JPH01193647A - 抗原・抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原・抗体反応により抗原又は抗体ｔ−測測定
る方法に関する◇特に医療における臨床検査の分野にお
ける血清、血漿、尿等に含まれるタンパク買及びその関
連物質全抗原・抗体反応を利用して定性的に若しくは定
量的に測定する方法に関する。

〔従来の技術〕

現在、免疫診断の分野においては、ＲＩＡ法（ラジオイ
ムノアッセイ＠）％　１ＩＡｆｆｉ（工ンザイムイムノ
アッセイｆｆ１）、ＴＩＡ法（免疫比濁法）及びＬＰＩ
Ａ法（ラテックス凝集反応＠）の４つの方法が一般的に
用いられている。

この中で、ラテックスの如き不溶性担体粒子に抗体若し
くは抗原を担持させ、検体中の抗原若しくは抗体と反応
させて抗原又は抗体を測定する方法として ＜１）反応で生成した凝集塊の沈降（１日〜２日會要す
る）を待って、その上清の濁度を測定して未反応ラテッ
クスの童を検知し、これから検体中の抗原若しくは抗体
の１を測定する方法（たとえばＮ、　ＤｅｔｓｅｌｌＣ
ら、　ＣｒｏａｔｉｃａＣｈｅｍｉｃａ　Ａｃｔａ　、
土２　４５７（１９７０））。

（０）　　反応混合物から凝集物を分離することなく、
そのままの状態で特定波長の光を照射して散乱光若しく
は透過光の強さｔ−測足し、その変化から検体中の抗原
若しくは抗体を定置する方法（たとえは、特公昭５８−
１１１７５号公報）０ があるが、本発明は前記（２）記載の方法の改良に関す
るものである。

他方、不溶性担体に担持させた抗体又は抗原の抗原・抗
体反応を利用する抗体又は抗原の測定方法の一つとして
、一部の不溶性担体を磁性体とする方法も提案されてい
る（たとえば特開昭６１−１２８１６８号公報）。しか
しながら、この公知の方法は、担体の磁性を利用して反
応物を分離し、その反応物中の予め結合されている蛍光
体或いは酵素の電を測定するもので、複雑な操作を必要
とし、本発明の目的とする簡便な大量検体の測定法とは
その手段を異にするものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

近年多数の検体の分析法として、多くの小孔ｔ−有する
プレートの谷小孔中で呈色反応などを行わせ、その小孔
の光学密度を直接測定することによって検体中の或る成
分を分析する方法が提案され広く普及している。

例えば、マイクロタイターと呼はれるプレートは％　８
ｃｍＸ１２ｃｍ位の大きさのプレートに９６ケの穴含有
し、四時に９６検体の分析が可能で、光字密度の読みと
りも専用のリーダーにより５０〜４０秒で可能である。

今、このような器具を用いてラテックスの凝集反応によ
る抗原・抗体反応の測定を前記（インの方法で行う場合
、沈降した縦果物が光路をさえぎり光学的測定が不能と
なる。このため、ヒ）の方法を採用するならば、横から
の測光か（これは不可能に近いが〕、或いは液の移し替
えを必要とするが、本発明はこのような問題点を解決す
るものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、抗体若しくは抗原を担持させる担体の一
部を磁性体とすることにより、凝集塊を任意の方向に引
き寄せることが出来るのみならず、意外にも引き寄せら
れた担体は器壁部に対して粘着性を示し容易に再拡散し
ないことを見いだし、本ｋＱ［−なすに到ったものでお
る。

しかも、反応により生じた縦果物の分離のための時間も
大巾に短縮される。

本発ＢＡは、 ｔ　不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させ、この担
持された担体又は抗原に、抗原又は抗体或いはその混合
物を液体媒体中で反応させて該反応の進行に伴う反応物
の変化の度合を測定することにより抗原又は抗体を測定
する方法において、上記担体粒子として磁性体含有不溶
性担体粒子と、磁性体を含有してない不溶性担体粒子を
用いて上記反応を行い、ついで反ら混合物に磁場を付与
することにより未反応の磁性体含有不溶性担体粒子及び
磁性体含有不溶性担体粒子を含む凝集粒子を反応混合物
から分離し、残存する磁性体を含有していない不溶性担
体粒子を検知することにより液体媒体中の抗原又は抗体
を定性的に、又は定型的に測定することを特徴とする抗
原・抗体測定法。

及び ２、磁性体含有不溶性担体粒子、又は磁性体を含有して
いない不溶性担体粒子に、測定しようとする抗原に対す
る抗体又は抗体に対する抗原上感作した懸濁液と、測定
しようとする抗原又は抗体を水溶媒中で抗原・抗体反応
が平衡に遅しない或る一定時間反応させ、さらに磁性体
を含有しない不溶性担体粒子、又は磁性体含有担体粒子
に測定しようとする抗原に対する抗体又は抗体に対する
抗原上感作した懸濁液を加え、抗原・抗体反応が平衡に
達するまで反応させ、反応が平衡に達した時点で反応混
合物に磁場を付与することにより、未反応磁性体含有粒
子及び磁性体含有凝集粒子と磁性体を含有していない不
溶性担体粒子七分離し、ＩＡ存する磁性体を含有してい
ない不溶性担体粒子を測定することにより、抗原又は抗
体を定性的に、又は定型的に測定することを特徴とする
抗原・抗体測定法。

である。

以下、本発明の詳細な説明する。

磁性体を含有する不溶性担体としては、有機高分子物質
及び無機微粉末が使用可能である。

有機高分子物質としては、ポリスチレン、スチレン−ブ
タジエン共１合体粒子の如き乳化重合により得られる有
機高分子物質のラテックスがあす、特にポリスチレンラ
テックスが有用である。無機微粉末としては、セラミッ
ク微粒子、シリカ、アルミナ、シリカ−アルミナ、炭末
等が使用可能である。

不溶性担体粒子中に含有させる磁性体としては、鉄及び
磁性酸化鉄が好ましく、これを５〜１００う含有するよ
うにａｌ１ｍ整されたものが用いられる。

不溶性担体粒子の粒径はα１μ〜５μの範囲内のものが
用いられ、１２μ〜２７Ｊの範囲内の粒径ｔ−有する不
溶性担体粒子が好ましい。

磁性体を含有していない不溶性担体としても、石機＾分
子物質及び無機微粉末が使用可能であるが、液体媒体中
に分散させたとき、測光する壜では自然の沈降がなく、
浮遊しているものが望ましい。

！磯高分子物質としては、ポリスチレン、スチレン−ブ
タジエン共重合体粒子の如き乳化重合により得られる有
機高分子物質のラテックスが用いられ％特に、ポリスチ
レンラテックスが有用である。

無機微粉末としては、セラミック微粒子、シリカ、アル
ミナ、シリカアルミナ、炭宋等が使用可能である。

不溶性担体の粒径としては、α１μ〜５μの範囲内のも
のが用いられ、α２μ〜２μの範囲内のものが好ましい
。

ま九、ｆＢ注体を含有しない不溶性担体として赤、宵、
緑、黄色等の色−のものｔ使用してもよい。

この色ｖＩ４を持つ不溶性担体粒子は、２徳以上の抗体
又は抗原を測定するとき使用される。この方法は、例え
は人という抗原とＢという抗原’ｔ−ｔｌ！Ｊ時に測定
しょうとする場合、磁性体含有担体粒子としてＡ抗体感
作不溶性担体粒子とＢ抗体感作不溶性担体粒子を混合し
て使用する。−方磁性体を含有していない不溶性担体粒
子としてはＡ抗体感作黄色不溶性担体とＢ抗体感作青色
不溶ｇ、担体粒子金混合して使用する。

先づ、Ａ、Ｂ抗原が測定しようとする水溶媒中に含まれ
ていない場合には、黄色と青色の不溶性担体粒子が残存
し、緑色となる。抗ｍＡが多波にＴｏ９、抗原Ｂが存在
しない場合には青色、抗原Ｂが多量にろ９抗原Ａが存在
しない場合は黄色となる０また抗原Ａと抗原Ｂが共に或
る割合で存在する場合には、黄と青を配合した色となる
０ 色調を有する不溶性担体粒子は、Ｍ慎高分子粒子又は無
機微粉末粒子中に種々の色調の色素を含有させるか、粒
子表面に色素を物理的吸漕法或いは化学的担持法により
コーティングするか、或いはアルブミン等のタンパクに
色素を担持させ、そのタンパクを不溶性粒子表面に物理
的に吸着させるか、化学的に担持させることによりｖ！
４製することができる。

