JPH0120871B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、一般に、微生物学工業に関し、さら
に詳細には、Ｌ−トレオニンの製造方法に関す
る。Ｌ−トレオニンは、医学用途の種々の栄養混
合物の成分として広範に適用出来る必須アミノ酸
として知られている。さらに、Ｌ−トレオニン
は、人間の食品および動物のかいばに対する添加
剤としてまた医薬および化学工業の試薬として使
用することが出来る。 ブレビバクテリウムフラバム
（Brevibacterium flavum）、大腸菌
（Escherichia coli）、コリネバクテリウムアセト
アシドフイラム（Corynebacterium
acetoacidophilum）、レツトゲル変形菌
（proteus rettgeri）、霊菌（Serratia
marcescensi）、アイロゲネス菌（Aerobacter
aerogenes）、コリネバクテリウムグルタミカム
（Corynebacterium glutamicum）のような生産
菌株を、グルコース、フラクトース、酢酸、エタ
ノールのような炭素源を含有しかつあるビタミン
およびアミノ酸でドープした栄養培地またはこれ
らの物質および窒素源および必須のミネラル塩を
含有する基体で成長させて深部培養することによ
りＬ−トレオニンを製造する多数の方法が当業界
で知られている（英国特許第1223470；1260995；
1286208号明細書、フランス国特許第1573433；
1580549；1579835号明細書、FRG特許第2044907
号明細書参照）。 Ｌ−トレオニンの最良収率は、グルコース培地
で最大18ｇ／のＬ−トレオニンを生産し
（Agr.Biol.Chem.1973、37、653参照）、酢酸培地
で最大40ｇ／のＬ−トレオニンを生産し（英国
特許第1260995号明細書参照）、そしてエタノール
培地で最大33.8ｇ／のＬ−トレオニンを生産す
る（英国特許第1286208号明細書参照）ブレビバ
クテリウムフラバム（Br.flavum）の突然変異菌
株により達成された。これらのすべての場合にお
いて、α−アミノ−β−キシ草酸に抵抗性のあ
る突然変異菌株が使用された。 炭水化物、窒素源、ミネラル塩を含有しかつ純
枠アミノ酸およびビタミンでドープされた栄養培
地で、またはこれらの物質を含有する蛋白質水解
物で大腸菌の突然変異菌株を深部培養することに
よりＬ−トレオニンを製造する１つの従来技術法
が知られている。酵素質培地で96時間発酵して最
大収量10.4ｇ／のＬ−トレオニンが得られた
（英国特許第1223470号、米国特許第3711375号、
フランス国特許第1551414および1580545号各明細
書参照）。 前記方法で使用される突然変異菌株は、イソロ
イシンまたはイソロイシンおよびメチオニン（英
国特許第1223470号明細書参照）またはジアミノ
ピメリン酸（米国特許第3711375号およびフラン
ス国特許第1551414号各明細書参照）を必要とす
る。 しかしながら、前述した方法は、低水準のＬ−
トレオニン蓄積（特に炭水化物培地において）お
よび長い発酵時間（96〜120時間）により特徴づ
けられるものであつた。 炭素および窒素源およびあるミネラル塩を含有
する栄養培地でＬ−トレオニン生産体の深部培養
によりＬ−トレオニンを製造するもう１つの方法
が当業界で知られている。Ｌ−トレオニン生産体
として、あるポリオーキソトロフイツク大腸菌
（polyauxotrophic E.coli）突然変異種たとえば
大腸菌菌株ATCC 21272、ATCC 21148および
ATCC21149が使用され、一方、炭素源としてグ
ルコースまたはフラクトースが適用されている。
これらの菌株は、ジアミノピメリン酸、イソロイ
シンまたはメチオニンを必要とする。したがつ
て、たとえば、大腸菌菌株ATCC 21272はジアミ
ノピメリン酸、メチオニン、イソロイシンを必要
とし、菌株ATCC 21148はジアミノピメリン酸お
