JP2022531341A - デジタルマイクロ流体凝集アッセイ - Google Patents

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Abstract

本開示は、「２プレート」ＤＭＦデバイスフォーマット上で凝集アッセイを実行する方法を提供する。目的分析物（粒子、細胞など）を含有する液滴が、ＤＭＦデバイス内にロードされ、液相または乾燥凝集抗体または抗原と混合される。凝集剤は、サンプル液滴のそれらの相補的な標的（例えば、例において抗体または抗原）と結合し、不溶性凝集体を形成する。ＤＭＦデバイス上の激しい混合により、反応時間を減らし、凝集効果を高める。凝集されたサンプルはＤＭＦデバイス上で２つのプレートの間に挟まれるので、結果を目でまたはデジタルカメラ越しに視覚化することが簡単である。【選択図】図１

Description

本開示は、「２プレート」デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）デバイスフォーマットを用いて凝集アッセイを行う方法に関する。目的分析物（粒子、細胞など）を含有する液滴がＤＭＦデバイス内にロードされ、液相または乾燥凝集抗体または抗原と混合される。
凝集アッセイは、サンプル内の分析物の存在を検出するために一般に用いられるものであり、典型的な用途として、感染症および病原体検出、ならびにドナー適合性のための血液型判定が挙げられる。凝集アッセイは、目的分析物との抗体または抗原の相互作用に依るものであり、この相互作用の結果、目で見ることができる大きな不溶性の塊または凝集体が形成される。かくして、凝集アッセイは、そうしたアッセイに用いられる他の技術（光子または電気エネルギーの計器測定に依る）に対して独自の利点－アッセイの結果が非常に読み取りやすい－を有する。
従来の凝集アッセイでは、抗体または抗原で被覆された粒子がサンプルと混ぜ合わされ、手動で混ぜられ、凝集体の存在を目視検査で判定する。標準技術の明らかな欠点として、手動混合の必要性、アッセイ読み出しの解釈におけるエラーの可能性、および低スループットが挙げられる。これら欠点に対処しようと試みるマイクロ流体デバイスにおける凝集アッセイが近年開発されてきている。例えば、Ｃａｓｔｒｏらは、撮像ベースの検出と組み合わせた混合のために流体力に依る凝集アッセイにおけるマイクロ流体法を記載した。これは、ユーザの入力を限定しかつ分析変動性を最小化するのに有用であると記載された。凝集アッセイの他のマイクロ流体実装は、フローサイトメトリー、光散乱、蛍光、および光学顕微鏡法に依るものであった。これらの検出法は、方法の開発および最適化には有用であるが、凝集の主な利点－複雑な検出スキームを必要とせずにテストの結果を読み取る機能を（最終的に）打ち消すことになる補助検出器を要する。
これまでに記載されたマイクロ流体ベースの凝集アッセイに影響を与える他の課題として、サンプルがマイクロ流体デバイスに導入される前に希釈されなければならないという要件があり、これはアッセイを複雑化させる。理想的な方法は、専門家以外の使用に対応可能である未処理のサンプルを受け入れるものである。さらに、狭いチャネルで凝集体を操作すると、チャネルの詰まりが引き起こされ得、デバイスの故障および信頼性に関する問題がもたらされ得る。最終的に、従来のマイクロ流体の代替として、ラテラルフローベースの「紙マイクロ流体」フォーマットに実装された凝集アッセイ法の多くの例がある（例えば、ＹｏｏｎおよびＹｏｕ）が、これらの方法は通常、低スループットを有し、かつ／または、手動での洗浄ステップを必要とする。ここで、上述の技術の制限を克服するデジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）に依る新規の方法を紹介する。
ＤＭＦは、ピコリットルからマイクロリットルのサイズにされた液体液滴を操作するのに静電力を用いる液体処理技術である。ＤＭＦの最も効果を発揮するフォーマットは、絶縁電極のアレイを露出させた対向する電極上部プレートと底部プレートの間に液滴が挟まれる「２プレート」構成である。２プレートフォーマットで操作すると、液滴を分注、分割、合流、かつ混合することができ、サンプル処理、免疫測定、および化学反応においてＤＭＦは極めて有用なものとなる。ＤＭＦは、従来のマイクロ流体法と多くの違いを有し、それには、多用途性（汎用デバイスアーキテクチャは多様な用途に用いることができる）、可動部品の必要なしに試薬（液体または乾燥状）位置全体への全面的な制御、チャネルを詰まらせることのないオープン形状での操作が含まれる。
本発明者らは、ＤＭＦデバイスに実装された凝集アッセイのこれまでの２つの記載を念頭に置いている。１つの方法は、ラテックス免疫凝集アッセイに後方光散乱検出を用いており、もう１つの方法は、検出のためのマイクロ分離手順に加えて、目的バイオマーカの凝集に官能化金ナノ粒子を用いた。これらの技術のいずれもデジタルマイクロ流体の「標準」フォーマットで実施されていないことに留意されたい。すなわち、第１の技術は、液滴を操作するのに電界を用いておらず（反対に、ＸＹＺステージが制御されたワイヤを用いて、液滴を表面の周りで機械的に押し出す／引っ張る）、第２の技術は、いわゆる「単一プレート」ＤＭＦを用いる（本明細書中で開示された方法で用いられる、より効果を発揮する「２プレート」ＤＭＦフォーマットとは異なり）。これらの「非標準」ＤＭＦフォーマットは、概念実証には有用であったが、それらの技術は、２プレートデジタルマイクロ流体における一般プレートとなっている完全一体型サンプルインアンサーアウトシステムのタイプとほぼ確実に互換性がないことが示唆される。
デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）という用語は、液体液滴操作システムを説明するのに広く用いられてきた。化学または熱勾配、磁石、音波、機械的および電気的方法を用いるといったいくつかの流体アクチュエータが記載されてきた。本発明は、誘電体上エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）としばしば称される静電液体操作力を用いることに依るので、１プレートと２プレートのＤＭＦ ＥＷＯＤデバイスの比較にのみ焦点を当てる。他の全てのデバイス（ＥＷＯＤでない）は、本発明に無関係な他の液体操作技術を用いるのでこれ以上は説明しない。
ＤＭＦ ＥＷＯＤシステムは、多くの場合２つの主なカテゴリに分けられる。すなわち、単一プレートＤＭＦと２プレートＤＭＦである。単一プレートＤＭＦデバイスから２プレートＤＭＦデバイスに移行するにはいくつかの理由および重要な技術的課題が存在する。１プレートＤＭＦデバイスという用語は、液滴が水平固体基板上に自由に置かれているオープンシステムを記載するのに用いられ、２プレートＤＭＦデバイスという用語は、液滴が２つのプレートの間に閉じ込められる被覆型システムを記載するのに用いられる。両タイプのデバイスは、操作のために十分な接地を必要とする。すなわち、１プレートデバイスは、液滴と直接接触する外部ワイヤまたは作動電極と同一の面内の電極のいずれかを必要とし、２プレートデバイスでは、グラウンドが上部プレート内に配置される。
プレート数以外に、これら２つのタイプのＤＭＦデバイスは、液滴操作を実行する機能の点で完全に異なるものである。液滴運動は、２プレートシステムの方が簡単である。さらに、液滴の分割および分注は、２プレートシステムのほぼ排他的なオプションである。それに対して、激しい混合、蒸発（種の濃縮のための）、および液体液滴への直接的なアクセスが必要とされるときは、１プレートデバイスが好ましい。なぜなら、液滴が容易に使用可能であるからである。１プレートデバイスは、多くの場合、はるかに高い電圧および低い周波数で動作するものであり、２プレートシステムとは異なるハードウェア設備を必要とする。したがって、凝集アッセイに用いられるデジタルマイクロ流体の記載はこれまでにもあるが、これらのデバイスによる凝集からいかにして２プレートＤＭＦシステムに移行し得るかは明らかではない。なぜなら、２つのタイプのデバイス間に多くの技術的な差異があるからである。それは、本明細書に記載される２プレートＤＭＦデバイス上の凝集アッセイを開発するために最適化かつ判定される必要がある。
さらに、凝集アッセイの観点からも、これまでの記載のいずれも理想的ではない。すなわち、後方散乱技術は、分析用の補助設備を必要とし、ナノ粒子ベースの技術は、遅く（ユーザは分析前に各サンプルが蒸発するのを待機しなくてはならないので）、カスタムで高価なナノ粒子ベースの試薬を必要とする。どちらの方法も１０年よりも前に記載されフォローアップ文献は出版されておらず、コミュニティによる理解が遅い（またはない）ことが示唆されることに我々は着目している。
本開示は、「２プレート」デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）デバイスフォーマット上で凝集アッセイを行う新規の方法を提供する。目的分析物（粒子、細胞など）を含有する液滴が、ＤＭＦデバイス内にロードされ、液相または乾燥凝集抗体または抗原と混合される。凝集剤は、サンプル液滴内のそれらの相補的な標的（例えば抗体または抗原）と結合し、不溶性凝集体を形成する。ＤＭＦ上の激しい混合により、反応時間を減らし、凝集効果を高める。凝集されたサンプルはＤＭＦデバイス上で２つのプレートの間に挟まれるので、結果を目でまたはデジタルカメラ越しに視覚化することが簡単である。
かくして、本開示は、複数の駆動電極を有する２プレートエレクトロウェッティングデジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）を用いて、分析物を含有するサンプルを特徴付ける方法を提供する。方法は、
凝集剤を上記ＤＭＦデバイス上にロードするステップと；
分析物を含有する流体サンプルを上記ＤＭＦデバイス上にロードするステップと；
エレクトロウェッティングを用いて、流体サンプルを凝集剤と接触させて、分析物を凝集させ凝集体を生成するステップとを含む。
方法は、さらに、凝集剤によって引き起こされた分析物の凝集量を特徴付けるステップを含み得る。
上記ＤＭＦデバイス上にロードされた流体は、界面活性剤を含有し得る。
界面活性剤は、予備乾燥された形態であり得、方法は、さらに、１つまたは複数の駆動電極を、事前判定されたスポットまたはデバイス表面全体にわたって、予備乾燥された形態の界面活性剤で被覆し、それによって、流体サンプルが予備乾燥された界面活性剤と接触したときに、可溶化し、界面活性剤が流体内に少なくとも０．０１％ｗｔ：ｗｔの量で存在し得るようにすることを含み得る。ＤＭＦデバイス上で試薬を乾燥かつ再構成するプロセスは、ＵＳ２０１４／０１４１４０９ Ａ１（Ｆｏｌｅｙら）に記載された方法にしたがって実行され得る。
界面活性剤は、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のどちらかであり得る。イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、臭化セトリモニウム、塩化セトリモニウム、およびラウリル硫酸ナトリウムからなる群から選択され得る。非イオン性界面活性剤としては、以下に限定されるものではないが、アルキルフェノールヒドロキシポリエチレン（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ ＲＴＭ）、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ ＲＴＭ）、ポロキサミン（例えば、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ＲＴＭ）、ポロキサマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ＲＴＭ）、およびソルビタンエステルが挙げられる。ポロキサマーは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）を備え得る。