不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させる方法は、磁
性体を含有する不溶性担体粒子及び磁性体を含有してい
ない不溶性担体粒子共に共通で６って、測定しようとす
る被検体中の抗原又は抗体に対する担体又は抗原を物理
的に吸着させるか或いは化学的に担持させることにより
実施される。

担持させる抗体としては、デーグロブリン、ＩｇＧ、Ｉ
蜘、Ｆ（ａｂ’）１、Ｆ（ａｂ’）等がめる。また担持
されるものとして抗原を用いる場合には、細胞片、ハプ
テン、抗原タンパク、免疫複合体等が用いられる。

一般に担持される抗原又は抗体の量はα０１〜／−〜１
０ｒｖ／−であり、好ましくはα０５９／　ｗＩｔ〜ｊ
　ｍ９／　ｍ　”ｔ’　６　ル。

抗体又は抗原を担持させた不溶性担体粒子は５１１Ｍリ
ン［２衝液（ｐＨ７）、αＩ　Ｍ　Ｔｒｉａ−塩酸ｅ両
液（’ｐＨ＆Ｏ）等の水溶媒中に１０１〜１０］［ｉｉ
％となるように分散され、懸濁液を形成する◇ 磁性体を含有する不溶性担体粒子と磁性体を含有しな＾
担体粒子の配合割合は、ｌ：２０〜２０：１でろり、好
ましくは１：４〜４：１でろる。

次に、具体的な測定方法について説明する。

（１１＠性体を含有している感作不溶性担体粒子と磁性
体を含有していない感作不溶性担体粒子を、予め、混合
する方法。

まず、磁性体を含有する感作不溶性担体粒子と磁性体を
含有していない感作不溶性担体粒子を予め、前述の配合
比で混合しておく。

この混合懸濁液と測定しようとする血漿、血清又は尿等
に含まれる抗原または抗体（以下検体とする）と反応さ
せる。検体は１１ＭＴｒｉｍ−塩酸緩衝液（ｐＨ８）や
１１Ｍリン改俊賃液（ｐＨ７）等の緩衝液で希釈しても
よい。反応は室温で平衡になるまで行なう。また、反応
速度を速めるために２５〜５０℃の恒温槽で反応させて
も工い。通常室温で反応が十負に適するまでｆＪ５０分
を必袋とする。

１２１　　ｔｒＢ’ｅＥ体？含有す体感含有＃江担体粒
子又は磁性体を含有していない感作不ｌ＠注担体粒子と
検体ｔ−反工６させ、続いて、磁性体ｔｔ有していない
感作不溶性担体粒子又は磁性体を官有している感作不溶
性担体粒子を龜加する方法０ まず、Ｉｎ注Ｓ＋ｔｔ有している感作不溶性担体（又は
磁性体と官有していない感作不溶注担体ンと検体、又は
峻爾液で希釈した検体と倉反応させる。反応６は測定す
る抗原又は抗体によって異なるが一般に室温で約１０分
間行なう。反応時間は磁性体を含有している感作不溶性
担体粒子（又は磁性体を含有していない感作不溶性担体
粒子）に担持さｎた抗体又は抗原と検体中の抗原又は抗
体との抗体・抗原反応が平衡に達しない時間が選ばれる
０続いて、磁性体七言有していない感作不溶性担体（又
に砿江俸を含有している感作不溶性担体）が前述の配付
比で６児され、さらに抗体・抗原反応を打なう。反応′
に室温で平寅になる１で行なう。また反応速［ｋ速める
ために２５〜５０℃の１１１ｍ槽で反応させても工い。

１１１、１２１の方法共に反応は一般に分光器用セル。

９６大マイクロプレートの内で行なわれ％反応が十惰に
堰した時、容器の外部から磁場ｔかけるか、又は反応混
合物中に磁性体粉又はｍ注体小片を投入又は挿入するこ
とにより、容器の−Ｊ元金さえぎらない位置に磁性体を
含有する　感作不溶性担体粒子と磁性体を含有しない感
作不溶性担体粒子との凝集塊及び未反応の８性体を含Ｍ
する感作不溶性担体粒子倉集める。８石としては永久６
石、電磁石等を便用する。反応液中にｒｉ浮遊している
蜂注体ｒｔ有していない感作不溶性孔体が残存する。こ
の残存１は抗原測定の場合は検体中の抗原濾に、抗体測
定の場合は検体中の抗装置に依存する。この残存１を外
Ｓ工りα５〜ｔｏμｍの範囲にある一定ｆｆ＆の光の９
＆元度又は散乱光強度を一１定することにより求める。

本発明方法においては目的とする既知の濃度の異なるレ
ベルの検体についての吸光度、又は散乱光の強度を測定
することにより、検ｉｔｍｖ作成しておき、この検量＃
に用いて未知濃度検体の吸光度、又は散乱光強度より未
知濃度の抗原又は抗体の衾度七定被することができる。

また、残存する磁性体を含有していない不溶性担体粒子
の雪上目視で検知することにより、定性的に抗原または
抗体のｔｔ−利足することかでさる。

ｗ、１図は底面がＶ字型になったマイクロタイターを用
い、各列２倍希釈濃度の抗原の検体を入れ反応させた後
底部↓り磁場ｔかけたものでろるが、ｌｉＢ注体含肩担
体及び凝集担体はＶ字型底部に速やかに沈殿し、抗原濃
度の皺い場合には上澄が完全に透明で、抗原嫌反が薄く
なるにつれ白色度が濃くなりＶ字型底部の沈殿物（実際
には褐色〜黄色を帯びている）は次第に見えなくなって
くる。この沈殿物の見える度合によシ抗原祉の士を目視
により見わけることは容易でめり、場合によっては標準
品に基いて対照を作成しておくことにより或る濾までは
定ｋを行うことも可能でろる。

また、従来モノクロナール抗体はラテックス凝集法には
利用が難かしいと言われていたが、本発明方法において
は、モノクロナール抗体で感作した磁性体を含有しない
不溶性担体粒子と、ポリクロナール抗体で感作した磁性
体を含有した不溶性担体粒子を用いることによりモノク
ロナール抗体及びポリクロナール抗体と反応する抗原を
前記と同様の方法で定性的に又は定量的に一１定するこ
とができる。

本発明方法は、従来の磁性体含有粒子を用いた技術と比
較し、次の点が異なる。

１、ｍ＆ｔした不溶性担体粒子を使用しないため、磁化
粒子又は磁化粒子を含む凝集粒子會反応谷器内に磁場を
かけることによって集め、上清を除くといった操作や洗
浄が不要でおり、操作が簡便でらるｏ′）ｌす、同一の
反応容器内で、反応から測定まで行なうことが可能でろ
る。このことは操作の自動化において大さなメリットと
なる。

λ　本発明は、ケイ元色素やラジオアイソトープを使用
せず、特別な装置や施設全必要としない。つまり、一般
的な分光器あるいはマイクロプレートリーダによって測
定が可能でめるＯ ｓ　本発Ｆ！Ａは、凝集粒子を測定するのではなく、残
存する磁性体を含有していない不溶性担体粒子ｔ　６１
１Ｊ足するものである。つまり、検体中に抗原又は抗体
が存在しない時吸光度及び散乱光強度が最大となり、抗
原又は抗体蓋が増加するに従って磁性体上含有しない不
溶性担体粒子の吸光度及び散乱光強度は減少する。

これにより、測定装置の感度が最もよい吸光度又は散乱
光強度となるよう磁性体を含有しない不溶性担体粒子濃
度を予め調整することができる。従って、特にブランク
値に近い低績匿検体を感度よ（検知する仁とが可能であ
るＯ ま友、凝集した粒子を速やかに除くことが可能でろるの
で、測定に要する時間が短時間ですむ。

〔実施例１）　　ＡＦＰの検出 （試薬の調製法） ・磁性体含有抗ＡＦＰ感作ラテックスのＢＡ膜製法１０
％（、ｖ′Ｖ）のα７μｍの磁性ラテックス（ロンヌブ
ーラン社裂エスタボールＳＭＬ２６６）から分離したラ
テックス１％を分散させた１１ＭのＴｒｉ　ｇ−塩酸緩
衝液（ｐＨａＯ）１ｃｒ−に、ヒトＡＦＰ（アルファフ
ェトブチイン）を動物に免疫して得られる抗ＡＦＰ％異
抗体１■金加え、約１時間攪拌し、感作した後、遠心分
離（１６，０００ｒｐｍで１０分間）シ、上溝を除き、
分離されたラテックスｔα５％牛血清アルブミン／　ｃ
ＬＩ　ＭのＴｒｉ　ｇ−塩酸緩衝液（ｐＨａｏ）に再分
散させ、更に１時間攪拌する。再度遠心分離（１６，０
００ｒｐｍで１０分間）を行なつ九後上清を除き、α１
Ｍ　ＩＪン戚Ｉり衝［（ｐＨ７）に再分散させる。

