JPH02140667A - 抗原又は抗体の検出方法及び検出用診断キット - Google Patents

抗原又は抗体の検出方法及び検出用診断キット

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JPH02140667A
JPH02140667A JP18866389A JP18866389A JPH02140667A JP H02140667 A JPH02140667 A JP H02140667A JP 18866389 A JP18866389 A JP 18866389A JP 18866389 A JP18866389 A JP 18866389A JP H02140667 A JPH02140667 A JP H02140667A
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リン　パク　レオン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、体液又は分泌液又は刊出物、細胞又は組織抽
出物、又は培地中の抗原又は抗体を検出する方法又はキ
ットに関する。
従来の技術とその問題点 抗原検出は、食品微生物学、実験生物学から非常に重要
である臨床Ｈ学にわたる様々な分野で免疫学名の作業を
長期間占有してきた。細菌性髄膜炎、虱チノス及びウィ
ルス性感染等の感染性状態及び妊娠及び種々のホルモン
異常等の非感染性状態の診断を助ける生物学的液体中の
抗原の検出試験がますます用いられるようになっている
。
最近２０年間で抗原検出のための免疫検定法が続々と登
場した。同位体標識を用いる放射性免疫検定法（ＲＩＡ
）は１９６０年代には一般的であったが、それでは反応
は本来溶液中で行なわれていた。
しかし７０年代以降それらは、マイクロプレートと同位
体ンー力の代わりの酵素標識を用いるより簡便でより安
全な固体酵素免検定（ＥＬＩＳＡ）により取って代わら
れた。最近になって硝酸セルロース膜に働＜ＲＩＡ及び
ＥＬＩＳＡシステムの変形例が導入された。これらのド
ツト免疫結合（ｄｏｔ　ｉｓｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ　
）検定は、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡシステムと同様感度が
高い。しかし、それらは全て多数のステップからなって
複雑であり、また従来行なわれてきた如く費用と時間が
かかる。
カウンター免疫電気泳動、共凝集（ｃｏ−ａｇｇｌｕｔ
ｉｎａｔｉｏｎ　）又はスライドラテックス凝集（ｓｌ
ｉｄｅ　１ａｔｅｘ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　）
等のより単純な検定が利用可能であり、脳を髄液試料か
ら抗原を検出する最も普通の方法となっている。これら
のうちおそらくスライドラテックス凝集が、その単純性
、低費用及び速。さの故に今日最も広く用いられている
と思われる。これは、特に脳を髄液中の細菌性抗原。
便中のウィルス性粒子及び尿中のホルモンの検出に用い
られる。この方法においては、抗体又は抗原により前も
って被覆されたラテックス粒子からなる試薬が、スライ
ド又はカード上で９吊（通常、０．０５７未満）の試験
物質サンプルと混合され、スライド又はカードは約５分
間穏やかに回動又は揺動される。次いでその結果が粒子
凝集の有無に基いて視覚的に確認される。この方法の主
たる欠点は、ＥＬＩＳＡに比較して相対的に鈍感なこと
と、端点の解釈が主観的にあることである。これらの点
について試験をスライド上ではなく大形の試験管中で行
なうならば若干の改善がなされる。
しかしこの管による方法は、大なるサンプル容積（１１
にりと長いインキュベーション期間（少なくとも１時間
）を必要とするので妊娠又は変形関節炎の場合に行なわ
れることがあるのを除けば日常的な診断に用いられるこ
とはめったにない。これが用いられた例においては、試
験は個々の大形管中で行なわれるだけであり、反応混合
物はインキュベーション中に振盪されない。
抗原の代わりに抗体が感染の、あるいは自己免疫異常等
の他の臨床状態のマーカーとしてしばしば用いられる。
この目的のため通常血清サンプル中の特定の特異性を有
する抗体の全濃度が判定される。しかし存在する抗体の
うちの特定のクラスのみが測定されるならば診断はより
信頼性のあるものとなる。通常１ｇＭ抗体が用いられる
が、これは感染症の急性期中に出現し、そしてＩｏＧ抗
体と異なり感染が終了すると通常消失するためである。
まれな場合には、他のクラスの抗体も診断上関係がある
ことがある。研究によりＩ（ＩＩＥ抗体はＩｏＭ抗体よ