凝集剤は、事前選択された駆動電極にロードかつ計量供給された液体であり得る。
凝集剤は、予備乾燥された形態であり得、方法は、さらに、１つまたは複数の駆動電極を、上記ＤＭＦデバイスの表面の事前判定されたスポットで、予備乾燥された形態の凝集剤で被覆し、それによって、流体が予備乾燥された凝集剤と接触したときに、可溶化するようにすることを含み得る。ＤＭＦデバイス上で試薬を乾燥かつ再構成するプロセスは、ＵＳ２０１４／０１４１４０９ Ａ１（Ｆｏｌｅｙら）に記載された方法にしたがって実行され得る。
方法は、さらに、ＤＭＦデバイス上でエレクトロウェッティングを用いて凝集剤を流体サンプルと激しく混合するステップを含み得る。
凝集剤は、凝集体を生成可能な物質の任意の１つまたは組み合わせを備え得る。物質の例は、化学凝集剤および生物凝集剤を含む。赤血球の凝集に対して、化学凝集剤は、ポリ－Ｌ－リシン臭化水素酸塩、ポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）クロリド（Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）－１００、Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）－２８０ ＲＴＭ、Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）－５５０ ＲＴＭ）、ポリ－Ｌ－アルギニン塩酸塩、ポリ－Ｌ－ヒスチジン、ポリ（４－ビニルピリジン）、ポリ（４－ビニルピリジン）塩酸塩、架橋ポリ（４－ビニルピリジン）、塩化メチル第４級塩、ポリ（４－ビニルピリジン－ｃｏ－スチレン）；ポリ（４－ビニルピリジニウム ポリ（フッ化水素））；ポリ（４－ビニルピリジニウム－Ｐ－トルエンスルホナート）；ポリ（４－ビニルピリジニウム－トリブロミド）；ポリ（４－ビニルピロリドン－ｃｏ－２－メタクリル酸ジメチルアミノエチル）；架橋ポリビニルピロリドン；ポリビニルピロリドン、部分メチル化ポリ（メラミン－ｃｏ－ホルムアルデヒド）；臭化ヘキサジメトリン；ポリ（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ）１：４臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）３：１臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）２：１臭化水素酸塩；ポリ－Ｌ－リシンスクシンシニル化；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）１：１臭化水素酸塩；およびポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｐ）１：４臭化水素酸塩からなる群から選択され得る。
化学凝集剤は、ポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）クロリドであり得る。
生物凝集剤は、タンパク質、抗体、ウィルスおよび抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡベースのアプタマーからなる群から選択され得る。
タンパク質は、糖構造と可逆的に結合可能なレクチンを備え得る。抗体は、抗Ａ、抗Ｂ、および抗Ｄを備え得る。
ウィルスは、インフルエンザウィルスを備え得る。
凝集剤によって引き起こされた分析物の凝集の量を特徴付けるステップは、視覚的な特徴付けを含み得る。この視覚的な特徴付けは、ＤＭＦデバイスを観察して凝集量を見積もる者によるものであり得る。代替として、視覚的な特徴付けのステップは、カメラを用いて実行される。カメラは、ウェブカム、携帯電話カメラ、デジタルカメラ（デジタル一眼レフカメラ、ＤＳＬＲを含む）、ビデオカメラ、監視カメラ、コンパクトカメラ、ＣＣＤ検出器付きカメラ、ＣＭＯＳ検出器付きカメラ、モノクロカメラ、白黒カメラ、カラーカメラのうちのいずれか１つであり得る。
粒子は、凝集剤で被覆され得る。これらには、ポリマー粒子（例えばラテックス）、金、銀、ナノ粒子およびマイクロ粒子のうちの任意の１つまたは組み合わせが含まれ得る。ポリマー粒子はラテックスを備え得る。
検出対象の分析物は抗体であり得、粒子は、抗原、または目的抗体を捕捉可能な他の剤で被覆され得る。
検出対象の分析物は抗原であり得、粒子は、抗体、または目的抗原を捕捉可能な他の剤で被覆され得る。
検出対象の分析物は細菌であり得、粒子は、抗体、または目的細菌を捕捉可能な他の剤で被覆され得る。
検出対象の分析物はウィルスであり得、粒子は、抗体、または目的ウィルスを捕捉可能な他の剤で被覆され得る。
方法は、ポリマー粒子の懸濁液の凝集に用いられ得る。
方法は、ナノ粒子の懸濁液の凝集に用いられ得る。
方法は、赤血球の懸濁液の凝集に用いられ得る。
流体は、少なくとも赤血球を有する血液サンプルであり得る。
流体は、赤血球または粒子の凝集を用いてウィルス検出するためのウィルス懸濁液を含有し得る。
方法は、白血球の懸濁液の凝集に用いられ得る。
流体は、少なくとも白血球を有する血清サンプルまたは血漿サンプルであり得る。
方法は、任意の他のタイプの真核細胞の懸濁液の凝集に用いられ得る。
凝集剤は、細胞の凝集を引き起こし可能な任意の物質であり得る。
細胞は、赤血球であり得る。
赤血球とともに用いられる場合の凝集剤は、ヘマトクリット値の判定に用いられ得る。
本開示は、
第１のプレートと第１のプレートから離間した第２のプレートであって、第１のプレートおよび第２のプレートのうちの１つが複数の駆動電極を有する、第１のプレートと第２のプレートと；
第１のプレートまたは第２のプレートのいずれかの表面であって、表面の事前選択された場所を被覆するまたはプレート全体を被覆する予備乾燥された形態の界面活性剤を有する表面、および、第１のプレートまたは第２のプレートのいずれかの別の表面であって、この別の表面の事前選択された場所を被覆する予備乾燥された形態の凝集剤を有する別の表面とを備える２プレートエレクトロウェッティングＤＭＦデバイスを提供する。
界面活性剤で被覆された表面および凝集剤で被覆された表面は、異なるまたは同じである。
本開示は、
複数の駆動電極を有する２プレートエレクトロウェッティングデジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）と；
２つのプレートの１つに配置する界面活性剤と；
２つのプレートの１つに配置する凝集剤とを備えるキットを提供する。
凝集剤は、赤血球の凝集のために選択され得る。
開示の機能的かつ有利な態様のさらなる理解は、以下の発明を実施するための形態および図面を参照して実現することができる。
実施形態を、単なる例示の目的で、図面を参照してここで説明する。
ＤＭＦデバイスおよびＤＭＦデバイス上の凝集アッセイの関連ステップの３（３）つのパネルである。（ｉ）とラベル付けされた最も左のパネルは、目的分析物を含有する１つまたは複数のサンプルが、凝集剤を含むＤＭＦデバイス上にロードされることを示す。（ｉｉ）とラベル付けされた真ん中のパネルは、サンプルが、サブサンプルへと計量供給され、次いで、各サブサンプルが、事前決定された期間、凝集剤と混合されることを示す。（ｉｉｉ）とラベル付けされた最も右のパネルは、凝集がＤＭＦデバイス上で視覚的にまたはカメラ越しに観察されるとことを示す。 血液型判定のためのＤＭＦ凝集アッセイの結果を描写する図である。全血サンプルがデバイス上にロードされた後、４つの液滴へと計量供給された。各サブ液滴は、ＤＭＦデバイス上で、抗Ａ（左）、抗Ｂ（左から２つ目）、抗Ａ／抗Ｂブレンド（右から２つ目）、および抗Ｄ（右）の抗体を含有する別々の液滴と混合された。２分間の混合後、結果は目で判別することができる。ここでの特定のサンプルは、抗Ａ、抗ＡＢ、および抗Ｄ（Ｒｈ）と凝集を形成し、Ａ＋型を示した。 ビーズベースのＤＭＦ凝集アッセイの結果を描写する図である。細菌溶解物の第１のサンプルがデバイスにロードされ、次いで、一対のサブ液滴へと計量供給され、それらは、ＰＢＰ２抗体で被覆されたラテックスビーズ（左）またはＰＢＰ２に非特異的な抗体で被覆されたラテックスビーズ（左から２つ目）を含有する液滴と混合された。第１のサンプルは、ＰＢＰ２抗体で被覆されたラテックスビーズと弱い凝集を形成し、ＰＢＰ２に特異的ではない抗体で被覆されたラテックスビーズとは凝集を形成せず、細菌はメチシリンに感受性があることを示した。同様に、細菌溶解物の第２のサンプルがデバイスにロードされ、次いで、一対のサブ液滴へと計量供給され、それらは、ＰＢＰ２抗体で被覆されたラテックスビーズ（右から２つ目）またはＰＢＰ２に特異的ではない抗体で被覆されたラテックスビーズ（右）を含有する液滴と混合された。第２のサンプルは、ＰＢＰ２抗体で被覆されたラテックスビーズと強い凝集を形成し、ＰＢＰ２に非特異的な抗体で被覆されたラテックスビーズとは凝集を形成せず、細菌はメチシリンに耐性を有することを示した。両方のケースにおいて、サンプルのロード後のプロセスは自動化されていて、約２分の混合後に結果がもたらされた。 ＤＭＦ凝集アッセイの出力を判定するための自動化された画像分析のワークフローを示す図である。Ａ）デジタルカメラから収集された画像であり、最初の画像キャプチャから、ＲＯＩ（目的領域）の切り離しまでのステップを示している。（ｉ）デバイスの画像が、反射を低減させるようにある角度をなしてキャプチャされる。（ｉｉ）パースペクティブコレクションが行われる。（ｉｉｉ）デバイスの中心に関連する画像部分が切り離される。（ｉｖ）切り離された画像において、目的領域（ＲＯＩ）が液滴ごとに特定される。（ｖ）各ＲＯＩがマスキングされ、分析のために別々の画像として保存される。Ｂ）画像（左）およびデータ（右）であり、各ＲＯＩの分析を示している。各ＲＯＩのピクセル強度のばらつきは、凝集の程度を示す。 ヘマトクリット値の判定のためのＤＭＦ凝集アッセイの結果を描写する図である。左側に、異なるヘマトクリット値（全血液量に対する赤血球量の割合）－２０％（一番上）、４０％（上から２つ目）、６０％（下から２つ目）、８０％（一番下）を有する４つの液滴が示される。液滴は、赤血球の非特異的な凝集を引き起こす化学凝集剤と混合された。ヘマトクリット値が高いと、凝集スポットは大きくなる。ヘマトクリット値は肉眼で評価またはデジタルカメラを用いて判定することができる。右側に、デジタルカメラを用いてキャプチャされた処理画像の出力が示される。ピクセル強度の差を用いて、サンプルのヘマトクリット値を判定することができる。 ドナー適合性テストのためのＤＭＦ凝集アッセイの結果を描写する３つのパネルを伴う図である。最も左のパネルに示すように、全血サンプルがデバイス上にロードされた後、４つのサブ液滴へと計量供給された。次いで、真ん中のパネルに示すように、各サブ液滴は、ＤＭＦデバイス上で血液ドナー予定者からの血漿を含有する別々の液滴と混合された。５分間の混合後、結果は目で判定することができる。ここでの特定のサンプルは、左から最初の２つのサンプルＤ１、Ｄ２（右手パネルにおける）と凝集を形成し、これらドナーサンプルはレシピエントの血液と不適合であることを示した。他の２つのサンプルＤ３、Ｄ４（右側の）は、凝集の兆候を全く見せず、これらドナーサンプルはレシピエントの血液と適合性があることを示した。 ヘマトクリット値の判定のためのＤＭＦ凝集アッセイの結果を描写する、ソートされたピクセル強度対ピクセル数のプロットである。垂直軸の左側に、２０～６０％の異なる人為的に定義されたヘマトクリット値－６０％（一番上）、５０％（上から２つ目）、４０％（上から３つ目）、３０％（下から２つ目）、２０％（一番下）を有する５つの液滴が示される。液滴は、赤血球の非特異的な凝集を引き起こす化学凝集剤と混合された。ヘマトクリット値が高いと、凝集スポットも大きくなる。ヘマトクリット値は、画像分析を用いて判定された。右側に、デジタルカメラを用いてキャプチャされた処理画像の出力が示される。サンプルごとのピクセル強度の積分を用いて、サンプルのヘマトクリット値を判定した。 図７に示す画像から生成された検量線を描写するヘマトクリットスコア対ヘマトクリット（％）のプロットである。マーカは実験データであり、エラーバーは、条件ごとにｎ＝３の実験に対して±１の標準偏差を表す。破線の二次多項式が、Ｒ２＝０．９９９０でデータにフィッティングされた。 参照基準（左）およびＤＭＦ－ＤＭＦ上での液滴凝集評価（ＤＡＡＤ）法（右）を用いたボランティアからの１２の指刺全血サンプルから収集されたヘマトクリット測定値の棒グラフである。１２のサンプルのセットにおいて、参照基準とＤＭＦ－ＤＡＡＤ法の比較により、ｐ≧０．５０４５となる。 ３４４のサンプル画像における凝集を検出するための凝集検出アルゴリズム間の性能比較を描写する一連のプロットである。データは、参照基準法によって定義されるように２２５の陽性サンプルおよび１１９の陰性サンプルを含むとして知られていた。陰性は、凝集を全く示さなかったサンプルであり、陽性は、凝集の何らかのサインを示したサンプルである。 ヒストグラム法の性能の図である。左側パネルは、ヒストグラム法対参照基準の結果によって生成されたサンプル画像の凝集スコアのプロットである。プロット内では、黒および灰色が、閾値Ｔ（１０ａ．ｕ．）を用いて正しい／誤りの評価の数を表す。右側パネルは、この方法の真陽性率対この方法の偽陽性率を示す受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線のプロットである。ＲＯＣ曲線の破線は、ランダム推測（コインフリップ）の結果を表す。この方法の曲線より下の部分の面積（ＡＵＣ）は、０．９８１である。 標準偏差法の性能の図である。左側パネルは、標準偏差法対参照基準の結果によって生成されたサンプル画像の凝集スコアのプロットである。プロット内では、黒および灰色が、閾値Ｔ（０．１３ａ．ｕ．）を用いて正しい／誤りの評価の数を表す。右側パネルは、この方法の真陽性率対この方法の偽陽性率を示す受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線のプロットである。ＲＯＣ曲線の破線は、ランダム推測（コインフリップ）の結果を表す。この方法の曲線より下の部分の面積（ＡＵＣ）は、０．９９９０である。 分散法の性能の図である。左側パネルは、分散法対参照基準の結果によって生成されたサンプル画像の凝集スコアのプロットである。プロット内では、黒および灰色が、閾値Ｔ（１ａ．ｕ．）を用いて正しい／誤りの評価の数を表す。右側パネルは、この方法の真陽性率対この方法の偽陽性率を示す受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線のプロットである。ＲＯＣ曲線の破線は、ランダム推測（コインフリップ）の結果を表す。この方法の曲線より下の部分の面積（ＡＵＣ）は、０．９９９７である。 ＤＭＦ上の液滴凝集評価（ＤＡＡＤ）法の性能の図である。 左側パネルは、ＤＡＡＤ法対参照基準の結果によって生成されたサンプル画像の凝集スコアのプロットである。プロット内では、黒および灰色が、閾値Ｔ（０．１５２ａ．ｕ．）を用いて正しい／誤りの評価の数を表す。 右側パネルは、この方法の真陽性率対この方法の偽陽性率を示す受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線のプロットである。ＲＯＣ曲線の破線は、ランダム推測（コインフリップ）の結果を表す。この方法の曲線より下の部分の面積（ＡＵＣ）は、１．０００である。
開示の様々な実施形態および態様は、以下に説明された詳細を参照して説明される。以下の説明および図面は、開示の例示であり、開示を限定するものとして解釈されるものではない。本開示の様々な実施形態の完全な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、場合によっては、本開示の実施形態の簡潔な説明を提供するために、よく知られているまたは従来の詳細は記載されない。
本明細書中で用いられる用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（備える）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備えている）」は、排他的ではなく、包括的かつ無制限として解釈されるものである。具体的には、明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（備える）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備えている）」およびそれらの変形は、指定された特徴、ステップまたは構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップまたは構成要素の存在を除外することを意図するものではない。
本明細書中で用いられる用語「ｅｘｅｍｐｌａｒｙ（例示的な）」は、「例、実例、または例示としての役割を果たす」ことを意味するものであり、本明細書中で開示される他の構成に比べて好ましいまたは有利と解釈されるべきではない。
本明細書中で用いられる用語「ａｂｏｕｔ（約）」および「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（おおよそ）」は、粒子、混合物の成分または他の物理的性質もしくは特性の寸法範囲と関連して用いられる場合、概して寸法の大部分は満たされるが統計的に寸法がこの範囲外に在り得る実施形態を除外しないように、寸法範囲の上限と下限内に存在し得るわずかな変動を網羅することを意味する。これらのような実施形態を本開示から除外することは意図されない。特段の記載がない限り、「ａｂｏｕｔ（約）」および「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（おおよそ）」という用語は、２５パーセント以下のプラスまたはマイナスを意味する。
特段の記載がない限り、任意の指定された範囲または群は、範囲または群の一つ一つの要素、ならびにその中に包含される可能な一つ一つの部分範囲または部分群そして任意の部分範囲または部分群の一つ一つの要素を個別に指す短縮形であることが理解されよう。特段の記載がない限り、本開示は、部分範囲または部分群の一つ一つの特定の要素および組み合わせに関するものであり、それらを明確に組み込む。
本明細書中で用いられる用語「ｏｎ ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ（程度）」は、量またはパラメータと関連して用いられる場合、記述された量またはパラメータのおおよそ１０分の１から１０倍にわたる範囲を指す。
本明細書で用いられる「凝集」は、特定の抗体と抗原成分の相互作用によってまたは同じ集塊効果を誘発し得る他の化学物質によって細胞または不活性粒子の塊が形成される過程を指す。
凝集は、特定の抗体による抗原表面成分に対する（直接凝集反応）または赤血球もしくは不活性粒子に吸着もしくは化学結合された抗原成分に対する（それぞれ受身血球凝集反応および受身凝集反応）細胞または不活性粒子の塊の形成として定義される。赤血球はまた、植物性タンパク質、ウィルス、重金属塩、無機コロイド酸塩基、および塩基性タンパク質（プロタミン、ヒストン）などの非抗体物質によって凝集される。凝集抑制または血球凝集抑制は、これらの反応を、抗体の結合と反応しそれによって患者に対するそれらの結合および凝集を防げる可溶性抗原によって抑制することを指す。
本明細書中で用いられる表現の「凝集アッセイ」は、凝集プロセスを用いて、標的エンティティ（分析物）の存在、量、および機能活性を定性的に評価かつ定量的に測定する調査手順を指す。
凝集アッセイは他のアッセイとは異なる。例えば、以下のようにＵＳ２０１７／００５６８８７（Ｈａｄｗｅｎら）に開示されたような凝固アッセイと異なる。
凝集は、粒子（固体／半固体または細胞）を塊にするプロセスである。凝集には多くの例がある。例えば、赤血球凝集は、赤血球の凝集であり、白血球凝集は、白血球の凝集である。
一方、凝固は、液体が固体／半固体状態に変化するプロセスである。凝固の例として、血液凝固のプロセスがあり、血液は液体からゲルに変化し、血の塊を形成する。血液凝固は、ゲル化プロセスと類似する。凝固には３つの主なステップ、すなわちｉ）血小板血栓の形成、ｉｉ）内因系または外因系経路、およびｉｉｉ）共通経路がある。
凝集と凝固の主な違いは、凝集は粒子凝集のプロセスであり、凝固は最終的な血塊の形成のプロセスであるということである。多くの粒子が凝集することができるが、血液のみが凝固することができる。
凝集は、抗原－抗体反応によるものであるが、凝固は、複数の血漿因子の活性化によるものである。
本明細書中で用いられる表現の「凝集剤」は、粒子の凝集（凝集体）の生成をもたらし得る、凝集アッセイで用いられる任意の物質を指す。
本明細書中で用いられる表現の「化学凝集剤」は、粒子凝集と同一の効果を生むが抗原－抗体反応に依るものではなく、粒子懸濁を破壊し粒子を互いに対して崩壊させ凝集体を形成する他のプロセスに依るものである、凝集アッセイで用いられる物質を指す。
図１は、特定の分析物が存在するか否かのテスト対象である液体分析物サンプルに凝集を生成するための、本開示で用いられる２（２）プレートデジタルマイクロ流体デバイスを示す。ＤＭＦデバイスを用いる主なステップが、最も左のパネルから最も右のパネルまでの３（３）つのパネルに記述されている。ＤＭＦデバイスにおいて、ＤＭＦデバイス上の凝集アッセイのステップは、（ｉ）とラベル付けされた最も左のパネルから始まる。そこでは、目的分析物を含有する１つまたは複数のサンプルが、凝集剤を含むＤＭＦデバイス上にロードされることを示す。（ｉｉ）とラベル付けされた真ん中のパネルは、サンプルがサブサンプルへと計量供給され、次いで各サブサンプルが、事前決定された期間、凝集剤と混合されることを示し、（ｉｉｉ）とラベル付けされた最も右のパネルは、ＤＭＦデバイス上で凝集が視覚的にまたはカメラによって観察されることを示す。
かくして、広義には、本開示は、複数の駆動電極を有する２プレートエレクトロウェッティングデジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）を用いて、分析物を含有するサンプルを特徴付ける方法を提供する。ＤＭＦデバイスの２プレート構成により、液滴は、分注、分割、かつ合流されることが可能となる。１プレートＤＭＦデバイスにおいては、液滴を分割かつ分注するのに、誘電体の絶縁破壊をも超える、より高い力／電圧が必要とされる。さらに、液滴の大部分は平坦領域として現れるので、液滴および液滴の成分の撮像には２プレートＤＭＦデバイスが理想的であり、一方、１プレートＤＭＦデバイスでは、液滴の曲面により、同じような撮像容易性は可能とならない。さらに、１プレートＤＭＦデバイスでは、空気に触れる液滴の面積はより大きく、液滴をより速く蒸発させ、そのことはアッセイと干渉し得る。
方法は、テスト対象の分析物を含有する流体サンプルをローティングすることを含む。この方法は、界面活性剤および凝集剤を含み得る。この方法は、ＤＭＦデバイスの事前選択された数の駆動電極上に界面活性剤を含み得、続いて、エレクトロウェッティングを用いて流体サンプルを凝集剤に接触させ、分析物を凝集させて凝集体を生成すること、次いで、凝集剤によってもたらされた分析物の凝集量を特徴付けることを含む。
実施形態では、流体サンプルおよび／または凝集剤は、界面活性剤を含有し得る。界面活性剤は、ＤＭＦデバイスの上部プレートまたは底部プレートへの分析物の非特異的な結合を低減するのに用いられ得る。界面活性剤はまた、ＤＭＦデバイス上での流体サンプルまたは凝集剤の運動を向上させるのにも用いられ得る。
実施形態では、界面活性剤は、予備乾燥された形態であり、そうである場合、方法は、さらに、１つまたは複数の駆動電極を、事前判定されたスポットまたはデバイス表面全体にわたって、予備乾燥された形態の界面活性剤で被覆し、それによって、流体サンプルが予備乾燥された界面活性剤と接触したときに、可溶化し、界面活性剤が流体内に少なくとも０．０１％ｗｔ：ｗｔの量で存在するようにすることを含む。別の実施形態では、凝集剤は、事前選択された駆動電極にロードされ計量供給された液体凝集剤である。
