CN116018354A

CN116018354A - 冠状病毒即时检验凝集测定

Info

Publication number: CN116018354A
Application number: CN202180055576.6A
Authority: CN
Inventors: 乔舒亚·凯恩·索尔多; 斯科特·道格拉斯·伯格曼
Original assignee: Villavis Co
Current assignee: Villavis Co
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2023-04-25
Also published as: AU2021325165A1; WO2022036330A1; AU2024202251A1; CA3191870A1; EP4196496A1; AU2021325165B2; KR20230047485A; JP2023540454A; US20230305005A1; IL300648A

Abstract

本说明书提供了用于快速检测SARS‑CoV‑2的试剂和方法。该测定可以在即时检验或实验室环境中实施。

Description

冠状病毒即时检验凝集测定

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年8月14日提交的美国临时专利申请63/065,993的权益，其全部内容以引用方式并入本文。

背景技术

有许多已用于检测个体的病毒感染的测定技术。虽然已经开发并且正在开发针对COVID-19的病原体SARS-CoV-2的多种测定，但这些测定中的许多测定需要实验室、复杂的装备、受过专门培训的人员以及大量时间来进行测定。这些要求限制了此类测定用于快速鉴定可能在公共集会上传播COVID-19的感染个体的有用性。

发明内容

需要用于检测和/或定量COVID-19的病原体SARS-CoV-2病毒的即时检验(point-of-care,POC)测定。本文公开了用于快速POC测定的试剂和方法，无论何时可遇到可能感染的个体，都可以进行所述快速POC测定，其中所述测定可以在几分钟(例如，5分钟)内完成，并产生视觉上可检测的结果。该测定只需要来自被测对象的唾液样品。

在另外的实施方式中，该测定程序可以适用于临床实验室，在所述临床实验室中例如在96孔板中并行处理多个样品以实现高通量。在这些实施方式的一个方面中，可以定量样品中的病毒量。

所公开的测定使用包被有抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体的珠粒，在SARS-CoV-2存在下所述珠粒会发生凝集。在一些实施方式中，抗体识别SARS-CoV-2的S1或S2刺突蛋白。在一些实施方式中，该抗体识别S1刺突蛋白的受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)。在一些实施方式中，该抗体识别S1刺突蛋白的N末端结构域(N-terminal domain,NTD)。在一些实施方式中，该抗体是中和抗体。在其他实施方式中，该抗体所识别的表面抗原是血凝素蛋白、基质(matrix,M)蛋白或包膜(envelope,E)蛋白。在一些实施方式中，通过竞争性ELISA测得，中和抗体的IC50为3-4nM。

在一些实施方式中，珠粒是胶乳珠粒。在一些实施方式中，珠粒是磁性珠粒。在一些实施方式中，珠粒具有深或强颜色。

在一些实施方式中，珠粒是荧光的。在一些实施方式中，珠粒是用荧光素酶或其他发光剂标记的。在仍其他实施方式中，珠粒是用任何其他产生视觉上或分光光度法可检测的信号的试剂标记的。

在一些实施方式中，珠粒的直径为1.3μm至1.9μm或约0.55μm至约2.7μm。在一些实施方式中，珠粒的直径为约550nm。在一些实施方式中，珠粒的直径为约1.6μm。在一些实施方式中，珠粒的直径为约2.7μm。这些直径大小是指在添加链霉亲和素、抗体或其他包衣或修饰之前的珠粒直径。

在一些实施方式中，珠粒是链霉亲和素化的。在一些实施方式中，珠粒是羧基珠粒，并且链霉亲和素使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学共价附接至所述珠粒。在一些实施方式中，抗体是生物素化的并通过生物素-链霉亲和素结合包被到链霉亲和素珠粒上。在一些实施方式中，抗体包衣包含25μg抗体/mg珠粒至35μg抗体/mg珠粒。在一些实施方式中，抗体包衣包含30μg抗体/mg珠粒。

在一些实施方式中，抗SARS-CoV-2抗体用除链霉亲和素以外的另一种亲和试剂缀合至珠粒。在各种实施方式中，缀合亲和试剂是蛋白A、蛋白G和抗Fc抗体、抗物种Ig抗体(例如，山羊抗兔Ig或兔抗小鼠Ig)、或抗标记抗体(例如，识别生物素、荧光素、葡聚糖等的抗体)，具体取决于抗SARS-CoV-2抗体的性质和该抗体已经进行的修饰。

在一些实施方式中，抗体使用EDC化学直接附接至羧基珠粒。在一些实施方式中，抗体直接附接至甲苯磺酰基活化的珠粒或环氧树脂活化的珠粒。

基本检测程序包括将经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒与来自待测试SARS-CoV-2感染的受试者的唾液样品组合；混合所述珠粒和所述唾液样品以形成混合物；孵育所述混合物；以及检测是否已发生凝集。在一些实施方式中，孵育进行约5分钟。在一些实施方式中，孵育在室温下进行。在其他实施方式中，孵育于37℃下进行。

在基本检测程序的变型中，将经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒与来自待测试SARS-CoV-2感染的受试者的唾液样品在多孔板中组合；将所述珠粒在室温下孵育1-10分钟(例如，5分钟)；并将所述板置于平板摇床中达某一时段。在一些实施方式中，该时段是5分钟。在一些实施方式中，摇床处于室温下。在其他实施方式中，平板摇床处于37℃下。在一些实施方式中，使用线性振荡运动。在一些实施方式中，振荡是快速的，例如，约1000次循环/分钟。

在一些实施方式中，唾液样品包含在口腔冲洗流体中。该口腔冲洗流体可以通过用盐溶液(例如，0.9％盐溶液)鼓漱并吐出到收集器皿中来获得。在一些实施方式中，使用5mL的盐水溶液进行冲洗。在一些实施方式中，进行鼓漱30秒。

或者，在一些实施方式中，鼻拭子或鼻咽拭子试样是通过在流体中搅动拭子以分散试样中存在的任何病毒而收集在盐水溶液或其他运送介质中的。在另一种变型中，将拭子在含有唾液样品的口腔冲洗溶液中搅动，以便可以检测到其中存在的病毒。该运送介质可以是

Universal Transport Medium^TM(Copan Diagnostics,Inc.Murrieta,CA)，是一种室温下稳定的病毒运送介质，其用于病毒和其他感染性试样的收集、运送、维持和长期冷冻储存，所述病毒运送介质由汉克平衡盐溶液、牛血清白蛋白、L-半胱氨酸、明胶、蔗糖、L-谷氨酸、HEPES缓冲液、酚红、蔗糖、万古霉素、两性霉素B和粘菌素组成。该介质是等渗的，并且对哺乳动物宿主细胞无毒。

在一些实施方式中，每个个体的唾液样品通过检测与收集分开处理。在一些实施方式中，将来自多个个体的混合物或其等分试样在混合或孵育步骤后被转移到多孔板的单独孔中，并且在酶标仪或微微阵列数字读取器中进行检测。在一些实施方式中，在孵育步骤之后但在转移步骤之前将稠化剂添加到混合物中。在一些实施方式中，稠化剂是FICOLL。

在一些实施方式中，测定已知量的病毒，例如稀释系列，以生成校准曲线，可以从该校准曲线定量个体的唾液样品中的病毒量。

在一些实施方式中，测定是定性的，区分病毒体的存在与否，但不提供对存在的病毒体数量的定量。在一些实施方式中，定性测定可以检测至少低至每毫升100个病毒体。在一些实施方式中，定性测定可以检测至少低至每毫升10个病毒体。

附图说明

图1显示了针对SARS-CoV-2的聚合酶链式反应(PCR)阳性(左)或PCR阴性(右)的测定的唾液样品。在左侧小瓶(含病毒样品)中清晰可见基于珠粒的凝集，而在右侧小瓶(无病毒样品)中未观察到珠粒凝集。

图2A至图2D描绘了当RBD多肽与固定在生物层干涉测量传感器上的抗体结合和解离时干扰的变化(以纳米为单位)。0秒处的竖直虚线指示生物传感器浸入RBD多肽溶液的时间，并且240秒处的竖直虚线指示生物传感器从RBD多肽溶液中取出并浸入缓冲液中的时间。曲线图中的每个曲线图都显示三对迹线。每对代表实际数据和拟合曲线，从中导出动力学常数(KD、Ka和Kd)。对于所述对中的几对，数据和拟合的迹线是无法区分的。在每幅曲线图中，最上面的迹线是针对100nM RBD多肽的，中间迹线是针对10nM RBD多肽的，并且底部迹线是针对0nm RBD多肽的。2A-Ty1；2B-MM57；2C-R001；和2D-MM43

图3示出了与来自实施例5的SARS-CoV-2阴性(顶部)和阳性(底部)样品一起孵育的Ty1包被的550nm珠粒的凝集反应图像。

图4示出了与来自实施例5的SARS-CoV-2阴性(顶部)和阳性(底部)样品一起孵育的R001包被的2.7μm珠粒的凝集反应图像。

图5示出了实施例6中所述的凝集反应的图像。共有五张图，从左到右为仅珠粒、图7阴性样品+100μL珠粒、100μL阳性样品+50μL珠粒、100μL阳性样品+100μL珠粒、和100μL阳性样品+200μL珠粒。

图6A至图6B示出了实施例7中所述的凝集反应的图像。可以看到四个孔的阵列。上部孔包含阴性样品，并且下部孔包含阳性样品。左边的一对孔使用2:1的珠粒与样品比进行凝集反应，并且右边的一对孔使用1:1的珠粒与样品比进行凝集反应。图6A示出原始图像，并且图6B示出处理后的同一图像。

图7示出了来自实施例8中所述的珠粒稀释凝集测定的图像。稀释从左到右以100:75∶50∶25:10:0的比率进行。上部行接收阴性样品，并且下部行接收阳性样品。

图8是用于进行SARS-CoV-2凝集测定的即时检验设备的图式。

图9A至图9B。图9A中描绘了用于基于智能手机的即时检验SARS-CoV-2凝集测定的测试卡。该测试卡显示测试室的适当定位，并为图像捕获提供了适当的背景。图9B描绘了来自图像读取智能手机应用程序的模拟结果屏幕。

图10A至图10C描绘了SARS-CoV-2测定结果。图10A报告了来自来自于感染者和未感染者的唾液样品、滴定病毒体和盐水的对象总面积(object sum area,OSA)，以及在15分钟终点处和针对0至3分钟的斜率的每个阳性样品与三个阴性样品的平均值的信噪比(signal to noise ratio,S/N)。图10B是0至3分钟内病毒体计数对比团块计数读数的曲线图。图10C是15分钟处病毒体计数对比团块计数读数的斜率的曲线图。图10B至图10C仅绘制了三个阴性样品(Δ)和病毒体的连续稀释(●)。

图11呈现了完整凝集测试过程的一个实施方式的概览。

图12示出了在某些实施方式中用于收集待测试的盐水口腔漱液的唾液设备。

图13A至图13B呈现了来自由OSA变化的斜率解释的凝集测定的结果。图13A绘制了用样品编号标记的测试样品中的每个测试样品的OSA随时间的变化。图13B呈现每个样品的图像。关于样品编号和说明请参见表4。

具体实施方式

一种用于检测或定量多价分析物(例如病毒粒子)的简单技术是凝集。凝集需要使粒子聚集在一起，通常取决于抗体-抗原结合。基于凝集的测定的经典示例包括ABO血型检定和用于艾普斯登-巴尔病毒感染的Monospot测定。当反应的抗体组分可以在两个(或更多个)负载抗原的粒子之间形成交联并且每个负载抗原的粒子与多个其他粒子交联时，就可发生凝集。如果相对于抗原存在过多的抗体，则抗体将使得负载抗原的粒子上的所有结合位点饱和，从而有效地不发生交联并且不发生凝集。例如，如果结合的几何形状使得与一个负载抗原的粒子结合的抗体不能跨越到第二个负载抗原的粒子，或者如果结合动力学使得两个抗体(假设，例如，二价抗体)结合位点与同一负载抗原的粒子接合，则空间因素也可干扰凝集。例如这些的空间因素通常可以通过以下方式来克服：将抗体附接至珠粒，从而有效地增加它们的效价、可及范围和位置多样性。

将抗体附接至珠粒还解决了另一个问题。病毒粒子和抗体分子小到使得即使发生凝集，也无法用肉眼观察到凝集物(团块)。通过将抗体附接至肉眼可见的珠粒，至少在凝集时，可以通过肉眼(或相机)检测到成功的凝集反应。

这种凝集方法检测病毒体，而不检测从病毒体解离的RNA或抗原。完整的病毒体样品(例如新鲜唾液样品、口腔盐水冲洗样品、或拭子/口腔盐水冲洗样品，以及伽马辐射的基于唾液的样品)最容易发生凝集。热灭活会使一些病毒体的病毒体结构变性或分解，这将降低受损病毒体或病毒体片段的凝集效率。由于凝集取决于基本上完整的病毒体，因此在感染已经消退后，不太容易因残留的抗原和RNA而产生假阳性测试。这与基于ELISA的测试和基于PCR的测试形成对比，所述基于ELISA的测试和基于PCR的测试分别检测抗原和RNA，而无论所述抗原和RNA是否与完整的病毒体相关联。

在具体实施方式中，抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体是生物素化的并与链霉亲和素化的磁性珠粒反应。这些特征中的几种特征是方便的，但不是必需的。生物素-亲和素反应广泛用于将抗体附接至珠粒和其他底物上，所述反应是很好理解的，并且必要的试剂是容易获得的。尽管如此，用于将抗体附接至珠粒的其他化学方法是已知并且可利用的。类似地，磁性珠粒可为易于处理的，但是本文所公开的一般测定方案不利用磁性。然而，磁性珠粒通常含有铁并具有便于视觉检测的深棕色。也可以使用非磁性珠粒，但所述非磁性珠粒应该是便于视觉检测的深和/或强颜色的。除了棕色之外，黑色和深色度的蓝色、绿色、红色和紫色也是合适的，而例如白色、黄色和棕黄色则是不太优选的。胶乳珠粒往往用于凝集测定，并且有多种颜色可用。

在具体实施方式中，抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体是一种中和抗体，其与SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域结合。抗体的中和活性对于测定不是必需的。任何与病毒粒子上的多价位点结合的抗体都是有用的。然而，受体结合结构域是可及且保存完好的位点，从而使其非常适合本发明目的。来自小鼠和兔的识别SARS-CoV-2的S1和S2刺突蛋白和受体结合结构域的单克隆抗体，包括中和单克隆抗体，是可从多个来源商购获得的。还生成了来自羊驼的中和单结构域抗体片段(Hanke等人，bioRxiv 2020.06.02.130161，该文献以引用方式整体并入本文)。虽然这些抗体片段(纳米抗体)是单价的，但是它们仍然适合在附接至珠粒时用于凝集测定，因为珠粒是多价的。

羊驼纳米抗体(Ty1)提供了几种优势。使用分选酶A在纳米抗体的C末端上进行酶促生物素化，这确保了纳米抗体与珠粒的取向一致，其中抗原结合位点背向珠粒，这对于病毒结合是最佳的。这与随机生物素化的抗体形成对比，在所述随机生物素化的抗体中抗体以各种取向附接至珠粒，所述取向中的一些取向会经受空间位阻。Ty1还能够识别处于“向上”和“向下”构象(也分别称为“开放”和“封闭”构象)两者的RBD。纳米抗体的小尺寸(仅12.5kD)允许纳米抗体与一个刺突蛋白中的三个S1原体中的每个S1原体的RBD结合。纳米抗体的小尺寸也意味着，与全尺寸抗体相比，每毫克抗体包被一个珠粒，就会存在更多的病毒结合位点。

抗体亲和力也是选择用作凝集试剂的抗体时要考虑的重要参数，更高的亲和力与更强的凝集作用相关联。在一些实施方式中，抗体的KD大于2.5、5.0、7.5、9.0或9.5，如通过生物层干涉法在磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS)中测量的。在各种实施方式中，KD的范围为2.5、5.0、7.5、9.0或9.5至10。在一些实施方式中，KD为约2.8。在一些实施方式中，KD为约9.9。

在具体实施方式中，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学品将具有游离羧酸根基团的磁性珠粒(羧基珠粒)共价连接至链霉亲和素，封闭并解吸(stripped)以防止非特异性结合。利用生物素-链霉亲和素结合来附接识别SARS-CoV-2的生物素化抗体。这种步骤的程序和变型是本领域中已知的(参见例如PCT/US2020/039503，其关于制备和使用包被有链霉亲和素的珠粒并附接生物素化分子的所有教导内容以引用方式并入本文)。期望的是经链霉亲和素包被的珠粒和随后的经生物素-抗体包被的链霉亲和素珠粒是单分散的，以均最大化结合表面积，并且该测定基于珠粒聚集/凝集。可以使用剧烈的珠粒混合、剪切混合和超声处理来确保珠粒是混合、均匀和单分散的。单分散珠粒(非聚集珠粒)也可以为PCR阴性唾液样品提供最佳对照结果，因为珠粒在没有其病毒靶标的情况下不应聚集或凝集。

在一些实施方式中，抗体使用EDC化学直接附接至羧基珠粒。在一些实施方式中，抗体直接附接至甲苯磺酰基活化的珠粒或环氧树脂活化的珠粒。在其他实施方式中，使用配位化学键合将抗体非共价包被到珠粒中。

在整个公开内容中描述了利用链霉亲和素的实施方式。然而，还考虑了包含替代物，例如亲和素、去糖基化的亲和素(中性抗生物素蛋白)、CaptAvidin、单体亲和素的另外实施方式。也考虑了链霉亲和素的天然和重组形式及其替代物。这些试剂可被称为用于结合生物素的手段。

可以将其他亲和试剂附接至珠粒来代替链霉亲和素或其类似物并用于缀合抗SARS-CoV-2抗体。在一些实施方式中，缀合亲和试剂是抗生物素抗体，并且可以缀合生物素化的抗SARS-CoV-2抗体。在一些实施方式中，缀合亲和试剂识别标记，例如荧光素、葡聚糖、His标签等，并且可以分别缀合荧光素化的、葡聚糖修饰的、His标记的或以其他方式标记的抗SARS-CoV-2抗体。在一些实施方式中，缀合亲和试剂识别抗体(例如蛋白A、蛋白G或抗Fc抗体)的Fc区，并且可以缀合包含Fc区的抗SARS-CoV-2抗体。在一些实施方式中，缀合亲和试剂是这样的抗体，所述抗体识别免疫球蛋白(immunoglobulinm,Ig)(例如，山羊抗兔Ig抗体或兔抗小鼠Ig抗体)中的物种特异性表位的抗体，并且可以缀合分别为兔抗体或小鼠抗体的抗SARS-CoV-2抗体。

可以使用各种尺寸的珠粒。在一些实施方式中，珠粒的直径为约500nm至约2.7μm，或约1.3μm至约1.9μm。在一些实施方式中，珠粒的直径为1.6μm。在一些实施方式中，珠粒的直径为2.7μm。珠粒尺寸可影响沉降时间，珠粒越大，则沉降得越快。在含有100-200μL液体(不含稠化剂)的平底96孔板中，2.7μm珠粒的沉降可在约3分钟内完成，并且1.6μm珠粒的沉降可在约5分钟内完成。550nm的珠粒可需要更长的时间才能沉降。然而，随着珠粒凝集/聚集，它们变成非常大的团块，与单分散珠粒相比，这可以减少凝集物的沉降时间。

珠粒可以包被有不同量的抗体。在一些实施方式中，珠粒含有约10μg抗体/mg珠粒至约50μg抗体/mg珠粒，或约25μg抗体/mg珠粒至约35μg抗体/mg珠粒。在一些实施方式中，珠粒包含30μg抗体/mg珠粒。

在一些实施方式中，为了获得唾液样品进行测定，用盐水溶液冲洗口腔并收集冲洗液(漱口和吐出)以获得口腔冲洗流体。在一些实施方式中，将5mL盐水溶液剧烈鼓漱30秒，然后吐出到收集器皿，例如带漏斗的收集管中。(来自OralDNA Labs的通用口腔冲洗流体收集套件适用于此目的；图12)。

在一些实施方式中，唾液样品，无论以何种方式获得，都被离心以去除细胞物质。

为了进行测定，将珠粒悬浮液添加到唾液样品中。在一些实施方式中，唾液样品包含在口腔冲洗流体中。在一些实施方式中，使用经抗SARS-CoV-2抗体包被的珠粒的1mg/mL悬浮液，以1:2的珠粒:唾液样品比率组合各组分。在这些实施方式的各方面中，珠粒悬浮液的浓度可大于或小于1mg/ml，具体取决于所需的总反应体积和由于唾液样品导致的稀释因子。在一些实施方式中，将0.5ml的珠粒悬浮液添加到1mL的唾液样品(例如，口腔冲洗流体)中。其他实施方式使用其他珠粒:样品比率和珠粒浓度(参见实施例6和实施例8)。将组合的珠粒悬浮液和唾液样品混合，然后进行孵育。在一些实施方式中，孵育在室温下进行。在其他实施方式中，孵育于37℃下进行。在一些实施方式中，孵育进行至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或5分钟、5分钟至15分钟、2分钟、3分钟或5分钟。在一些实施方式中，孵育以实现凝集和沉降在单个步骤中发生。

通常，重要的是维持珠粒(凝集试剂)与唾液样品体积的最佳比率。这可以针对更大或更小大小的反应进行成比例缩放，例如，在玻璃瓶中对比在微量滴定板中进行的反应。然而，可以通过使用更大体积的唾液样品(以及成比例地更多的凝集试剂)来提高检测灵敏度，因为将有更大质量的材料形成凝集物。

在替代实施方式中，当使用磁性珠粒时，将所述珠粒与悬浮流体磁分离，然后再悬浮在唾液样品(口腔冲洗流体)中。珠粒的最终浓度可以与上述相似，例如，约0.33mg珠粒/mL。在各种实施方式中，凝集反应中的珠粒浓度可为0.1mg/mL至1.5mg/mL，例如0.13mg/mL、0.33mg/mL、0.5mg/mL、0.67mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL或1.33mg/mL，或由这些值的对限定的任何范围。然后孵育再悬浮的珠粒，在一些实施方式中在室温下或于37℃下进行孵育。在一些实施方式中，孵育至少1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或5分钟、5分钟至15分钟、2分钟、3分钟或5分钟，此时已发生凝集。

在另外的实施方式中，除了由于添加组分导致的混合之外，在孵育之前没有明确的混合。在另外的实施方式中，静态孵育之后是在摇床例如平板摇床上孵育。在一些实施方式中，振荡孵育在室温下进行，而在其他实施方式中，在升高的温度下，例如在37℃下进行。在这些实施方式中的一些实施方式中，振荡孵育之前是静态孵育，例如约1分钟或约5分钟。在其他实施方式中，在完成将试剂分配到平板之后没有明确的静态孵育。

这种凝集是可见事件并且可以通过多种方法读取，所述方法的范围从人类视觉评定一直到全自动高通量平板成像仪。在许多实施方式中，(通过眼睛)视觉评定凝集物的形成就足够了。在替代实施方式中，凝集物可以用相机(例如，智能手机相机)、光密度读取器、分光光度计、光度计、荧光计或数字流动室、粒度分析仪(例如，Anton Paar Litesizer500)检测。所有这些检测凝集物的模式都可以被称为用于检测凝集的步骤。

对于更高通量的应用，在混合或孵育步骤之后，可以将凝集反应的等分试样(即，珠粒和唾液样品的混合物)转移到多孔板(例如96孔板)的孔中。凝集形成的检测可以用酶标仪通过例如光密度来完成，或者用微阵列数字读取器通过图像分析来完成。这些检测凝集物的模式也可被称为用于检测凝集的步骤，或被称为用于检测凝集的高通量步骤。在此类实施方式中，还可以包括已知病毒样品的稀释系列作为校准曲线，以便可以对唾液样品中存在的病毒量进行定量。

珠粒和凝集物将都有沉降的趋势。在一些实施方式中，这可为非期望的。为了抑制沉降，可以在孵育步骤之后和检测步骤之前以及在转移步骤之前(如果使用的话)将稠化剂通过混合添加到凝集反应中。一种适当的稠化剂是FICOLL(一种中性、高度支化、高质量、亲水性的多糖)。

微阵列数字读取器是基于相机的并且使用图像分析。它们具有窄景深。这与酶标仪形成对比，酶标仪通过使光束传递穿过样品的整个深度并测量光密度、透射率或吸光度来操作(尽管有些读取器在样品中的多个点进行测量)。由于窄景深，所以微阵列数字读取器可以并且往往只看孔的底部，在这种情况下，凝集物的沉降将是期望的。然而，也可以改变焦平面并扫描样品的整个深度以构建3维图像。这个过程通常每块平板只需要一分钟多一点。当扫描通过多个焦平面时，可需要使用稠化剂来抑制珠粒和凝集物的沉降。当使用酶标仪时，珠粒和凝集物的更均匀分布也可为有利的，因此在此类实施方式中也可以使用稠化剂。

一些酶标仪能够扫描整个孔以产生2维(对象总面积)或3维轮廓，可以从该轮廓计算所检测到的峰和谷的表面积或体积，并用于定量凝集。在一些实施方式中，测定结果基于在开始测定后的特定时间点(例如，2-20分钟或该范围内的任何整数值，例如15分钟)处的读数(例如，体积、表面积或对象总面积)。在一些实施方式中，测定结果基于读数(斜率)在从时间零到2-20分钟或该范围内的任何整数值(例如0至3分钟)的时段内的变化率。

本文所述的测定可用于出于任何目的检测SARS-CoV-2感染。然而，它们非常适合速度和/或简单性是有利或需要的情况。例如，这些测定可用于家庭筛查，例如在SARS-CoV-2感染后重返工作之前，或用于在允许人员进入任何公共集会场所(如学校、政府办公室、礼拜堂、商店、体育赛事、机场或航班等)之前进行筛查以鉴定所述人员。

当使用磁性珠粒时，可以对测定的样品本身进行通过PCR确认阳性结果的测试。将用于提取病毒RNA的试剂添加到孔或小瓶中，将珠粒磁性地分离，并将流体转移到PCR反应中。确认性PCR检测也可用于确认检测到的病毒实际上是SARS-CoV-2，而不是交叉反应的冠状病毒，或鉴定存在哪种SARS-CoV-2毒株。

或者，当唾液中存在或可能存在干扰物质时，可在PCR测试之前使用凝集试剂清洁唾液样品。将经抗SARS-CoV-2抗体包被的磁性珠粒添加到唾液样品中并孵育以结合病毒。将磁性珠粒(凝集的或未凝集的)磁性地分离并洗涤。然后像往常一样提取病毒RNA，再次将珠粒磁性地分离，并收集含有病毒RNA的流体进行PCR分析。

实施例

以下非限制性实施例仅提供用于说明目的，以便于更完全地理解现在设想的代表性实施方式。这些实施例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施方式。

实施例1

珠粒准备

如下将直径为550nm和1.6μm、负载有游离羧基的磁性珠粒用共价附接的链霉亲和素包被：

1.使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)化学品来用链霉亲和素包被1.6μm和550nm的羧基珠粒。

2.偶联缓冲液是40mM MES，pH 5.2。

3.在偶联期间，每1.0mg珠粒使用0.5mg链霉亲和素

4.每1.0mg珠粒添加0.1mg EDC(在1.6μm珠粒上18.6mol EDC/mol COOH；在550nm珠粒上9mol EDC/mol COOH)。将EDC以10mg/mL添加到40mM MES溶液，pH 5.2中。

5.在10mg/mL的珠粒浓度下进行反应。

6.使EDC反应在室温下混合约12小时

7.从珠粒上解吸被动吸附的链霉亲和素以确保共价附接，并用聚合物阻断剂封闭以减少珠粒的非特异性结合并确保单分散性。

8.将珠粒用Tween-20和NaN₃(10mM Tris、150mM NaCl、0.05％ Tween-20、0.05％NaN₃)以10.0mg/mL的珠粒浓度洗涤到TBS中。

