HU180566B - Process for the microbiological production of l-threonine - Google Patents

Process for the microbiological production of l-threonine Download PDF

Info

Publication number
HU180566B
HU180566B HU8080597A HU59780A HU180566B HU 180566 B HU180566 B HU 180566B HU 8080597 A HU8080597 A HU 8080597A HU 59780 A HU59780 A HU 59780A HU 180566 B HU180566 B HU 180566B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
threonine
strain
fermentation
medium
coli
Prior art date
Application number
HU8080597A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Albert F Solin
Viktor P Antipov
Tamara M Pozdnyakova
Vlagyimir G Debarov
Nelli I Zsdanova
Alekszander K Szokolov
Vitalij A Livsics
Jurij I Kozlov
Jevgenyij M Kurgez
Nyikolaj K Jankovszkij
Mihail M Guzjatyiner
Original Assignee
Vnii Neftekhim Protsessov
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vnii Neftekhim Protsessov filed Critical Vnii Neftekhim Protsessov
Publication of HU180566B publication Critical patent/HU180566B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)

Description

ή A találmány tárgya, eljárás L-treonin előállítására mikrobiológiai úton. Az L-treonin az esz<1 szenciális aminosavak közé tartozik, és gyógyászati célokra különböző tápanyagkeverékekben széleskörűen alkalmazzák. Az L-treonin továb- 5 bá emberi és állati élelmezésre szolgáló termékek adalékaként, valamint a farmakológiai és kémiai iparban reagensként alkalmazható.
Az L-treonin előállítására különböző mikrobiológiai eljárások ismeretesek, amelyek során például a Brevibacterium flavum, Escherichia coli, Corinebacte'rium acetoacidophilum, Pro/ teus rettgeri, Serratia marcescens, Aerobacter aerogenes, Corynebacterium glutamicum termelő törzseket süllyesztett kultúrában, szénforrásként glukózt, fruktózt, ecetsavat, etanolt, továb| bá vitaminokat, aminosavakat, nitrogénforrást j( és a szükséges ásványi sókat tartalmazó tápkö1’ zegben tenyésztik (1 223 470., 1 260 995., 1 286 208.
é ? sz. brit szabadalmi leírások, 1 573 433, 1 580 549., 1 579 835., 1 603 855. sz. francia szabadalmi leírások, 2 044 907. sz. NSZK-beli szabadalmi leírás).
A legnagyobb L-treonin hozamot a Brevibacterium flavum mutált törzseivel érték el: glukóz-tartalmú közegben 18 g/1 (Agr. Bioi. chem. 1973, 37, 653), ecetsav-tartalmú közegben 40 g/1 (1 260 995. sz. brit szabadalmi leírás). Mindegyik esetben az a-amino-^-oxivaleriánsavval szemben ellenálló mutánsokat alkalmazták.
Egy további ismert eljárás szerint az Escherichia coli mutált törzseit szénhidrátokat, nitrogénforrásokat, ásványi savakat, tiszta aminosavakat vagy azokat tartalmazó fehérje-hidrolizátumokat tartalmazó tápközegben, süllyesztett kultúrában tenyésztik. 96 órás fermentálás után az L-treonin legmagasabb hozama 10,4 g/1 volt (1 223 470. sz. brit szabadalmi leírás, 3 711 375. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1 551 414. és 1 580 545. sz. francia szaba10 dalmi leírás).
Az eljárásokban alkalmazott mutánstörzsekre jellemző az izoleucin vagy izoleucin és metionin (1 223 470. sz. brit szabadalmi leírás), vagy diímino-pimelinsav (3 711 375. sz. amerikai egyelő sült államokbeli szabadalmi leírás és 1 551 414.
sz. francia szabadalmi leírás) szükségletük. Az eljárások közös hátránya, hogy (főleg szénhidrát-tartalmú közegben) az L-treonin csak kismértékben dúsul fel, továbbá hát20 rányos a hosszú fermentálás! idő (96—120 óra).