好ましい実施形態では、方法は、ＤＭＦデバイス上でエレクトロウェッティングを用いて凝集剤を流体と激しく混合するステップを含み、そのことは、テスト対象の分析物が存在する場合凝集のプロセスを有利に加速させる。
界面活性剤は、テスト対象の分析物によって、イオン性界面活性剤であってもよくまたは非イオン性界面活性剤であってもよい。イオン性界面活性剤として、以下に限定されるものではないが、ドデシル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、臭化セトリモニウム、塩化セトリモニウム、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。非イオン性界面活性剤として、以下に限定されるものではないが、アルキルフェノールヒドロキシポリエチレン（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ ＲＴＭ）、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ ＲＴＭ）、ポロキサミン（例えば、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ ＲＴＭ）、ポロキサマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ＲＴＭ）、およびソルビタンエステルが挙げられる。イオン性界面活性剤か非イオン性界面活性剤かの使用の選択は、実行される凝集アッセイのタイプおよび分析対象のサンプルのタイプに基づく。界面活性剤の適合性を判定するために、特定のアッセイおよびサンプルタイプにおける界面活性剤のスクリーニングが実行されるべきである。
例えば、非イオン性界面活性剤は、以下の実施例で説明するように、血液型を判定するために血液をテストするときに好ましい。非イオン性界面活性剤は、細胞に対する等張環境を維持するために血液とともに用いられ、細胞溶解を防ぐ。
凝集剤は、凝集体を生成可能な物質の任意の１つまたは組み合わせを備え得る。物質の例は、化学凝集剤および生物凝集剤を含む。赤血球の凝集に対して、化学凝集剤は、以下に限定されるものではないが、ポリ－Ｌ－リシン臭化水素酸塩、ポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）クロリド（例えば、Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）－１００ ＲＴＭ、Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）－２８０ ＲＴＭ、Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）－５５０ ＲＴＭ）、ポリ－Ｌ－アルギニン塩酸塩、ポリ－Ｌ－ヒスチジン、ポリ（４－ビニルピリジン）、ポリ（４－ビニルピリジン）塩酸塩、架橋ポリ（４－ビニルピリジン）、塩化メチル第４級塩、ポリ（４－ビニルピリジン－ｃｏ－スチレン）；ポリ（４－ビニルピリジニウム ポリ（フッ化水素））；ポリ（４－ビニルピリジニウム－Ｐ－トルエンスルホナート）；ポリ（４－ビニルピリジニウム－トリブロミド）；ポリ（４－ビニルピロリドン－ｃｏ－２－メタクリル酸ジメチルアミノエチル）；架橋ポリビニルピロリドン；ポリビニルピロリドン、部分メチル化ポリ（メラミン－ｃｏ－ホルムアルデヒド）；臭化ヘキサジメトリン；ポリ（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ）１：４臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）３：１臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）２：１臭化水素酸塩；スクシニル化ポリ－Ｌ－リシン；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）１：１臭化水素酸塩；およびポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｐ）１：４臭化水素酸塩を含むポリカチオンなどの物質から選択され得る。最も好ましいポリカチオンは、ポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）クロリドである。
化学凝集剤は、任意の赤血球の凝集を引き起こすのに用いられるものであり、したがって、以下の実施例で説明するように、化学凝集剤は、血液凝集アッセイにおける陽性対照として用いることができ、化学凝集剤はまた、ヘマトクリット値の判定のために赤血球を凝集するのに用いることができる。
生物凝集剤は、凝集体を生成可能な生物学的性状の任意の物質である。赤血球の凝集に対して、例として、レクチン（糖構造と可逆的に結合可能なタンパク質）および抗体（例えば、抗Ａ、抗Ｂ、抗Ｄ）などのタンパク質、ウィルス（例えば、インフルエンザウィルス）、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡベースのアプタマーが挙げられる。生物凝集剤は、赤血球にまたはサンプルに目的の特定の分析物が存在するか否かを判定するのに用いられる。例えば、抗体の抗Ａは、赤血球の表面に抗原Ａが存在するか否かを検出するのに用いられる。別の例として、インフルエンザウィルスは、血漿に存在するウィルスに対する抗体量を判定するのにかつ患者のサンプルの免疫レベルを判定するのに用いられる。
凝集剤によってもたらされる分析物の凝集量を特徴付けるステップは、視覚的な／光学的な特徴付けによるのが好ましい。これまで挙げられてきた特徴付けの他の方法には、電気化学（例えば、インピーダンス分光法）、吸光および比濁技術の使用が含まれる。しかしながら、これら技術の実装は、追加のハードウェア装備およびＤＭＦデバイス上のいくつかの変更を必要とするものであり、したがって、凝集反応の結果を視覚的に調査する操作者またはカメラの使用のいずれかによる視覚的な特徴付けを用いる本プロセスは、システムへの追加変更が必要でないという点で極めて有利である。
視覚的な特徴付けは、ＤＭＦデバイスを視覚的に観察して凝集量を見積もる者によるものであり得る。代替として、視覚的な特徴付けのステップは、カメラを用いて実行される。用いられ得るカメラの非限定的な例として、ウェブカム、携帯電話カメラ、デジタルカメラ（デジタル一眼レフカメラ、ＤＳＬＲを含む）、ビデオカメラ、監視カメラ、コンパクトカメラ、ＣＣＤ検出器付きカメラ、ＣＭＯＳ検出器付きカメラ、モノクロカメラ、白黒カメラ、カラーカメラが挙げられる。カメラを含む視覚的な／光学的な特徴付けにおいて、ＤＭＦ上での液滴凝集評価（ＤＡＡＤ）が開発された。ＤＡＡＤは、ＤＭＦデバイス上で液滴における凝集を自動的に検出するのに用いられる画像分析アルゴリズムである。ＤＡＡＤアルゴリズムは、カメラと関連付けられたマイクロプロセッサに格納され得る、または、ＤＭＦデバイスの駆動電極を制御するＤＭＦ電源に接続されているマイクロプロセッサに格納され得る、またはリモートコンピュータに格納され得る。ＤＡＡＤアルゴリズムは、マイクロプロセッサまたはコンピュータによって実行され得る。
実施形態では、凝集剤は、凝集剤で被覆された粒子を備える。非限定的な例として、ポリマー（例えば、ラテックス）、金、銀、ナノ粒子およびマイクロ粒子が挙げられる。目的分析物に応じて、粒子は凝集剤で被覆される。例えば、抗原の検出に対して、粒子は、抗体、または目的抗原を捕捉可能な他の剤で被覆される。抗体の検出の場合、粒子は、抗原、または目的抗体を捕捉可能な他の剤で被覆されるであろう。
方法は、ポリマー粒子の懸濁液の凝集に用いられ得る。非限定的な例として、風疹抗体検出に対する被覆ラテックス粒子、任意のウィルスの検出に対する抗体で被覆されたラテックス粒子、ストレプトリジンＯで被覆されたラテックス粒子、Ｃ反応性タンパク質検出に対する抗体で被覆されたラテックス粒子、黄色ブドウ球菌の同定に対する被覆ラテックス粒子、および任意のタイプの細菌の同定に対する被覆ラテックス粒子が挙げられる。
本明細書中で開示された方法は、ナノ粒子の懸濁液の凝集に用いられ得る。非限定的な例として、抗原の検出に対する抗体で被覆されたナノ粒子、および具体的な抗体の検出に対する抗原で被覆されたナノ粒子が挙げられる。
方法は、以下の実施例で説明されるように、患者の血液型を判定するため赤血球の懸濁液の凝集に用いることができる。この用途では、流体は、少なくとも赤血球のみを備える血液サンプルである。これらの血球は、以下に限定されるものではないが、血漿、等張緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、ＰＢＳおよび血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン）を含有する溶液などの液体希釈剤と混合される。
しかしながら、全血（白血球および赤血球、血小板および血漿）を含み、また希釈血液（全血の一部が採取されなんらかの例を提供するために何か他のものと混合されている）、白血球、血清、および血漿の懸濁液も含み得る他のタイプの血液サンプルをこの方法を用いて特徴付けることができることが理解されよう。
方法は、以下の実施例で説明されるように、ヘマトクリット値を判定するため赤血球の懸濁液の凝集に用いることができる。この用途では、流体は、少なくとも赤血球を備える血液サンプルである。これらの血球は、液体希釈剤と混合され得る。この実施例では、任意の凝集剤を、ヘマトクリット値を判定するために用いることができる。
以下に限定されるものではないが、全血、血清、血漿、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＰＢＳおよび血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン）を含有する溶液、鼻水、鼻咽頭粘液、尿および唾液などの液体希釈剤内のウィルス懸濁液を含む他のタイプの流体サンプルを、この方法を用いて特徴付けることができる。これらの流体サンプルは、ウィルス検出のため凝集剤と混合され得る。
任意の他のタイプの真核細胞の懸濁液を含む他のタイプの流体サンプルは、この方法を用いて特徴付けることができる。凝集剤は、細胞の凝集を引き起こし可能な任意の物質であり得る。
本明細書中で開示された方法の非限定的かつ例示的な例をここで説明するが、本開示はこれらの例に限定されないことが理解されるであろう。
実施例１
図２に示す第１の実施例は、赤血球の凝集を引き起こすために血液凝集抗体を用いる血液型判定アッセイである。３つの抗体（モノクローナルまたはポリクロナール）のセット－抗原Ａ（抗Ａ）、Ｂ（抗Ｂ）およびＲｈＤ（抗Ｄ）ならびにＡとＢのブレンド（抗Ａ、Ｂ）に特異的な－が、ＡＢＯおよびアカゲザル（Ｒｈ）血液型を判定するのに用いられる。図２に示す実施例では、凝集試薬が、溶液形態でデバイス内にロードされた。我々は、凝集試薬が乾燥スポットとしてデバイス上に予めロードされ、サンプルまたは別の試薬（例えば、溶解緩衝剤）にさらされると可溶化するという類似方法も実施している。完全なアッセイが要するのはほんの数分であり、完全自動化されている。
予備乾燥された試薬が用いられた例では、再構成は、ＵＳ２０１４／０１４１４０９ Ａ１にＦｏｌｅｙらによって記載されたように実行された。
アッセイは、血球凝集として知られる現象に依る。米国国立医学図書館によれば、血球凝集（または血球凝集）は、「抗体、レクチン、およびウィルスタンパクを含む凝集素による赤血球の凝集」として定義される。従来、血球凝集アッセイは、血液をカテゴリ（血液型）に分類するために赤血球膜（抗原）に見られる表面マーカのばらつきまたは多型を検出するのに用いられてきた。現在、３３９の血液型抗原が認められ、そのうちの２９７は、３３の血液型系の１つに分類される。これらの血液型系のうち、ＡＢＯおよびＲｈは、それらの輸血医療における重要性から、最も良く知られている系である。