よびメチオニンを必要とし、菌株ATCC 21149は
ジアミノピメリン酸のみを必要とする。さらに、
これらの菌株の培養には、前記成長因子の他に、
リシンが必要である。培養は、20〜40℃で行われ
る。7.5％のフラクトースを含有する培地で培養
すると、前記菌株はＬ−トレオニンを生産し、培
地中のその濃度は最初は上昇するが、しかし時間
と共に分解して減少する。Ｌ−トレオニン蓄積の
時間を延長させかつその濃度低下を防止するため
には、ある抗生物質たとえばストレプトマイシ
ン、テトラサイクリン、カナマイシン、ポリミク
シンまたはそれらの混合物が使用される。 発酵開始後40時間してストレプトマイシンを添
加すると、発酵は120時間迄延長され、Ｌ−トレ
オニン蓄積水準は13.2ｇ／に達する。これは、
7.5％のフラクトースを含有しかつジアミノピメ
リン酸およびメチオニンを必要とする栄養培地で
成長せしめられる大腸菌菌株ATCC 21148の培養
の場合である。栄養培地への抗生物質の添加量
は、10〜1000mg／である（フランス国特許第
1579835号明細書参照）。 この方法は、発酵工程中の目的生成物の平均蓄
積速度は１時間当り0.15〜0.20ｇ／という低い
平均蓄積速度であるという欠点を有し、したがつ
て、Ｌ−トレオニン蓄積水準が低くかつ発酵工程
の時間が増大するものである。さらに、この方法
の適用には、生産体が必要とするある追加成分た
とえばジアミノピメリン酸、メチオニンまたはイ
ソロイシンの導入が伴う。 本発明の本質的目的は、Ｌ−トレオニン生産体
の発酵工程中培地におけるＬ−トレオニン蓄積速
度を増大させることである。 前記および他の目的は、炭素および窒素源およ
びミネラル塩を含有する栄養培地で抗生物質の存
在下で生産体すなわち大腸菌菌株を深部培養し、
培養液体から生物体（biomass）を分離し、目的
生成物を単離することによりＬ−トレオニンを製
造する方法において、生産体として、突然変異体
受容菌株に突然変異遺伝子を含むマルチコピー性
雑種プラスミド（multicopy hybrid plasmid）
を導入することによりＬ−トレオニン生産速度を
高め得る突然変異遺伝子の量を増大させる遺伝子
工学の技術により得られる、セントラル ミユー
ジアム オヴ コマーシヤル マイクロオーガニ
ズムズ（Central Museum of Commercial
Microorganisms）に寄託番号No.CMYMB−1856
で寄託され、大腸菌菌株VNIIジエネテイカ
（genetika）VL334／pYN7／の自然変異性に基
いて選ばれた大陽菌菌株VNIIジエネテイカＭ−
１を使用し、培養をペニシリンの存在下で行う
（ペニシリンに対する抵抗性は上記の雑種プラス
ミドにより生ずるものである）ことを特徴とす
る、上記方法により達成される。ペニシリンは
0.1〜0.5ｇ／の量で最初の栄養培地に導入する
のが適当であり、これにより、発酵工程のために
ある栄養物で富化された培地を使用することが出
来、その結果、発酵の初期（非生産性）段階期間
内で培養の比成長速度をいかなる主たる生産体特
性の損失もなしに何倍も増大させることができる
ので、発酵初期段階期間が大幅に低減される。最
初の栄養培地を富化するために、イースト乾燥重
量に換算して１〜５ｇ／の酸または酵素イース
ト水解物またはイースト自己消化物が使用され、
一方、発酵期間中を通して炭素および窒素の最適
濃度および発酵培地中のPH値を維持するために、
アンモニア性溶液および炭素源を含有する均衡の
取れた供給混合物が周期的に栄養培地に添加され
る。 本発明の方法は次のようにして行われる。 生産菌株として、原大腸菌菌株VNIIジエネテ
イカVL334／pYN7／の自然変異性に基いて選定
された大腸菌菌株VNIIジエネテイカＭ−１を用
いる。大陽菌菌株VNIIジエネテイカVL334／
pYN7／の製造方法は、トレオニンオペロンの全
遺伝子を含有するエンドヌクレアーゼの助けで得
られるドナー大腸菌菌株VNIIジエネテイカMG
−442の染色体のDNAの部分と、ベクトルDNA
分子とを、当業界で周知の方法で結合する（ここ
においてプラスミドpBR 322が使用される）こ
とからなる。その結果、雑種プラスミドが生成す
る。このようにして得られた雑種プラスミドは、
１分子のプラスミドpBR 322およびドナー菌株
染色体のDNAの前記した部分からなり、細胞を
耐ペニシリン性にし、対数的成長の段階で40〜50
コピーの量で細胞中に生じ得る。次に、この生成
雑種プラスミドは、菌株中にＬ−トレオニンの合
成およびＬ−トレオニン代謝の隣接経路を妨害し
得るある突然変異を有する受容体大腸菌菌株
VL334の細胞を変換するために使用される。その
突然変異は、最小限のグルコース−塩培地で培養
中増幅された雑種プラスミドを含有する細胞に対
して選択的利点を与える。その結果、Ｌ−トレオ
ニン生産大腸菌菌株VNIIジエネテイカVL334／
pYN7／が得られ、このものは、All−Union
Research Institute for Genetics and Selection
of Commercial Microorganismsの下にある
Central Museum of Commercial
Microorganismsに、寄託番号No.、ＭMB−
1684として寄託されている。尚、この菌株は、ブ
ダペスト条約の下での国際寄託機関であるオール
ユニオン コレクシヨン オヴ インダストリ
アル マイクロオーガニズムズ アツト ザ
“VNIIGENETIKA”インステイテユート（All
Union Collection of Industrial
Microorganisms at the“VNIIGENETIKA”
institute）に移管され受託番号（TsMPM）
VKPM Ｂ−1684を有している。 このようにして得られた菌株は、寒天をドープ
した培地に接種され、多くの個々のコロニーが最
小限のグルコース−塩栄養培地でＬ−トレオニン
を生産する能力および発酵工程中プラスミドを保
持する能力について調らべられ、その結果、大腸
菌菌株VNIIジエネテイカＭ−１が単離された。 大腸菌生産菌株VNIIジエネテイカＭ−１は下
記の特徴を有する。尚、このものは上記Central
Museum of Commercial Microorganismsに、
寄託番号No.CMYMB−1856として寄託されてい
る。またこの菌株は更に上記の国際寄託機関に移
管され受託番号（TsMPM）VKPM Ｂ−1856を
有している。 形態学：敏速に可動するグラム陰性の細長い細
菌、長さ1.52μｍmm、丸い端縁。 培養および生理学的特性： 牛肉エキス寒天 37℃で24時間成長後、菌株
は、直径２〜３mmの丸い白色がかつた半透明コロ
ニーを形成する；表面は滑らかであり、端縁は平
らかまたは軽く波がついており、コロニーの中心
は少し隆起しており、構造は均一であり、堅さ
（Consistency）はペースト状であり、容易に乳化
することが出来る。 最小限の寒天ドープグルコース含有栄養培地
（アダムス） 37℃で２日間成長後、菌株は、直
径１〜1.5mmの丸い灰色がかつた白色コロニーを
形成し、端縁は平らであり、軽く凸状をなし、均
一な内部構造を有し、光沢表面を有し、４日また
は、５日で、コロニーは粘液様の堅さ（mucoid
consistency）になる。 牛肉エキス汁中の成長 37℃で24時間成長後、
強い均一な濁りが生じ、特徴のある臭気を有する
わずかの沈殿が沈殿する。倍増時間は33分であ
る。 アダムスの液体最小限培地での成長 37℃で通
気下で２日間成長後、強い均一な濁りが生じる。 倍増時間は240分である。 牛肉エキス寒天上の深部スタツブ（stub）培養
の成長 スタツブ培養全体にわたつて良好な成
長。 ゼラチン液化力 なし。 ミルク上の成長 ミルク凝固を伴う良好な成
長。 インドール生成能力 有効 種々の炭水化物上の成長 グルコース、ラクト
ース、マンノース、ガラクトース、キシロース、
フラクトース、グリセロールおよびマンニツト上
で酸およびガスの生成を伴つて良好な成長。 抗生物質に対する抵抗性 ペニシリン耐性。菌