・磁性体を含有しない抗ＡＦＰ感作ラテックスのｌ＆ｌ
ｌＩ製法。

１０％（ｖｖ）　Ｏ（１４９７μｍ　Ｏホ９　スｆ　ｖ
　ｙ、ラテックス（Ｄｏｗ社製）から分離したラテック
ス１１劃散させたαＩ　Ｍ（ＤＴｒｉａ−ｊ！酸緩衝液
（ＰＨＩＬＯ）１ｃｃに、抗ＡＦＰ％異抗体１■／−を
加え、約１時間攪拌し、感作した後遠心分離（１６，０
００ｒｐｍで１０分間）し、上清上瞼き、分離されたラ
テックスを１１３％牛血清アルブミン／α１ＭのＴｒｉ
８−塩改緩衝ｇ（ｐＨａＯ）に再分散させ、１時間攪拌
する。再度遠心分ａ（１６，０００ｒｐｍで１０分間）
１−行なった後、上清を除きαＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７）に再分散させる。

（操作方法〕 １％の磁性体含有抗ＡＦＰ感作ラテックスを１うのａ性
体七含有しないＡＦＰ悪作ラテうクスｔ″１：１の割合
で混合した後、αＩＭＩＪン酸稜衝液で８倍に希釈する
。これ？ラテックス調、ｉ試薬とする。

ＡＦＰ標準品（２５０ｎｔ／ｗｄ、ダイアヤトロン社ｇ
）ｉＡＦＰの含まれていない人血清で２倍希釈した系列
上杵製し、これ七検体とする。

９６穴マイクロプレー）　（Ｆａｌｃｏｎ　社製Ｆ１ｅ
ｘＦｂｌｅ　Ａｓ５ａｙ　Ｐｌａｔｅ　　平底）に検体
５０　ｔｔｔ。

ａｍ液（αＩ　Ｍ　Ｔｒｉｏ−ＨＣｔ（ｐＨＦＩＯ）　
）　５０ｐｔ、ラテックス調装試薬５０μｔ２加え、よ
く混合した後３０分呈温で反応させる。次に、永久磁石
金マイクロプレートの検体分注部測面に外部よりあて、
側面に磁性体を含むラテックス凝集塊及び未反応磁性体
含有ラテックスを集める。

約５分で磁性体を含有する凝集塊及び未反応磁性体含有
ラテックスを集めることができる。そして、このマイク
ロプレート上に残存しているａｌａ体を含有していない
不溶性担体粒子の濃度をマイクロプレートリーダー（日
本インターメツド社ｆｉ　ＮＪ２０００）に工９、波長
６２　Ｇ　ｎｍで、その吸光度を測定することにより測
定した。

表１に吸光度とＡＦＰｉ１度の検濾線データ奢示す。

〔実施例２〕　大腸菌易熱性エンテロトキシンの検出 （試薬の！ｌ１ｌｌ装法） ・出性体含有抗エンテロトキシン感作ラテックスの調製
法 コレラ菌エンテロトキシンと大腸菌易熱性エンテロトキ
シンは互いに免疫学的に抗原共通性ｔｉするため、コレ
ラ菌エンテロトキシンを動吻に免疫して得られる大腸菌
易熱性エンテロトキシン抗体（Ｌ１ダ／−を、１０％の
磁性体含有ラテックス（ロンヌプーラン社裏エスタボー
ル８ＭＬ２６６）から分離したラテックス１チを分散さ
せたαＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ２後衝液（ｐＨａｏ）１
へ中に加え？ＦＪ１時間攪拌し、感作する。遠心分１ｍ
（１６，ＯＱ　Ｑ　ｒｐｍで１０分間）シ、上清を除き
、沈降したラテックスをα１う牛血清アルブミン／αＩ
　ＭＴｒｉｓ−ＨＣ４後１１ｇ（ＰＨａＯ）に再分散さ
せ、約１時間撹拌した後、遠心分＃ＩＩ（１６，００Ｏ
ｒｐｍで１０分間〕する。上清を除き、ＣＬＩＭ’Ｊン
ｒＲ置衝液に再分散させる。

・磁性体を含有してない抗エンテロトキシン感作ラテッ
クス 磁性体を含有していない感作ラテツクスについては市販
品（デンカ生研株式会社コレラ菌エンテロトキシン−大
腸菌易ＩＩＩｋ性エンテｏトキシン検出用キット）の感
作ラテツクスを使用した。

（操作方法ン １％の磁性体含有感作ラテックス全α１Ｍリン咳緩衝敲
（ｐＨ７，０）で８倍に希釈し、磁性体を含有してない
感作ラテツクス（デンカ生研社製）と１：２の割合で混
合し、これをラテックス調製液とする。

エンテロトキシンを４０ｎｆ／−の割合で含有するαＩ
　Ｍ　Ｔｒｉｍ−ＨＣ２＠＠ｇ、（ｐＨａＯ）　ｆα１
ＭのＴｒｉｓ　−ＨＣＬ　Ｉｌ＠ｆＩＬ（ｐＨａＯ）で
２倍希釈系列全つくりこれを検体とした０ ９６穴マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　　社製Ｆｌｅ
ｘｉｂｌｅ　Ａｓ５ａｙ　Ｐｌａｔｅ　Ｘ１２−底ンに
サンプル５０μｔ１ラテックスｙ４製試県１００μｔｆ
分注し、よく混合した後３０分室温で反応させる。

次に永久磁石をマイクロプレートの検体分注部側面に外
部よりあて、側面に磁性体を含むラテックス凝集塊及び
未反応磁性含有ラテックスを集める。約５分で磁性体金
含有する凝集塊及び未反Ｇｆｍ注体ラテックスは来める
ことができる。そしてこのマイクロプレートをマイクロ
プレートリーダー（日本インターメツド社ｉ　ＮＪ２０
００　）により、波長６２０ｎｍで、その吸光度全測定
する。表２にその吸光度と＠度の検披線データを示す。

〔実施例３）　　ＡＦＰ、ＣＥＡ同時検出（試薬のｖ！
４製法） ５−１　磁性体含有抗ＣＥＡ感作ラテツクスの調装法 １０　％　（Ｗ／Ｖ）の平均粒径α７μｍの磁性ラテッ
クス（ｅＩンヌプーラン社製エスタポールＳＭＬ２６６
）から分離したラテックス１俤を分散させたα１ＭのＴ
ｒｉａ　塩酸後［ｒ液（ｐＨａＯ）１仁にヒトＡＦＰ（
アルファフェトプロティン）を動物に免疫して得られる
抗ＡＦＰ％異抗体ｌＴＲ９ｔ−加え、約１時間攪拌し、
感作する。遠心分離（１６，００Ｏｒｐｍで１０分間）
シ、上清ｔｌＳ′＠、沈綾したラテックス１（Ｌ３％牛
血清アルブミン／αＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈａｏ）　　に再分散させ、１時間攪拌する。再度、遠
心分離（１６，０００ｒｐｍで１０分間）ｔ−行った後
、上清を除き、α１ＭリンｒＩＩ峻備液（ｐＨ７）に再
分散させる。

３−２　磁性体含有抗ＣＥＡ感作ラテツクスの調装法 １０％（Ｗ／Ｖ）の平均粒径α７μｍの磁性ラテックス
（ロンヌプーラン社製エスタボールＳＭＬ２６６）から
分離し次ラテックス１％を分散させｆｔ−（Ｌ　Ｉ　Ｍ
　ｆ）　Ｔｒｙｓ−塩ｃｈｅｗ液（ｐＨ，ａｏン　１仁
に、ヒトＣＥＡ（カルジノエンブリオニック　アンティ
ジエン）を動物に免疫して得られる抗（’ＥＡ特異抗体
α５１ｎ９を加え約１時間攪拌し、感作する。遠心分ｉ
１！（１６，００Ｏｒｐｍで１０分間）し、上清全除き
、沈般したラテックスをα１％牛血清アルブミン／αＩ
　Ｍ　Ｔｒｉｓ−塩ｒ：Ｒ緩衝ｇ　（ｐＨａＯ）に再分
散させ、１時間攪拌する。再度、遠心分離（１６，ＯＯ
Ｏｒｐｍで１０分間）ｔｌ−行つ喪後、上清を除き、α
Ｉ　Ｍ　ＩＪン改緩衝液（ｐＨ７）に再分散させる。