りもサイトメガロウィルス感染のインジケータとして優
れていることが判明しており、エプスタイン−パールウ
ィルスのＶＣＡ抗原に対する巡回１０Ａ抗体は、ヒトに
おける上咽頭ガンの存在と強い相関性を有する。
抗体検出に用いられる方法は抗原検出に用いられる方法
に類似する。クラス特異的抗体を判定するのに最もしば
しば用いられるｈ法はＥＬＩＳＡであるが、ＲＩＡ及び
螢光抗体細胞法が用いられることもある。従来のラテッ
クス凝集法ではかかる判定はできなかった。抗原被覆ラ
テックス粒子は、凝集に基くのではな〈従来の固相ＥＬ
ＩＳＡに暴く様式で風疹ウィルスに対するＩ（ＩＭ抵抗
体検出する例でのみ用いられていた。試験は？イクロプ
レート上で行なわれ、結果はマイクロプレートウェル内
でのラテックス粒子の沈降パターンに基いていた。
問題点を解決するための手段 本発明の第１の態様によれば、抗原又は抗体に被覆され
５０乃至１５００ｎｍの直径を有する粒子がインジケー
タ試薬として用いられて抗体又は抗原が検出されるべき
液体サンプルを収容した１組の小形の管に添加され、管
は検出されるべき前記抗体又は抗原がサンプル中に存在
する場合には試薬の粒子が変化するよう充分最短１分間
完全混合されつつ囲繞温度でインキュベーションされる
、液体サンプル中の抗原又は抗体の検出方法が提供され
る。
本発明の第２の態様によれば、サンプルを収容する１組
の小形の管と、前記サンプル中の検出されるべき抗原又
は抗体にそれぞれ反応する抗体又は抗原に被覆され５０
乃至１５００ｎｍの直径を有する粒子からなるインジケ
ータ試薬とからなる液体サンプル中の抗原又は抗体の検
出で用いられる診断キットが提供される。
抗体又は抗原で被覆するのに用いられる粒子は、例えば
ラテックス（スチレンブタジェン共重合体。
ポリスチレン、スチレンジビニルベンピン共重合体又は
アクリル共重合体等）、又は金その他の物質のゾル、又
はこれらの２つ以上の混合物からなる均散微小球である
のが好ましい。インジケータ試薬として単一種の粒子が
用いられる場合には、粒子は単一寸法であるのが好まし
い。ラテックスの場合様々な異なる色の粒子が使用しう
るが、好ましい色は赤、青、緑及び黄色である。
粒子は液状担体媒地中にか、あるいは検定を受ける液体
サンプル中に直接浮遊さゼて用いられる。
検定で用いられる浮遊粒子の濃度は０．００１％（Ｒ終
的、Ｗ／Ｖ）（機器読取り用）乃至０．２％（視認用）
である。結果が視覚的に読取られる大部分の検定では、
好ましくは約８００ｎｍの直径の粒子を用いて０．０１
乃至０．０８％の濃度が好ましい。
本発明の小形管の組は特別に設計されたもので、２本以
上（好ましくは２本乃至１２本、例えば８本）の管から
なる単一列に配誼されるのが好ましい。小形管の組は、
例えば単一ユニットとした単一の型から成形されるか、
あるいは適宜な材料のブロックに管を機械加工で形成す
ることで一体的に形成されるようにできる。あるいは小
形管の組は、別々に製作された個々の小形管を、小形管
内の反応が観察できるようにしてホルダ内に多少なりと
も固定的に保持することで構成されてもよい。
つまり（同一種類又は異なる種類の）２本以上の小形管
の組は物理的に連結されているか合わせて保持されてい
る。
小形管の組に用いられる材料は重要ではないが、如何な
る反応の結果も観察しつるよう少なくとも半透明である
べきである。
小形管の組及び個々の管が特定の形状又は寸法であるこ
とは重要ではないが、管が比較的小形であることは重要
である。管が小形であるならば、必要な試薬及びサンプ
ルの容積は比較的小さくてすむ。
各小形管は０．０５乃至０．５ｍの反応混合物を保持す
るようにされる。８管は口が試験物質及び試薬の引渡し
が容易であるのに充分なだけ広くされ、また視認が容易
となるよう反応混合物が管内で妥当な高さになるように
下方に狭い幅となるもですぼまるのが好ましい。また管
は低濃度の試薬粒子が使用されて見ることができるよう
充分な深さを有するのが好ましい。小形管の組の面は、
反応を透視しやすいよう平坦であるのが好ましい。
個々の管及び組全体としての形状及び寸法の好ましいパ
ラメータについては後述する。
大形の個々の管の代わりに小形の管の組を用いるという
思想は次のことに基く。
ａ）単一の小形の管よりも組となるよう物理的に接合さ
れた幾本かの小形の管を取扱う方が容易である。
ｂ）小形の管の組を用いると多数（例えば８つ）の試験
が同時に行えるが、大形の個別の管では（例、えば）３
より多くのかかる試験を行なうのは困難である。
Ｃ）小形の管の組を構成することで、単一の管では困難
である管の内容の効果的な手動混合のための新規で単純
な８Ｎ構が得られる（小形の管内では管の内容と管との
間の粘着力が相当大きくなりうることに注意されたい）
。小形管の組は、面を横断する一端で親指と人さし指と
の間で保持されて、他方の手のひらく又は他の物体に）
繰返しく例えば毎分１５０回）軽く打ちつけられ、組の
他端の面を数センチメートル離れた物体に当てられる。
この運動中相の面は水平に保持されているのが好ましい
。管の内容に加えられる力は、引き起される運動の力及
び速度だけでなく、組の長さ及び重量、ならびにセット
が保持される点から管の距離にも依存する。力は最も離
れた管で最大となる。実際にはこの方法では先端３分の
１にある管の内容のみが効果的に混合されるため、−時
には組の３分の１のみが用いられる。あるいは管の組は
、少なくとも組の３倍の長さの（後述する）特定のホル
ダに載置されて、ホルダの端に載置されるなら組全体を
振盪する所望のテコ作用が得られるようにされてもよい
。
ｄ）他の免疫検定システムで用いられる接合されたウェ
ル列からなる既存の微足滴定プレート又はストリップは
、粒子免疫検定で用いるには適さない。これらの反応シ
ステムは振盪されるよう設計されていない。例えば微量
滴定プレートを例えば平床機械ローテータに載置しても
所望の内容混合は得られない。混合過程で本質的な容器
のつＩルの封止のための対策がないのである。また反応
は、側面を通してではなくウェルの取付台を通して頂部
から見られる。従来技術のウェルの設Ｂ１と、本発明の
小形管の組の設計とは、前者では結果は絶対量の特定反
応物の存在に基くのに対し、粒子免疫検定はインジケー
タ粒子の（絶対数ではなく）濃度に暴くから異なってい
る。
本発明にとっては小形管の組内の反応混合物が少なくと
も最短期間完全攪拌されることが木質的である。かかる
攪拌により任意の反応が個別的な大形の管を用いる公知
の方法による場合よりもはるかに急速に起こる。反応の
速度及び強さは、反応混合物が振盪される力ならびに攪
拌の期間に依存する。従って最良の結果は、後述の如き
機械的混合機を用い、記載の如き好ましい条件で好まし
くは最低５分間のインキュベーションを行なうことで得
られる。ただし同様の検定感度を同程度のあるいはより
短い期間手動で混合することによっても得ることができ
るが、かかる手動混合の場合は小形管を一定時間（例え
ば１時間半又は−晩）静置するのが好ましい（注意：こ
の［手動混合プラスインキュベーションの方法は、静的
インキューベージコンを用いるのみの公知の大形管によ
る方法と等価ではない。もし本発明の小形管の相中のサ
ンプルに静的インキュベーションのみが行なわれるだけ
ならば、結果は非常に不十分であって感度が低くなる）
。
本発明の小形管の組の攪拌は、手動によるか適宜の混合
器つまり攪拌装置により行なわれる。手動攪拌が用いら
れる場合には、小形管の組が一方の手で保持され他方の
手に繰返し当てられる上述の如き方法を用いて行なわれ
るのが好都合である。
本発明の小形管の組を収容して管の内容を必要なだけ混
合するよう設計された機械的混合機は入手可能でない。
混合機が用いられる場合には、それは特殊な設計のもの
でなければならない。その混合機は１又は複数の小形管
の組を保持できなければならない。小形管の組は、水平
方向軸を中心として！直面内で振動する混合機の腕の一
端又は両端に取り付けられる。腕の運動の範囲は、上方
に少なくとも２０°　（好ましくは４７”）、下方に少
なくとも２０°　（好ましくは４７′″）である。
運動速度は少なくとも５０ｒｐ糟、好ましくは１６０ｒ
ＤＩである。
あるいは、後述の手動混合装置と同様にして小形管の組
を攪拌する電気混合機を用いてもよい。
あるいは異なる仕方で例えば管の反転を繰返すことで管
の内容を混合する措置を用いてもよい。
本発明のキットは次の要素からなる。
１、反応及び観察両方のための容器として用いられる前
述の如き小形管の組。
２、適当な抗原又は抗体により被覆された前述の如き反
応インジケータ粒子からなる試薬。
ａ　小形管の組のうちの管に試験物質を供給する点滴器
。
４、　次の付属品。
ａ）管の内容を手ｖＪ混合するためにも使用される管の
紺のホルダ。
ｂ）管の内容を混合するよう１又は複数組の管を保持し
つる電気装置。
Ｃ）試験結果を肉眼で読取るのに用いられる照明器具及
び拡大鏡からなるビューア−ｄ）混濁度測定、比色定量
、化学ルミネッセンス又は螢光宇部に基き試験結果を読
取る電子装置。
キットが使用されて、本発明の方法は好ましくは全ての
ステップが室温で行なわれるようにして以下の通り実行
されるのが好ましい。
試験リンプルは（例えば前処理を受けるか受けないかし
、必要ならば適当に希釈された０、０５７）は、インジ
ケータ粒子のシンブル（例えばＯ，ｌｄ　）とともに、
小形管の組のうちの１本の管中に入れられる。次いで管
には蓋がされる。制御陽性及び陰性サンプルも含められ
るのが好ましい。次いで小形管の組は、一定期間又は陽
性ｖｌ’ｍサンプルが所望の効果を示すまで内容を充分
混合するよう手動か機械により振盪される。反応物を適
切に攪拌することが必要であり、そのための対策がなさ
れているのが本発明の基本的な特徴である。１乃至５分
間連続して管を振盪し、必要ならば同程度又はより長い
ｍ間の後過程を繰返すことで手動混合が行なわれる。過
程は、総ｒｔ間が５乃至３０分となるまでさらに数回繰
返されてもよい。
機械混合は５乃至６０分間連続して行なわれる。
結果は攪拌過程直後に読取られてもよいが、粒子凝集シ
ステムにおける分解能及び感度が向上するように凝集粒
子がｖｃＲするようさらにある期間管は単に静置した後
に読取られてもよい。この後置インキュベーションは短
く数分間であってもよく、また感度を上げるためかある
いは都合上より長く例えば１時間とされてもよい。
結果は小形管の組の面を通して肉眼又は電子装置により
読取られる。視覚による検査は、例えば２つの異なる色
のラテックス粒子の組み合わせを用い一方の種類の粒子
の反応（沈降）が他方の色の粒子を浮遊状態に残すこと
による反応混合物の色の変化に基いて行なわれるのが好
ましい。あるいは単色システムにおいては結果は、粒子
凝集、（凝結）又は粒子沈降に基く（混濁度測定）。結
果の機器読取りは、使用される粒子の種類に応じて様々
なｈ法で行なわれる。比色定思は多色システムにおいて
色分離を検出するのに用いられる一方、分光光度４は単
色システムにおれける混濁変化を検出するのに用いられ
る。粒子を化学ルミネッセンス性又は螢光性とし、かか
る性質に基く適宜のセンサをこれらの粒子の濃度検出に
用いることも考えられる。
実施例 １土工呈１ 直接的方法による抗原検出 本方法においては試験サンプル及び試薬粒子は、短時間
ともにインキュベーションされ、次いで反応混合物での
凝集（凝結）の有無についての結果が読取られる。検定
は、（ａ）サンプル中の抗原の試薬のく抗体により被覆
されている）粒子による直接的結合に基くか、又は（ｂ
）サンプル中の抗原と試薬のくこの場合は抗原で被覆さ
れている）粒子との試薬の（可溶性の）抗原に対する競
合に基き２通りの方法で行なわれる。
この方法は、尿、脳を髄液、細胞（微生物を含む）及び
組織の緩衝抽出物及び培地等の粒子凝集に干渉しないサ
ンプルにのみ適用しうる。従ってこのｈ法は、（特定の
ため）培養ブイヨン中の、あるいはく髄膜炎の診断のた
め）脳を髄液中の細菌性抗原の検出、あるいは特にブタ
の旋毛虫症を診断のための豚肉組織由来の幼生抽出物か
らの旋毛虫抗原の検出に用いられる。また競合による方
は、正常妊娠及び子宮外妊娠両方の診断のため尿中の胎
盤性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の検出に用いられる。こ
の後者の応用について以下詳細を説明する。
Ｌ−基 試薬は、スライドラテックス凝集試験を行なう市販の妊
娠試験キット（グラビンデツクス　βｈＣＧ　　スライ
ド　テスト　フォア　プレグナンシイ、オーツ　ダイア
グノーチフス　システムスインコーボレーテッド、ライ
タン、ニュジャージー）から得られた。それは、ｈＣＧ
に共有結合したう゛アラ９ス粒子の浮遊物と、溶液又は
ｈＣＧのβサブユニットに特異的なモノクローン抗体か
らなる。あるいは試薬は、パリ、ローヌープラニから得
られる着色ラテックス粒子（径は８００ｍ＋）、セント
ルイスのシグマ　ケミカル　カンパニーから得られるｈ
ＣＧ及びオックスフォードのセロチックから得られるβ
−ｈＣＧに対するモノクローン抗体等の基本的材料から
調製することもできる。
１．０．１−の試験物質が管に入れられた。
２．０．０１−の貯蔵試薬抗体の適当な希釈液が添加さ
れた。
１　０．０１ａｔのインジケータラテックス粒子の適当
な希釈液が添加された（最終的０．０１％Ｗ／Ｖ）。
４、管は封止され、管の組は機械的混合器により室温で
３０分間攪拌された。
５、次いで結果が視覚的に読取られた。
級−１ 提案されている方法で、試験サンプルとして種々の量の
ｈＣＧを添加された緩衝液（０１Ｍのグリシン−０，９
％の塩化ナトリウム、　Ｅ）Ｈ８，２）を用い、異なる
期間について異なる試薬濃度で１ｑられた結果が以下の
表１に示されている。３０分間１：２０抗体希解釈液を
用いると良好な感度（３１，３国際単位／Ｌ）が得られ
る。これは並行的に行なわれた従来のスライドラテック
ス凝集テストで得られた悪疫より１５−３０倍優れてい
る。
提案された方法の感度は反応容積に影響されなかった。
また反応物をある最短時間充分に混合することは絶対に
必要であり、そうでないとたとえ反応混合物を３７℃で
４時間もの長さインキ１べ一ションしても反応物の濃度
では反応が起こらなかった。
提案された方法を、妊娠がうたがわれでいる患者及び妊
娠していない女性からの臨床的試料に適用したところ、
スライドによる方法に比べ特異性は同一のままでより多
くの例を検出できた。陽性例においてｈＣＧレベルを定
量したところ、提案の方法はスライドによる方法よりも
１５倍感度が良かったが、２つの方法には非常に良好な
相関関係があった。
表１ に　　　ｈ に ュベーゝヨ インキュベーション期間（分） 抗体希釈　　　　抗体希釈 １：１０１：２０１：４０　１１０１：２０１：４０ｈ
ＣＧＩｉ温度　　　　　１５ 抗体希釈 （［１１ｗＡ１１ｉ位／Ｌ）　１：１０１：２０１：４
０２５−ｍ− ６２，５±　　−−± ３１．３＋−−＋ １６　　　　　　　　　＋＋　　　　±　　−＋＋８　
　　　　　　４令　　　十　　−＋＋４　　　　　◆◆
　　±　−＋＋ ２　　　　　＋＋　　十−＋＋ ０令＋十±十令 一：試験陽性（凝集の強い抑制） ±：疑陽性 十−＋：試験陰性（凝集） （全て視覚検査に暴く） ±　− ＋ （＋　± ＋＋＋ ＋＋　＋ ＋＋　＋ 鵠 抗体希釈 １：１０１：２０１：４０ 星ｉすｉ璽 この方法は、ラテックス凝集に干渉する血清等の臨床的
試料又は大量にあるサンプルで用いるよう第１実流例の
方法を変形したものであり、２つの段階からなる。第１
の段階では抗体が被覆されたビーズが、試験サンプルか
ら所望の抗原を取出すために用いられる。次いでビーズ
は洗浄され、緩衝液中に再浮遊せしめられる。第２の段
階では、適切な抗体に被覆されたインジケータラ゛ｊツ
クス粒子が第１実施例として記載されたのと類似の手続
きで吸着された当該抗原を検出するようビーズ浮遊液に
添加される。実験の最後にはビーズは必然的に管底部に
沈降するが、反応しなかったインジケータ粒子は浮遊し
たままである。これは、大寸法（例えば２０００ｎ■）
のビーズ又は、磁石により沈澱するようにｒｉｉ性を用
いて実現される。一方インジケータ粒子は小さく　（１
２００ｎｓ未満）抗原−抗体相互作用を通じてビーズに
結合される場合にのみ沈澱する。
この方法では同一の試験で複数種類の抗原が検出できる
。このためには抗原捕獲で用いられるよう適切な特異性
の抗体で別々に被覆されたビーズが混合される。使用さ
れる異なる種類の被覆ビーズは互いに区別できる必要は
ない。次に適切な抗体で別々に被覆されたインジケータ
ラ“アックス粒子が試験を行なうために用いられる。こ
れらは例えば色により互いに区別できなければならない
。
説明のため、乳児下痢症の異なる診断のためロタウィル
ス（ＲＶ）及びアデノウィルス（ＡＶ）の検出を取り上
げる。抗ＲＶ及び抗ＡＶインジケーテ粒子が試験で用い
られ、それぞれ例えば青及び黄色に着色される場合、試
験結果はラテックス浮遊液の発色により判定される。つ
まりＲＶのみが試験リンプル中に存在するならばラテッ
クス浮遊液は、実験終了時にもとの緑色を帯びた浮遊液
と比べてより黄色が強くなる。これは青色の抗ＲＶイン
ジケータ粒子が管底部へ離脱するからである。
逆にＡＶのみが試料中に存在するならば黄色の抗ＡＶ粒
子のｌｌ１１ｍ１２によりラテックス浮遊液は青色にな
る。他方、１種類のインジケータラテックス粒子が用い
られる場合には第１実施例における如く混濁度測定によ
り結果が判定される。この後者の応用については本発明
者の研究所で製造されたＯ〜９七ツクツクローン抗体い
てチフス菌のリボ多糖の検出の場合を以下説明する。
Ｌ−ユ 磁性ビーズ（ダイナビーズＭ−４５０，径４５００ｎ■
）はオスＯ，スコーヤンのダイナルから得られ、ラテッ
クスビーズ（径８００ｎｓ　）はセントルイスのシグマ
　ケミカル　カンパニーから得られた。粒子は両方とも
リルモネラＯ−９抗原に対する七ツクＤ−ン抗体で被覆
される。使用された抗原であるチフス菌のリボ多糖（Ｌ
ＰＳ）はデイフコ　カンパニーから購入された。
１、　０．０５　ｄの（適当な濃度の）抗体被覆された
ダイナビーズが組のうちの管に入れられた。
２．０．１乃至５．０ｄの試験サンプル（ＬＰＳ添加緩
衝液）が管に添加された。
ａ　管は封止され、小型管の組は機械的混合器により室
温で４５分間Ｓ纏された。
４、　ビーズは！！！画液で３回洗浄され、磁石により
管底部に収集された。
５、　ビーズに０．１−のインジケータラテックス試薬
が添加された（最終濃度０．０１％Ｗ／Ｖ）。
６、　混合物はステップ３における如くインキュベーシ
ョンされた。
７、　ダイナビーズは管底部に収集され、次いで試ｗＡ
結果が読取られた。
１−里 下記の表２は、第１実施例の直接的−段階手続と比較し
た上記の捕獲的１ノ法を用いる抗原検出の結果を示す。
直接的方法は、同−容１　（０，１ａ（６）の試験サン
プルが用いられるなら捕獲的方法よりも感度が良い。し