如下将识别SARS-CoV2刺突蛋白的受体结合结构域的三种抗SARS-CoV2中和抗体生物素化：

1.将该三种抗体在PBS(40mM Na₂HPO₄、10mM KH₂PO₄、137mM NaCl、3mM KCl)pH 8.0中调至1mg/mL，总体积为100μL(100μg抗体)。

a.Sino Biological货号40591-MM43批号HB14AP2001，100μg，1.63mg/mL的PBS溶液(comp.unk.)。如由制造商报告的，通过中和测定测得的典型IC₅₀为1.41μg/mL并且通过ELISA测得的的典型IC₅₀为0.857nM的小鼠单克隆抗体。

b.Sino Biological货号40592-MM57批号HB14AP2002，100μg，1.98mg/mL的PBS溶液(comp.unk.)。如由制造商报告的，通过中和测定测得的典型IC₅₀为0.41μg/mL并且通过ELISA测得的的典型IC₅₀为3.694nM的小鼠单克隆抗体。

c.Sino Biological货号40592-R001批号HA14MY2101，100μg，5.36mg/mL的PBS溶液(comp.unk.)。如由制造商报告的，通过中和测定测得的典型IC₅₀为0.11μg/mL并且通过ELISA测得的的典型IC₅₀为0.59nM的兔单克隆抗体。

2.将QUANTA生物素-dPEG₄-TFP酯货号10009批号AF1-A0402-011在DMSO(LTBaker#9224-01批号0000217025)中重构并添加到抗体溶液中。

3.使用10X摩尔过量的用于抗体的生物素接头。

4.在旋转混合器上在室温下的孵育时间为2小时。

5.生物素化的抗体在生物素化后不脱盐。

6.将生物素化的抗体包被到以下三种尺寸的经链霉亲和素包被的珠粒上：

a.550nm—将MM43抗体以50μg抗体/mg珠粒包被

b.1.6μm—将MM57抗体以30μg/mg抗体珠粒包被

c.2.7μm—将R001抗体以10μg抗体/mg珠粒包被

如上所述制备550nm和1.6μm的珠粒。购买链霉亲和素形式的2.7μm床(Agilent PN6727-1003；每毫克珠粒2220皮摩尔的结合能力(生物素-4-荧光素结合能力))，但如上所述进行解吸和封闭。

7.将珠粒以10mg/mL的浓度包被。

8.抗体和珠粒在室温下在旋转混合器上的孵育时间为2小时。

9.(通过磁性分离)将珠粒用TWEEN-20和NaN₃(10mM Tris、150mM NaCl、0.05％Tween-20、0.05％ NaN₃)以1.0mg/mL的珠粒浓度洗涤到TBS中三次。

实施例2

凝集

将0.5mL的包被有30μg/mg MM57抗体的1.6μm直径的链霉亲和素化的磁性珠粒的1mg/mL悬液添加到各1mL的SARS-CoV-2PCR阳性口腔漱液和阴性口腔漱液中。将合并的试剂混合并在室温下孵育5分钟。凝集的珠粒在病毒阳性样品中是视觉上明显的，但在病毒阴性样品中则不明显(图1)。

实施例3

抗体解离常数的测定

使用生物层干涉测量法(bio-layer intereferometry,BLI)来确定以下四种抗体与SARS-CoV-2S1刺突蛋白的RBD部分的结合亲和力：MM57、R001、MM43和Ty1，Ty1是羊驼源纳米抗体，如上所述。将MM57、R001和MM43在随机赖氨酸处生物素化，而将Ty1在独特的C末端位点处生物素化，从而确保相对于所附接的底物的统一取向。

BLI是一种光学分析技术，其分析从以下两个表面反射的白光的干涉图案：生物传感器尖端上的固定化蛋白质层，和内部参考层。在本实例中，将生物传感器尖端用链霉亲和素包被，然后使待测抗体与链霉亲和素结合以形成固定化蛋白质层。将生物传感器尖端浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的100nM、10nM或0nM的RBD多肽溶液中，并观察当RBD多肽与抗体结合时干扰的变化。当接近饱和时，将生物传感器尖端浸入缓冲液(PBS)中，并观察当抗体解离时干扰的变化(图2A至图2D)。根据这些数据计算KD、Ka和Kd(表1)。

表1

实施例4

使用经纳米抗体包被的珠粒进行SARS-CoV-2凝集

这个实验是使用包被到以下三种不同珠粒上的Ty1单生物素化的纳米抗体进行的：JSR Magnosphere^TMMS55/羧基，包被有链霉亲和素的550nm珠粒(珠粒尺寸1)；JSRMagnosphere^TMMS160/羧基，包被有链霉亲和素的1.6μm珠粒(珠粒尺寸2)；和Agilent2.7umLodeStars链霉亲和素珠粒(珠粒尺寸3)。将珠粒按如上所述处理并以1mg/ml悬浮在Tris缓冲盐水(TBS；10mM Tris、150mM NaCl、0.05％ TWEEN-20、0.05％ NaN3，pH 7.4)中。

阳性和阴性样品是口腔漱液加插入的鼻拭子。病毒已通过于60℃下孵育10分钟进行了热灭活。这会使病毒蛋白部分变性，并且与新鲜的患者样品相比，预计会在一定程度上降低测定的灵敏度。阳性和阴性样品已通过PCR进行验证。PCR测定中的检测限为约15个病毒体/mL，并且对应于约38个循环的循环时间(cycle time,Ct)。阴性样品的Ct>40。这个实验中使用的阳性样品的Ct为27.9。

将100μL的阳性或阴性样品与50μL、100μL或200μL的三种尺寸中的每种尺寸的珠粒悬浮液在单个小瓶中组合。在室温下孵育5分钟后，通过眼睛以以下等级对凝集进行评分：0-无凝集，1-轻微凝集，2-良好凝集，3-优异凝集。这些结果呈现在表2中。

表2.

将这些小瓶随机分配并呈现给六名实验室技术人员中的每一位实验室技术人员，要求所述实验室技术人员对所述小瓶是否存在棕色沉淀物进行评分。所有六名实验室技术人员都容易地挑出了9个阳性样品和3个阴性样品，实现了100％的阳性一致性和100％的阴性一致性。

实施例5

使用各种抗体和珠粒尺寸的SARS-CoV-2凝集

这个实验比较了用实施例3中表征的四种抗体中的每种抗体包被的如实施例4中所述的三种珠粒尺寸中的每种珠粒尺寸。在96孔平板中进行实验。96孔平板已经通过与0.023％ PLURONIC F108和0.05％ TWEEN-20的TBS溶液一起孵育5分钟进行预处理来阻断病毒或珠粒与孔表面的结合，在此之后吸出封闭液。

然后，将66μL的各种珠粒悬浮液(1mg/mL的TBS溶液)分配到黑色透明平底96孔平板的孔中。将33μL样品(含0.9％盐水的口腔漱液，加插入的鼻拭子，热灭活的)添加到珠粒中，并用手轻轻旋动平板以混合。这个实验中使用的阳性样品的Ct为27.9。将珠粒在室温下孵育并使其沉降(>5分钟)。随后用聚焦在孔底部的微阵列读取器对孔进行成像。

表3.