Szén- és nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó közegben süllyesztett kultúrában tenyésztett L-treonin-termelő törzsként továbbá az Escherichia coli poliauxotróf mutánsait is 25 alkalmazzák, például az E. coli ATCC 21 272, E. coli ATCC 21148, E. coli ATCC 21149 törzseket. Szénforrásként glukózt és fruktózt használnak. Az említett törzsek növekedéséhez diamino-pimelinsav, izoleucin, metionin szükséges. így pél30 dául az E. coli ATCC 21272 törzsnek diamino
180 566
180 566 pimelinsavra, metioninre, izoleucinre van Szüksége, E. coli ATCC 21148 csak diamino-pimelinsav és metionin jelenlétében növekszik, az E. coli ATCC törzs növekedési adaléka a diaminopimeiinsav. Ezen túlmenően az tenyészléhez iizint is kell adni. A fermentálást 20—40 °C-on végzik. 7,5% fruktózt tartalmazó közegben a nevezett törzsek ugyan L-tréonint termelnek, de az L-treonin koncentrációja a fermentáció során először riövekszik, később azonban a degradáció kövétkeztében csökken. A tenyészléhez antibiotikümokat adnak, hogy az L-treonin feldúsulásának időszakát meghosszabbítsák, koncentrációjának csökkenését megakadályozzák. Antibiotikumként streptomicint, tetraciklint, kanamicint, polimyxint vagy azok keverékeit alkalmazzák.
Ha a fermentáció 'megindítása után 40 órával streptomicint adnak a tenyészléhez, a fermentáció időtartamát 120 órára lehet nyújtani, és az L-tréonin szintje eléri a 13,2 g/1 értéket (ez a 7,5% fruktózt tartalmazó közegben tenyésztett É. coli ATCC 21148 törzsre* vonatkozik). Az antibiotikum koncentrációja a tápközegben 10—1000 mg/1 (1 579 835. sz.’ francia szabadalmi leírás.).
Az említett eljárás fő hátránya, hogy a fermentáció során a termék feldúsulásának átlagsebessége alacsony : 0,15—0,20 g/1 óra, ami alacsony feldúsulási szintet vagy hosszú fermentációt eredményez. Az eljárás további hátránya, hogy járulékos komponensek, így diamino-pimelinsav, metionin, izóleucin adagolása szükséges. A termelő törzs ezeket a komponenseket elfogyasztja.
Találmányunk célkitűzése, hogy új termelő törzs alkalmazása és a tenyésztési körülmények módosítása révén az L-treonin feldúsulásának sebességét növeljük és a fermentáció időtartamát csökkentsük.
A 'fenti feladató^ olyan eljárással oldjuk meg, ''''amelynek 'során' egy Éscherichia1 coli termelő törzset nitrogén- és 'szénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó tápközegben antibiotikumok jelenlétében süllyesztett kultúrában te;' nyésztünk. A találmány szdéinti eljárásra jel lemző, hogy termelő törzsként az Éscherichia cólí-nak á Szövetségi Genetikái Kutató Intézet ' Mikrobiológiai Letefbehélyezési Intézményében CMIM B—1856'. szárit alatt Tététbe helyezett törzsét alkalmazzuk.
Á fenti törzset (ideiglenes elnevezése: Éscherichia coli WNÍI Genetika Μ—1) az Éscherichia coli WNÍI'Genetika VL 334 (pYN7) törzs természetes mutációja alapján szelektálták. Á kiindulási törzset úgy nyerték, hogy az L-treonin termeléséért felelős riiutáns-géneket fokozott mértékben beépítették a vonatkozó gének hordozójának szerepét betöltő hibrid-plazmidokba.
A törzset penicillin jelenlétében tenyésztjük. A mikroorganizmus penicillin-rezisztenciáját a plazmidok határozzák meg. Előnyösen 0,1—0,5 ' g/1 jJeriicillirit1 ádunk á'kiindulási tápközeghez.