３−３　磁性体を含有しない抗ＡＦＰ感作ラテックスの
ａｌｌ製法 １ｏ　％　（Ｗ／＋１’）粒径（Ｌ４５〜［Ｌ５５Ｊ１
ｍ（Ｄ青色ポリスチレンラテックス（ロンヌプー５ン社
製エスタポール　ＫＯ３０Ｂｌｕｅ　）　　から分離し
たラテックス１１→散させたα１ＭのＴｒｉｓ−塩酸緩
衝液（ｐＨａＯ）１ｃｒ、に抗ＡＦＰ特異抗体１■を加
え約１時間撹拌し、感作する。遠心分離（１６，０００
ｒｐｍで１０分間）し、上清を除き、沈殿したラテック
ス會１３％牛血清アルブミン／　（Ｌ　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−塩＃を緩衝ｇ（ｐＨａＯ）に再分散させ、１時間撹
拌する。再度、遠心分１Ｉｌ（１６，０００ｒｐｍで１
０分間）ｔ−行なった後、上清を除き、ＣＬ　Ｉ　Ｍ　
＋７ン酸後衝液（ｐＨ７）に再分散させる。

３−４　＠柱体全含有しない抗ＣＥＡ感作ラテツクスの
ｆ％ｌ１ｍＪＡ法 １０　％　（％’Ｖ）　＋７）粒径α４５−（１５５μ
ｍＯ黄色ボリスチレ／ラテックス（ロンヌプーラン社製
ニスタボ−ｋ　　ＫＯ３０Ｙｅｌｌｏｗ　）　　から分
離したラテックス１９６ｉ＋散させた１１ＭのＴｒｉｓ
　−塩酸緩衝液１弧に抗ＣＥＡ特異抗体１５〜を加え％
　ＦＪ　１時間攪拌し、感作する０遠心分ＩＩ！（１６
，０００ｒｐｍで１０分間）シ、上？ｊｌ−除き、沈殿
したラテックスをα１チ血清アルブミン／（１１Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−塩ｍｕ衝Ｍ（ｐＨａＯ）に再分散させ、１時間
撹拌する０再度、遠心分＃ｌ！（１６，００Ｏｒｐｍで
１０分間）１−行った後、上清上瞼き、α１Ｍ　ＩＪン
＃を緩衝液（ｐＨ７）に再分散させる。

５−１．５−２．５−５．５−４で調製し比容ラテック
ス調製液をα１Ｍリン酸後衝緩衝ｐＨ７，０）で２倍に
希釈し、等蓋づつ収り、十分混合し、ＡＦＰ、ＣＥＡ同
時検出調製液とする。

（操作方法） ＡＦＰ標準品（２５０ｎｆ／ｌＲｔ、ダイアヤトロン社
製）會ＡＦＰとＣＥＡｉ含んでいない人血清で２倍希釈
系列を調製する。また、ＣＥＡ儂準品（１６０ｎｔ／ｌ
ｐｔ、三菱化成工業ｉ　）　ｋ　ＡＦＰとＣＥＡｉ含ん
でいない人血清で２倍希釈系列ｔ−ｖＩ４製する。ＡＦ
Ｐ、Ｃ’ＥＡともにある濃度をもつ検体のモデルとして
ＡＦＰ標準品２５０ｎｌＰ／−とＣＥＡ標準品１６０　
ｎｆ／ｓｓｇ　ｆ　１　：　１で混合し、ＡＦ　Ｐ　１
２５　ｎｆ／ｄ、ＣＥＡ　８０　ｎｒ／ｗｄｋｆｆｔｒ
溶ｆｆｋ作成ｔ、、これｆ　（Ｌ　Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＬ緩衝液で希釈し、２倍希釈系列を調製する。これ
らのａｍ製した５種類の希釈系列を検体として測定した
。

９６穴マイクロプレー）　（Ｆａｌｃｏｎ　社製Ｆｌｅ
ｘｉ’ｂｌｅ　Ａｓ５ａｙ　Ｐｌａｔｅ　ｓＰ−底）に
サンプル５０μｔ％　α２　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ２後衝
ｇ　ｐＨ＆　（１５０ｔｔｔ。

ＡＦＰ、ＣＥＡ同ａｔ検出ＤＩ４ＨＫ　５０　μＬ　ｋ
分注し、よく混合した後３０分室温で反応させる。

次に永久磁石ｔマイクロプレートの検体分注部側面に外
部よりあて、側面に磁性体を含むラテックス凝集塊及び
未反応磁性体含有ラテックスを集める。約１０分で磁性
体を含有する凝集塊及び未反応伍性体含有ラテックスを
集めることができる。マイクロプレートを目視的に色合
い１ｊｔ観祭することにより、ＡＦＰ、Ｃ’ＥＡ？（検
出した。結果を表−３に示す。