在这个实验中，Ty1纳米抗体显示出对珠粒尺寸的最低敏感度。具有较低亲和力之一的MM43抗体始终表现不佳。图3和图4分别示出了来自将经Ty1包被的550nm珠粒和经R001包被的2.7μm珠粒与SARS-CoV-2阴性和阳性样品一起孵育的图像。

实施例6

使用不同珠粒与样品比率的凝集

使用经封闭的96孔平板，以与上述实施例5类似的方式使用经Ty-1包被的1.6μm珠粒进行这个实验。阳性样品已热灭活，并且其PCT Ct为27.9。准备了五个样品：单独的珠粒；100μL阴性口腔漱液+100μL珠粒悬浮液(1mg/mL)；和100μL阳性口腔漱液加50μL、100μL或200μL珠粒悬浮液(样品与珠粒的比率(体积:体积)为2:1、1:1和1:2)。使用微阵列读取器对孔进行成像，其中焦平面设置在孔底部，并且在珠粒完全沉降后拍摄图像。所述图像在图5中示出。

实施例7

使用添加振荡步骤的凝集

这个实验是使用在经封闭的96孔平板中的经Ty1包被的2.7μm珠粒进行的。阳性(Ct为27.9)和阴性样品是口腔漱液加插入的鼻拭子。一组反应使用66μL珠粒(1mg/mL的TBS溶液)和33μL样品，比率为2∶1，并且第二组反应使用各50μL的珠粒和样品，比率为1:1。将反应物孵育约一分钟，然后放入37℃的平板摇床中5分钟。将摇床设置为以约1000次循环/分钟进行线性振荡。取下平板，并在从下方照亮平板的同时，使用配备有外部15x放大镜头的智能手机相机从上方对平板进行成像。凝集物在孔的中心附近形成暗条带。图像处理可使阳性与阴性之间的差异更加明显。参见图6A和图6B。

实施例8

凝集反应中珠粒浓度的滴定

这个实验是使用在经封闭的96孔平板中的经R001包被的2.7μm珠粒进行的。阳性样品和阴性样品是口腔漱液加插入的鼻拭子，并且阳性样品的PCR Ct为25.92，使用珠粒含量比率为100:75:50:25:10:0的六种浓度的珠粒稀释系列。珠粒浓度最高的孔接收66μL的2mg/mL TBS悬浮液，其中稀释系列中的每个连续孔接收比例较小的体积。缺失的体积用稀释剂0.9％盐水(与口腔冲洗溶液相同)补足。每个孔按此次序接收稀释剂、99μL样品和珠粒。如上所述，反应设置在封闭、平底和透明的黑色96孔平板中。在添加试剂后，将平板静置5分钟而不混合，然后置于37℃的平板摇床中5分钟。将摇床设置为以约1000次循环/分钟进行线性振荡。将平板从平板摇床中取出，并使用智能手机获得图像(参见图7)。在最高珠粒浓度下，阳性与阴性样品之间的差异相对较小，但是随着珠粒浓度降低，在阳性孔的中心形成了越来越明显的条带，而阴性孔中珠粒保持扩散和有点圆形的图案。

实施例9

用于SARS-CoV-2凝集测定的即时检验设备

图8中描绘了可最小化样品处置和操纵的即时检验设备。

将口腔漱液(或类似样品)添加到盐水冲洗贮存器中，并压下柱塞，使样品混合并被收集在读取填充室中。不需要对样品或测试试剂进行其他操纵。在视觉上或使用智能手机相机和应用程序对凝集进行评定。

该设备包括圆柱体和微流控模块。该圆柱体包括柱塞并且包括三个空间和四个通道。圆柱体在柱塞头上方的内部体积构成了接收样品的盐水冲洗贮存器。圆柱体的在柱塞头下方的内部体积被可变形塑料或

膜一分为二。所述空间中的一个空间构成珠粒室，所述珠粒室包含经抗RBD抗体包被的珠粒的悬浮液。另一个空间是盐水测量室。其体积小于盐水贮存器的体积和样品的预期体积。通道(如图所示在圆柱体的左侧)允许将样品从盐水冲洗贮存器排入盐水测量室，而排气通道(未图示)允许空气逸出。通过填充盐水测量室，获得了固定体积的样品，而无需用户测量或转移样品。来自所述室中的每个室的通道通向微流控模块的流体混合路径。在连接到流体混合路径之前，这两个通道可以任选地在内联混合器(未图示)处汇合。读取填充室装有溢出阀以允许空气在填充所述室时逸出，但防止液体离开所述室。读取填充室的顶部是透明的，例如薄的透明光学聚苯乙烯，以便可以观察和/或拍摄是否存在凝集物形成。读取填充室的底部可和顶部一样是透明的，在这种情况下，所述设备应放置在浅色背景上以进行读取(拍照)。或者，底部可以是不透明的白色塑料。

一旦有足够的样品排出以填充盐水测量室，就可以压下柱塞。在压下柱塞后，将珠粒悬浮液和样品保留在其腔室中的密封件被破坏，并且两种流体流过圆柱体底部的通道，通过T形接头、内联混合器(如果存在的话)和流体混合路径进入读取填充室。流体混合路径的曲折度也有助于混合。该设备可以按比例缩放以使用各100μL的珠粒悬浮液和样品进行操作。

实施例10

POC—基于智能手机应用程序的测试

使用智能手机相机对完成的凝集反应进行成像，并使用应用程序读取结果。诊断结果基于由经阳性样品和阴性样品训练的AI进行的图像分析。这种技术防止在读取样品时出现人为错误，并使每个人都能快速、轻松、准确地进行测试。

为了运行此POC测试，使用以下程序：

1)从套件中取出塑料吐杯

2)从套件中取出口腔冲洗溶液瓶，取下旋盖，将全部5mL口腔漱液倒空到口中，鼓动25秒并漱5秒。

3)将5mL口腔冲洗唾液样品吐入塑料吐杯中

4)从套件中取出毛细口针设备(唾液样品收集设备)，将所述毛细口针设备插入吐杯中的口腔冲洗唾液样品中，以吸取50uL唾液样品到毛细口针中

5)从套件中取出凝集试剂密封小瓶并混合10次(上/下颠倒)以将珠粒混合成悬浮液。(如果使用透明小瓶，则可以指导用户混合直至变成浅棕色，没有可见的黑点或珠粒团块)。

6)通过以下方式将带有唾液样品的毛细口针插入凝集试剂中：在插入时刺破密封件并插入，直到毛细口针紧贴或紧密地适配到凝集试剂小瓶中以形成密封。

7)将唾液样品与凝集试剂通过颠倒10次进行混合。

8)取下覆盖插入凝集试剂小瓶的毛细口针设备上的滴管端的盖子。

9)将带有测试室的测试卡放在平坦表面上，或者也将测试室放在测试卡上，使测试卡覆盖测试室轮廓或正方形。

10)将滴管端保持在测试室上方并轻轻挤压瓶以添加足够数量的液滴以覆盖测试室底部。

11)该应用程序将有计时器，并指示如何以及何时拍摄在测试卡前面的测试室中的样品的照片(图9A)