株は病原性ではない。 プラスミツド含量 成長の対数的段階で、細胞
は約40〜50コピーのプラスミツドpyN7（分子量
5.7メガダルトン）を含有し、これは、トレオニ
ンオペロンの遺伝子を運ぶ菌株のペニシリン耐性
を保証する。 大腸菌菌株VNIIジエネテイカVL334／
pYN7／の接種培養から選定された大腸菌菌株
VNIIジエネテイカＭ−１は、コロニーの表面の
顕著なムコイド性、増大されたトレオニン生産
力、栄養添加剤をドープした培地で成長させた場
合のより高い安定性、すなわち、そのような条件
下で培養後細胞が主な特性を保持する能力（トレ
オニン生産能力およびペニシリン耐性）の点で原
菌株と異なる。前記菌株の比較特性を下記表に示
す。

【表】 培養菌は表に示す培地を用い37℃のシエーカー
中で成長させた。10世代の発生が得られた後、培
養菌を寒天ドープホツチンガー肉汁を含有する皿
に種付けして個々のコロニーを得た。次に、各実
験において少なくとも100のコロニーをレプリケ
ーターを用いてペニシリン耐性およびトレオニン
生産能力について調らべた。 上記表のデータから明らかなように、グルコー
ス−塩培地で培養後両菌株の細胞集団は、ほゞ等
しい水準でトレオニン生産能力を保持することが
分る、すなわち、これらの条件下でそれらは安定
であることが分る。しかしながら、栄養物が豊富
な培地（牛肉エキス汁）で培養後、トレオニン生
産能力を保持する細胞の数は、原菌株に比較して
新規な大陽菌菌株VNIIジエネテイカＭ−１では
非常に多く、すなわち、新規な菌株は富化培地条
件でより安定である。 大腸菌菌株VNIIジエネテイカＭ−１のこの特
性は、ペニシリンの培地への導入と共に、（雑種
プラスミドによりペニシリンへの抵抗性がもたら
される）培養過程で栄養添加剤を使用することを
可能にし、その結果、微生物成長が非常に促進さ
れる。したがつて、たとえば、グルコース−塩培
地で培養された大腸菌菌株VNIIジエネテイカＭ
−１の発生時間は240分であるに対し、一方、富
化培地の場合の発生時間は30〜40分である。富化
培地での菌株成長のより速い速度により、フラス
コおよび接種器で接種物を調製する段階を工程フ
ローシートから除去しかつ発酵時間を短縮するこ
とが可能となる。 培養工程は次のようにして行われる。 大腸菌微生物の菌株VNIIジエネテイカＭ−１
の培養菌の接種物は、ペニシリン（500ガンマ／
ml）を含有する寒天ドープ最小限栄養培地で40〜
50時間成長せしめられ、次に、培養菌の細胞を寒
天斜面の表面から生理学的塩水で洗い流す。得ら
れた細胞懸濁液は発酵培地の接種に用いる。発酵
器の最初の細胞濃度は、約２〜５×10³〜10⁷セ
ル／mlでありうる。最初の栄養培地は、グルコー
ス、ミネラル窒素、塩類、ペニシリンおよび蛋白
質水解物形の栄養添加剤たとえばイーストの酸水
解物、自己消化物または酵素的水解物を含有す
る。培地の初期PHは7.0または7.2であり、次に、
発酵期間中、アンモニア成分（水溶液）およびグ
ルコースを含有する均衡の取れた供給物を添加し
てPHモニターによりこれらのPH範囲内に自己で維
持する。Ｌ−トレオニン生産体の培養過程での培
地のPH値の低下は、生産体のアンモニア成分の利
用に基づく培地中の低減されたアンモニア成分
（窒素）濃度により説明され、一方、窒素および
グルコース利用速度間の比はほゞ同じであるの
で、栄養培地中のそれら成分の量間の比は、生産
体培地によるこれら成分の利用速度間の比に対応
しなければならない。これは、発酵過程中に前述
の供給物添加剤を導入することにより達成され
る。この工程は、連続通気および撹拌下で行わ
れ、温度は30〜40℃に維持される。発酵時間は40
〜50時間である。 発酵工程（fermentation process）が終つた
ら、最大30ｇ／のトレオニンが培養液中に蓄積
される。Ｌ−トレオニンの単離は、次のようにし
て行われる。 生産体細胞生物体は、酸化カルシウムおよびオ
ルト燐酸で予め処理した後遠心分離または過に