マイクロプレートの反応液の色が黄の場合はＡＦＰ陽性
、青の場合はＣＥＡ陽性、緑の場合はＡＦＰ、ＣＥＡと
もに陰性、透明の場合はＡＦＰ、ＣＥＡともに陽性とな
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、底面が７字型になったマイクロタイターを用
い各列２倍希釈濃度の）ＩＣＧの検体を入れ反応させた
後底部より磁場をかけ磁性体含有不溶性担体粒子及び凝
集した磁性体含有不溶性担体粒子を底部に沈殿させた状
態を示すものである。なお、図面において、Ｈは９００
０ｍ１Ｕ〜　のＨＣ’Ｇを含有し、以下２倍希釈でＡは
ＨＣＧを含有していないものを示す。 特許出願人　　三菱化成工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させ、この担
   持された抗体又は抗原に、抗原又は抗体或いはその混合
   物を液体媒体中で反応させて該反応の進行に伴う反応物
   の変化の度合を測定することにより、抗原又は抗体を測
   定する方法において、上記担体粒子として磁性体含有不
   溶性担体粒子と、磁性体を含有してない不溶性担体粒子
   を用いて上記反応を行い、ついで反応混合物に磁場を付
   与することにより未反応の磁性体含有不溶性担体粒子及
   び磁性体含有不溶性担体粒子を含む凝集粒子を反応混合
   物から分離し、残存する磁性体を含有していない不溶性
   担体粒子を検知することにより、液体媒体中の抗原又は
   抗体を定性的に、又は定量的に測定することを特徴とす
   る抗原・抗体測定法。 ２、磁性体含有不溶性担体粒子又は磁性体を含有してい
   ない不溶性担体粒子に、測定しようとする抗原に対する
   担体又は担体に対する抗原を感作した懸濁液と、測定し
   ようとする抗原又は抗体を液体媒体中で抗原・抗体反応
   が平衡に達しない或る一定時間反応させ、さらに磁性体
   を含有しない不溶性担体粒子又は磁性体含有不溶性担体
   粒子に測定しようとする抗原に対する抗体又は抗体に対
   する抗原を感作した懸濁液を加え、抗原・抗体反応が平
   衡に達するまで反応させ、反応が平衡に達した時点で反
   応混合物に磁場を付与することにより、磁性体含有粒子
   及び磁性体含有凝集粒子と磁性体を含有していない不溶
   性担体粒子を分離し、残存する磁性体を含有していない
   不溶性担体粒子を測定することにより、抗原又は抗体を
   定法的に又は定量的に測定することを特徴とする抗原・
   抗体測定法。 ３、磁性体として鉄及び／又は磁性酸化鉄を含有する不
   溶性担体粒子を使用する特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の抗原・抗体測定法。 ４、不溶性担体粒子として有機高分子物質よりなる粒子
   を使用する特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記
   載の抗原・抗体測定法。 ５、不溶性担体粒子として無機微粉末を使用する特許請
   求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の抗原・抗体測
   定法。 ６、不溶性担体粒子としてポリスチレンラテックス粒子
   又はスチレン−ブタジエン共重合体粒子を用いる特許請
   求の範囲第４項記載の抗原・抗体測定法。 ７、不溶性担体粒子としてセラミック微粒子、シリカ、
   アルミナ、シリカ−アルミナ、炭末又は金属の微粉末を
   用いる特許請求の範囲第５項記載の抗原・抗体測定法。 ８、磁性体含有不溶性担体粒子と磁性体を含有していな
   い不溶性担体粒子の配合比が１：２０〜２０：１である
   特許請求の範囲第１項記載の抗原・抗体測定法。 ９、残存する磁性体を含有していない 不溶性担体粒子を目視で検知することにより検体中の抗
   原又は抗体を定性的に判定する特許請求の範囲第１項又
   は第２項記載の抗原・抗体測定法。 １０、磁性体を含有していない不溶性担体として色素を
   含有する有機高分子物質よりなる粒子を使用する特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載の抗原・抗体測定法。 １１、色素を含有する有機高分子物質よりなる粒子とし
   て２種類以上の色素を含有する有機高分子物質よりなる
   粒子を使用する特許請求の範囲第１０項記載の抗原・抗
   体測定法。