12)测试结果显示在应用程序上(图9B)

显示在智能手机屏幕上的测试结果可包括时间码(参见图9B，左小图)，该时间码指示人员何时被测试为阴性(或阳性)。阴性测试码可以作为标识以便于进入公共集会场所(例如，航班、工作、体育赛事、教堂、学校等)。代替或作为时间码的补充，还可以有条形码或QR码。结果屏幕可以针对文本和图像或背景使用不同的颜色。例如，阴性结果屏幕可以使用绿色或蓝色，阳性测试屏幕可以使用红色、橙色或黄色；并且不确定的测试屏幕可以使用蓝色或黑色。对每个结果使用不同颜色的其他配色方案也是可能的。

实施例11

凝集病毒的确认测试

冠状病毒可能会与任何特定的抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体发生交叉反应，并且可生成假阳性结果。此外，已鉴定出多种SARS-CoV-2毒株，并且个体感染了哪种毒株可具有临床或流行病学意义。因此，可为有用的是确认凝集物中捕获的病毒体实际上是SARS-CoV-2和/或鉴定它们是哪种毒株。这两个目的都可以通过对捕获的病毒体进行PCR(或类似)测试来实现。

将结合凝集物的病毒体热灭活和裂解，将珠粒磁性地分离，并将含有裂解病毒的液体吸出并像往常一样进行PCR。或者，通过用甘氨酸pH 2.5洗脱缓冲液洗涤来洗脱病毒体。然后将溶液调节至中性pH，将珠粒磁性地分离，并吸出经洗脱的纯化病毒体并像往常一样进行PCR。

实施例12

用经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的磁性珠粒进行样品清洁

唾液不一定是干净的物质，而是可能含有来自咖啡、口香糖、烟草、食物等的物质，所述物质可干扰PCR测定。经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的磁性珠粒提供了一种从唾液样品清洁干扰PCR测试的干扰物的方法。对于这种应用，凝集不是必要的，只要病毒体与珠粒结合即可。

将经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的磁性珠粒添加到唾液样品中以捕获SARS-CoV-2病毒体，以便用0.9％盐水进行磁性洗涤以洗去这些干扰物。然后将结合珠粒的病毒体热灭活和裂解，将珠粒磁性地分离，并将含有裂解病毒的液体吸出并像往常一样进行PCR。

或者，通过用甘氨酸pH 2.5洗脱缓冲液洗涤来洗脱病毒体。然后将溶液调节至中性pH，将珠粒磁性地分离，并吸出经洗脱的纯化病毒体并像往常一样进行PCR。

实施例13

用于SARS-CoV-2聚集/凝集测定的模型方案

方法概述：将包被有抗SARS-CoV-2刺突-RDB蛋白的抗体的顺磁性微粒子(paramagnetic microparticle,PMP)引入来自混入到生理盐水中的鼻拭子的人样品中。PMP通过团聚在一起进行反应。然后对团聚的PMP进行成像和计数，例如，通过BioTekCytation 5显微细胞计数器。在尺寸选通门(size gate)中对团块进行计数。计数的团块或团块随时间推移的增加速率与样品中SARS-CoV-2病毒体的存在成比例。

材料：

1)与生物素化的MM57抗RBD单克隆抗体缀合的经链霉亲和素包被的PMP(直径为1.6μm)(参见实施例1)。

2)鼻腔收集拭子(Copan PN502CS01 Copan Diagnostics Inc,26055JeffersonAve,Murrieta,CA 92562)。

3)盐水(0.09％ NaCl在纯水中的溶液)。

4)Cytation 5细胞成像多模式读取器。

5)Alpaqua Catalyst^TM96，96孔开槽环形磁性平板SKU：A000550(AlpaquaInc.100Cummings Center,Suite#424A,Beverly,MA 01915)。

6)反应平板(Corning PN353910Corning Inc,1River Front Plaza Corning NY14831)

7)半面积读取平板(Greiner PN675090Greiner BioOne GMBH Maybach St 2,72636Frickenhausen,Germany)。

8)TTA：含有0.05％ Tween 20和0.05％叠氮化钠的Tris缓冲盐水。

该方案可以适用于使用来自其他供应商的等效试剂。

方案3样品收集

1)给患者无菌样品拭子

2)指导患者通过抵靠鼻管旋转拭子5次轻轻拭抹前鼻管。

3)将拭子直接放入15mL收集管中的3mL盐水中

4)盖上管并进行涡旋

5)将液体移至二级收集管并离心

6)取出经离心的澄清液体进行测试

测试方案

1)将50μL经离心(以21380rcf离心10分钟)的患者样品添加到反应平板中

2)将50μL的1mg/mL抗体缀合的PMP的TTA溶液添加到反应平板中的各个50μL患者样品中

3)在30℃的振荡摇床(500RPM)中放置30分钟

4)将反应平板放在96位磁铁上5分钟

5)通过向每个孔中添加15μL TTA来条件化读取平板

6)使用移液器混合将反应平板沉淀重悬

7)将10μL来自步骤6的重悬的PMP添加到半面积读取平板中

8)将读取平板放入Cytation 5中，并以3分钟间隔进行动力学读取15分钟

9)输出以下OSA尺寸选通门数据

a.2-30微米(优选的)

b.15-20微米

c.25-30微米

d.或根据0分钟和3分钟处的数据测量值计算斜率。

10)使用盐水信号+15％作为阳性截止值

11)阳性样品有信号>盐水+15％

实施例14

SARS-CoV-2测定结果

将阳性和阴性患者唾液样品和连续稀释的SARS-CoV-2病毒基本上如实施例13(上文)所述进行测定。将数据收集选通门设置为2-30微米，并从0分钟至15分钟以3分钟增量进行读取(图10A)。从Access Genetics(Eden Prairie,MN)获得来自四名SARS-CoV-2感染患者的唾液样品以及PCT测定结果。使用经伽马辐射的SARS相关冠状病毒2，分离株USA-WA1/2020(BEI Resources,Manassas,VA)来制备病毒体在盐水中的10⁶至10²个病毒体/mL的10倍连续稀释。

对三个阴性样品(一个盐水样品和两个来自未感染志愿者的唾液样品)的对象总面积(OSA)读数(珠粒的二维投影)取平均，并将阳性与阴性之间的截止值针对15分钟端点(665667)和0分钟至3分钟的斜率(137900)设置为阴性样品的平均OSA读数的115％。还确定了每个阳性样品与阴性样品的OSA读数平均值之间的信噪比(S/N；图10A)，表明可以轻松区分阳性和阴性样品。针对15分钟终点(图10B)和0分钟至3分钟内的斜率(图10C)两者绘制样品中的每个样品的OSA读数。(将阴性样品任意绘制为0.1个病毒体/mL，因为在对数刻度上没有真正的零)。同样，人们可以容易地区分阳性样品和阴性样品。测定的结果是定性的而不是定量的。病毒体浓度(或PCR循环数)与读数量值之间没有相关性。