かし、試論物質の容積が増すに従って後者の方法は感度
が大幅に上背するのに対し、前者の方法は同じにとどま
る。捕獲的方法の感度は、試論の両段階における撹拌／
インキュベーションの期間により影響された。血清が捕
獲的方法よりも直接的方法の方に大きく抑圧的に働くこ
とは示されていない。
表２　捕獲的方法による抗原検出 試験サンプル容積　　抗原濃度（ｎｏ／ｄ）（ＩＲｌ） ５０　　　２５　　　１２．５　　　　６．２５　　　
００．１（直接　＋　　　± 的方法） ０．１　　　　±（８４）−（１００）−（１００）　
　−（９６）０．５　　　−（８９）±（８５）　　−
（１００）　　−（９８）２．０　　　　＋（５８）＋
（６３）　　＋（，６８）　　　−（９９）５．０　　
　−ｔ（４６）＋（６０）　　＋（ｅ（６）　　　＋（
６８）表２において視覚検査士は試験陽性を、−は試験
Ｆｌ＋ｇを、士は疑陽性を示す。カッコ内の数字は、１
１ｗ管内の混濁度の自分率で表わした反応混合物の混濁
度の分光光度計（４００ｎ−）による測定値である。
表２中での直接的方法は、捕獲ビーズを用いることなく
同一のインジケータラテックス粒子を用いる・−段階方
法である。
１」」温度Ｍ 旌」 本方法は第２実施例の方法と類似する。まず抗体で（抗
μ）被覆されたビーズが試験（血清）サンプルからＩｇ
Ｍ全量を取出すのに用いられる。
次に吸着された抗体内に特定の特異性を有する抗体が存
在かが、１ｌ１１連する抗原により被覆されたインジケ
ータラテックス粒子を用いて判定される。
局−の試験で複数の特異性の抗体を検出することが可能
である。そのためにはそれぞれ異なる抗原で被覆された
異なる色のインジケータ粒子が用いられる。例えば患者
のウィルス伯肝炎の原因がＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）
によるのかＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）によるのかを判
定するには、例えばそれぞれ青と黄色に着色されたＨＡ
ＶとＨＢＶのインジケータ粒子を、ＩｇＭ結合ビーズに
添加する。抗ＨＡＶ性１ｇＭが存在するなら、実験終了
時にラテックス浮遊液はもとの浮遊液又は制御浮遊性の
緑色を帯びた色に比べて黄色に見えるようになる。これ
は青いＨＡＶインジケータ粒子が沈澱したビーズに結合
するからである。逆に抗ＨＢＶ性１ｇＭが存在するなら
ラテックス浮遊液は青色を帯びるようになる。
説明のため、マウス血清中の旋毛虫に対する［ｇＭ抵抗
体検出に用いられた本発明の方法について以下説明する
。
圧−恭 精製ヤギ抗μ（マウス）抗体（シグマ）により被覆され
たグイプピーズ（ダイプル、オス口）及び旋毛虫抗原が
共有結合されたラテックス粒子＜　８０Ｏｎ＋％、シグ
マ）が第２実施例の方法の対応する試薬の代わりに用い
られた。その他は説明された手続きと同一であった。
醍−！ 第８図のグラフは提案された方法による特定の１（３Ｍ
検出の結果を示す。結果は波長４００ｎｓに設定された
分光光学計を用いて読取られ、未反応の１１１１１１ラ
テツクス浮遊液における混濁度の百分率として表わされ
ている。混濁度の２０％以上の減少は眼で識別可能であ
る。第８図では９つの血清サンプルの一連の希釈液が試
験により検査された。
８０％の混濁度がカットオフレベルとして用いられる場
合には、試験により６ザンブルが陽性であり、滴定濃度
は１：５０から１　：　　６００にわたった。
これらのサンプルで得られた結果は、エンザイムリンク
ト　イムノソルベント　アッセイにより得られる結果と
高い相関性があった。
第１図及び第２図に示された微小管の組を参照するに、
第１（ａ）図、第１（ｃ）図及び第２図中の小型管の組
は例えば射出成型により一体的ユニットとして形成され
ている。
第１（ｂ）図では個別的な小型管がホルダにより保持又
は固定されている。第２図の実施例では小型管は、中心
が１０１１の間隔で離面され、又約２１の高さを有する
。第２図の小型管の組の幅は１αであり、組のなかの個
々の小型管はそれぞれ広い１１０部から狭い基部へすぼ
まっている。
第３図を参照するに、第３図には本発明による小型管の
組用の単純なホルダ兼混合機が示される。
管ホルダ兼混合機は管がホルダ兼混合機の一端において
振盪される一方、他端が手で保持されるように広範囲の
長さの管の組を（あるいは単一の管でも）保持するよう
設計されている。用いられる原理及び手続は、管の紺で
用いられている原理及び手続に基く。第３図のホルダを
用いる代わりに千ｖＪ混合用の適当なホルダを即製する
ことも講常に容易である６１例えば定規を用いるだけで
もよく、その場合管の組はその端部の一方に単にリップ
で止められる。