Ezen intézkedés következtében több tápanyagot tartalmazó, dúsabb közeget használhatunk a fermentációhoz, így a kezdő (nem-termelő) szakasz időtartamát csökkenteni tudjuk, ugyanis a dúsabb tápközegberi a tenyészet növekedési sebessége közel egy nagyságrenddel nagyobb anélkül, hogy a termelő törzs tulajdonságai lényegesen megváltoznának. Á kiindulási tá'pközeg feldúsítására savval vagy fermentációs'utón hidrolizált élesztőt vagy élesztő-aUtoíizátumöt adagolunk 1—5 g élesztő-szárazsúly/liter mennyiségben. A szén- és nitrogén-koncentráció, valamint a pH érték optimális betartása érdekében a tenyésztés során többször is adagolunk olyan elegyet a tenyészléhez, amely szénforrást és vizes ammóniaoldatot tartalmaz.
A találmány szerinti eljárásban termelő törzsként az É. coli WNII Genetika M—1 jelű törzset alkalmazzuk. Ez a törzs az E. coli WNII Genetika VL 334 (p YN7) természetes mutációja1 során jött létre. Az E. coli WNII Genetika VL 334 jelű törzset á genetikái technika szokásos módszereivel az E. coli WNII Genetika MG—442 jelű törzsből állították elő az alábbiak szerint:
Az E. coli WNII Genetika MG—442 donortörzs erizinjei (a' thr A jelű gén termékei) a mutáció következtében rezisztensek a treonin inhibitáló hatásával szemben. A fenti donortörzs kromoszómájának a Hind III. jelű endonukleáz segítségével kapott DNS-fragmense pedig a treonin-operon összes génjét tartalmazza. Az említett DNS-fragmenst a DNS-vektormolekulaként alkalmazott pBR 322 jelű plazmidokikal hibrid-plazmiddá egyesítették. A hibrid-plazmid molekulasúlya 11,4 megadalton (egy dalton = 1 hidrogénatom tömege = l,67xl0'24 g), alkotórészei a pBR 322 plazmid két másolata és a donor-törzs kromoszómájának fent említett DNS-fragmense. A hibrid-plazmidokat a Hind III és Bam Hl jelű endonukleázokkal kezelték, és az így kapott frangmenseket polinukleotidligázzal kezelve újra egyesítették. Az így kapott hibrid-plazmid 5,7 megadalton mólsúlyú, a pBR 322 plazmid egy molekulájából és a fenti DNSfragmensből áll. Ez a plazmid a mikroorganizmus sejtjeit rezisztenssé teszi a penicillinnel szemben. A plazmidok a logaritmikus növekedés szakaszában 40—50 másolat mennyiségben képződnek a sejtben.
Az E. coli VL 334 recipiens törzs mutációja abban van, hogy a sejtekben az L-treonin ésizoleucin szintézise blokkolt. Az izoleucin-szintézis gátlása nem teljes, ha a sejt több treonint tartalmaz, az izoleucin-szintézis gátlása megszűnik. A fenti recipiens törzset a hibrid-plazmidokkal transzferálták, így nyerték az E. coli WNII Genetika VL 334 (pyN7) törzset, amely L-treonint termel. A törzset a Szövetségi Genetikai Kutató Intézet Mikfobiológiai Letétbehelyezési' Intézményénél CMIM B—1684. szám alatt letétbe helyezték.
Az E. coli WNII Genetika VL 334. sz. törzset agart tartalmazó táptalajra; oltották; 'nagyon
180 566 sok telepet vizsgáltak meg abból a Szempontból, hogy a mutáns termel-e L-treÖnint, tenyészthető-e minimális (csak glukózt és sókat tartalmazó) táptalajon és továbbÖrokíti-e a plazmidokat a fermentáció során; így izolálták végül az E. coli WNII Genetika M—1 jelű törzset, amelyet a találmány szerinti eljárásban alkalmazunk.
A törzs jellemzői az alábbiak:
Morfológia: gram-negatív, enyhén mozgékony, vékony pálcikák, végük gömbölyű, hosz’szuk 1,5—2 úm.
Fiziológiai és tenyésztési jellemzők:
Hús-pepton-agar: 37 °C-on 24 órás növekedés Után kör alakú, fehér,'félig átlátszó, 2—3 mm álmérőju ’ telepek. A' telepek felületé sima, szélük sima vagy enyhén hullámos, központjuk kiémélkedik. A telepek állaga homogén, pasztaszerű, könnyen emulgálható.