实施例15

SARS-CoV-2测定结果(鼻拭子)

该测定在与上述实施例不同的条件下运行。测定了SARS-CoV-2感染者和未感染者的鼻拭子样品(如通过PCR判断的)、经RBD包被的胶乳珠粒和经滴定的病毒体样品。在96孔平板中添加20μL鼻拭子样品，补足至50μL。然后，将80μL与抗RBD单克隆抗体缀合的PMP添加到每个孔中，并在外部平板加热器上在于37℃孵育5分钟。将该位置插入环境温度下的Biotek Cytation 5酶标仪，并在9-99微米粒径窗口中收集OSA读数(图13A至图13B)。在17-21分钟的时段内计算斜率。

如在表4(以下)中看到的，小于约1000的斜率与阴性样品相关。尽管每样品10个病毒体低于通过PCR检测到的，但是其在这个凝集测定中给出了阳性信号。

表4.各种样品和对照的OSA和计算斜率

*PCR阴性结果被取为Ct≥40

**来自Access Genentics的经PCR确认的患者样品

最后，应理解，尽管通过参考具体实施方式突出了本说明书的各方面，但本领域技术人员将容易理解，这些公开的实施方式仅说明本文公开的主题的原理。因此，应理解，所公开的主题绝不限于本文所述的特定方法、方案和/或试剂等。如此，在不脱离本说明书的精神的情况下，可以根据本文的教导对所公开的主题进行各种修改或改变或替代配置。最后，在此使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。因此，本发明不限于精确地如所示和所述的那些。

本文描述了本发明的某些实施方式，包括本发明人已知的用于实现本发明的最佳方式。当然，对于本领域普通技术人员来说，在阅读前面的描述后，这些描述的实施方式的变型将变得显而易见。本发明人希望技术人员适当地采用此类变型，并且本发明人希望以不同于本文具体描述的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的本文所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述实施方式的所有可能变型的任何组合。

本发明的替代实施方式、要素或步骤的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独地或与本文公开的其他组成员任意组合地被提及和要求保护。预期组中的一个或多个成员可以出于方便和/或可专利性的原因而被包括在组中或从组中删除。当发生任何此类包括或删除时，本说明书被视为包含经修改的组，从而满足对所附权利要求书中使用的所有马库什组的书面描述。

除非另有说明，否则在本说明书和权利要求中使用的表示特征、项目、数量、参数、性质、术语等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。如本文所用，术语“约”是指如此限定的特征、项目、数量、参数、性质或期限包括高于和低于所述特征、项目、数量、参数、性质或期限的值的±10％的范围。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是可以变化的近似值。无论如何并非试图限制权利要求书范围的等同物的原则的应用，每个数值指示应至少根据报告的有效位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和数值是近似值，但具体实施例中列出的数值范围和值尽可能精确地报告。然而，任何数值范围或值固有地含有必然由其各自相应的测试测量中存在的标准偏差引起的某些误差。本文中对数值范围的描述仅旨在用作为引用落入该范围的每个单独数值的速记方法。除非本文另有说明，否则数值范围的每个单独的值被并入本说明书中，如同在本文中被单独引用一样。

除非在此另外指明或者明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一个”、“该”以及类似的指示词应被解释为涵盖单数和复数两者。除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有示例、或例示性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何不要求保护的要素对于本发明的实践为必不可少的。

本文公开的具体实施方式可以在权利要求中使用由......组成或基本上由……组成的语言来进一步限制。当在权利要求中使用时，无论是原始提交还是按照修正添加，过渡术语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，以及不会对基本和新颖特征产生实质性影响的那些材料或步骤。如此要求保护的本发明的实施方式在本文中被固有地或明确地描述和实现。

本说明书中引用和标识的所有专利、专利出版物和其他出版物均单独和明确地以引用方式整体并入本文，以用于描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类出版物中描述的组合物和方法的目的。提供这些出版物仅仅是因为它们在本申请的提交日之前的公开内容。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借在先发明或任何其他原因而先于此类公开。关于这些文献的的日期或内容的陈述都是以申请人可获得的信息为基础，申请人并不能保证所有这些文献的日期或内容的正确性。

Claims

1.一种检测一个或多个个体的SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括：

a)将经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒与来自所述一个或多个个体中的每个个体的唾液样品单独组合以形成与每个个体对应的混合物；

b)混合每个个体的混合物的所述珠粒和唾液样品；

c)孵育所述混合物；以及

d)检测每个个体的混合物中是否已发生凝集。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面抗原是S1或S2刺突蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体识别所述S1刺突蛋白的受体结合结构域或N末端结构域(NTD)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述唾液样品包含在口腔冲洗流体中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述口腔冲洗流体是通过以下方式获得的：使所述一个或多个个体中的每个个体在其口腔中鼓漱盐水溶液，然后吐出到收集器皿中，由此获得所述口腔冲洗流体。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒是有色的并且具有深或强的色度。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒是磁性的。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒是链霉亲和素化的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗体是生物素化的并且生物素部分与链霉亲和素结合。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒的直径为1.3μm至1.9μm。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒的直径为1.6μm。

12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒的直径为2.7μm。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒包含25μg抗体/mg珠粒至35μg抗体/mg珠粒。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒包含30μg抗体/mg珠粒。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述孵育在室温下进行的。

16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述孵育是于37℃下进行的。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中每种混合物孵育2-5分钟。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述检测包括视觉观察。

19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用相机。

20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述检测包括使用光密度计。

21.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法包括在混合或孵育步骤之后将来自每个个体的混合物的等分试样转移到多孔板的孔中，并检测每个个体的混合物是否已发生凝集。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述检测包括使用酶标仪。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述检测包括使用微阵列数字读取器。

24.根据权利要求23所述的方法，所述方法进一步包括在所述孵育步骤之后但在所述转移步骤之前向所述混合物中添加稠化剂。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述稠化剂是FICOLL。

26.根据权利要求21-25中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：

a)将含有已知量的病毒体的样品与所述经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒组合，以形成与每个病毒体量相对应的标准曲线混合物，

b)混合每个标准曲线混合物的所述珠粒和病毒体样品，

c)孵育所述标准曲线混合物，以及

d)在所述混合或孵育步骤之后将每个标准曲线混合物转移至所述多孔板的孔中，并检测每个标准曲线混合物是否已发生凝集；

其中将所述标准曲线混合物用作校准曲线，可以从校准曲线定量所述唾液样品中的所述病毒量。

27.一种检测一个或多个个体的SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括：

检测与每个个体对应的孵育混合物中是否已发生凝集，

其中每个混合物包含经抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体包被的珠粒和来自一个个体的唾液样品。

28.根据权利要求27所述的方法，其中将所述孵育的混合物在室温下孵育2-5分钟。

29.根据权利要求27所述的方法，其中同时振荡所述孵育的混合物1-5分钟。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述孵育于37℃下进行。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述抗SARS-CoV-2表面抗原的抗体是羊驼源纳米抗体。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述纳米抗体是Ty1。