本発明のキットは、インジケータとしてやはり粒子を用
いる既存の診断キットと少なくとも次の点で異なる。
１、用いられる反応容器が異なる。個別的な管と異なり
設計された小型管の組が用いられているため、多数の試
験を同時に行ないえ、またその構造により手動攪拌が用
いられる場合に管の内容の効率的な混合が可能となる。
これに対し、従来のキットではスライド又はカード（ス
ライドラテックス凝集試験）又は単一の（大形）管（管
ラテックス凝集試験）が用いられていた。
２　用いられるインキｌベーション状態が異なる。本発
明の方法では管の内容が特定の混合方法（手動）を用い
るか特別に設４された（Ｉ械的）装置を用いるかして少
なくと６１分吋充分に混合されるという必須の段階があ
る。既存の管ラテックス試験は、かかる段階は不用とみ
なして採用していない。これは検定で用いられる試薬粒
子はブラウン運動あるいは熱運動（つまり３７℃のイン
キユベーシヨン）により運動するのに充分寸法が小さい
と考えられていたためである。。
３　本発明の方法のある実施例では、試験リンプルはイ
ンジケータ粒子とともにインＶ１ベーションされる前に
例えば試薬粒子（ダイナビーズ）により前処理される。
この２粒子シス゛アムは以前用いられていなかった。
４、異なる色のインジケータ粒子の組み合わせが用いら
れて色分離に基き結果が得られるということは従来の管
による試験では用いられてぃなかった。スライドラテッ
クス凝集試験では類似の分析り法が用いられてはいたが
、その色分離パターンは提案された管による方法でのパ
ターンとは異なる。反応混合物の色変化に基く方法は、
大形の個別的な管についても単一種類の非ラテックス（
金ゾル）粒子を用いるものが存在するが、その場合の色
変化のメカニズムは２粒子系の場合とは異なる。
以上を要約するに本発明によれば、抗原又は抗体に被覆
され５０乃至１５００ｎｍの直径を有する粒子がインジ
ケータ試薬として用いられて抗体又は抗原が検出される
べき液体サンプルを収容した１組の小形の管に添加され
、管は検出されるべき前記抗体又は抗原がリンプル中に
存在する場合には。
試薬の粒子が変化するよう充分最短１分間完全混合され
つつ囲１ｍ度でインキュベーションされる、液体サンプ
ル中の抗原又は抗体の検出方法が提供される。又本発明
によれば、リンプルを収容する１組の小型の管と、前記
サンプル中の検出さるべき抗原又は抗体にそれぞれ反応
する抗体又は抗原に被覆され５０乃至１５００ｎｍの直
径を有する粒子からなるインジケータ試薬とからなる液
体リンプル中の抗原又は抗体の検出で用いられる診断ｔ
ットが提供される。
【図面の簡単な説明】
第１（ａ）図乃至第１（ｃ）図はそれぞれ本発明による
微小管の組の実施例の正面図及び側面図、第２図は本発
明による微小管の組の別の実施例の正面図、側面図及び
斜視図、第３図は本発明による微小管の組を手動で攪拌
するためのホルダの概略図、第４図は本発明の方法で用
いられる混合器の縦断面図、第５図は提案された直接的
又は競合的方法でｈｃＧ等の抗原を検出する本発明の第
１実施例の方法を説明するためるの図、第６図は提案さ
れた捕獲的方法で便サンプル中のロタウィルス（ＲＶ）
及びレトロウィルス（ＡＶ）を検出する本発明の第２実
施例の方法を説明するための図、第７図は提案された方
法によるＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）及びＢ型肝炎ウィ
ルス（ＨＢＶ）に対する血清１ｑＭ抗体を検出する本発
明の第３実洗例の方法を説明するための図、第８図は第
３実施例の結末を承りグラフであって、提案された方法
法での特異的１（ＩＭの存在に対する血清力ンブルの滴
定を示し、その縦軸を値は未反応制御浮遊液での混濁度
の百分率で表わした反応混合物の混濁度である。 ｆｉｉ？Ｆ出願人　リン　バク　レオン図面の浄書（内
容に変更なし） Ｆ　Ｉ　Ｇ、１α。 ＦＩＧ、１ｂ。 ＦＩＧ、１ｃ。 手続ネｆｔｉ　、ｉＥ−書（方式） 特許庁長官　　古　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 平成元年　特許願　第１８８６６３号 ２、発明の名称 抗原又は抗体の検出方法及び検出用診断キットａ　補正
をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　ホンコン　ユニバーシティ　オブ　ホンコンデバ
〜トメント　オブ　マイクロバイオロジー（番地なし） 氏名　　リン　バク　レオン ４、代理人 ６、　補正の対象 願書及び図面。 ７、　補正の内容 （１）　　ｇｉ占中、優先権番号を別紙のとおり補正す
る。 ■　図面の浄書（内容に変更なし）を別紙のと１１５つ
補充する。 以上