Agár- és glukóz-tartalmú minimálközeg (Adams szerint).
°C-on 2 napig tenyésztve szürkés-fehér, kor alakú, 1—1,5 mm átmérőjű, enyhén domború telepeket képez; szélük sima, belső szerkezetük homogén. A telepek felülete fényes. 4—5 nap múlva a telepek nyálkássá válnak.
Hús-pepton-lé °C-on 24 órán át folytatott tenyésztés után a tenyészlé erősen zavarossá válik, kis mennyiségű csapadék képződik. Jellegzetes szag.
Adams-féle folyékony ásványi tápközeg °C-on levegőztetés mellett 2- napon át folytatott tenyésztés után erős zavarosság.
A törzs a zselatint nem folyósítja, tejen jól nö' vekszik, koagulációt idéz elő, indolt képez.
A különböző szénhidrátok közül jól növekszik glükóz, laktóz, mannóz, g'alaktóz, xilóz, fruktóz, glicerol és mamiitól jelenlétében sav- és gázképződés mellett.
Az antibiotikumok közül péiiicillinnel szemben ellenálló. A törzs nem pátogén.
Plazmid-tarfalom ‘ A logaritmikus növekedés szakaszában á sejtek a pYN7 plazmid (mólsúly: 5,7 megadalton) 40—50 másolatát tartalmazzák. E plazmid a treonin-operon génjeinek hordozója, és a penicillinnel szembeni ellénállóképésséget biztosítja.
Növekedéshez szükséges anyagok
A törzs glukózt és ásványi sókat tartalmazó minimális közegben növekszik (generációs idő 240 perc). Izoleucin stimulálja a növekedést (generációs idő 60 perc). Élesztő savas-, vagy enzimes-hidrolizátumával dúsított tápközegben a generációs idő 30—40 perc.'
Az E. coli WNII Genetika VL 334 (pYN7) kiindulási törzstől a következőkben különbözik: telepeinek a felülete · nyálkás, treonin-termelő - képessége nagyobb, tápanyagadalékokat tartalmazó közegekben a stabilitása (a képessége, hogy fő tulajdonságait — treonin-termelés és a penicillin-rezisztenciia — megtartsa) nagyobb. Ezeket a különbségeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze.
Törzs Azoknak a sejteknek a mennyisége (%), amelyek tenyésztés után tulajdonságaikat megtartották
Glukózt és sókat tar- Hustálmázó pepton-lé közeg
E. coli WNII
Genetika VL 334 (pYN7) 72— 98 2—42
E. coli WNII
Genetika Μ—1 88—100 82—98
Λ tenyésztést rázóasztalon 37 °C-on a megadott tápközegekbéíí' végezzük. A 10. generáció után Hóttinger-félé agar-húslével töltött edényékbe visszük át á ihikroorganizmust elkülönült telepek nyerése céljából. Mindegyik kísérletben legalább 100 telep penicillin-rezisztenciáját és tréóhin-térmelő képességét vizsgáljuk meg.
A táblázatból kitűnik, hogy glukózt és ásványi sókat tartalmazó közegben végzett tenyésztés esetén mindkét törzs majdnem azonos mértékben tartotta fenn a képességet treonin termelésére, tehát e között a körülmények között a két törzs állandósága azonos. Tápanyagokban dús közegben (hús-pepton-lé) végzett tenyésztés esetén azonban az új törzs, az E. coli WNII Genetika M—1 sokkal nagyobb mértékben tartja meg tulajdonságait, mint a kiindulási törzs. Az új törzs feldúsított tápközeg esetén állandóbb. A törzs ezen állandósága, valamint (a hibrid-plazmidok okozta) penicillin-rezisztenciája lehetővé teszi, hogy a tápközeghez penicillint és a mikroorganizmus növekedését erősen fokozó tápanyagokat adagolhassuk a közeghez. Az E. coli WNII Genetika M—1 törzs generáció ideje a glukózt és ásványi sókat tartalmazó közegben 240 perc, a feldúsított közégben 30—40 perc. A nagy növekedési sebesség következtében a lombikokban és oltókészülékekben végzett oltó' anyág-készítés: feléslégessé válik, és á fermentáció időtartamd csökkenthető.