より分離される。原溶液（native solution）中
のＬ−トレオニンおよびカチオンの含量および色
素化合物の含量を正しく計算するために、原溶液
を、色素化合物を吸収する清澄化吸着剤およびカ
チオンおよびＬ−トレオニンを吸着するＨ型のス
ルホカチオナイトを充填した一列の縦に並んだカ
ラムに通す。次いで、このように吸着されたＬ−
トレオニンは、アンモニア溶液を用いてスルホカ
チオナイト充填カラムから溶離される。大部分の
Ｌ−トレオニンを含有する溶離部分は、真空蒸発
により濃縮され、冷却され、Ｌ−トレオニンは結
晶化される。結晶化促進のためにある種のアルコ
ールを加えてもよい。得られたＬ−トレオニン
は、クロマトグラフイー的には均質であり、97〜
99％の主要物質を含有する。したがつて、医学的
用途調製物を得るには、この生成物を単に再結晶
化すればよい。そのような調製物は組織細胞培養
の培地に適用することが出来る。前記工程による
目的生成物の収率は、80〜95％である。培養液中
でより高いＬ−トレオニン濃度（18ｇ／以上）
の場合であつて比較的不純物の含量が低い場合
は、Ｌ−トレオニンは、イオナイトへの吸着に訴
えることなく単離することが出来る。この目的の
ためには、目的生成物の清澄化された溶液を真空
低温で蒸発濃縮し、その後、ある量のエタノール
を添加してまたは添加せずに低減された温度でＬ
−トレオニンを結晶化する。再結晶化すると、99
％の主要物質を特徴とするＬ−トレオニンが得ら
れる。 本発明の方法は、従来公知の炭水化物培地でＬ
−トレオニンを製造するあらゆる方法より効果的
であり、他のアミノ酸の混合物なしで培養液中で
最大30ｇ／のＬ−トレオニン濃度を得ることが
出来、また、発酵工程時間を40時間に低減するこ
とが出来る。 発酵過程でのＬ−トレオニン蓄積平均速度は、
１時間当り0.75ｇ／に達し、これは公知方法に
よるＬ−トレオニン蓄積のそれの５倍である。 下記に、本発明のＬ−トレオニン製造方法の実
施例を説明する。 例 １ 大腸菌生産菌株VNIIジエネテイカＭ−１の接
種物を、下記組成：グルコース5.0；NH₄Cl1.0；
KH₂PO₄1.5；Na₂HPO₄3.5；MgSO₄・
7H₂O0.1；ペニシリン500ガンマ／ml；寒天
20.0；蒸留水残部を有する寒天ドープ最大限グル
コース−塩栄養培地で43時間培養する。培地のPH
は7.0〜7.2である。グルコースおよびペニシリン
は、別々に滅菌し、溶融培地に添加し、その後冷
却して接種を行う。成長した培養菌を滅菌水道水
で洗い流し、得られた細胞懸濁液を、発酵器への
種付けに用いる。発酵培地における生産細胞の初
期濃度は10⁶〜10⁷セル／mlである。 発酵工程は、0.5容量の実験用発酵器で行う。
基本的な発酵栄養培地の組成は次のようである （容量％）： （NH₄）₂SO₄ 1.5 K₂HPO₄ 0.2 MgSO₄ 0.04 酸イースト水解物（イースト乾燥重量換算） 0.3 消泡剤 0.1 残部の水 栄養培地は発酵器と共に滅菌し、その後、培地
に、滅菌グルコース（２％）およびペニシリン
（0.5ｇ／）を添加する。 発酵工程は35〜37℃で行い、アンモニア成分
（2.5〜2.7％）およびグルコース（35％濃度）を
含有する混合物形の均衡の取れた供給物の添加を
伴う。この供給混合物は、PHモニターにより送ら
れる信号に応じて添加される。PH値は7.0〜7.2に
維持される。40時間の発酵後、30ｇ／のＬ−ト
レオニンが培養液に蓄積する。Ｌ−トレオニンの
平均蓄積速度は１時間当り0.75ｇ／である。Ｌ
−トレオニンの合成に消費されるグルコース量
は、Ｌ−トレオニン１ｇにつき６ｇである。 次に、Ｌ−トレオニンを培養液から単離する。
この目的のために、30ｇ／に等しいＬ−トレオ
ニン濃度を有する培養液300mlに、絶えず撹拌し
ながら３ｇの酸化カルシウムを添加し、その後、
燐酸を導入してPH値を5.6にし、次いで、溶液を
60℃に加熱し、10分間保持し、生物体を真空で
過分離する。このようにして得られた原溶液は１
cmキユベツトで525nｍで0.4の光学濃度を有し、