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）抗原又は抗体に被覆され５０乃至１５００ｎｍの
    直径を有する粒子がインジケータ試薬として用いられて
    抗体又は抗原が検出されるべき液体サンプルを収容した
    １組の小形の管に添加され、管は検出されるべき該抗体
    又は抗原がサンプル中に存在する場合には試薬の粒子が
    変化するよう充分最短１分間完全混合されつつ囲繞温度
    でインキユベーシヨンされる、液体サンプル中の抗原又
    は抗体の検出方法。
  2. （２）粒子はラテックス粒子からなることを特徴とする
    請求項１記載の抗原又は抗体の検出方法。
  3. （３）２つ以上の異なる色のラテックス粒子の混合物が
    用いられることを特徴とする請求項２記載の抗原又は抗
    体の検出方法。
  4. （４）サンプルは、インジケータ粒子と異なりインジケ
    ータ粒子から分離可能な第２の種類の粒子により前処理
    されることを特徴とする請求項１記載の抗原又は抗体の
    検出方法。
  5. （５）第２の種類の粒子は磁性を有するか寸法がより大
    きいことによりインジケータから区別されることを特徴
    とする請求項４記載の抗原又は抗体の検出方法。
  6. （６）小形管の組の攪拌は手動で行なわれることを特徴
    とする請求項１記載の抗原又は抗体の検出方法。
  7. （７）手動混合が用いられることを特徴とする請求項６
    記載の抗原又は抗体の検出方法。
  8. （８）小形管の撹拌は機械で行なわれることを特徴とす
    る請求項１記載の抗原又は抗体の検出方法。
  9. （９）小形管の組の撹拌は、水平軸を中心にして振動す
    る腕の端部上で管の組を上下動せしめることで行なわれ
    ることを特徴とする請求項８記載の抗原又は抗体の検出
    方法。
  10. （１０）振動する腕は、水平から少なくとも＋２０°乃
    至少なくとも−２０°の角度範囲にわたって運動するこ
    とを特徴とする請求項９記載の抗原又は抗体の検出方法
    。
  11. （１１）腕は少なくとも毎分５０行程振動することを特
    徴とする請求項９記載の抗原又は抗体の検出方法。
  12. （１２）変化は視覚的に検出されることを特徴とする請
    求項１記載の抗原又は抗体の検出方法。
  13. （１３）変化は、分光測定法、比色定量法、化学ルミネ
    ッセンス及び螢光定量法のいずれかにより検出されるこ
    とを特徴とする請求項１記載の抗原又は抗体の検出方法
    。
  14. （１４）変化は色分離により検出されることを特徴とす
    る請求項１記載の抗原又は抗体の検出方法。
  15. （１５）サンプルを収容する１組の小形の管と、該サン
    プル中の検出されるべき抗原又は抗体にそれぞれ反応す
    る抗体又は抗原に被覆され５０乃至１５００ｎｍの直径
    を有する粒子からなるインジケータ試薬とからなる液体
    サンプル中の抗原又は抗体の検出用診断キット。
  16. （１６）小形管の組は添付図面の第１（ａ）図、第１（
    ｂ）図又は第１（ｃ）図に実質的に示されていることを
    特徴とする請求項１５記載の抗原又は抗体の検出用診断
    キット。
  17. （１７）小形管の組は添付図面の第２図に実質的に示さ
    れていることを特徴とする請求項１５記載の抗原又は抗
    体の検出用診断キット。
  18. （１８）小形管の組内のサンプルを手動混合するための
    装置からなることを特徴とする請求項１５記載の抗原又
    は抗体の検出用診断キット。
  19. （１９）装置は添付図面の第３図に実質的に示されてい
    ることを特徴とする請求項１８記載の抗原又は抗体の検
    出用診断キット。
  20. （２０）小形管の組内のサンプルを混合する機械的混合
    機からなることを特徴とする請求項１４記載の抗原又は
    抗体の検出用診断キット。
  21. （２１）水平軸を中心にして振動する腕と、腕を振動せ
    しめる手段と、腕の先端に配置され小形管の組を保持す
    る手段とからなる、抗原又は抗体の検出方法における小
    形管の撹拌機。
  22. （２２）添付図面の第４図に実質的に示されている、抗
    原又は抗体の検出方法における小形管の組の撹拌機。
JP18866389A 1988-07-21 1989-07-20 抗原又は抗体の検出方法及び検出用診断キット Pending JPH02140667A (ja)

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