A tenyésztést az alábbiak szerint hajtjuk végre.
Az E. coli WNII Genetika M—1 mikroorganizmus oltóanyagát agar-tartalmú, 500 /zg/ml penicillint tartalmazó minimális táptalajon 40— 50 órán keresztül tenyésztjük, utána a ferde aga'r felületéről a sejtekre fiziológiai konyhasóoldattal leöblítjük. A kapott sejt-szuszpenzióval a fermentációs közeget oltjuk be. A sejtek kezdő koncentrációja 2—5X103—10’ sejt/ml lehet. A kiindulási tápközeg glukózt, ásványi nitrogént, sókat és penicillint, valamint tápadalékokat tartalmaz. Tápadalékként például fehérjehidrolizátum, így az élesztő savval vagy enzimekkel nyert hidrolizátumai és autolizátumai alkalmazhatók. A közeg pH értékét 7,0 és 7,2
180 566 közötti értékre állítjuk be. A fermentáció során a pH értéket automatikus pH-szabályozó segítségével, vizes ammóniaoldatot és glukózt tartalmazó oldat adagolásával tartjuk fenn. A fermentáció során bekövetkező pH csökkenés oka az, hogy a mikroorganizmus az ammóniát (nitrogént) fogyasztja. Tekintettel arra, hogy a nitrogén- és a glukózfogyasztás sebességének aránya közel állandó marad, ezt az arányt az ammóniát és glukózt tartalmazó oldat adagolásával kell fenntartani. Folyamatos levegőztetés és keverés mellett a mikroorganizmust 30—40 °C-on 40—50 órán át tenyésztjük.
A fermentáció végén az L-treonin a 30 mg/1 értéket is elérő koncentrációban feldúsul. Az L-treonint az alábbiak szerint izoláljuk.
A fermentléhez ícalciumoxidot és ortofoszforsavat adunk, utána a biomasszát szeparálással vagy szűréssel elkülönítjük. Az oldatot — Ltreonin-, kation- és pigment-tartalmától függően — so'rbakapcsolt kolonnák egész során vezetjük át. A kolonnák tartalmazhatnak például derítő adszorbenst a színezőanyagok megkötésére, Hformájú szulfokationcserélő gyantát a kationok és az L-treonin adszorbeálására. A szufokationcserélő oszlopról az L-treonint ammóniaoldattal eluáljuk. Az L-treonin fő tömegét tartalmazó frakciókat vákuumban bepároljuk, lehűtjük és az L-treonint kristályosítjuk. A kristályosodás meggyorsítására alkoholt adhatunk az oldathoz. A kapott termék 97—99% L-treonint tartalmaz. A hozam 80—95%. Járulékos átkristályosítás után a termék például szövetsejttenyésztéshez szükséges közegekben használható fel. Ha a tenyészlé treonin-tartalma viszonylag magas (18 g/1 felett), a szennyező kísérőanyagok mennyisége pedig csekély ,az L-treonint abszorpciós lépések nélkül, közvetlenül ioncserélő gyantán is izolálhatjuk. A tisztított oldatot alacsony hőmérsékleten vákuumban betöményítjük, lehűtés után az L-treonint adott esetben etilalkohol hozzáadásával kristályosítjuk. A kapott terméket még egyszer átkristályosítva 99% tisztaságú terméket kapunk.
A találmány szerinti eljárás hatékonysága az L-treonin szénhidrát-közeggel végzett előállítására irányuló ismert összes eljárásét felülmúlja. A tenyészlé treonin-tartalma a 30 g/1 értéket is eléri, ugyanakkor más aminosav nem szennyezi a közeget. A fermentáció időtartama 40 órára csökkenthető.
A fermentáció során az L-treonin feldúsulásának átlagsebessége 0,75 g/l.óra, ami az ismert eljárásban mért feldúsulási átlagsebességnek ötszöröse.
