の（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸アルカリ土類塩が適当である。

この方法によってＮ−（５−ホルミル−６３）−５，６，７，８−テトラヒドロ プテロイル）−り一グルタミン酸のカルシウム−及びマグネシウム−塩が初めて 工業的に入手できる。

ホリニン酸のアルカリ土類塩としてホリニン酸−カルシウム、−マグネシウム、 −ストロンチウム及び−バリウムが挙げられる。ホリニン酸−カルシウム及び− マグネシウムが好ましい。というのはこれを続いて行われる分離後そのまま薬剤 として使用することができるからである。一方たとえばストロンチウム−及び特 にバリウム−塩は次いで他の、生理学的に妥当な塩に変えられる。

無機又は有機塩基としてたとえば次のものが挙げられる： 水酸化アルカリ、たとえば水酸化−ナトリウム、−カリウム及び−リチウム、水 酸化アルカリ土類、たとえば特に水酸化−カルシウム及び−マグネシウム、アン モニア、ヒドラジン、水溶性有機塩基、特に簡単な第一、第二、第三アミン、た とえばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエ チルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、メチルエ チルアミン、アミノアルコール、たとえばエタノールアミン、ジェタノールアミ ン、トリエタノールアミン、プロパツールアミン、ブタノールアミン、ジヒドロ キシプロピルアミン（２，３−ジヒドロキシプロピルアミン、セリノール）、ト リヒドロキシブチルアミン（トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、 グルカミン、Ｎ−メチル−グルカミン、ペテロ環状アミン、たとえばピロリジン 、ピペリジン、モルホリン又はピペラジン。

本発明による方法に従う最初の再結晶を、８．５から１２の間、好ましくは９． ０から１０．５の間のｐＨ−値で実施する。より一層低いｐ）ｌの場合、結晶形 での（６Ｓ）−型の明らかな増加は起きず、より一層高いｐＨの場合、ホリニン 酸の安定性は著しく小さくなり、更にアルカリ土類塩はほとんど結晶化しない。

（６Ｓ）−フォリン酸アルカリ土類塩から（６Ｒ）−ホリニン酸塩の残存量を除 去するために、次の再結晶をほぼ中性媒体中で、たとえば６．５ないし８．５の ｐＨ−範囲で実施することができる。再結晶に於いて対応するアルカリ土類−イ オンの添加によって溶解積が急速に得られ、それによって収率を上昇することが できる。アルカリ土類−イオン、好ましくはＣａ、　Ｍｇ、Ｓｒを任意の易溶性 塩の形で、たとえば塩化物、硫酸塩又は硝酸塩の形で加える。これを一般にホリ ニン酸塩の０．２ないし４倍量で使用する。

本発明の対象は、また本発明による方法によって初めて工業的に入手できる（６ Ｓ）−ホリニン酸塩、特にホリニン酸カルシウム及び（６Ｓ）−ホリニン酸並び にその製造方法とは無関係に新規のマグネシウム塩及び良好に入手できる（６Ｓ ）−ホリニン酸アルカリ土類塩から、たとえば再度塩となして容易に得られる新 規（６Ｓ）−ホリニン酸−ナトリウム及び−カリウムである。（６Ｓ）−ホリニ ン酸マグネシウムは極めて重要である。というのは２ｇ／１００−より大きいそ の同等に良好な水溶性及びその高い相容性によって、注射溶液の製造に通する出 発材料を形成するからである。更に多く同じことが（６ｓ）−ホリニン酸−ナト リウム及びカリウムに対してもいえる。（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムは２０ °Ｃで０．９５％水性溶液しか形成することができない。このことは注射溶液の 製造を困難にする。

次の例は本発明を説明するためのものである：且土 ６Ｓ　−ホＩニン　カルシ　ム １、結晶化： ５０〜６０°Ｃの熱水約１４２中の粗（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウム１０ ０ｇに塩化カルシウム（ＣａＣ１ｚ２８ｚＯ）　１２　３６　ｇを加え、３０° Ｃで水性アンモニア（２５％）の添加によってｐＨ１０に調整し、１８゛Ｃで晶 出させる。１Ｂ−２０時間後、沈澱した生成物を濾取し、希塩化カルシウム−溶 液で、次いで無水エタノールで洗滌する。８８％（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウ ム及び１２％（６Ｒ）−ホリニン酸カルシウムを含有するホリニン酸カルシウム ４１ｇが得られる。光学的収率７２％。

２結晶化： ８８％（６Ｓ）−ホリニン酸塩を含有する、】、結晶化からの粗（６Ｓ）−ホリ ニン酸カルシウム４０ｇを５５〜６０°Ｃで水に溶解し、徐々に水性塩酸（２０ ％）をｐＨ６，１になるまで加え、次いで塩化カルシウム４０〜１６０ｇを加え る。５５°Ｃで苛性ソーダ溶液の添加によって溶液のｐＨを７〜７．５に調整す る。約３５°Ｃで純正な（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを結晶種として加えて 、１８〜２０°Ｃで生成物が晶出する。

約４０時間後、晶出した生成物を濾取し、水性エタノールで洗滌し、乾燥する。

（Ｓ）−ホリニン酸塩含有率９８％を有する（　Ｓ）−ホリニン酸カルシウム３ ０．４　ｇが得られる。光学的収率ニア９〜８１％。

３、結晶化： （６Ｓ）−型含有率９４〜９８％を有する（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウム１０ ｇを熱水中に溶解し、塩化カルシウム１０ｇを加え、ｐＨ７，０〜７．５及び１ ８−２０°Ｃで晶出させる。３〜４日後、生成物を濾取し、少量の水で、次いで 湿潤エタノールで洗滌し、乾燥する。

純粋な（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウム８ｇが得られる。

（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウム含有率＝９９−１００面積％ 水中での溶解度：２０″Ｃで０．９５　ｇ　／　１００　ｒｎＲ及び４０°Ｃで １．５ｇ／１００　ｍｌ！ 比旋光度〔α）　’ｎ”ニー１５°（無水Ｃａ−塩に対して）注釈： ホリニン酸カルシウム含有率ニスタンダートに対してＨＰＬＣを用いて測定。

（６Ｓ）−型含有率：キラルカラムの使用下にＨＰＬＣを用いて測定（レゾルボ シル（ Ｒｅｓｏｌｖｏｓｉｌ）−ＢＳＡ−７）　。

ｍ 種々の塩基の存在下に結晶化して（６Ｒ，Ｓ）−ホ（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カ ルシウム３０ｇを５０℃で水２００−３００ｄ中に溶解し、３０〜４０°Ｃで（ ６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸カルシウムモルあたり塩基０．５−０．６当量を加える 。

溶液を室温で５〜１７時間攪拌する０通常直ちに自発結晶化が生じる。結晶を濾 取し、少量の５％塩化カルシウム−溶液で、次いでエタノールで洗滌し、乾燥す る。

結果は表１から明らかである。

表１ 塩基無添加　７．５　５０．１　９９　分離されず 水酸化ナトリ　８．５　５２　１０１　分離ラム　開始 ＮａＯＨ１０８０９６７０ セリノール　９．６　７５　９８．２　７５メチルアミン　１０　７９　９６． ５　７６エチルアミン　９．９　８２　９７．５　７８アンモニア　１０　８４ 　９８．９　７２ヒドラジン　１０　８３　９７　７２ ２．１．に従って得られた粗（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムの再結晶 前記方法１に従って得られた粗（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムを塩化カルシウ ム１−４部の添加下にｐ）Ｉ　６．５〜７．５で水から再結晶する。その際少量 の難溶性分画を濾過によって分離する。濾液から蒸発し、冷却した後に純粋な（ ６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムが晶出する。

（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウム含有率＝９９．９面積％ ■主 ６Ｓ　−ホ丁二ン　マグシウム １、結晶化： （６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸ナトリウムの水性溶液から塩化マグネシウムで沈澱さ せて製造された（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸マグネシウム３０ｇを熱水中に溶解し 、塩化マグネシウム１００ｇを加え、水性水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ １０に調整する。

攪拌下１６−１８℃に冷却する。

いく日か後、晶出した粗（６Ｓ）−ホリニン酸マグネシウムを濾取し、エタノー ルを洗滌し、乾燥する。（Ｓ）−ホリニン酸塩含有率８０％を有するホリニン酸 マグネシウムが得られる。

λ再結晶： 塩化マグネシウムの添加下に少量の水からほぼ中性ｐＨで再結晶して、粗製のも のから理論値の９５％より多い（６Ｓ）−ホリニン酸塩含有率を有する純粋な（ ６Ｓ）−ホリニン酸マグネシウムが得られる。

水中での溶解度：２０°Ｃで２．４　ｇ／１００　ｍ（６Ｓ）−ホリニン該カル シウムの実質上飽和された水性溶液をイオン交換体−カラムによって抽出濾過す る。このカラムはＮａ（゛）　−型のカチオン交換樹脂で、たとえばアンバーラ イト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＩＲ−１２０、Ｎａ”ゝ　−型で充填されている。

溶離液を濃縮する。エタノールの添加によって（６Ｓ）−ホリニン酸ナトリウム を沈澱させる。（６Ｓ）−ホリニン酸ナトリウムは容易に水に溶ける。

これに代えて（６Ｓ）−ホリニン酸ナトリウムを等量の水酸化ナトリウム中に（ ６Ｓ）−ホリニン酸を溶解しても得ることができる。

これに必要な（６Ｓ）−ホリニン酸は例６に従っ量の水性水酸化カリウムに溶解 しで、この化合物が得られる。

その濃縮された水性溶液から、エタノール、イソプロパツール又はアセトンを添 加して（６Ｓ）−ホリニン酸カリウムを沈澱させることができる。

（６Ｓ）−ホリニン酸カリウムは容易に水に溶ける。

（６Ｓ）−ホリニン酸カルシウムの水性溶液に慎重に希塩酸を加える。この場合 （６Ｓ）−ホリニン酸を沈澱させ、濾過によって得られる。

（６Ｓ）−ホリニン酸は全く水に溶けない。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成元年１月１３日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．（６Ｒ，Ｓ）−ホリニン酸のアルカリ土類塩を再結晶し、場合によりホリニ ン酸アルカリ土類塩から酸を遊離する及び（又は）場合によりそのアルカリ塩に 変えることによって（６Ｓ）−ホリニン酸又はその塩を製造するにあたり、再結 晶を塩基の存在下に実施することを特徴とする上記化合物の製造方法。
2. ２．得られた結晶を塩基の存在下に又はほぼ中性ｐＨ−値で少なくとももう一回 再結晶する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．再結晶を付加的なアルカリ土類−イオンの存在下に実施する請求の範囲第１ 項又は第２項記載の方法。
4. ４．請求の範囲第１項又は第２項に従って製造された（６Ｓ）−ホリニン酸及び そのカルシウムー塩。
5. ５．（６Ｓ）−ホリニン酸のマグネシウムー塩。
6. ６．（６Ｓ）−ホリニン酸のナトリウムー及びカリウムー塩。