これを50mlの清澄化樹脂を充填したカラムに通
し、そして清澄化された溶液（0.08の光学濃度を
有する）をＨ型のスルホカチオナイト150mlを充
填したカラムに通し、その後、カラムを30mlの水
で洗浄する。このように吸着されたＬ−トレオニ
ンを３％アンモニア溶液で溶離し、溶離液を真空
中で25％乾燥物質含量になるまで蒸発濃縮し、あ
る量のエタノールを１：１の比で添加し、混合物
を０〜＋５℃で10時間結晶化させる。Ｌ−トレオ
ニン結晶を過し、洗浄し、乾燥して8.1ｇのＬ
−トレオニン（収率は90％）を得る。薄層技術に
よるクロマトグラフイー分析（10ガンマの調製物
がクロマトグラムに適用された）によつて、他の
アミノ酸が全く含まれないことが証明された。 例 ２ 大腸菌生産菌株VNIIジエネテイカＭ−１の接
種物を例１と同様にして調製する。 発酵工程は、0.5容量の発酵器で行う。最初
の栄養培地の組成は、栄養添加剤として、イース
ト乾燥重量に換算して0.5％の酵素的イースト水
解物（酸イースト水解物の代りに）を用いること
を除いて例１と同様である。 発酵条件は、例１と同様である。41時間の発酵
後、29ｇ／のＬ−トレオニンが培養液に蓄積す
る。Ｌ−トレオニンの平均蓄積速度は、0.71ｇ／
ｈである。次に、Ｌ−トレオニンを培養液から単
離する。 この目的に対して、生産体細胞を培養液から遠
心分離し、その後、7.5％乾燥物質を含有しかつ
525nｍで0.6の光学濃度を有する300mlＬ−トレオ
ニン原溶液を真空中で50℃で50mlの容量まで蒸発
濃縮し、次いで、同じ量のエタノールを添加し、
Ｌ−トレオニンを０℃で５時間結晶化させる。こ
のようにして得られた結晶を別し、15mlエタノ
ールで洗浄し、乾燥して6.1ｇのＬ−トレオニン
を得る。薄層技術によるクロマトグラフイー分析
（10ガンマの調製物がクロマトグラムに適用され
た）によつて他のアミノ酸は全く示されない。 例 ３ 大腸菌生産菌株VNIIジエネテイカＭ−１の接
種物を例１と同様にして調製する。 発酵工程は、２m³発酵器で行う。最初の栄養培
地の組成は、栄養培地への栄養添加剤として、イ
ースト乾燥重量に換算して0.4％のイースト自己
消化物を使用し、かつペニシリン含量が0.2ｇ／
であることを除いて、例１と同じである。 発酵培地中の生産体細胞の初期濃度は、10³〜
10⁴セル／mlである。 43時間発酵後、18ｇ／のＬ−トレオニンが培
養液に蓄積する。グルコース消費速度は例１と同
じである。Ｌ−トレオニンの平均蓄積速度は１時
間当り0.42ｇ／である。 目的生成物の単離は例１と同様にして行う。Ｌ
−トレオニンの収率は80％である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 大腸菌菌株VNIIジエネテイカＭ−１
   （Escherichia coli strain VNII genetika Ｍ−
   １）をＬ−トレオニン生産体として炭素および窒
   素源およびミネラル塩を含有する栄養培地で抗生
   物質ペニシリンの存在下で培養し、次いで生物体
   を培養液から分離し、目的生成物であるＬ−トレ
   オニンを単離することを特徴とするＬ−トレオニ
   ンの製造方法。 ２ 培養が0.1〜0.5ｇ／のペニシリンの存在下
   で行われる、特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ３ 培養が、酸イースト水解物、酵素イースト水
   解物またはイースト自己消化物をイースト乾燥重
   量に換算して0.1〜0.5％含有する栄養培地で行わ
   れる、特許請求の範囲第１項または第２項に記載
   の方法。 ４ 培養過程中最適の炭素および窒素濃度および
   一定のPH値を維持する目的で、アンモニア溶液お
   よび炭素源を含有する混合物が培地に周期的に導
   入される、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか
   一項に記載の方法。