A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük.
1. példa
Az E. coli WNII Genetika M—1 termelő törzs oltóanyagát az alábbi összetételű agartáptalajfelületen 43 órán át tenyésztjük: 4
Glukóz 5,0 g/I
NH«CI ί 1,0 g/1
KH2PO4 1,5 g/1
NA2HPO4 3,5 g/1
MgSO4.7H2O 0,1 g/1
Penicillin 500 A*g/1
agar 20,0 g/1
víz ad 1000 ml
A tápközeg pH értéke 7,0—7,2. A glukózt és a penicillint külön-külön sterilizáljuk, majd a folyósított közegbe (annak lehűtése és a ráoltás előtt) adagoljuk.
A kapott tenyészetet steril vízzel leöblítjük, és a kapott sejtszuszpenzióval 0,5 liter térfogatú fermentáló edényt oltunk be. A kiindulási sejtkoncentráció 10®—107 sejt/ml. A fermentációs közeg összetétele az alábbi:
(NH4)2SO4 1,5 tf%
K2HPO4 0,2 tf%
MgSO4 savval nye'rt élesztőhidrolizátum (élesztő 0,04 t f%
szárazanyagra számítva) 0,3 tf%
habzásgátló víz 0,1 t f%
tápközeget a készülékkel együtt sterilizál-
juk, utána 2 tf% steril glukózt és 0,5 g/1 penicillint adunk a közeghez.
A tenyészetet 35—37 °C-on fermentáljuk, közben az automatikus pH figyelő jelzésére 2,5— 2,7% ammóniát és 35% glukózt tartalmazó oldatot adagolunk a közegbe, a pH érték (7,0— 7,2) betartása céljából. 40 órás fermentáció után a tenyészlé 30 g/1 L-treonint tartalmaz. Az Ltreonin feldúsulásának átlagos sebessége 0,75 g/1. óra. A glukózfelhasználás 6 g, 1 g L-treoninra vonatkoztatva.
Ezt követően az L-treonint elkülönítjük. 300 g tenyészléhez keverés közben 3 g kalciumoxidot adunk, majd a folyadék pH értékét orto-foszforsavval 5,6-ra állítjuk. Az oldatot 60 °C-ra melegítjük, 10 percig állni hagyjuk, majd a biomasszát vákuumszűrővel elválasztjuk. A felülúszó részt (optikai sűrűség 0,4; 1 cm-es küvettában, 525 nm hullámhossz mellett) 50 ml derítő gyantát tartalmazó oszlopon át szűrjük. A derített oldat optikai sűrűsége 0,08. Az oldatot 150 ml H-formájú szulfokation-cserélő gyantát tartalmazó oszlopon keresztül engedjük. Utána az oszlopot 300 ml vízzel mossuk, majd az adszorbeált L-treonint 3%-os vizes ammónia-oldattal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban 25% szárazanyag-tartalomig betöményítjük, azonos térfogatú etilalkoholt adunk hozzá, és az elegyet 0 és +5 °C közötti hőmérsékleten 10 órán át állni hagyjuk. Az L-treonin-kristályokat leszűrjük, mossuk, majd szárítjuk, 8,1 g (90%) L-treonint kapunk. 10 mg terméket vékonyréteg-kromatográfiailag vizsgálva a kromatogramban más aminosavat nem észlelünk.
180 566
2. példa
Az E. coli WNII Genetika M—1 termelő törzs oltóanyagát az 1. példában leírt módon állítjuk elő. A fermentációs készülék és a tápközeg őszszetétele az 1. példában elmondottaknak felel 3 meg, azzal a különbséggel, hogy tápadalékként enzimesen készített élesztő-hidrolizátumot adunk a tápközeghez 0,5 t f% mennyiségben (az élesztő szánazsúlyára vonatkoztatva). A fermentáció körülményei az 1. példában leírtakhoz hasonlóak. 41 órás fermentáció után a tenyészlé 29 g/1 L-treonint tartalmaz. Az L-treonin feldúsulásának átlagos sebessége 0,71 g/l.óra.
