KR20230047485A - 코로나 바이러스 현장진료 응집 검정 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 SARS-CoV-2의 신속한 검출을 위한 시약 및 방법을 제공한다. 검정은 현장진료 또는 실험실 환경에서 구현될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 8월 14일에 출원된 미국 가특허 출원 63/065,993의 이익을 주장하며, 이는 전체가 참조로 본원에 포함된다.
배경
개체의 바이러스 감염을 검출하기 위해 이용되어온 많은 검정 기술이 있다. COVID-19의 원인제인 SARS-CoV-2에 대한 다양한 검정이 개발되었고 개발 중이지만, 이들 중 다수는 실험실, 복잡한 장비, 전문 교육을 받은 인력 및 검정을 수행하는 데 상당한 시간이 필요하다. 이러한 요구 사항은 공개 모임에서 잠재적으로 COVID-19를 전파할 수 있는 감염된 개체를 신속하게 식별하기 위한 이러한 검정의 유용성을 제한한다.
COVID-19의 원인제인 SARS-CoV-2 바이러스의 검출 및/또는 정량을 위한 현장진료(point-of-care: POC) 검정이 필요하다. 잠재적으로 감염된 개체가 마주칠 수 있는 곳이면 어디에서나 수행될 수 있고 검정이 몇 분(예컨데, 5분) 내에 완료될 수 있고 시각적으로 검출 가능한 결과를 생성할 수 있는 신속한 POC 검정을 위한 시약 및 방법이 본원에 개시된다. 이 검정에는 시험 대상체로부터의 타액 샘플만 필요하다.
추가 실시양태에서, 검정 절차는 고처리량을 가능하게 하기 위해, 예컨대 96웰 플레이트에서 다중 샘플이 병렬로 처리되는 임상 실험실에서 사용하기 위해 조정될 수 있다. 이들 실시양태의 한 측면에서, 샘플 내의 바이러스의 양이 정량화될 수 있다.
개시된 검정은 SARS-CoV-2의 존재 시 응집(agglutination)을 수행하는 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체로 코팅된 비드를 사용한다. 일부 실시양태에서, 항체는 SARS-CoV-2의 S1 또는 S2 스파이크 단백질을 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체는 S1 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)을 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체는 S1 스파이크 단백질의 N-말단 도메인(NTD)을 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체는 중화 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체에 의해 인식되는 표면 항원은 헤마글루티닌 단백질, 엔벨로프(E) 단백질의 매트릭스(M) 단백질이다. 일부 실시양태에서, 중화 항체는 경쟁적 ELISA에 의해 3-4 nM의 IC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 비드는 라텍스 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 실시양태에서, 비드는 어둡거나 강렬한 색상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 비드는 형광성이다. 일부 실시양태에서, 비드는 루시퍼라제 또는 다른 발광 발생제로 태그처리된다. 또 다른 실시양태에서, 비드는 임의의 다른 시각적으로 또는 분광광도적으로 검출 가능한 신호 발생제로 태그처리된다.
일부 실시양태에서, 비드는 1.3 내지 1.9 μm 또는 약 0.55 μm 내지 약 2.7 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비드는 약 550 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비드는 약 1.6 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비드는 약 2.7 μm의 직경을 갖는다. 이러한 직경 크기는 스트렙타비딘, 항체 또는 다른 코팅 또는 변형을 추가하기 전의 비드 직경을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 비드는 스트렙타비딘화된다. 일부 실시양태에서, 비드는 카르복시 비드이고, 스트렙타비딘은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 화학을 이용하여 비드에 공유적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 항체는 비오티닐화되고, 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 스트렙타비딘화된 비드 상에 코팅된다. 일부 실시양태에서, 항체 코팅은 25 내지 35 μg의 항체/비드 mg을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 코팅은 30 μg의 항체/비드 mg을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-SARS-CoV-2 항체는 스트렙타비딘이 아닌 또 다른 친화성 시약으로 비드에 접합된다. 다양한 실시양태에서, 접합 친화성 시약은 항-SARS-CoV-2 항체의 특성 및 이것이 변형되었을 수 있는 것에 따라 단백질 A, 단백질 G, 및 항-Fc 항체, 항-종 Ig 항체(예컨대, 염소 항-토끼 Ig 또는 토끼 항-마우스 Ig), 또는 항-표지 항체(예컨대, 비오틴, 플루오레세인, 덱스트란 등을 인식하는 항체)이다.
일부 실시양태에서, 항체는 EDC 화학을 이용하여 카르복시 비드에 직접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 항체는 토실 활성화된 비드 또는 에폭시 활성화된 비드에 직접적으로 부착된다.
기본 검정 절차는 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드를 SARS-CoV-2 감염에 대해 시험할 대상체로부터의 타액 샘플과 조합하는 단계; 비드 및 타액 샘플을 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및 응집이 발생했는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 약 5분 동안이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 실온에서 수행된다. 다른 실시양태에서 인큐베이션은 37℃에서 수행된다.
기본 검정 절차의 변형에서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드는 다중웰 플레이트에서 SARS-CoV-2 감염에 대해 시험될 대상체의 타액 샘플과 조합되고; 비드는 실온에서 1 내지 10분(예컨대, 5분) 동안 인큐베이션되고; 플레이트는 소정의 시간 간격 동안 플레이트 진탕기에 배치된다. 일부 실시양태에서, 간격은 5분이다. 일부 실시양태에서, 진탕기는 실온에 있는다. 다른 실시양태에서, 플레이트 진탕기는 37℃에 있는다. 일부 실시양태에서, 선형 진탕 동작이 이용된다. 일부 실시양태에서, 진탕은 빠르며, 예컨대 약 1000 사이클/분이다.
일부 실시양태에서, 타액 샘플은 구강 린스액에 포함된다. 구강 린스액은 식염수, 예컨대 0.9% 식염수 용액으로 스위싱 및 가글링하고 수집 용기에 뱉음으로써 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 린스를 위해 5 mL의 식염수 용액이 사용된다. 일부 실시양태에서, 스위싱 및 가글링은 30초 동안 진행된다.
대안적으로, 일부 실시양태에서, 비강 면봉 또는 비인두 면봉 검체는 검체에 존재하는 임의의 바이러스를 분산시키기 위해 유체 내 면봉의 교반에 의해 식염수 용액 또는 다른 수송 매질에 수집된다. 또 다른 변형에서, 면봉은 타액 샘플을 함유하는 구강 린스 용액에서 교반되어 어느 하나에 존재하는 바이러스가 검출될 수 있다. 수송 매질은 헹크(Hank)의 균형잡힌 염 용액, 소 혈청 알부민, L-시스테인, 젤라틴, 수크로스, L-글루탐산, HEPES 버퍼, 페놀 레드, 수크로스, 반코마이신, 암포테리신 B 및 콜리스틴으로 이루어진, 바이러스 및 다른 감염성 검체의 수집, 수송, 유지 및 장기 동결 저장을 위한 실온 안정한 바이러스 수송 매질인 UTM®, Universal Transport Medium™(Copan Diagnostics, Inc. Murrieta, CA)일 수 있다. 매질은 등장성이며, 포유동물 숙주 세포에 무독성이다.
일부 실시양태에서, 각각의 개체의 타액 샘플은 검출을 통한 수집과 별도로 처리된다. 일부 실시양태에서, 다수의 개체로부터의 혼합물 또는 이의 분취물은 혼합 또는 인큐베이션 단계 후에 다중웰 플레이트의 별도의 웰로 이송되고, 검출은 마이크로플레이트 판독기 또는 마이크로어레이 디지털 판독기에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 단계 후 이송 단계 전에 점성화제가 혼합물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 점성화제는 FICOLL이다.
일부 실시양태에서, 공지된 양의 바이러스, 예컨대 일련의 희석물은 개체의 타액 샘플 내의 바이러스의 양이 정량화될 수 있는 검량 곡선을 생성하기 위해 검정된다.
일부 실시양태에서, 검정은 정성적이며, 비리온의 존재와 부재를 구별하지만, 존재하는 비리온의 수에 대한 정량화를 제공하지는 않는다. 일부 실시양태에서, 정성 검정은 밀리리터당 적어도 100개의 비리온을 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정성 검정은 밀리리터당 적어도 10개의 비리온을 검출할 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2에 대해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 양성(왼쪽) 또는 PCR 음성(오른쪽)인 검정된 타액 샘플을 표시한다. 비드 기반 응집은 왼쪽 바이알(바이러스 함유 샘플)에서 명확하게 볼 수 있는 반면, 오른쪽 바이알(바이러스가 없는 샘플)에서는 비드 응집이 관찰되지 않는다.
도 2a-d는 RBD 폴리펩티드가 바이오-층 간섭계 센서 상에 고정된 항체에 결합하고 항체로부터 해리될 때 간섭의 변화(나노미터 단위)를 도시한다. 0초에서의 수직 점선은 바이오센서가 RBD 폴리펩티드 용액에 담긴 시간을 나타내고, 240초에서의 수직 점선은 바이오센서가 RBD 폴리펩티드 용액에서 제거되어 버퍼에 담긴 시간을 나타낸다. 각각의 플롯은 3쌍의 추적을 보여준다. 각각의 쌍은 실제 데이터 및 동역학 상수(KD, Ka 및 Kd)가 유도된 피팅 곡선을 나타낸다. 여러 쌍의 경우, 데이터 및 피팅에 대한 추적을 구별할 수 없었다. 각각의 플롯에서, 최상단 추적은 100 nM RBD 폴리펩티드에 대한 것이고, 중간 추적은 10 nM RBD 폴리펩티드에 대한 것이고, 하단 추적은 0 nm RBD 폴리펩티드에 대한 것이다. 도 2a - Ty1; 도 2b - MM57; 도 2c - R001; 및 도 2d - MM43
도 3은 실시예 5로부터의 SARS-CoV-2 음성(상단) 및 양성(하단) 샘플과 함께 인큐베이션된 Ty1 코팅된 550 nm 비드에 대한 응집 반응의 이미지를 보여준다.
도 4는 실시예 5로부터의 SARS-CoV-2 음성(상단) 및 양성(하단) 샘플과 함께 인큐베이션된 R001 코팅된 2.7 μm 비드에 대한 응집 반응의 이미지를 보여준다.
도 5는 실시예 6에 기재된 응집 반응의 이미지를 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 비드 단독, 음성 샘플 + 100 μL의 비드, 100 μL의 양성 샘플 + 50 μL의 비드, 100 μL의 양성 샘플 + 100 μL의 비드 및 100 μL의 양성 샘플 + 200 μL의 비드의 5개 이미지가 있다.
도 6a-b는 실시예 7에 기재된 응집 반응의 이미지를 보여준다. 4개의 웰의 어레이가 보여진다. 위쪽 웰은 음성 샘플을 함유하고 아래쪽 웰은 양성 샘플을 함유한다. 왼쪽 쌍의 웰은 2:1 비율의 비드 대 샘플을 사용하여 응집 반응을 유지하고 오른쪽 쌍의 웰은 1:1 비율의 비드 대 샘플을 사용하여 응집 반응을 유지한다. 도 6a는 미가공 이미지를 보여주고, 도 6b는 처리 후 동일한 이미지를 보여준다.
도 7은 실시예 8에 기재된 비드 희석 응집 검정으로부터의 이미지를 보여준다. 희석은 100:75:50:25:10:0의 비율로 왼쪽에서 오른쪽으로 진행된다. 위쪽 행은 음성 샘플을 받았고 아래쪽 행은 양성 샘플을 받았다.
도 8은 SARS-CoV-2 응집 검정을 수행하기 위한 현장진료 장치의 다이어그램이다.
도 9a-b. 스마트폰 기반 현장진료 SARS-CoV-2 응집 검정을 위한 시험 카드는 9a에 도시된다. 시험 카드는 시험 챔버의 적절한 위치 매김를 보여주고 이미지 캡처를 위한 적절한 배경을 제공한다. 도 9b는 이미지 판독 스마트폰 앱으로부터의 목업(mock-up) 결과 화면을 도시한다.
도 10a-c는 SARS-CoV-2 검정 결과를 보여준다. 도 10a는 감염된 사람 및 감염되지 않은 사람으로부터의 타액 샘플, 적정된 비리온, 및 식염수로부터의 객체 합 면적(object sum area: OSA) 뿐만 아니라, 15분 종점에서 3개의 음성 샘플의 평균 대비 각각의 양성 샘플에 대한 신호 대 잡음비(S/N) 및 0 내지 3분에 걸친 기울기에 대해 보고한다. 도 10b는 0 내지 3분에 걸쳐 판독되는 비리온 수 대 덩어리 수의 플롯이다. 도 10c는 15분에 판독되는 비리온 수 대 덩어리 수의 플롯이다. 10b-c는 3개의 음성 샘플(Δ)과 비리온의 연속 희석(●)만 플로팅한다.
도 11은 완전한 응집 시험 과정의 한 실시양태의 개요를 나타낸다.
도 12는 특정 실시양태에서 시험될 식염수 구강 린스를 수집하기 위한 타액 장치를 도시한다.
도 13a-b는 OSA 변화의 기울기에 의해 해석된 응집 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 13a는 샘플 번호로 표지된 시험된 각각의 샘플에 대해 시간에 따른 OSA를 플로팅한다. 도 13b는 각각의 샘플의 이미지를 나타낸다. 샘플 번호 및 설명은 표 4를 참조한다.
도 2a-d는 RBD 폴리펩티드가 바이오-층 간섭계 센서 상에 고정된 항체에 결합하고 항체로부터 해리될 때 간섭의 변화(나노미터 단위)를 도시한다. 0초에서의 수직 점선은 바이오센서가 RBD 폴리펩티드 용액에 담긴 시간을 나타내고, 240초에서의 수직 점선은 바이오센서가 RBD 폴리펩티드 용액에서 제거되어 버퍼에 담긴 시간을 나타낸다. 각각의 플롯은 3쌍의 추적을 보여준다. 각각의 쌍은 실제 데이터 및 동역학 상수(KD, Ka 및 Kd)가 유도된 피팅 곡선을 나타낸다. 여러 쌍의 경우, 데이터 및 피팅에 대한 추적을 구별할 수 없었다. 각각의 플롯에서, 최상단 추적은 100 nM RBD 폴리펩티드에 대한 것이고, 중간 추적은 10 nM RBD 폴리펩티드에 대한 것이고, 하단 추적은 0 nm RBD 폴리펩티드에 대한 것이다. 도 2a - Ty1; 도 2b - MM57; 도 2c - R001; 및 도 2d - MM43
도 3은 실시예 5로부터의 SARS-CoV-2 음성(상단) 및 양성(하단) 샘플과 함께 인큐베이션된 Ty1 코팅된 550 nm 비드에 대한 응집 반응의 이미지를 보여준다.
도 4는 실시예 5로부터의 SARS-CoV-2 음성(상단) 및 양성(하단) 샘플과 함께 인큐베이션된 R001 코팅된 2.7 μm 비드에 대한 응집 반응의 이미지를 보여준다.
도 5는 실시예 6에 기재된 응집 반응의 이미지를 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 비드 단독, 음성 샘플 + 100 μL의 비드, 100 μL의 양성 샘플 + 50 μL의 비드, 100 μL의 양성 샘플 + 100 μL의 비드 및 100 μL의 양성 샘플 + 200 μL의 비드의 5개 이미지가 있다.
도 6a-b는 실시예 7에 기재된 응집 반응의 이미지를 보여준다. 4개의 웰의 어레이가 보여진다. 위쪽 웰은 음성 샘플을 함유하고 아래쪽 웰은 양성 샘플을 함유한다. 왼쪽 쌍의 웰은 2:1 비율의 비드 대 샘플을 사용하여 응집 반응을 유지하고 오른쪽 쌍의 웰은 1:1 비율의 비드 대 샘플을 사용하여 응집 반응을 유지한다. 도 6a는 미가공 이미지를 보여주고, 도 6b는 처리 후 동일한 이미지를 보여준다.
도 7은 실시예 8에 기재된 비드 희석 응집 검정으로부터의 이미지를 보여준다. 희석은 100:75:50:25:10:0의 비율로 왼쪽에서 오른쪽으로 진행된다. 위쪽 행은 음성 샘플을 받았고 아래쪽 행은 양성 샘플을 받았다.
도 8은 SARS-CoV-2 응집 검정을 수행하기 위한 현장진료 장치의 다이어그램이다.
도 9a-b. 스마트폰 기반 현장진료 SARS-CoV-2 응집 검정을 위한 시험 카드는 9a에 도시된다. 시험 카드는 시험 챔버의 적절한 위치 매김를 보여주고 이미지 캡처를 위한 적절한 배경을 제공한다. 도 9b는 이미지 판독 스마트폰 앱으로부터의 목업(mock-up) 결과 화면을 도시한다.
도 10a-c는 SARS-CoV-2 검정 결과를 보여준다. 도 10a는 감염된 사람 및 감염되지 않은 사람으로부터의 타액 샘플, 적정된 비리온, 및 식염수로부터의 객체 합 면적(object sum area: OSA) 뿐만 아니라, 15분 종점에서 3개의 음성 샘플의 평균 대비 각각의 양성 샘플에 대한 신호 대 잡음비(S/N) 및 0 내지 3분에 걸친 기울기에 대해 보고한다. 도 10b는 0 내지 3분에 걸쳐 판독되는 비리온 수 대 덩어리 수의 플롯이다. 도 10c는 15분에 판독되는 비리온 수 대 덩어리 수의 플롯이다. 10b-c는 3개의 음성 샘플(Δ)과 비리온의 연속 희석(●)만 플로팅한다.
도 11은 완전한 응집 시험 과정의 한 실시양태의 개요를 나타낸다.
도 12는 특정 실시양태에서 시험될 식염수 구강 린스를 수집하기 위한 타액 장치를 도시한다.
도 13a-b는 OSA 변화의 기울기에 의해 해석된 응집 검정으로부터의 결과를 나타낸다. 도 13a는 샘플 번호로 표지된 시험된 각각의 샘플에 대해 시간에 따른 OSA를 플로팅한다. 도 13b는 각각의 샘플의 이미지를 나타낸다. 샘플 번호 및 설명은 표 4를 참조한다.
바이러스 입자와 같은 다가 분석물을 검출하거나 정량화하는 간단한 기술 중 하나는 응집이다. 응집은 전형적으로 항체-항원 결합에 따라 입자가 함께 덩어리지는 것을 수반한다. 응집 기반 검정의 전형적인 예로는 ABO 혈액 타이핑 및 엡스타인-바 바이러스 감염에 대한 모노스팟 검정이 있다. 반응의 항체 성분이 2개 (또는 그 초과)의 항원 보유 입자 사이에 가교를 형성할 수 있고 각각의 항원 보유 입자가 다수의 다른 입자에 가교될 때 응집이 발생할 수 있다. 항원에 비해 너무 많은 항체가 존재하는 경우, 항체는 항원 보유 입자 상의 모든 결합 부위를 포화시킬 것이므로 효과적으로 가교가 일어나지 않고 응집이 발생하지 않는다. 예컨대, 결합의 기하학적 구조가 하나의 항원 보유 입자에 결합된 항체가 제2 항원 보유 입자에 도달할 수 없도록 하는 경우 또는 결합 동역학이 항체(예컨대, 2가 항체라고 가정)의 결합 부위 둘 다가 동일한 항원 보유 입자와 관계를 맺도록 하는 경우, 입체적 인자는 또한 응집을 방해할 수 있다. 이와 같은 입체적 인자는 종종 비드에 항체를 부착하여 원자가, 범위 및 위치 다양성을 효과적으로 증가시킴으로써 극복될 수 있다.
항체를 비드에 부착시키는 것은 또한 추가 문제를 다룬다. 바이러스 입자 및 항체 분자는 매우 작아 응집이 발생하더라도 응집(덩어리)이 시각적으로 관찰되지 않을 수 있다. 육안으로 보이는 비드에 항체를 부착함으로써 적어도 응집되었을 때 성공적인 응집 반응을 눈 (또는 카메라)으로 검출할 수 있다.
이 응집 방법은 비리온은 검출하지만 비리온으로부터 해리된 RNA 또는 항원은 검출하지 않는다. 응집은 신선한 타액 샘플, 구강 식염수 린스 샘플 또는 면봉/구강 식염수 린스 샘플과 같은 무손상 비리온 샘플 뿐만 아니라 감마선 조사 타액 기반 샘플에서 가장 잘 발생한다. 열 불활성화는 손상된 비리온 또는 비리온 단편에 대한 응집 효율을 감소시킬 일부 비리온에 대한 비리온 구조를 변성시키거나 파괴할 수 있다. 응집은 실질적으로 무손상 비리온에 의존하기 때문에, 감염이 해결된 후 잔류 항원 및 RNA로 인해 발생하는 위양성 시험이 덜 발생할 것이다. 이는 무손상 비리온과 연관되어 있는지의 여부에 관계없이 각각 항원 및 RNA를 검출하는 ELISA 및 PCR 기반 시험과 대조된다.
특정 실시양태에서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체는 비오티닐화되고, 스트렙타비딘화된 자성 비드와 반응된다. 이러한 특색 중 일부는 편리하지만 필수는 아니다. 비오틴-아비딘 반응은 비드 및 다른 기체에 항체를 부착하는 데 널리 사용되고, 반응이 잘 이해되며, 필요한 시약은 쉽게 이용 가능하다. 그럼에도 불구하고, 비드에 항체를 부착하기 위한 다른 화학이 공지되어 있고 이용될 수 있다. 유사하게, 자성 비드는 처리하기 쉬울 수 있지만, 본원에 개시된 일반적인 검정 프로토콜은 자성을 이용하지 않는다. 그러나, 자성 비드는 전형적으로 철을 함유하고, 시각적 검출을 용이하게 하는 짙은 갈색을 띤다. 비자성 비드도 사용될 수 있지만, 시각적 검출이 용이할 어둡고/거나 강렬한 색상이어야 한다. 갈색 외에도 검정색 및 파란색, 녹색, 빨간색 및 보라색의 어두운 색조는 적합한 반면, 흰색, 노란색 및 황갈색은 덜 선호된다. 라텍스 비드는 종종 응집 검정에 사용되었으며, 다양한 색상으로 이용 가능하다.
특정 실시양태에서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인에 결합하는 중화 항체이다. 항체의 중화 활성은 검정에 필수적인 것은 아니다. 바이러스 입자 상의 다가 부위에 결합하는 임의의 항체가 잠재적으로 유용하다. 그러나, 수용체 결합 도메인은 접근 가능하고 잘 보존된 부위이므로 본 목적에 매우 적합하다. 마우스 및 토끼로부터 중화 모노클로날 항체를 포함한 SARS-CoV-2 S1 및 S2 스파이크 단백질 및 수용체 결합 도메인을 인식하는 모노클로날 항체는 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하다. 알파카로부터 중화 단일 도메인 항체 단편이 또한 생성되었다(Hanke et al., bioRxiv 2020.06.02.130161, 이는 전체가 본원에 참조로 포함됨). 이러한 항체 단편(나노바디)은 1가 이지만, 그럼에도 불구하고 비드가 다가일 것이기 때문에 비드에 부착될 때 응집 검정에 사용하기에 적합하다.
알파카 나노바디(Ty1)는 여러 이점을 제공한다. 나노바디는 소타제 A(Sortase A)를 사용하여 C-말단에서 효소적으로 비오티닐화되고, 이는 바이러스 결합에 최적인 비드에서 빗나가는 항원 결합 부위를 갖는 비드에 대한 나노바디의 일관된 배향을 보장한다. 이는 항체가 다양한 배향으로 비드에 부착되는 무작위로 비오티닐화된 항체와 대조되며, 이 중 일부는 입체적으로 방해될 것이다. Ty1은 또한 "위쪽" 및 "아래쪽" 입체형태(각각 "개방" 및 "폐쇄" 입체형태라고도 함) 모두에서 RBD를 인식할 수 있다. 나노바디의 작은 크기(단지 12.5 kD)는 나노바디가 하나의 스파이크 단백질의 3개의 S1 프로토머 각각에서 RBD에 결합할 수 있게 한다. 나노바디의 작은 크기는 또한 전체 크기 항체보다 더 많은 바이러스 결합 부위가 비드를 코팅하는 항체 mg당 존재한다는 것을 의미한다.
항체 친화도는 또한 응집 시약으로 사용할 항체를 선택할 때 고려해야 할 중요한 파라미터이며, 더 높은 친화도는 더 강력한 응집과 관련이 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 생물층 간섭계에 의해 포스페이트 완충된 식염수(PBS)에서 측정할 때 2.5, 5.0, 7.5, 9.0 또는 9.5보다 큰 KD를 갖는다. 다양한 실시양태에서, KD는 2.5, 5.0, 7.5, 9.0, 또는 9.5 내지 10의 범위이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 2.8이다. 일부 실시양태에서, KD는 약 9.9이다.
특정 실시양태에서, 유리 카르복실레이트기를 갖는 자성 비드(카르복시 비드)는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 화학을 이용하여 스트렙타비딘에 공유적으로 연결되고, 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단 및 스트리핑된다. 이어서, SARS-CoV-2를 인식하는 비오티닐화된 항체가 비오틴-스트렙타비딘 결합을 이용하여 부착된다. 이 단계에 대한 절차 및 변형은 당업계에 공지되어 있다(예컨대 PCT/US2020/039503 참조, 이는 스트렙타비딘으로 코팅된 비드의 제조 및 사용 및 비오티닐화된 분자의 부착에 대해 교시하는 모든 내용에 대해 본원에 참조로 포함됨). 스트렙타비딘 코팅된 비드 및 후속 비오틴-항체 코팅된 스트렙타비딘 비드는 모두 결합 표면적을 최대화하기 위해 단분산인 것이 바람직하며, 검정은 비드 집합(aggregation)/응집을 기반으로 한다. 활발한 비드 혼합, 전단 혼합 및 음파 처리를 사용하여 비드가 혼합되고 균질하고 단분산되도록 할 수 있다. 단분산 비드(비집합된 비드)는 바이러스 표적의 부재 하에서 비드가 집합되거나 응집되지 않아야 하므로 PCR 음성 타액 샘플로 최적의 대조 결과를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체는 EDC 화학을 이용하여 카르복시 비드에 직접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 항체는 토실 활성화된 비드 또는 에폭시 활성화된 비드에 직접적으로 부착된다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 협조된 화학 결합을 이용하여 비공유적으로 비드에 코팅된다.
스트렙타비딘을 사용하는 실시양태는 본 개시내용 전반에 걸쳐 기재되어 있다. 그러나, 아비딘, 탈글리코실화된 아비딘(뉴트라비딘), 캡타비딘, 단량체성 아비딘과 같은 대안을 포함하는 추가 실시양태가 또한 고려된다. 스트렙타비딘의 천연 및 재조합 버전 및 이의 대안이 또한 고려된다. 이들 시약은 비오틴 결합을 위한 수단으로 지칭될 수 있다.
스트렙타비딘 또는 이의 유사체 대신에, 다른 친화성 시약이 비드에 부착되고 항-SARS-CoV-2 항체의 접합에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합 친화성 시약은 항-비오틴 항체이고 비오티닐화된 항-SARS-CoV-2 항체를 접합시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합 친화성 시약은 플루오레세인, 덱스트란, His-태그 등과 같은 표지를 인식하고, 플루오레세인화, 덱스트란-변형, His-태그 부착 또는 달리 표지된 항-SARS-CoV-2 항체를 각각 접합시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합 친화성 시약은 단백질 A, 단백질 G 또는 항-Fc 항체와 같은 항체의 Fc 영역을 인식하고, Fc 영역을 포함하는 항-SARS-CoV-2 항체를 접합시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합 친화성 시약은 면역글로불린(Ig), 예컨대 염소 항-토끼 Ig 항체 또는 토끼 항-마우스 Ig 항체에서 종-특이적 에피토프를 인식하는 항체이며, 각각 토끼 또는 마우스 항체인 항-SARS-CoV-2 항체를 접합시킬 수 있다.
다양한 크기의 비드가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 약 500 nm 내지 약 2.7 μm, 또는 약 1.3 내지 약 1.9 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비드는 1.6 μm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비드는 2.7 μm의 직경을 갖는다. 비드 크기는 침전 시간에 영향을 줄 수 있으며, 더 큰 비드가 더 빨리 침전된다. 100-200 μL의 액체(점성화제 없음)를 함유하는 평평한 바닥 96웰 플레이트에서, 2.7 μm 비드의 침전은 약 3분에 완료될 수 있고, 1.6 μm 비드의 침전은 약 5분에 완료될 수 있다. 550 nm 비드는 침전하는 데 더 오래 걸릴 수 있다. 그러나, 비드가 응집/집합함에 따라 이들은 매우 큰 덩어리가 되어 단분산 비드에 비해 응집체의 침전 시간을 감소시킬 수 있다.
비드는 다양한 양의 항체로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드는 약 10 내지 약 50 μg의 항체/mg의 비드, 또는 약 25 내지 약 35 μg의 항체/비드 mg을 함유한다. 일부 실시양태에서, 비드는 30 μg의 항체/비드 mg을 함유한다.
일부 실시양태에서, 검정할 타액 샘플을 수득하기 위해, 구강을 식염수로 세정하고, 린스액을 수집하여(스위싱 및 뱉음) 구강 린스액을 수득한다. 일부 실시양태에서, 5 mL의 식염수 용액을 세게 스위싱하고 30초 동안 가글링한 다음 수집 용기, 예컨대 깔때기 수집 튜브로 뱉어낸다. (오랄 DNA 랩스(OralDNA Labs)로부터의 범용 구강 린스 수집 키트가 이 목적에 적합함; 도 12).
일부 실시양태에서, 그러나 수득된 타액 샘플은 세포 물질을 제거하기 위해 원심분리된다.
검정을 수행하기 위해, 비드 현탁액을 타액 샘플에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 타액 샘플은 구강 린스액에 포함된다. 일부 실시양태에서 성분은 항-SARS-CoV-2 항체 코팅된 비드의 1 mg/mL 현탁액을 사용하여 1:2 비드:타액 샘플의 비율로 조합된다. 이들 실시양태의 측면에서, 비드 현탁액의 농도는 원하는 총 반응 부피 및 타액 샘플로 인한 희석 인수에 따라 1 mg/ml보다 높거나 낮을 수 있다. 일부 실시양태에서, 0.5 ml의 비드 현탁액이 1 ml의 타액 샘플(예컨대, 구강 린스액)에 첨가된다. 다른 실시양태는 다른 비드:샘플 비율 및 비드 농도를 사용한다(실시예 6 및 8 참조). 조합된 비드 현탁액 및 타액 샘플을 혼합한 다음 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 실온에서 수행된다. 다른 실시양태에서, 인큐베이션은 37℃에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5분 동안, 5분 내지 15분 동안, 2분 동안, 3분 동안, 또는 5분 동안이다. 일부 실시양태에서, 응집 및 침전을 위한 인큐베이션은 단일 단계로 일어난다.
일반적으로, 타액 샘플 부피에 대한 비드(응집 시약)의 최적화된 비율을 유지하는 것이 중요하다. 이는 더 크거나 더 작은 크기의 반응, 예컨대 유리 바이알 대 미세역가 플레이트에서 수행되는 반응에 대해 스케일링될 수 있다. 그러나, 더 큰 부피의 타액 샘플 (및 비례적으로 더 많은 응집 시약)을 사용하면 응집체를 형성하는 더 많은 양의 물질이 있을 것이므로 검출 민감도를 높일 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 자성 비드가 사용될 때, 비드는 현탁 유체로부터 자기적으로 분리된 다음 타액 샘플(구강 린스액)에 재현탁된다. 비드의 최종 농도는 상기에 기재된 것과 유사할 수 있으며, 예컨대 약 0.33 mg 비드/mL이다. 다양한 실시양태에서, 응집 반응에서 비드 농도는 0.1 내지 1.5 mg/mL, 예컨대 0.13, 0.33, 0.5, 0.67, 0.75, 1.0 또는 1.33 mg/mL, 또는 이들 값의 쌍으로 경계를 이루는 임의의 범위일 수 있다. 이어서, 재현탁된 비드는, 일부 실시양태에서, 실온 또는 37℃에서 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5분 동안, 5 내지 15분 동안, 2분 동안, 3분 동안, 또는 5분 동안이며, 이때 응집이 발생한다.
추가의 실시양태에서, 성분의 첨가로 인한 것 외에는 인큐베이션 전에 명백한 혼합이 없다. 추가 실시양태에서, 정적 인큐베이션 후에 진탕기, 예컨대 플레이트 진탕기 상에서의 인큐베이션이 이어진다. 일부 실시양태에서, 진탕 인큐베이션은 실온에서 수행되는 반면, 다른 실시양태에서는 상승된 온도, 예컨대 37℃에서 수행된다. 이들 실시양태 중 일부에서, 진탕 인큐베이션에 앞서, 예컨대 약 1분 또는 약 5분의 정적 인큐베이션이 선행된다. 다른 실시양태에서, 플레이트에 시약 분배를 완료한 후 명시적인 정적 인큐베이션은 없다.
이 응집은 눈에 띄는 이벤트이며, 인간의 시각적 평가부터 완전히 자동화된 고처리량 플레이트 이미저에 이르기까지 다양한 방법으로 판독될 수 있다. 많은 실시양태에서, 이는 응집체의 형성을 (눈으로) 시각적으로 평가하는 것으로 충분하다. 대안적인 실시양태에서, 응집체는 카메라(예컨대, 스마트폰 카메라), 광학 밀도 판독기, 분광광도계, 발광계, 형광계 또는 디지털 유동 셀, 입자 크기 측정기(예컨대, Anton Paar Litesizer 500)으로 검출될 수 있다. 이러한 응집체 검출 방식은 모두 응집 검출 단계로 지칭될 수 있다.
더 높은 처리량 적용을 위해, 응집 반응의 분취량(즉, 비드 및 타액 샘플 혼합물)은 혼합 또는 인큐베이션 단계 후에 다중웰 플레이트, 예컨대 96웰 플레이트의 웰로 이송될 수 있다. 응집체 형성의 검출은 마이크로플레이트 판독기로, 예컨대 광학 밀도에 의해, 또는 마이크로어레이 디지털 판독기로, 이미지 분석에 의해 수행될 수 있다. 이러한 응집체 검출 방식은 응집 검출 단계 또는 응집 검출을 위한 고처리량 단계로 지칭될 수도 있다. 이러한 실시양태에서, 타액 샘플에 존재하는 바이러스의 양이 정량화될 수 있도록 공지된 바이러스 샘플의 일련의 희석물을 검량 곡선으로 포함하는 것도 가능하다.
비드 및 응집체는 둘 다 침전하는 경향을 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 이는 바람직하지 않을 수 있다. 침전을 억제하기 위해, 인큐베이션 단계 후 및 검출 단계 전, 및 이송 단계(사용되는 경우) 전에 응집 반응에 점성화제를 혼합하면서 첨가할 수 있다. 하나의 적합한 점성화제는 FICOLL(중성, 고분지형, 고질량, 친수성 다당류)이다.
마이크로어레이 디지털 판독기는 카메라 기반이며 이미지 분석을 사용한다. 이들은 좁은 초점 깊이를 갖는다. 이는 비록 일부 판독기는 샘플의 여러 지점에서 측정을 수행하지만, 샘플의 전체 깊이를 통해 광선을 통과시키고 광학 밀도, 투과율 또는 흡광도를 측정함으로써 작동하는 마이크로플레이트 판독기와 대조된다. 초점 깊이가 좁기 때문에, 마이크로어레이 디지털 판독기는 웰의 바닥만 볼 수 있고 종종 그러하며, 이 경우 응집체의 침전이 바람직할 것이다. 그러나, 초점 평면을 변경하고 샘플의 전체 깊이를 스캐닝하여 3차원 이미지를 구축하는 것도 가능하다. 이 과정은 전형적으로 플레이트당 1분 이상 걸리지 않는다. 다중 초점 평면을 통해 스캐닝할 때 비드 및 응집체의 침전을 억제하기 위해 점성화제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 비드 및 응집체의 보다 균일한 분포는 또한 마이크로플레이트 판독기를 사용할 때 유리할 수 있으므로, 이러한 실시양태에서도 점성화제가 사용될 수 있다.
일부 마이크로플레이트 판독기는 검출된 피크 및 골의 표면적 또는 부피를 계산할 수 있고 응집을 정량화하는 데 사용할 수 있는 2차원(객체 합 영역) 또는 3차원 프로파일을 생성하기 위해 웰을 가로질러 스캐닝할 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정 결과는 검정을 시작한 후 특정 시점, 예컨대, 2-20분 또는 이 범위 내의 임의의 정수 값, 예컨대 15분에서의 판독값(예컨대, 부피, 표면적 또는 객체 합 면적)을 기반으로 한다. 일부 실시양태에서, 검정 결과는 시간 0에서 2-20분까지의 시간 간격에 걸친 판독의 변화율(기울기) 또는 0 내지 3분과 같은 이 범위 내의 임의의 정수 값을 기반으로 한다.
본원에 기재된 검정은 임의의 목적으로 SARS-CoV-2 감염을 검출하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 속도 및/또는 단순성이 유리하거나 필요한 상황에 매우 적합하다. 예컨대, 이러한 검정은, 예컨대 SARS-CoV-2 감염 후 직장에 복귀하기 전에 홈 스크리닝에 사용될 수 있거나, 또는 학교, 관공서, 예배당, 상점, 스포츠 이벤트, 공항 또는 항공편 등과 같은 임의의 공공 집회 장소에 들어가기 전에 사람을 식별하기 위한 스크리닝에 사용될 수 있다.
자성 비드를 사용하는 경우, PCR에 의한 양성 결과의 확증 시험은 검정된 샘플 자체에서 수행될 수 있다. 바이러스 RNA를 추출하기 위한 시약을 웰 또는 바이알에 첨가하고, 비드를 자기적으로 분리한 다음, 유체를 PCR 반응으로 이송한다. 확증적 PCR 시험은 검출된 바이러스가 교차 반응하는 코로나 바이러스가 아니라 실제로 SARS-CoV-2인지 확인하거나 SARS-CoV-2의 어떤 스트레인이 존재하는지를 식별하는 데에도 사용될 수 있다.
대안적으로, 응집 시약은 타액 내 방해 물질의 존재 또는 잠재적 존재가 문제가 될 때 PCR 시험 전에 타액 샘플을 세척하는 데 사용될 수 있다. 항 SARS-CoV-2 항체 코팅된 자성 비드를 타액 샘플에 첨가하고, 바이러스에 결합하도록 인큐베이션한다. 비드(응집되거나 응집되지 않음)는 자기적으로 분리되고 세척된다. 이어서, 바이러스 RNA를 통상적으로 추출하고, 비드를 다시 자기적으로 분리하고, PCR 분석을 위해 바이러스 RNA 함유 유체를 수집한다.
실시예
다음의 비제한적 실시예는 단지 현재 고려되는 대표적인 실시양태의 보다 완전한 이해를 용이하게 하기 위해 예시의 목적으로 제공된다. 이들 실시예는 본원에 기재된 임의의 실시양태를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
비드 제조
유리 카르복실기를 보유하는 직경 550 nm 및 1.6 μm의 자성 비드를 다음과 같이 공유적으로 결합된 스트렙타비딘으로 코팅하였다:
1. EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드) 화학을 이용하여 스트렙타비딘으로 1.6 um 및 550 nm 카르복시 비드를 코팅하였다.
2. 40 mM MES, pH 5.2는 커플링 버퍼였다.
3. 커플링 동안 비드 1.0 mg당 0.5 mg의 스트렙타비딘을 사용하였다.
4. 비드 1.0 mg당 0.1 mg의 EDC를 첨가하였다(1.6 um 비드에서 COOH mol당 18.6 mol EDC; 550 nm 비드에서 COOH mol당 9 mol EDC). EDC를 40 mM MES 용액(pH 5.2)에 10 mg/mL로 첨가하였다.
5. 반응은 10 mg/mL의 비드 농도에서 수행되었다.
6. EDC 반응은 RT에서 약 12시간 동안 혼합되도록 하였다.
7. 공유적 부착을 보장하기 위해 비드에서 수동적으로 흡착된 스트렙타비딘을 제거하고, 비드에 의한 비특이적 결합을 줄이고 단분산성을 보장하기 위해 폴리머 차단제로 차단하였다.
8. 비드를 10.0 mg/mL 비드 농도에서 트윈-20 및 NaN3(10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, 0.05% NaN3)를 갖는 TBS로 세척하였다.
SARS-CoV2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인을 인식하는 3개의 항-SARS-CoV2 중화 항체를 다음과 같이 비오티닐화하였다:
1. 총 부피 100 μL(항체 100 μg)의 PBS(40 mM Na2HPO4, 10 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 3 mM KCl) pH 8.0에서 3개의 항체를 1 mg/mL로 만들었다.
a. 시노 바이오로지칼(Sino Biological) 카탈로그 번호 40591-MM43 로트 HB14AP2001, 100 μg, PBS 중 1.63 mg/mL(comp. unk.). 제조업자에 의해 보고된 바와 같이, 중화 검정에 의해 1.41 μg/mL 및 ELISA에 의해 0.857 nM의 전형적인 IC50을 갖는 마우스 모노클로날 항체.
b. 시노 바이오로지칼 카탈로그 번호 40592-MM57 로트 HB14AP2002, 100 μg, PBS 중 1.98 mg/mL(comp. unk.). 제조업자에 의해 보고된 바와 같이, 중화 검정에 의한 0.41 μg/mL 및 ELISA에 의해 3.694 nM의 전형적인 IC50을 갖는 마우스 모노클로날 항체.
c. 시노 바이오로지칼 카탈로그 번호 40592-R001 로트 HA14MY2101, 100 μg, PBS 중 5.36 mg/mL(comp. unk.). 제조업자에 의해 보고된 바와 같이, 중화 검정에 의해 0.11 μg/mL 및 ELISA에 의해 0.59 nM의 전형적인 IC50을 갖는 토끼 모노클로날 항체.
2. 퀀타(QUANTA) 비오틴-dPEG4-TFP 에스테르 카탈로그 번호 10009 로트 AF1-A0402-011을 DMSO(LT Baker #9224-01 로트 0000217025)에서 재구성하고 항체 용액에 첨가하였다.
3. 항체에 대한 10X 몰 과량의 비오틴 링커를 사용하였다.
4. 인큐베이션 시간은 회전 혼합기에서 RT에서 2시간이었다.
5. 비오티닐화 항체는 비오티닐화 후 탈염되지 않았다.
6. 비오티닐화 항체를 3가지 크기의 스트렙타비딘 코팅된 비드에 코팅하였다:
a. 550 nm - MM43 항체는 비드 mg당 50 μg 항체로 코팅되었다.
b. 1.6 μm - MM57 항체는 비드 mg당 30 μg 항체로 코팅되었다.
c. 2.7 μm - R001 항체는 비드 mg당 10 μg 항체로 코팅되었다.
550 nm 및 1.6 μm 비드는 상기에 기재된 바와 같이 제조되었다. 2.7 μm 비드는 스트렙타비딘화 형태(Agilent PN 6727-1003; 비드 mg당 2220 피코몰의 결합 용량(비오틴-4-플루오레세인 결합 용량))로 구입되었지만 상기에 기재된 바와 같이 제거되고 차단되었다.
7. 비드를 10 mg/mL의 농도로 코팅하였다.
8. 항체 및 비드의 인큐베이션 시간은 회전 혼합기에서 실온에서 2시간이었다.
9. 비드를 1.0 mg/mL 비드 농도에서 트윈-20 및 NaN3(10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, 0.05% NaN3)을 갖는 TBS로 3회 (자성 분리에 의해) 세척하였다.
실시예 2
응집
30 μg/mg MM57 항체로 코팅된 1.6 μm 직경의 스트렙타비딘화된 자성 비드의 1 mg/mL 현탁액 0.5 mL를 SARS-CoV-2 PCR-양성 및 음성 구강 린스 각각 1 mL에 첨가하였다. 조합된 시약을 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 응집된 비드는 바이러스 양성 샘플에서는 시각적으로 명백했지만, 바이러스 음성 샘플에서는 그렇지 않았다(도 1).
실시예 3
항체 해리 상수의 결정
생물층 간섭계(BLI)를 사용하여 상기에 기재된 바와 같은 4개의 항체: MM57, R001, MM43 및 알파카 유래된 나노바디인 Ty1에 대한 SARS-CoV-2 S1 스파이크 단백질의 RBD 부분과의 결합 친화도를 결정하였다. MM57, R001 및 MM43은 임의의 리신에서 비오티닐화되는 반면, Ty1은 특유한 C-말단 부위에서 비오티닐화되어 부착된 기체에 대해 균일한 배향을 보장하였다.
BLI는 바이오센서 팁 상의 고정화된 단백질의 층 및 내부 기준 층의 2개의 표면에서 반사되는 백색광의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기술이다. 이 경우, 바이오센서 팁을 스트렙타비딘으로 코팅한 다음, 시험될 항체를 스트렙타비딘에 결합시켜 고정화된 단백질의 층을 형성하였다. 바이오센서 팁을 포스페이트 완충된 식염수(PBS) 중의 RBD 폴리펩티드의 100 nM, 10 nM 또는 0 nM 용액에 담그고, RBD 폴리펩티드가 항체에 결합함에 따라 간섭의 변화를 관찰하였다. 포화에 가까워짐에 따라 바이오센서 팁을 버퍼(PBS)에 담그고, 항체가 해리됨에 따라 간섭의 변화를 관찰하였다(도 2a-2d). 이러한 데이터로부터 KD, Ka 및 Kd를 계산하였다(표 1).
실시예 4
나노바디 코팅된 비드를 사용한 SARS-CoV-2 응집
이 실험은 3가지의 상이한 비드 상에 코팅된 Ty1 모노비오티닐화된 나노바디로 수행되었다: JSR Magnosphere™ MS55/카르복실, 스트렙타비딘으로 코팅된 550 nm 비드(비드 크기 1); JSR Magnosphere™ MS160/카르복실, 스트렙타비딘으로 코팅된 1.6 μm 비드(비드 크기 2); 및 에질런트(Agilent) 2.7 um 로드스타(LodeStars) 스트렙타비딘 비드(비드 크기 3). 비드를 상기에 기재된 바와 같이 처리하고, 트리스 완충된 식염수(TBS; 10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈-20, 0.05% NaN3, pH 7.4)에 1 mg/ml로 현탁시켰다.
양성 및 음성 샘플은 구강 린스 및 삽입된 비강 면봉이었다. 바이러스는 60℃에서 10분간 인큐베이션하여 열 불활성화되었다. 이는 부분적으로 바이러스 단백질을 변성시키고, 신선한 환자 샘플과 비교하여 검정의 민감도를 다소 감소시킬 것으로 예상되었다. 양성 및 음성 샘플은 PCR에 의해 검증되었다. PCR 검정에서 검출 한계는 약 15개 비리온/mL이며, 약 38 주기의 주기 시간(Ct)에 해당한다. 음성 샘플은 Ct >40을 갖는다. 이 실험에 사용된 양성 샘플은 27.9의 Ct를 가졌다.
100 μL의 양성 또는 음성 샘플을 개별 바이알에서 3가지 크기 각각의 비드 현탁액 50, 100 또는 200 μL와 조합하였다. 5분 동안 실온 인큐베이션 후, 응집을 육안으로 0 - 응집 없음, 1 - 약간의 응집, 2 - 우수한 응집, 3 - 탁월한 응집의 등급으로 점수화하였다. 이러한 결과는 표 2에 제시된다.
바이알을 무작위로 분류하여 갈색 침전물의 존재 또는 부재에 대해 점수를 매기도록 요청받은 6명의 실험실 기술자 각각에게 제시하였다. 6명 모두 100% 양성 일치 및 100% 음성 일치로 9개의 양성 샘플 및과 3개의 음성 샘플을 쉽게 골라내었다.
실시예 5
다양한 항체 및 비드 크기를 사용한 SARS-CoV-2 응집
이 실험은 실시예 3에서 특징지어진 4개의 항체 각각으로 코팅된 실시예 4에 기재된 바와 같은 3가지의 비드 크기 각각을 비교하였다. 실험은 96웰 플레이트에서 수행되었다. 96웰 플레이트를 TBS에서 0.023% 플루로닉(PLURONIC) F108 및 0.05% 트윈-20과 함께 5분간 인큐베이션하여 바이러스 또는 비드가 웰 표면에 결합하는 것을 차단하도록 전처리한 후, 차단 용액을 흡인하였다.
이어서, 66 μL의 다양한 비드 현탁액(TBS 중 1 mg/mL)을 검은색의 투명하고 평평한 바닥 96웰 플레이트의 웰에 분배하였다. 33 μL의 샘플(0.9% 식염수의 구강 린스 + 삽입된 비강 면봉, 열 불활성화됨)을 비드에 첨가하고, 플레이트를 손으로 부드럽게 와동시켜 혼합하였다. 이 실험에 사용된 양성 샘플은 27.9의 Ct를 가졌다. 비드를 실온에서 인큐베이션하고 침전하도록 하였다(>5분). 웰은 이후에 웰 바닥에 초점을 맞춘 마이크로어레이 판독기로 이미지화되었다.
이 실험에서, Ty1 나노바디는 비드 크기에 대한 민감도가 가장 낮았다. 낮은 친화도 중 하나를 가진 MM43 항체는 지속적으로 성능이 좋지 않았다. SARS-CoV-2 음성 및 양성 샘플과 함께 인큐베이션된, Ty1 코팅된 550 nm 비드 및 R001 코팅된 2.7 μm 비드로부터의 이미지는 각각 도 3 및 도 4에 나타나 있다.
실시예 6
상이한 비드 대 샘플 비율을 사용한 응집
이 실험은 차단된 96웰 플레이트를 사용하여 상기 실시예 5와 유사한 방식으로 Ty-1 코팅된 1.6 μm 비드를 사용하여 수행되었다. 양성 샘플은 열 불활성화되었고, 27.9의 PCT Ct를 가졌다. 5개의 샘플을 제조하였다: 비드 단독; 100 μL 음성 구강 린스 + 100 μL 비드 현탁액(1 mg/mL); 및 100 μL 양성 구강 린스 + 50, 100 또는 200 μL의 비드 현탁액(2:1, 1:1 및 1:2의 샘플 대 비드의 비율(부피:부피)). 웰을 이미지화 하는 데 마이크로어레이 판독기를 사용하였으며, 초점면을 웰의 바닥에 놓고 비드가 완전히 침전된 후 이미지를 촬영하였다. 이미지는 도 5에 나타나 있다.
실시예 7
추가된 진탕 단계를 사용한 응집
이 실험은 차단된 96웰 플레이트에서 Ty1 코팅된 2.7 μm 비드를 사용하여 수행되었다. 양성(27.9의 Ct) 및 음성 샘플은 구강 린스 + 삽입된 비강 면봉이었다. 한 세트의 반응은 66 μL의 비드(TBS 중 1 mg/mL) 및 33 μL의 샘플을 2:1 비율로 사용하였고, 제2 세트는 각각 50 μL를 1:1 비율로 사용하였다. 반응물은 37℃에서 5분 동안 플레이트 진탕기에 넣기 전에 약 1분 동안 인큐베이션되었다. 진탕기는 약 1000회 주기/분의 선형 진탕으로 설정되었다. 플레이트를 꺼내고, 플레이트를 아래로부터 조명을 비추면서 외부 15x 확대 렌즈가 장착된 스마트폰 카메라를 사용하여 위에서부터 이미지화하였다. 응집체는 웰의 중앙 근처에 어두운 띠를 형성한다. 이미지 처리를 이용하여 양성과 음성의 차이를 더욱 뚜렷하게 만들 수 있다. 도 6a 및 6b를 참조한다.
실시예 8
응집 반응에서 비드 농도의 적정
이 실험은 차단된 96웰 플레이트에서 R001 코팅된 2.7 μm 비드를 사용하여 수행되었다. 양성 및 음성 샘플은 구강 린스 + 삽입된 비강 면봉이었고, 양성 샘플은 25.92의 PCR Ct를 가졌다. 비드 함량 비율이 100:75:50:25:10:0인 6가지 농도의 비드 희석 시리즈를 사용하였다. 가장 높은 농도의 비드를 갖는 웰은 TBS에서 66 μL의 2 mg/mL 현탁액을 받았고, 희석 시리즈의 각각의 연속적인 웰은 비례적으로 더 적은 부피를 받았다. 부족한 부피는 0.9% 식염수 희석제(구강 린스 용액과 동일)로 보충하였다. 각각의 웰은 희석제, 99 μL의 샘플, 및 비드를 순서대로 받았다. 반응은 상기와 같이 차단되고 평평하고 투명한 바닥의 검은색 96웰 플레이트에 준비되었다. 시약을 첨가한 후, 플레이트를 혼합하지 않고 5분 동안 방치한 다음, 37℃에서 5분 동안 플레이트 진탕기에 두었다. 진탕기는 약 1000회 주기/분의 선형 진탕으로 설정되었다. 이어서, 플레이트를 플레이트 진탕기에서 꺼내고, 스마트폰으로 이미지를 얻었다(도 7 참조). 가장 높은 비드 농도에서는 양성 샘플과 음성 샘플 사이에 상대적으로 약간의 차이가 있지만, 비드 농도가 감소함에 따라 양성 웰의 중앙에 점점 더 뚜렷한 밴드가 형성되는 반면, 음성 웰에서는 비드가 확산되고 다소 원형 패턴이 유지된다.
실시예 9
SARS-CoV-2 응집 검정을 위한 현장진료 장치
샘플 취급 및 조작을 최소화하기 위한 현장진료 장치가 도 8에 나와 있다.
구강 린스 (또는 유사한 샘플)가 식염수 린스 저장소에 첨가되고, 플런저를 누르면 샘플이 혼합되고 리딩 필 챔버에 수집된다. 샘플 또는 검정 시약의 다른 조작은 필요하지 않다. 응집은 시각적으로 또는 스마트폰 카메라 및 앱으로 평가된다.
장치는 실린더 및 미세유체 모듈을 포함한다. 실린더는 플런저를 함유하고, 3개의 공간과 4개의 채널을 포함한다. 플런저 헤드 위의 실린더의 내부 부피는 샘플을 받는 식염수 린스 저장소를 구성한다. 플런저 헤드 아래 실린더의 내부 부피는 변형 가능한 플라스틱 또는 Mylar® 필름에 의해 둘로 나뉜다. 공간 중 하나는 항-RBD 항체 코팅된 비드의 현탁액을 함유하는 비드 챔버를 구성한다. 다른 공간은 식염수 측정 챔버이다. 이의 부피는 식염수 저장소의 부피 및 샘플의 예상된 부피보다 적다. 채널(실린더 왼쪽면에 도시됨)을 통해 샘플이 식염수 린스 저장소에서 식염수 측정 챔버로 배출되고 환기 채널(도시되지 않음)을 통해 공기가 빠져나갈 수 있다. 식염수 측정 챔버를 채우면 사용자가 샘플을 측정하거나 이송시킬 필요 없이 고정된 양의 샘플이 수득될 수 있다. 각각의 챔버의 채널은 미세유체 모듈의 유체 혼합 경로로 이어진다. 두 채널은 유체 혼합 경로에 연결하기 전에 임의적으로 인라인 혼합기(도시되지 않음)에서 만날 수 있다. 리딩 필 챔버에는 오버필 밸브가 장착되어 챔버가 채워질 때 공기는 빠져나가지만 액체는 챔버에서 빠져 나가는 것은 방지할 수 있다. 리딩 필 챔버의 상단은 투명하고, 예컨대 얇고 투명한 광학 폴리스티렌이어서, 응집체 형성의 유무를 관찰 및/또는 사진으로 찍을 수 있다. 리딩 필 챔버의 바닥은 상단과 같이 투명할 수 있으며, 이 경우 장치는 판독(사진 촬영)되도록 밝은 색상의 배경에 놓아야 한다. 대안적으로, 바닥이 불투명한 흰색 착색된 플라스틱일 수 있다.
식염수 측정 챔버를 채우기에 충분한 샘플이 배출되면 플런저를 누를 수 있다. 플런저를 누르면 챔버 내의 비드 현탁액 및 샘플을 유지하는 밀봉재가 파손되고, T-정션, 인라인 혼합기(존재하는 경우) 및 유체 혼합 경로를 통해 실린더 바닥의 채널을 통해서 리딩 필 챔버로 두 유체가 흐른다. 유체 혼합 경로의 비틀림도 혼합에 도움이 된다. 장치는 각각 100 μL의 비드 현탁액 및 샘플로 작동되도록 스케일링될 수 있다.
실시예 10
POC - 스마트폰 앱 기반 시험
스마트폰 카메라를 사용하여 완성된 응집 반응을 이미지화하고, 앱을 사용하여 결과를 판독한다. 진단 결과는 양성 및 음성 샘플에 대해 훈련된 AI의 이미지 분석을 기반으로 한다. 이 기술은 샘플을 판독할 때 사람의 실수를 방지하고 모든 사람에게 빠르고 쉽고 정확한 시험을 이용할 수 있도록 한다.
이 POC 시험을 실행하기 위해 다음 절차가 이용된다:
1) 키트로부터 플라스틱 침 컵을 꺼낸다.
2) 키트로부터 구강 린스 용액 병을 꺼내고, 트위스트 캡을 제거하고, 구강 린스 5 mL 전체를 입에 쏟아 비우고, 25초 동안 스위싱하고 5초 동안 가글링한다.
3) 5 mL 구강 린스 타액 샘플을 플라스틱 침 컵에 뱉는다.
4) 키트(타액 샘플 수집 장치)로부터 모세관 란셋 장치를 꺼내고, 침 컵의 구강 린스 타액 샘플에 삽입하여 모세관 란셋으로 50 uL의 타액 샘플을 빼낸다.
5) 키트로부터 응집 시약이 밀봉된 바이알을 꺼내고, 10회(상/하 반전) 혼합하여 비드를 현탁액으로 혼합한다. (투명 바이알을 사용하는 경우, 사용자는 어두운 반점 또는 비드 덩어리가 보이지 않고 밝은 갈색이 될 때까지 혼합하도록 지시될 수 있음).
6) 타액 샘플을 갖는 모세관 란셋을 삽입할 때 밀봉재에 구멍을 뚫어 응집 시약에 삽입하고, 모세관 란셋이 응집 시약 바이알에 꼭 맞거나 꽉 맞아 밀봉을 형성할 때까지 삽입한다.
7) 타액 샘플을 응집 시약과 10회 뒤집어 혼합한다.
8) 응집 시약 바이알에 삽입된 모세관 란셋 장치 상의 점적기 끝을 덮고 있는 캡을 제거한다.
9) 시험 챔버를 갖는 시험 카드를 평평한 표면에 놓거나, 또한 시험 챔버 윤곽선 또는 스퀘어를 덮도록 시험 카드에 시험 챔버를 놓는다.
10) 점적기 끝을 시험 챔버 위에 놓고, 병을 부드럽게 짜서 시험 챔버 바닥을 덮기에 충분한 수의 방울을 첨가한다.
11) 앱은 타이머를 갖고 시험 카드 앞의 시험 챔버에서 샘플 사진을 찍는 방법 및 시기를 지시할 것이다(도 9a).
12) 시험 결과는 앱에 표시된다(도 9b).
스마트폰 화면에 표시되는 시험 결과는 사람이 음성(또는 양성)을 검사한 때를 나타내는 시간 코드(도 9b, 왼쪽 패널 참조)를 포함할 수 있다. 음성 시험 코드는 공개 모임(예컨데, 비행기, 직장, 스포츠 행사, 교회, 학교 등)에 쉽게 입장할 수 있는 배지 역할을 할 수 있다. 타임 코드 대신 또는 타임 코드에 추가하여 바코드 또는 QR 코드가 있을 수 있다. 결과 화면은 텍스트 및 이미지 또는 배경에 특유한 색상을 사용할 수 있다. 예컨대, 음성 결과 화면은 녹색 또는 파란색을 사용할 수 있고, 양성 시험 화면은 빨간색, 주황색 또는 노란색을 사용할 수 있으며, 결정적이지 않은 시험 화면은 파란색 또는 검은색을 사용할 수 있다. 각각의 결과에 대해 상이한 색을 사용하는 다른 배색이 가능하다.
실시예 11
응집 바이러스의 확인 시험
임의의 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체와 교차 반응할 코로나바이러스가 존재하고 위양성 결과를 생성할 수 있다. 또한, SARS-CoV-2의 다수의 스트레인이 확인되었으며 개체가 어떤 스트레인에 감염되었는지는 임상적 또는 역학적 관심 대상일 수 있다. 따라서, 응집체에 포획된 비리온이 실제로 SARS-CoV-2인지 확인하고/하거나 이들이 어떤 스트레인인지 식별하는 것이 도움이 될 수 있다. 포획된 비리온을 PCR (또는 유사한) 시험에 적용하여 양쪽 말단을 달성할 수 있다.
응집체 결합된 비리온은 열 불활성화 및 용해되고, 비드는 자기적으로 분리되고, 용해된 바이러스를 함유하는 액체는 흡인되고, 통상적으로 PCR에 적용된다. 대안적으로, 글리신 pH 2.5 용출 버퍼로 세척하여 비리온을 용출시킨다. 이어서, 용액을 중성 pH로 조정하고, 비드를 자기적으로 분리하고, 용출된 정제된 비리온을 흡인하고, 통상적으로 PCR에 적용한다.
실시예 12
항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 자성 비드를 사용한 샘플 세척
타액은 반드시 깨끗한 물질은 아니지만 PCR 검정을 방해할 수 있는 커피, 츄잉껌, 담배, 음식 등으로부터의 물질을 함유할 수 있다. 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 자성 비드는 PCR 시험을 방해하는 타액 샘플로부터의 간섭을 제거하는 방법을 제공한다. 이 적용에 대해, 비리온이 비드에 결합하는 한 응집이 발생하는 것이 필수적이지는 않다.
항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 자성 비드를 타액 샘플에 첨가하여 SARS-CoV-2 비리온을 포획하고, 0.9% 식염수로 자성 비드를 세척하여 이러한 간섭을 씻어낸다. 이어서, 비드 결합 비리온을 열 불활성화 및 용해시키고, 비드를 자기적으로 분리하고, 용해된 바이러스를 함유하는 액체를 흡인하고, 통상적으로 PCR에 적용한다.
대안적으로, 비리온은 글리신 pH 2.5 용출 버퍼로 세척하여 용출된다. 이어서, 용액을 중성 pH로 조정하고, 비드를 자기적으로 분리하고, 용출된 정제된 비리온을 흡인하고, 통상적으로 PCR에 적용한다.
실시예 13
SARS-CoV-2 집합/응집 검정을 위한 모델 프로토콜
방법 개요: SARS-CoV-2 스파이크-RDB 단백질에 대한 항체로 코팅된 상자성 미세입자(PMP)는 식염수에 혼합된 비강 면봉으로부터의 인간 샘플에 도입된다. PMP는 서로 덩어리짐으로써 반응한다. 이어서, 덩어리진 PMP는, 예컨대 바이오텍 싸이테이션(BioTek Cytation) 5 현미경 세포 계수기에 의해 이미지화되고 계수된다. 덩어리는 크기 게이트에서 계수된다. 시간 경과에 따른 계수된 덩어리 또는 덩어리 증가율은 샘플 내 SARS-CoV-2 비리온의 존재에 비례한다.
재료:
1) 비오티닐화 MM57 항-RBD 모노클로날 항체와 접합된 스트렙타비딘 코팅된 PMP(직경 1.6 μm)(실시예 1 참조).
2) 비강 수집 면봉(Copan PN502CS01 Copan Diagnostics Inc, 26055 Jefferson Ave, Murrieta, CA 92562).
3) 식염수(정제수 중 0.09% NaCl).
4) 싸이테이션 5 세포 이미징 다중 모드 판독기.
5) Alpaqua Catalyst™ 96, 96웰 슬롯 링 자석 플레이트 SKU: A000550(Alpaqua Inc. 100 Cummings Center, Suite #424A, Beverly, MA 01915).
6) 반응 플레이트(Corning PN353910 Corning Inc, 1 River Front Plaza Corning NY 14831)
7) 하프 영역 판독 플레이트(Greiner PN675090 Greiner BioOne GMBH Maybach St 2, 72636 Frickenhausen, Germany).
8) TTA: 0.05% 트윈 20 및 0.05% 아지드화나트륨을 갖는 트리스 완충된 식염수.
프로토콜은 다른 공급업체의 동등한 시약을 사용하도록 조정될 수 있다.
프로토콜 3 샘플 수집
1) 멸균된 샘플 면봉을 환자에게 준다.
2) 비강에 대해 면봉을 5회 회전시켜 전비강을 부드럽게 면봉으로 닦도록 환자에게 지시한다.
3) 면봉을 15 mL 수집 튜브 내의 3 mL 식염수에 직접적으로 넣는다.
4) 튜브에 마개를 씌우고 볼텍싱한다.
5) 2차 수집 튜브로 액체를 이동시키고 원심분리한다.
6) 원심분리된 투명한 액체를 시험을 위해 이동시킨다.
시험 프로토콜
1) 원심분리된(21380rcf에서 10분) 환자 샘플 50 μL를 반응 플레이트에 첨가한다.
2) TTA 중의 1 mg/mL의 50 μL 항체 접합된 PMP를 반응 플레이트 내의 50 μL 환자 샘플 각각에 첨가한다.
3) 30℃에서 30분 동안 진동 진탕기(500 RPM)에 둔다.
4) 반응 플레이트를 96 자리 자석에 5분 동안간 둔다.
5) 각각의 웰에 TTA 15 μL를 첨가하여 판독 플레이트를 조건화한다.
6) 피펫 혼합을 이용하여 반응 플레이트 펠렛을 재현탁시킨다.
7) 단계 6에서 재현탁된 PMP 10 μL를 절반 영역 판독 플레이트에 첨가한다.
8) 판독 플레이트를 싸이테이션 5에 넣고, 3분 간격으로 15분 동안 역학적으로 판독한다.
9) 다음의 OSA 크기 게이트 데이터를 내보낸다.
a. 2-30 미크론(권장)
b. 15-20 미크론
c. 25-30 미크론
d. 또는 0분 및 3분의 데이터 측정으로부터 기울기를 계산한다.
10) 양성 컷오프로서 식염수 신호 + 15%를 사용한다.
11) 양성 샘플은 신호 > 식염수 +15%를 갖는다.
실시예 14
SARS-CoV-2 검정 결과
양성 및 음성 환자 타액 샘플 및 연속 희석된 SARS-CoV-2 바이러스는 기본적으로 실시예 13(상기)에 기재된 바와 같이 검정되었다. 데이터 수집 게이트는 2-30 미크론으로 설정되었고, 0분에서 15분까지 3분 증분으로 판독되었다(도 10a). PCT 검정 결과를 갖는 4명의 SARS-CoV-2 감염 환자로부터의 타액 샘플은 어쎄스 제네틱스(Access Genetics)(Eden Prairie, MN)에서 입수되었다. SARS-관련된 코로나바이러스 2(Isolate USA-WA1/2020, 감마선-조사됨)(BEI Resources, Manassas, VA)를 사용하여 106 내지 102개의 비리온/mL을 위해 식염수에서 비리온의 10배 연속 희석액을 제조하였다.
3개의 음성 샘플(1개의 식염수 샘플 및 감염되지 않은 지원자로부터의 2개의 타액 샘플)에 대한 객체 합 영역(OSA) 판독(비드의 2차원 프로젝션)을 평균화하고, 양성 및 음성 사이의 컷오프를 15분 종점(665667) 및 0 내지 3분에 걸친 기울기(137900)에 대한 음성 샘플에 대한 평균 OSA 판독의 115%로 설정하였다. 각각의 양성 샘플에 대한 OSA 판독과 음성 샘플 평균 사이의 신호 대 잡음비(S/N; 도 10a)도 결정되었으며, 이는 양성과 음성이 쉽게 구별될 수 있음을 보여준다. 각각의 샘플에 대한 OSA 판독은 15분 종점(도 10b) 및 0 내지 3분에 걸친 기울기(도 10c) 모두에 대해 플로팅되었다. (음성 샘플은 로그 스케일에 진정한 0이 없기 때문에 mL당 0.1 개의 비리온으로 임의로 플로팅되었다). 다시 말하지만, 양성 샘플과 음성 샘플을 쉽게 구별할 수 있다. 검정 결과는 정성적이며 정량적이지 않다. 비리온 농도 (또는 PCR 주기 수)와 판독 크기 사이에는 상관관계가 없었다.
실시예 15
SARS-CoV-2 검정 결과(비강 면봉)
검정은 상기 실시예와 다른 조건 하에서 실행되었다. SARS-CoV-2 감염된 사람 및 감염되지 않은 사람(PCR로 판단)으로부터의 비강 면봉 샘플, RBD 코팅된 라텍스 비드, 적정된 비리온 샘플을 검정하였다. 비강 면봉 샘플 20 μL를 96웰 플레이트의 50 μL에 첨가하였다. 이어서, 항-RBD 모노클로날 항체가 접합된 PMP 80 μL를 각각의 웰에 첨가하고, 외부 플레이트 히터에서 37 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 주위 온도에서 바이오텍 싸이테이션 5 플레이트 판독기에 삽입하고, OSA 판독을 9-99 미크론 입자 직경 창에서 수집하였다(도 13a-b). 기울기는 17-21분 간격으로 계산되었다.
표 4(아래)에서 볼 수 있는 바와 같이, 약 1000 미만의 기울기는 음성 샘플과 상관관계가 있었다. 샘플당 10개의 비리온이 PCR에 의해서는 검출 미만이었지만, 이 응집 검정에서는 양성 신호를 나타내었다.
마지막으로, 본원의 측면이 특정 실시양태를 참조함으로써 강조되지만, 당업자는 이들 개시된 실시양태가 본원에 개시된 주제의 원리를 예시할 뿐이라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 개시된 주제는 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및/또는 시약 등에 결코 제한되지 않음을 이해해야 한다. 이와 같이, 본원의 취지를 벗어나지 않고 본원의 교시에 따라 개시된 주제의 다양한 수정 또는 변경 또는 대체 구성이 이루어질 수 있다. 마지막으로, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 권리범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명은 청구범위에 의해서만 정의된다. 따라서, 본 발명은 정확히 도시되고 설명된 것에 한정되지 않는다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 모드를 포함하여 본 발명의 특정 실시양태가 본원에 기술된다. 물론, 이러한 기술된 실시양태에 대한 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이러한 변형을 적절하게 채택할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과는 다르게 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 해당 법률이 허용하는 바에 따라 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 수정 및 등가물을 포함한다. 또한, 전술한 실시양태의 모든 가능한 변형의 임의의 조합은 본원에서 달리 나타내거나 달리 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 대안적인 실시양태, 요소 또는 단계의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로 또는 본원에 개시된 다른 그룹 구성원과 조합하여 언급되고 청구될 수 있다. 편의 및/또는 특허성 때문에 그룹의 하나 이상의 구성원이 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 본 명세서는 수정된 그룹을 함유하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마르쿠쉬(Markush) 그룹의 글로 표현된 설명을 충족한다.
달리 나타내지 않는 한, 본원 및 청구범위에 사용된 특징, 항목, 양, 파라미터, 특성, 용어 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 이렇게 한정된 특징, 항목, 양, 파라미터, 특성 또는 용어가 언급된 특징, 항목, 양, 파라미터, 속성 또는 용어의 값의 위 및 아래의 ±10% 범위를 포함함을 의미한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 본원 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 다양할 수 있는 근사치이다. 최소한, 청구범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각각의 수치 표시는 적어도 보고된 유효 숫자의 수에 비추어 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 값이 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 설명된 수치 범위 및 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치 범위 또는 값은 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오류가 본질적으로 함유된다. 본원에서 값의 수치 범위에 대한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 수치값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 사용하기 위한 것이다. 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 수치 범위의 각 개별 값은 본원에서 개별적으로 인용되는 것처럼 본원에 포함된다.
본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 다음 청구범위의 맥락에서) 사용되는 단수형 용어는 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어(예컨대, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본원의 어떤 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 특정 실시양태는 '이루어진' 또는 '필수적으로 이루어진'의 언어를 사용하여 청구범위에서 추가로 제한될 수 있다. 전환 용어 “이루어진"은 출원 시 또는 보정에 따라 추가되는지의 여부에 관계없이 청구항에 사용될 때 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 전환 용어 "필수적로 이루어진"은 청구범위를 특정한 재료 또는 단계 및 기본 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 이렇게 청구된 본 발명의 실시양태는 본원에 본질적으로 또는 명시적으로 설명되고 가능하다.
본원에서 참조되고 확인된 모든 특허, 특허 공개문 및 다른 공개문은, 예컨대 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 공개문에 기재된 조성물 및 방법론을 기재하고 개시할 목적으로 전체가 개별적으로 및 명백하게 본원에 참고로 포함된다. 이들 공개문은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명 또는 다른 이유로 이러한 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이들 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 관한 모든 진술은 출원인이 사용할 수 있는 정보를 기반으로 하며, 이들 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 승인도 구성하지 않는다.
Claims (32)
- 하기 단계를 포함하는, 하나 이상의 개체에서 SARS-CoV-2 감염을 검출하는 방법:
a) 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드를 상기 하나 이상의 개체 각각으로부터의 타액 샘플과 개별적으로 조합하여 각각의 개체에 해당하는 혼합물을 형성하는 단계;
b) 각각의 개체의 혼합물의 비드 및 타액 샘플을 혼합하는 단계;
c) 혼합물(들)을 인큐베이션하는 단계; 및
d) 각각의 개체의 혼합물에서 응집이 발생했는지의 여부를 검출하는 단계. - 제1항에 있어서, 표면 항원이 S1 또는 S2 스파이크 단백질인 방법.
- 제2항에 있어서, 항체가 S1 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 또는 N-말단 도메인(NTD)을 인식하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 타액 샘플이 구강 린스액에 포함되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 구강 린스액이, 하나 이상의 개체 각각이 구강에서 식염수 용액을 스위싱하고 가글링한 다음 수집 용기로 뱉어냄으로써 구강 린스액이 수득되는 것인 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 유색이고 어둡거나 강렬한 색조를 갖는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 자성인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 스트렙타비딘화되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 항체가 비오티닐화되고 비오틴 모이어티가 스트렙타비딘에 결합되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 1.3 내지 1.9 μm의 직경을 갖는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 1.6 μm의 직경을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 2.7 μm의 직경을 갖는 것인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 25 내지 35 μg의 항체/비드 mg을 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드가 30 μg의 항체/비드 mg을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션이 실온에서 이루어지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션이 37℃에서 이루어지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 혼합물이 2-5분 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 시각적 관찰을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 카메라의 사용을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 광학 밀도계의 사용을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합 또는 인큐베이션 단계 후에 각각의 개체의 혼합물로부터의 분취량을 다중웰 플레이트의 웰로 이송하고 각각의 개체의 혼합물에 대해 응집이 발생했는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 검출이 마이크로플레이트 판독기의 사용을 포함하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 검출이 마이크로어레이 디지털 판독기의 사용을 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 인큐베이션 단계 후 이송 단계 전에 혼합물에 점성화제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 점성화제가 FICOLL인 방법.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 공지된 양의 비리온을 함유하는 샘플을 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드와 조합하여 각각의 비리온 양에 해당하는 표준 곡선 혼합물을 형성하는 단계,
b) 각각의 표준 곡선 혼합물의 비드 및 비리온 샘플을 혼합하는 단계,
c) 표준 곡선 혼합물을 인큐베이션하는 단계, 및
d) 혼합 또는 인큐베이션 단계 후 각각의 표준 곡선 혼합물을 다중웰 플레이트의 웰로 이송하고 각각의 표준 곡선 혼합물에 대해 응집이 발생했는지의 여부를 검출하는 단계
를 추가로 포함하고;
표준 곡선 혼합물은 타액 샘플 내의 바이러스 양이 정량화될 수 있는 검량 곡선 역할을 하는 것인 방법. - 하나 이상의 개체에서 SARS-CoV-2 감염을 검출하는 방법으로서,
각각의 개체에 해당하는 인큐베이션된 혼합물에서 응집이 발생했는지의 여부를 검출하는 단계를 포함하고,
각각의 혼합물은 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체 코팅된 비드 및 하나의 개체로부터의 타액 샘플을 포함하는, SARS-CoV-2 감염을 검출하는 방법. - 제27항에 있어서, 인큐베이션된 혼합물이 실온에서 2-5분 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
- 제27항에 있어서, 인큐베이션된 혼합물이 1-5분 동안 동시에 진탕되는 것인 방법.
- 제29항에 있어서, 인큐베이션이 37℃에서 이루어지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항-SARS-CoV-2 표면 항원 항체가 알파카 유래된 나노바디인 방법.
- 제31항에 있어서, 나노바디가 Ty1인 방법.
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