ＡＢＯ系は特に、抗原が赤血球の表面に提示されないとき、むしろ、相互抗体が血漿に可溶性エンティティとして一貫して予測通りに見られる唯一の血液型系であるので、独自の系である。ＡＢＯ抗原は、多くの場合、それらの広範な分布は、それらを組織適合抗原としてもしばしば用いることができることを意味するので、組織血液型抗原と称される。最も重要なことは、抗Ａおよび抗Ｂの広範な分布は、溶血性輸血反応（ＨＴＲ）が不適合腎臓、肝臓および心臓移植の超急性拒絶を引き起こし得るので、異なる血液型の輸血が破滅的なものとなることである。同様に、Ｒｈ抗原は、胎児および新生児の溶血性疾患（ＨＤＦＮ）を防ぐためにしばしば用いられる。
この実施例に記載されたアッセイは血液サンプルに実装され、関連するテストを血清において実行することができ、それは一般にウラ判定と称される。ウラ判定では、患者の血清は、既知の表面抗原（例えば、ＡＢＯにおけるＡ細胞およびＢ細胞）を有する赤血球と混合され、血球凝集の観察により、対応する抗体が存在するか否かが示される。いずれのフォーマット（通常または「ウラ」）においても、２０２２年までに２５億ドルに達すると見込まれる血液型判定の世界市場からも明らかなように血液型判定アッセイの新規、迅速、かつ容易な実行を発展させる強い動機付けが存在する。
実施例２
新規の仕様の別の用途は、システムを、救急処置室または外傷治療室（時間が重要である場所）といったリスク／リターンが高い設定においてその場で迅速に実行されなくてはならない重要な作業である血液のドナー－レシピエントの交差適合に使用することである。具体的には、この設定における血漿の採血の第１のステップは、レシピエントの、ＡＢＯ／Ｒｈ系による型を判定し、ドナーの型を同定可能とすることである（例えば、Ｂ＋のレシピエントに対してＢ＋のドナー）。しかし、このレベルの選択性では十分ではない。なぜなら、ＡＢＯ／Ｒｈ系によって捕捉されない不適合性を引き起こし得る多くの他のサブタイプが存在するからである。したがって、第２のステップが通常実行される（多くの場合、患者のベッドサイドで、輸血直前に）。そのステップでは、ドナー候補者の血漿を、患者の血液との凝集に対して直接テストする。ＤＭＦ血球凝集によって実行されＤＡＡＤによって分析された模擬交差適合試験の例を図６に示す。この例では、４つのドナー候補者のうちの２つが、レシピエント候補者と適合性を有することが分かった。
実施例３
赤血球の凝集を、血液サンプルのヘマトクリットの判定に用いることができる。図５は、ヘマトクリット値の判定のためのＤＭＦ凝集アッセイの結果を示す図面である。図５の左には、異なるヘマトクリット値（全血液量に対する赤血球量の割合）－２０％（一番上）、４０％（上から２つ目）、６０％（下から２つ目）、８０％（一番下）を有する４つの液滴が示される。液滴は、赤血球の非特異的な凝集を引き起こす化学凝集剤と混合された。ヘマトクリット値が高いと、凝集スポットは大きくなる。ヘマトクリット値は肉眼で評価またはデジタルカメラを用いて判定することができる。右側に、デジタルカメラでキャプチャされた処理画像の出力が示される。ピクセル強度の差を用いて、サンプルのヘマトクリット値を判定することができる。
特にヘマトクリットの判定において、全ピクセル数のほんの一部の間に（包括的に）見られるピクセル強度の積分が、「ヘマトクリットスコア」として定義される。［図７ 初期実験において、２０％から６０％の間の人為的に定義されたヘマトクリット値を有する希釈された血液サンプルのトレーニングセットからのヘマトクリットスコアが発見され、ヘマトクリット値の関数としてプロットされ、二次多項式でフィッティングされた。ｙ＝－０．０２４９×２＋１．０９２ｘ＋１０７．３］。各液滴のヘマトクリットスコアは、キャリブレーションプロットと比較されて、予測％ヘマトクリットを判定した（図８）。
図７は、ヘマトクリット値の判定のためのＤＭＦ凝集アッセイの結果を示す。図７の左に、異なるヘマトクリット値（全血液量に対する赤血球量の割合）－６０％（一番上）、５０％（上から２つ目）、４０％（上から３つ目）、３０％（下から２つ目）、２０％（一番下）を有する５つの液滴が示される。図５と同様に、液滴は、赤血球の非特異的な凝集を引き起こす化学凝集剤と混合された。ヘマトクリット値が高いと、凝集スポットは大きくなる。
図８は、既知のヘマトクリット値の関数としてのヘマトクリットスコアの検量線を示す。マーカは、実験データであり、エラーバーは、条件ごとにｎ＝３の実験に対して±１の標準偏差を表す。破線の二次多項式が、Ｒ２＝０．９９９０でデータにフィッティングされた。
図９は、参照基準（左）およびＤＭＦ－ＤＡＡＤ法（右）を用いたボランティアの１２の指刺全血サンプルから収集されたヘマトクリット測定値の棒グラフを示す。１２のサンプルのセットにおいて、参照基準とＤＭＦ－ＤＡＡＤ法の比較により、ｐ≧０．５０４５となる。
実施例４
図３に示された本開示の第４の実施例は、ラテックス免疫凝集アッセイ（ＬＩＡ）であり、それは、目的分析物を検出するのにラテックス粒子の懸濁液を用いる。分析物がない場合、ビーズは、個々のユニットとして浮遊し、懸濁液は、「スムース」に見える（すなわち、異種塊がない）が、分析物が存在する場合、粒子は凝集し、目で見ることができる異種凝集体を形成する。これらのアッセイは、１価抗原および多価抗原、タンパク質、薬物、ステロイドホルモン、さらに微生物の検出などの幅広い有用性がある。ＬＩＡは、インフルエンザ検出、および抗生物質感受性テストに対して臨床医によって一般に用いられる。後者の場合、いずれの治療を処方するかを決めるために、抗生物質に耐性を有する菌株と有さない菌株の区別を可能とすることが非常に重要である。例えば、病院で感染する感染症の主因は、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であり、ＭＲＳＡに感染した患者にメチシリンを処方することは、明らかに時間と資源の無駄である。原理の実証として、我々は、図３で特徴を示したように、菌株におけるメチシリン耐性および感受性を検出するためのＤＭＦ上でのラテックスビーズベースの凝集アッセイを開発した。
この実施例では、感受性を有する－（第１のサンプル－左の液滴の対）および耐性を有する－（第２のサンプル－右の液滴の対）菌株が、ペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２）抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）で被覆されたラテックスビーズと混合された（各対の左の液滴）。各サンプルはまた、陰性コントロールとして機能するＰＢＰ２に対して特異的でない抗体で被覆されたラテックスビーズとも混合された（各対の右の液滴）。結果は、第１のサンプルは感受性を示す弱い凝集を示し（これらの細菌に感染した患者はメチシリンで治療可能であり得ることを示唆する）、第２のサンプルは、強い凝集を示す（これらの細菌に感染した患者は代替の治療を受けるべきであることを示唆する）ことを表す。まとめると、ＤＭＦベースのアッセイは、目で容易に識別される３つの状態：凝集なし（陰性コントロールにおける）、抗生物質に感受性を有する細菌における弱い凝集、および抗生物質に耐性を有する細菌における強い凝集の迅速な検出を可能とする。
凝集結果の視覚判定
凝集アッセイにおける検出の最も簡単なモードは、ユーザによる目視での観察であり、この方法は、上述の実施化してきた実施例に効果を発揮する。しかし、凝集はまた、画像処理を介する完全な自動化にも適している。流体チャネルにおける血球凝集の自動化された検出の記載がいくつかあるが、それらは、付属機器（例えば、顕微鏡、導波管など）および複雑な後処理手順に依る。例えば、Ｈｕｅｔらは、凝集の進捗を検出するのにＭＡＴＬＡＢで人工ネットワークを訓練したが、アルゴリズムは普遍的ではなく、新規の撮像セットアップごとに新規の訓練セットが必要とされる。
それに対して、図４Ａおよび４Ｂに描写するような本方法は簡単であり、デジタルカメラを備えた任意のシステムに適用することができる。カメラを含む光学的特徴付けの場合、ＤＭＦ上の液滴凝集評価（ＤＡＡＤ）は、８つのステップで実行される。最初の６つの画像前処理ステップ（ｉ－ｉｖ）は、血液型判定（図２）、ラテックス凝集アッセイ（図３）、ヘマトクリット分析（図５）およびドナー適合性テスト（図８）と同じである。
図４Ａ－Ｉは、カメラを用いてデバイスの画像を収集するステップｉ）を示す。カメラは、ＤＭＦデバイスに垂直な面に対してある角度をなして配置される。画像は通常、各カメラの最大解像度でキャプチャされる（しかし、より低い解像度の画像も処理することができる）。
図４Ａ－ｉｉは、ソース画像の４つの座標および４つの基準座標を画定することによって、画像にパースペクティブコレクションが行われるステップｉｉを示す。３×３行列が、各座標セットに基づいて計算され（画像－基準の対応する対）、次いで、同じ行列がソース画像に適用されて、パースペクティブコレクションされた画像を取得する。
図４－ｉｉｉは、既知のデバイス特徴を検出することによってＤＭＦデバイスの中心が自動的に位置付けられ、画像のこの領域が、さらなる処理のために切り離されるステップｉｉｉ）を示す。
図４Ａ－ｉｖは、輪郭を識別し隣接する輪郭を組み合わせることによって液滴が検出されて、画像を抽出するためのマスクを画定するのに用いられる液滴ごとの矩形の目的領域（ＲＯＩ）を形成するステップｉｖを示す。
図４Ａ－ｖは、各液滴に対応するＲＯＩ画像がマスキングされ、切り離され、ＲＢＧからグレースケールに変換されるステップｖを示す。
図４Ｂ－左は、切り離された各画像が一次元配列に平坦化され正規化され、ピクセル強度が全８ビット範囲［０－２５５］を覆うようにし、次いでピクセル値ごとに最小値から最大値にソートされるステップｖｉを示す。
図４Ｂ－右は、この勾配におけるピクセル強度の傾きが、次いで、凝集の程度の指標として用いられる（血液型判定、ドナー適合性テスト、ステップｖｉｉｉで用いられるプロセス）ステップｖｉｉを示す。例えば、図４Ｂでは、Ａ、Ｄ（Ｒｈ）、およびＡ、Ｂブレンドにおけるピクセルの強度の急傾斜は凝集を示し、Ｂにおける平坦な傾きは凝集なしを示す。ラテックスビーズの凝集の検出を自動化する同様の画像処理方法（図３）を開発しており、この方法の、これまでの記載に比べての柔軟性を強調する。
視覚的な特徴付けにおいて、他の分析方法が実行され得る。３つの代替の凝集検出アルゴリズム、すなわちヒストグラム法、標準偏差法および分散法がテストされ、ＤＡＡＤと比較された。ヒストグラム法では、ＤＡＡＤのサブステップ（ｉ）－（ｖ）が実行されて、各ＲＯＩ画像が切り離された。画像ごとに、ヒストグラムが、ピクセル強度値ごとのピクセル数から生成された。ヒストグラムは、移動平均フィルタを用いて平滑化され（ウィンドウ＝１０ビン）、平滑化されたデータセットにおいて、主ピークは、ピクセル強度と隣接値の比較により局所的な最大値を見つけることによって特定された。
平滑化されたヒストグラムにおける主ピークの平均ピクセル強度が、閾値Ｔとして定義された。最終的に、凝集スコアは、１００×（Ｓ＞Ｔ／Ｓ）として定義された。Ｓは、ＲＯＩ画像のピクセル数であり、Ｓ＞Ｔは、Ｔより大きい強度を有するピクセル数である。標準偏差法（以前の記載出典の）では、ＤＡＡＤのサブステップ（ｉ）－（ｖｉ）が実行された後、アレイが、範囲［０、１］に正規化され（再度）、ピクセル強度の標準偏差σが凝集スコアとして定義された。分散法（以前の記載出典の）では、ＤＡＡＤのサブステップ（ｉ）－（ｖ）が実行されて、各ＲＯＩ画像が切り離された。各ピクセルのその隣に対する局所的分散
Figure 2022531341000002
が、３×３行列を用いて計算され、画像におけるすべてのピクセルの平均分散
Figure 2022531341000003
が判定された。
凝集スコアは、
Figure 2022531341000004
として定義された。一連の８６のサンプル（３４４のＲＯＩ）が、ＤＡＡＤおよび３つの代替方法によって評価された。代替方法における「最も良い」凝集閾値（最も高い真陽性率および最も低い偽陽性率を有する）は、ヒストグラム法、標準偏差法、および分散法においてそれぞれ１０ａ．ｕ．、０．１３ａ．ｕ．、および１ａ．ｕ．であることが分かった（図１０）。
まとめると、発明者らは、最初の２プレートデジタルマイクロ流体システムおよび凝集アッセイを実行可能な方法を記載している。発明者らは、上記の４つの実施例において、この発明の４つの非限定的かつ例示的な実施形態を実施した。第１の実施形態は、血液型判定の血球凝集アッセイであり、我々が２プレートＤＭＦデバイス上に実装されることを認識する最初のものである。この方法は、液相または乾燥凝集抗体の使用に対応することが実証され、それらは、希釈されていない全血と混合され、結果は数分以内に目で判定される。血液型判定アッセイの延長として、血液サンプルがドナー予定者サンプルと混合されると、ドナー適合性テストを、レシピエント患者に対する正しいドナーを示すために実行することができる（第２の実施形態）。さらに、上記アッセイに対して、我々は、サンプルのヘマトクリットの判定のため化学試薬を用いて血球凝集の使用を実施した（第３の実施形態）。第４の実施形態では、ラテックス免疫凝集アッセイ（ＬＩＡ）を実行するためにＤＭＦ法を実装した。この例では、抗生物質感受性に対してテストが実証されたが、任意のＬＩＡに適合性があるだろうことを見込んでいる。最終的に、ＤＭＦ凝集アッセイの結果を解釈するためのカスタムであるが一般化されたアルゴリズムを用いての撮像ベースの読み出しを記載する。まとめて考えると、ユーザは、サンプルをロードし、ボタンを押し、数分程度で結果を受信し得る。
以下の表１は、ここに記載した我々の新規方法と文献に記載されたこれまでの２つのＤＭＦ凝集法の大きな違いの一部を概説した表である。
Figure 2022531341000005
Figure 2022531341000006
本発明者らは、デジタルマイクロ流体を用いる凝集アッセイを実施している文献記載を認識しているが、それらの全ては本発明とは無関係である。先の記載のいずれも、凝集アッセイを実行するのに２プレートエレクトロウェッティングデバイスを用いていない。反対に、異なるタイプのアッセイ、レクチンを用いる凝固アッセイおよび血漿分離が２プレートＤＭＦデバイス上で実施されているが、上記のいずれも本発明に関連しない。さらに、凝集の検出は、肉眼またはＤＡＡＤ（デジタルカメラでキャプチャされた画像において凝集を検出する我々の独自の検出アルゴリズム）の使用のいずれかで実行される。本方法は、先に記載した通り、凝集を判定するのに吸光モジュールを用いることに依るものであり、アルゴリズムは、凝集の検出に、先に記載された方法のいずれも用いていない。なぜなら、これらの方法は、高額な撮像機器（顕微鏡セットアップまたはハイエンドＤＳＬＲカメラ）に依り、撮像条件（明度、コントラスト、ホワイトバランスなど）に高く依存するからである。いくつかの他の先に記載された方法の性能は、ＤＡＡＤと比較され、本ＤＡＡＤはそれらのいずれよりも性能が優れていることが本明細書中で示されている。
まとめると、一態様において、本開示は、複数の駆動電極を有する２プレートエレクトロウェッティングデジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）を用いて、分析物を含有するサンプルを特徴付ける方法を提供する。方法は、分析物を含有する流体サンプルおよび界面活性剤および凝集剤を上記ＤＭＦデバイス上にロードするステップと；エレクトロウェッティングを用いて流体サンプルを凝集剤に接触させ、分析物を凝集剤により凝集するステップとを備える。
別の態様では、本開示は、第１のプレートと上記第１のプレートから離間した第２のプレートであって、上記第１のプレートおよび第２のプレートのうちの１つが複数の駆動電極を有する、第１のプレートと第２のプレートと；第１のプレートまたは第２のプレートのいずれかの表面であって、表面の事前選択された場所を被覆する予備乾燥された形態の界面活性剤を有する表面、および、第１のプレートまたは第２のプレートのいずれかの別の表面であって、この別の表面の事前選択された場所を被覆する予備乾燥された形態の凝集剤を有する別の表面とを備える２プレートエレクトロウェッティングＤＭＦデバイスを提供する。
界面活性剤によって被覆された表面および凝集剤で被覆された表面は、異なるまたは同じである。
本開示はまた、複数の駆動電極を有する２プレートエレクトロウェッティングデジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）と；上記２つのプレートの１つに配置する界面活性剤と；２つのプレートの１つに配置する凝集剤とを備えるキットを提供する。
上述された具体的な実施形態は、例として示されており、これらの実施形態は様々な変更および代替形態を生じやすくあり得ることが理解される。特許請求の範囲は、開示された特定の形態に限定されることが意図されるのではなく、本開示の精神および範囲内の全ての変更物、等価物および代替物を網羅することが意図されることもさらに理解される。
参照文献
１．Ｃａｓｔｒｏ， Ｄ．， Ｃｏｎｃｈｏｕｓｏ， Ｄ．， Ｋｏｄｚｉｕｓ， Ｒ．， Ａｒｅｖａｌｏ， Ａ． ＆ Ｆｏｕｌｄｓ， Ｉ． Ｇ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍ． Ｇｅｎｅｓ ９， ２８１ （２０１８）
２．Ｍａ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｉｃｒｏ－ｃｈｉｐ ｓｈｅａｔｈｌｅｓｓ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ９， ０６６５０１－０６６５０１ （２０１５）
３．Ｌｕｃａｓ， Ｌ． Ｊ．， Ｈａｎ， Ｊ．－Ｈ．， Ｃｈｅｓｌｅｒ， Ｊ． ＆ Ｙｏｏｎ， Ｊ．－Ｙ． Ｌａｔｅｘ ｉｍｍｕｎｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ｕｓｉｎｇ ｓｔａｔｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ２２， ２２１６－２２２２ （２００７）
４．Ａｆｓｈａｒ， Ｒ．， Ｍｏｓｅｒ， Ｙ．， Ｌｅｈｎｅｒｔ， Ｔ． ＆ Ｇｉｊｓ， Ｍ． Ａ． Ｍ． Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｆ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｆｏｒ ｏｎ－ｃｈｉｐ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８３， １０２２－１０２９ （２０１１）
５．Ｈｕｅｔ， Ｍ．， Ｃｕｂｉｚｏｌｌｅｓ， Ｍ． ＆ Ｂｕｈｏｔ， Ａ． Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｓｉｄｅ ａ ｐａｓｓｉｖｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｂｉｏｃｈｉｐ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ． Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ９３， １１０－１１７ （２０１７）
６．Ｈｕｅｔ， Ｍ．， Ｃｕｂｉｚｏｌｌｅｓ， Ｍ． ＆ Ｂｕｈｏｔ， Ａ． Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｔｙｐｉｎｇ Ｗｉｔｈｉｎ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐｓ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ７， １０ （２０１８）
７．Ｙｏｏｎ， Ｊ．－Ｙ． ＆ Ｙｏｕ， Ｄ． Ｊ． Ｂａｃｋｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｉｎ ｗｉｒｅ－ｇｕｉｄｅ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２， １５－１５ （２００８）
８．Ｋｉｒｂｙ， Ａ． Ｅ． ＆ Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ａ． Ｒ． Ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８５， ６１７８－６１８４ （２０１３）
９．Ｒａｃｋｕｓ， Ｄ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ ｆｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ． Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １５， ３７７６－３７８４ （２０１５）
１０．Ｎｇ， Ａ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｂｅｌｌａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ： ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ６１， ４２０－４２９ （２０１５）
１１．Ｎｇ， Ａ． Ｈ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｄｉｇｉｔａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｉｎ ｒｅｍｏｔｅ ｓｅｔｔｉｎｇｓ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． １０， ｅａａｒ６０７６ （２０１８）
１２．Ｊｅｂｒａｉｌ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ． Ｊ． Ｆｌｏｗ Ｃｈｅｍ． ２， １０３－１０７ （２０１２）
１３．Ｒａｓｔｏｇｉ， Ｖ． ＆ Ｖｅｌｅｖ， Ｏ． Ｄ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌｉｓｔｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｏａｓｓａｙｓ ｉｎ ｆｒｅｅｌｙ ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ． Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ １， １４１０７ （２００７）
１４．Ｈｏｌｍｅｓ， Ｈ． Ｒ． ＆ Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ， Ｋ． Ｆ． Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ． Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＆ Ｎａｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １， １５０２２ （２０１５）
１５．Ｄａｒｈｕｂｅｒ， Ａ． Ａ．， Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ， Ｊ． Ｐ．， Ｄａｖｉｓ， Ｊ． Ｍ．， Ｔｒｏｉａｎ， Ｓ． Ｍ． ＆ Ｗａｇｎｅｒ， Ｓ． Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ａｃｔｕａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｔｒｅｓｓｅｓ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． Ｌｅｔｔ． ８２， ６５７－６５９ （２００３）
１６．Ｌｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｕａｔｅｄ ｒｏｂｏｔ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ６， ｅａａｙ５８０８ （２０２０）
１７．Ｄｉｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｏｕｓｔｉｃ ｗａｖｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ． Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ １３， ３６２６－３６４９ （２０１３）
１８．Ｆｏｌｅｙ， Ｊ．， Ｂｕｒｄｅ， Ｓ．， Ｐａｍｕｌａ， Ｖ． Ｋ． ＆ Ｐｏｌｌａｃｋ， Ｍ． Ｇ． Ｒｅａｇｅｎｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｎ ａ ｄｒｏｐｌｅｔ ａｃｔｕａｔｏｒ． （２０１７）
１９．Ｓｔａｖｉｔｓｋｙ， Ａ． Ｂ． ｉｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ） （ｅｄ． Ｄｅｌｖｅｓ， Ｐ． Ｊ．） ５６－５９ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９９８）
２０．Ｈａｄｗｅｎ， Ｂ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｓｅｎｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｎ ａｓｓａｙ ｔｈｅｒｅｉｎ． （２０１７）
２１．Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓ．， Ｃｌａｒｋ， Ｌ． ＆ Ｄｕｍａｓ， Ｎ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｅｒａ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １８， １９７－１９８ （１９８３）
２２．Ｋａｓｅｍｐｉｍｏｌｐｏｒｎ， Ｓ．， Ｓａｅｎｇｓｅｅｓｏｍ， Ｗ．， Ｌｕｍｌｅｒｔｄａｃｈａ， Ｂ． ＆ Ｓｉｔｐｒｉｊａ， Ｖ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｄｏｇ ｓａｌｉｖａ ｕｓｉｎｇ ａ ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３８， ３０９８－３０９９ （２０００）
２３．Ｋｏｔｂｙ， Ａ． Ａ．， Ｈａｂｅｅｂ， Ｎ． Ｍ． ＆ Ｅｌａｒａｂ， Ｅｌ， Ｓ． Ｅ． Ａｎｔｉｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ Ｏ ｔｉｔｅｒ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ： ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ． Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ４， （２０１２）
２４．Ｗｉｎｋｌｅｓ， Ｊ．， Ｌｕｎｅｃ， Ｊ． ＆ Ｄｅｖｅｒｉｌｌ， Ｉ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ－ｌａｔｅｘ－ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ， ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ａｎａｌｙｚｅｒ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３３， ６８５－６８９ （１９８７）
２５．Ｉｄｅｌｅｖｉｃｈ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ－ｂａｓｅｄ ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２， ３３９４－３３９８ （２０１４）
２６．Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｅｓｈ／６８００６３８４． （Ａｃｃｅｓｓｅｄ： ２８ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１９）
２７．Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｇ． Ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐｓ： ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐｓ １－１０ （２０１３）
２８．Ｄｅａｎ， Ｌ． Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ． （２００５）
２９．Ｂｌｏｏｄ Ｇｒｏｕｐｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ． （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ）． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｙｃｔｓ．ｏｒｇ／Ｐｏｒｔａｌｓ／０／Ａｓｓａｙ＿ＰＩ／ＷｈｏｌｅＢｌｏｏｄ／ＡＢＯＲＨ．ｐｄｆ． （Ａｃｃｅｓｓｅｄ： ２８ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１９）
３０．Ｇｌｏｂａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｇｒｏｕｐ Ｔｙｐｉｎｇ Ｍａｒｋｅｔ． （Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ Ｍａｒｋｅｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙｍａｒｋｅｔｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅ／ｂｌｏｏｄ－ｇｒｏｕｐ－ｔｙｐｉｎｇ－ｍａｒｋｅｔ．ｈｔｍ． （Ａｃｃｅｓｓｅｄ： ２８ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１９）
３１．Ｏｓａｄａ， Ｙ．， Ｐｉｎｇ Ｇｏｎｇ， Ｊ． ＆ Ｔａｎａｋａ， Ｙ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｇｅｌｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐａｒｔ Ｃ： Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４， ８７－１１２ （２００４）
３２．Ｃｈｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ５Ｎ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９， １５５－１６０ （２００７）
３３．ｖａｎ Ｇｒｉｅｔｈｕｙｓｅｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ｓｌｉｄｅ ｌａｔｅｘ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７， ２７８９－２７９２ （１９９９）
３４．Ｎｅｍｒ， Ｃ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ９１， ２８４７－２８５３ （２０１９）
３５．Ａｓｈｉｂａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂｌｏｏｄ ｔｙｐｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ－ｍｏｄｅ ｓｅｎｓｏｒｓ． Ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏ－Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３， ５９－６４ （２０１５）
３６．Ｃａｓｔｒｏ， Ｄ．， Ｃｏｎｃｈｏｕｓｏ， Ｄ．， Ｋｏｄｚｉｕｓ， Ｒ．， Ａｒｅｖａｌｏ， Ａ． ＆ Ｆｏｕｌｄｓ， Ｉ． Ｇ． Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ ｉｎ ａ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｇｅｎｅｓ ９， ２８１ （２０１８）
３７．Ｋｌｉｎｅ， Ｔ． Ｒ．， Ｒｕｎｙｏｎ， Ｍ． Ｋ．， Ｐｏｔｈｉａｗａｌａ， Ｍ． ＆ Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ， Ｒ． Ｆ． ＡＢＯ， Ｄ Ｂｌｏｏｄ Ｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｐｌｕｇ－Ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ８０， ６１９０－６１９７ （２００８）
３８．Ｓｉｓｔａ， Ｒ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｏ Ｍａｘｉｍｉｚｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ Ｌｏｗ Ｓａｍｐｌｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｎｅｗｂｏｒｎｓ ａｎｄ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ １０， ２１ （２０２０）
３９．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ， Ｖ．， Ｐａｍｕｌａ， Ｖ． Ｋ．， Ｐｏｌｌａｃｋ， Ｍ． Ｇ． ＆ Ｆａｉｒ， Ｒ． Ｂ． Ｄｒｏｐｌｅｔ－ｂａｓｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｓｓａｙｓ． （２０１３）

Claims (31)

  1. 事前選択された分析物が存在するか否かを凝集アッセイを用いて判定するようにサンプルを特徴付ける方法であって、
    複数の駆動電極を有する２プレートエレクトロウェッティングデジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）を提供するステップと；
    前記分析物を含有する流体サンプルおよび凝集を生じさせることが可能な凝集剤を、前記ＤＭＦデバイスの別々の駆動電極上にロードするステップと；
    エレクトロウェッティングを用いて前記流体サンプルを前記凝集剤に接触させ、前記サンプルに存在する前記分析物のいずれかを前記凝集剤で凝集して凝集体を生成するステップと；
    前記流体サンプルの前記事前選択された分析物の存在によって形成された凝集体を視覚的に特徴付けるステップとを含む、前記方法。
  2. 前記凝集体を視覚的に特徴付ける前記ステップが、前記凝集体を見ているユーザによってまたはカメラを用いることによってのいずれかで実行される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記流体サンプルの前記事前選択された分析物の存在によって形成された凝集体を視覚的に特徴付けるのにカメラを用いるとき、前記凝集剤によって引き起こされた前記分析物の凝集量を、前記流体サンプルの画像分析を用いて判定することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記分析物を含有する前記流体サンプルまたは前記凝集剤またはその両方に混合された界面活性剤をさらに含む、請求項１、２、または３に記載の方法。
  5. 予備乾燥された形態の界面活性剤をさらに備える、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法がさらに、１つまたは複数の駆動電極を、駆動電極の事前判定されたスポットまたはアレイ全体にわたって、前記予備乾燥された形態の界面活性剤で被覆し、前記流体サンプルが前記予備乾燥された界面活性剤と接触すると、可溶化するようにすることを含む、前記方法。
  6. 前記界面活性剤が、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のうちの１つである、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、臭化セトリモニウム、塩化セトリモニウム、およびラウリル硫酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記非イオン性界面活性剤が、アルキルフェノールヒドロキシポリエチレン、ポリソルベート、ポロキサミン、ポロキサマー、およびソルビタンエステルからなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記凝集剤が、事前選択された駆動電極にロードかつ計量供給された液体凝集剤である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＤＭＦデバイス上で、前記凝集剤をエレクトロウェッティングを用いて前記流体サンプルと激しく混合するステップをさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記凝集剤が、１つまたは複数の化学凝集剤および生物凝集剤からなる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記化学凝集剤が、ポリ－Ｌ－リシン臭化水素酸塩、ポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）クロリド、ポリ－Ｌ－アルギニン塩酸塩、ポリ－Ｌ－ヒスチジン、ポリ（４－ビニルピリジン）、ポリ（４－ビニルピリジン）塩酸塩、架橋ポリ（４－ビニルピリジン）、塩化メチル第４級塩、ポリ（４－ビニルピリジン－ｃｏ－スチレン）；ポリ（４－ビニルピリジニウム ポリ（フッ化水素））；ポリ（４－ビニルピリジニウム－Ｐ－トルエンスルホナート）；ポリ（４－ビニルピリジニウム－トリブロミド）；ポリ（４－ビニルピロリドン－ｃｏ－２－メタクリル酸ジメチルアミノエチル）；架橋ポリビニルピロリドン；ポリビニルピロリドン、部分メチル化ポリ（メラミン－ｃｏ－ホルムアルデヒド）；臭化ヘキサジメトリン；ポリ（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ）１：４臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）３：１臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）２：１臭化水素酸塩；ポリ－Ｌ－リシンスクシンシニル化；ポリ（Ｌｙｓ、Ａｌａ）１：１臭化水素酸塩；ポリ（Ｌｙｓ、Ｔｒｐ）１：４臭化水素酸塩；およびポリ（ジメチルジアリルアンモニウム）クロリドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記生物凝集剤が、タンパク質、抗体、ウィルスおよび抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡベースのアプタマーからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記タンパク質が、糖構造と可逆的に結合可能なレクチンを備える、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記抗体が、抗Ａ、抗Ｂ、および抗Ｄを備える、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記ウィルスが、インフルエンザウィルスを備える、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記凝集剤が、前記凝集剤で被覆された粒子を備える、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記粒子が、ポリマー粒子、金、銀、ナノ粒子およびマイクロ粒子の任意の１つまたは組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ポリマー粒子がラテックス粒子である、請求項１８に記載の方法。
  20. 検出対象の前記分析物が抗体であり、前記粒子が、抗原、または前記目的抗体を捕捉可能な他の剤で被覆されている、請求項１７に記載の方法。
  21. ポリマー粒子の懸濁液の凝集に用いる、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 赤血球の懸濁液の凝集に用いる、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記流体が、少なくとも赤血球を備える血液である、請求項１から２０のいずれか1項に記載の方法。
  24. 前記凝集剤が、ヘマトクリット値の判定のために赤血球を凝集するのに用いられる化学凝集剤である、請求項２３に記載の方法。
  25. 第１のプレート、前記第１のプレートから離間した第２のプレートであって、前記第１のプレートおよび第２のプレートの１つが複数の駆動電極を有する、前記第１のプレート、前記第２のプレートと；
    前記第１のプレートまたは前記第２のプレートのいずれかの表面であって、前記表面の事前選択された場所を被覆する予備乾燥された形態の界面活性剤を有する前記表面、および、前記第１のプレートまたは前記第２のプレートのいずれかの別の表面であって、前記別の表面の事前選択された場所を被覆する予備乾燥された形態の凝集剤を有する前記別の表面とを備える、２プレートエレクトロウェッティングＤＭＦデバイス。
  26. 電源および前記複数の駆動電極に接続されかつ事前選択された分析物の存在が調査されている流体サンプルの液滴および凝集剤を前記電極にわたって移動させるために前記駆動電極に事前選択されたパターンで電力を提供する命令でプログラミングされたマイクロプロセッサをさらに備える、請求項２５に記載のＤＭＦデバイス。
  27. 前記界面活性剤で被覆された前記表面と前記凝集剤で被覆された前記表面が、異なるまたは同じである、請求項２５または２６に記載のＤＭＦデバイス。
  28. 視野角が前記ＤＭＦデバイスを覆うように配置されたカメラを含み、前記画像が、前記流体サンプルの画像分析を用いて、前記凝集剤によって引き起こされた前記分析物の凝集量を判定するように分析される、請求項２５、２６、または２７に記載のＤＭＦデバイス。
  29. 前記凝集体の画像分析を用いて前記凝集剤によって引き起こされた前記分析物の凝集量を判定する前記ステップが、前記凝集物における前記凝集量を判定するための前記液滴凝集アルゴリズムのすべてまたは一部を用いるようにプログラムされた画像分析アルゴリズムを用いて実行される、請求項３に記載の方法。
  30. 前記アルゴリズムが、前記カメラと関連するマイクロプロセッサに格納される、または前記ＤＭＦデバイスの前記駆動電極を制御するＤＭＦ電源に接続されているマイクロプロセッサに格納される、または、リモートコンピュータに格納され前記マイクロプロセッサあるいは前記コンピュータによって実行されるようにプログラムされる、請求項３に記載の方法。
  31. 複数の駆動電極を有する２プレートエレクトロウェッティングデジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）と；
    電源および前記複数の駆動電極に接続されかつ前記流体サンプルの液滴および前記凝集剤を前記電極にわたって移動させるために前記駆動電極に事前選択されたパターンで電力を提供する命令でプログラミングされたマイクロプロセッサと；
    前記２つのプレートの１つに配置する界面活性剤と；
    前記２つのプレートの１つに配置する凝集剤と；
    視野角が前記ＤＭＦデバイスを覆うように配置されたカメラと；
    前記流体サンプルの画像分析を用いて、前記凝集剤によって引き起こされた前記分析物の凝集量を判定することを含む、前記流体サンプルの前記事前選択された分析物の存在によって形成された任意の凝集体を視覚的に特徴付ける画像分析アルゴリズムとを備える、キット。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1176424B1 (en) * 2000-07-27 2006-01-18 Sysmex Corporation Whole blood immunoassay
AU2003272491B2 (en) * 2002-09-18 2008-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods and kits for detection of an antigen on a cell and in a biological mixture
US10533998B2 (en) * 2008-07-18 2020-01-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
AU2005303388A1 (en) * 2004-11-15 2006-05-18 Inverness Medical Switzerland Gmbh Blood type method system and device
US9631244B2 (en) 2007-10-17 2017-04-25 Advanced Liquid Logic, Inc. Reagent storage on a droplet actuator
WO2009135205A2 (en) 2008-05-02 2009-11-05 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator techniques using coagulatable samples
WO2017004463A1 (en) * 2015-07-01 2017-01-05 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
US20170056887A1 (en) 2015-08-28 2017-03-02 Sharp Kabushiki Kaisha Droplet microfluidic device and methods of sensing the results of an assay therein
EP3370064B1 (en) 2015-10-30 2023-10-04 LSI Medience Corporation Reagent and method for measuring thrombin-antithrombin complex
JP2020502478A (ja) * 2016-10-05 2020-01-23 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 試料分析のためのデバイスおよび方法
BR112019006927A2 (pt) 2016-10-05 2019-07-02 Abbott Lab dispositivos e métodos para análise de amostra

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