Az L-treonin elkülönítésére 300 ml tenyészléből a sejteket centrifugálással elválasztjuk. A felül úszó rész 7,5% szárazanyagot tartalmaz, optikai sűrűsége 0,6 (525 nm). Az oldatot vákuumban 50 °C-on 50 ml térfogatra betöményítjük, 50 ml etilalkoholt adunk hozzá, majd az elegyet 0 °C-on 5 órán át állni hagyjuk. A kivált kristályokat szűréssel elválasztjuk, 15 ml etilalkohollal mossuk, majd szárítjuk. 6,1 g Ltreonint kapunk. A termék vékonyréteg-kromatográfiai vizsgálata azt mutatja, hogy egyéb aminosavakat nem tartalmaz.
3. példa
Az oltóanyagot az 1. példában leírtak szerint kezeljük. A fermentálást 2 m3 űrtartalmű fermentorban végezzük az 1. példában foglaltak szerint, azzal a különbséggel, hogy tápadalékként élesztő-autolizátumot adagolunk 0,4 tf% mennyiségben (az élesztő szárazanyagára vonatkoztatva). A tápközeg penicillin-tartalma 0,2 g/1. A kiindulási sejt-koncentráció 103—104 sejt/ml.
órás fermentáció után a tenyészlé 18 g/1 L-treonint tartalmaz. A glukózfogyasztás hasonló, mint az 1. példa esetén. Az L-treonin feldúsulásának átlagos sebessége 0,42 g/l.óra.
Az L-treonint az 1. példában leírt módon izoláljuk. A hozam 80%.

Claims (4)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás L-treonin előállításána Escherichia coli termelő törzs szén- és nitrogénforrásokat és ásványi sókat tartalmazó tápközegben antibiotikumok jelenlétében végzett süllyesztett tenyésztése, a biomassza elválasztása és a végtermék elkülönítése útján, azzal jellemezve, hogy termelő törzsként az Escherichia coli-nak a Szövetségi Genetikai Kutató Intézet Mikrobiológiai Letétbehelyezési Intézményében CMIM B—1856 szám alatt letétbe helyezett törzsét alkalmazzuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy antibiotikumként penicillint alkalmazunk 0,1—0,5 g/1 mennyiségben.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztéshez az élesztő savval vagy fermentációs úton nyert hidrolizátumát vagy autolizátumát — az élesztő szárazsúlyára vonatkoztatva — 0,1—0,5% mennyiségben tartalmazó tápköz.eget alkalmazunk.
  4. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentálás alatt időszakonként szénforrást és ammóniát tartalmazó elegyet adunk a tenyészléhez.
HU8080597A 1979-07-13 1980-03-13 Process for the microbiological production of l-threonine HU180566B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU792781356A SU943282A1 (ru) 1979-07-13 1979-07-13 Способ получени L-треонина

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU180566B true HU180566B (en) 1983-03-28

Family

ID=20834297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU8080597A HU180566B (en) 1979-07-13 1980-03-13 Process for the microbiological production of l-threonine

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4321325A (hu)
JP (1) JPS5615696A (hu)
CS (1) CS226352B1 (hu)
DD (1) DD148464A3 (hu)
FR (1) FR2461006A1 (hu)
HU (1) HU180566B (hu)
SU (1) SU943282A1 (hu)
YU (1) YU42330B (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55156591A (en) * 1979-05-23 1980-12-05 Ajinomoto Co Inc Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid
NL8401255A (nl) * 1983-08-05 1985-03-01 Grace W R & Co Werkwijze voor de biologische bereiding van l-aminozuren.
EP0219808B1 (en) * 1985-10-18 1993-12-22 Toray Industries, Inc. Plasmid with wide host range
JPH03501682A (ja) * 1988-10-25 1991-04-18 味の素株式会社 Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ　ｂ‐３９９６菌株
DE3844959B4 (de) * 1988-10-25 2006-04-27 Ajinomoto Co., Inc. Stamm der Bakterien Escherichia coli BKIIM B-3996, Produzent von L-Threonin
US5976843A (en) 1992-04-22 1999-11-02 Ajinomoto Co., Inc. Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine
US5661012A (en) * 1992-11-10 1997-08-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for the production of L-threonine by fermentation, using mutated DNA encoding aspartokinase III
US5939307A (en) * 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
RU2148642C1 (ru) * 1998-12-23 2000-05-10 ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты
US7220571B2 (en) 2000-09-28 2007-05-22 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
US7368266B2 (en) * 2001-02-13 2008-05-06 Cj Corporation Method for L-threonine production
JP4380305B2 (ja) * 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
US7723097B2 (en) * 2005-03-11 2010-05-25 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains that over-produce L-threonine and processes for their production
JP5432524B2 (ja) * 2005-06-20 2014-03-05 アーチャー−ダニエルズ−ミッドランド カンパニー アスパラギン酸由来アミノ酸および化学物質の改善された生産のための改変グリオキシル酸シャント
US20070004014A1 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine
JP2009153382A (ja) 2006-03-30 2009-07-16 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法
BRPI0715584B8 (pt) * 2006-07-19 2017-02-21 Ajinomoto Kk método para produzir um l-aminoácido
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1975241A1 (de) 2007-03-29 2008-10-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007044134A1 (de) 2007-09-15 2009-03-19 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007052270A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2060636A1 (de) 2007-11-14 2009-05-20 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008044768A1 (de) 2008-08-28 2010-03-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2267145A1 (de) 2009-06-24 2010-12-29 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
EP3608409A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Evonik Operations GmbH Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
US11053526B2 (en) 2018-08-09 2021-07-06 Evonik Operations Gmbh Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
US12017182B2 (en) 2019-12-24 2024-06-25 Cathay Biotech Inc. Method and system for refining long chain dicarboxylic acid

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1176125A (en) * 1967-01-21 1970-01-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for Producing L-Threonine.
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
US4237224A (en) * 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
FR2464299A1 (fr) * 1979-08-28 1981-03-06 Inst Genetiki Selektsii Procede de preparation de souches productrices d'acides amines

Also Published As

Publication number Publication date
SU943282A1 (ru) 1982-07-15
FR2461006B1 (hu) 1984-03-09
DD148464A3 (de) 1981-05-27
CS226352B1 (en) 1984-03-19
JPS5615696A (en) 1981-02-14
YU77380A (en) 1984-02-29
FR2461006A1 (fr) 1981-01-30
US4321325A (en) 1982-03-23
JPH0120871B2 (hu) 1989-04-18
YU42330B (en) 1988-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU180566B (en) Process for the microbiological production of l-threonine
EP0593792B1 (en) Novel L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
JP3036930B2 (ja) 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
JP3698758B2 (ja) 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法
US6132999A (en) L-threonine-producing microbacteria and a method for the production of L-threonine
HU215545B (hu) Eljárás L-treonin előállítására
JPH03501682A (ja) Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ　ｂ‐３９９６菌株
DE69011880T2 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation.
JPS61202694A (ja) 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法
FR2661191A1 (fr) Procede de production de l-lysine par fermantation et mutant pour la mise en óoeuvre du procede.
WO2018077159A1 (zh) 氨基酸衰减子的改造方法及其在生产中的应用
JPS594993B2 (ja) 発酵法によるｌ−リジンの製法
JP3717970B2 (ja) 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
SU974817A1 (ru) Способ получени L-треонина
HU202590B (en) Process for producing l-treonine
HU205389B (en) Process for producing 1-alanine
KR910002850B1 (ko) L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 제조방법
Fisek et al. Muscle extractives in the production of tetanus toxin
SU904325A1 (ru) Способ получени L-треонина
SU1694643A1 (ru) Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент L-треонина
JPS6135840B2 (hu)
US2947666A (en) Amino acids and process
DE3320651A1 (de) Fermentatives verfahren zur herstellung von l-leucin
JP2775948B2 (ja) Ｌ‐トレオニン生産者としてのエシェリキア・コリｂｋｉｉｍ ｂ‐３９９６菌株
SU1693056A1 (ru) Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS - продуцент L - фенилаланина

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee