JP2011043450A - バイオアッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】従来よりも正確なバイオアッセイを提供する。
【解決手段】試料液中に含まれる測定対象物を測定するバイオアッセイは、前記試料液に、前記測定対象物と特異的に結合する生物学的特異的結合物質を担持している担体粒子含有試薬を混合して、試薬混合試料液を準備する第１工程と、一対の電極間領域の反応部に、前記試薬混合試料液を導入する第２工程と、前記一対の電極に交流電圧を印加し、前記試薬混合試料液中の前記担体粒子を集合させて生物学的特異結合反応を起こさせる第３工程と、前記交流電圧の印加を停止する第４工程と、前記反応部の画像情報から粒子密度を検出する第５工程と、前記反応部を複数の領域に分割し、前記複数の領域のそれぞれの前記粒子密度がしきい値以上である領域のみを解析領域として決定する第６工程と、前記解析領域における前記担体粒子の凝集度を検出する第７工程と、を含む。
【選択図】図４

Description

本発明は、バイオアッセイに関する。特に、粒状担体を誘電泳動力により制御することでバイオアッセイを実施する方法に関する。バイオアッセイは、特異結合反応に基づく原理であり、生化学反応、酵素反応、免疫反応等の特異結合反応に関する。

近年、分析・解析・検査技術に進歩により、様々な物質を測定することが可能となってきている。臨床検査分野においては、生化学反応、酵素反応、免疫反応等の特異結合反応に基づく測定原理の開発により、病態に反映する血液中の物質を測定できるようになった。特に、免疫反応である抗原抗体反応という特異結合反応を利用する測定方法は、測定するべき物質の抗体を作製することができるので、測定原理として幅広く適用できる。その抗原抗体反応を用いたひとつの方法として、抗原抗体反応によって生じた免疫凝集物を光学的に検出する方法がある。この方法では、まず、測定対象物質を含む液体試料に測定対象物質に特異的に結合することが可能な抗体を一定量加えて、凝集物を形成させる。次に、凝集物に光を照射すると、光は凝集物に当たって散乱する為に、液体試料を透過する光量が変化する。光量の変化は、透過光、反射光、散乱光のいずれかを測定することにより知ることができる。一般に透過光を測定する方法が免疫比濁法であり、散乱光を検出する方法が免疫比朧法として区別されているが、凝集物による光の散乱の影響を観察するという点では同じ検出原理であると言える。凝集物の量は、測定対象物質の濃度に比例して変化するので、透過光、反射光、散乱光のいずれかを測定すれば、測定対象物質の濃度を求めることが可能である。

この方法について感度をさらに向上させる方法がラテックス凝集法である。前述の方法において、抗体をラテックスに結合させておくと、測定対象物質と抗体が結合することによって、ラテックス粒子の凝集物が形成される。ラテックス粒子の凝集物は、抗原抗体反応性物質の凝集物よりもはるかに光の散乱が大きいので、より高感度な検出が可能である。

ラテックス凝集法をさらに高感度化させる方法が、特許文献１により開示されている。図１５から図１７を用いて、文献１に開示されている測定装置および測定方法について説明する。図１３は、測定チップの断面図、図１４は、反応測定装置のブロック図、図１５および図１６は測定チップの電極部分の拡大図である。スライドグラス２２に、厚さ２０μｍの電極９Ａ、Ｂが、電極間距離が０．５ｍｍになるように挟み込まれている。ラテックス粒子２３は、スライドグラス２２および電極９Ａ、９Ｂで囲まれた流路２４に懸濁液として分散されている。電極９Ａ、９Ｂに、交流電源発生装置２６を用いて交流電圧を印加し、上記反応系に電場を印加することによって、ラテックス粒子２３がパールチェーンと呼ばれる直線的に並ぶ現象を起こす。

その後、電場を停止すると直線的に並んでいたラテックス粒子２３は再び分散する。パールチェーン化の際に抗原抗体反応性物質が存在すると、電場を停止後もラテックス粒子１２の再分散が起こらず、パールチェーン化した粒子の存在がなおも認められる。したがって、電場を停止後も再分散しない、すなわち抗原抗体凝集反応に関与しているラテックス粒子２３を、顕微鏡２７、ＣＣＤカメラ２８、画像処理ボード２９、パーソナルコンピュータ３０より成る画像処理装置により、ラテックス粒子１２の凝集状態を測定して、抗原抗体反応性物質の存在を検出又は測定する。以上のように、電場の力を利用し、ラテックス粒子同士を迅速に接触させることで、高感度かつ迅速な測定を実現している。

特開平７−８３９２８号公報

従来の方法において、ラテックス粒子を電場に沿ってパールチェーン化させることで免疫凝集反応を促進させることが実現できている。すなわち、粒子をパールチェーン化させることが重要な工程であり、同じ条件でパールチェーン化された粒子を画像解析しなければ正確なバイオアッセイは実現できない。しかしながら、従来の方法ではパールチェーン化の作用を受ける時間（以下、ＰＣ反応時間と呼ぶ）が微小空間の場所により異なり、正確なバイオアッセイができない可能性があった。

上記にも示すように、従来技術で使用されている測定チップは厚み２０μｍ程度の微小な空間であるため、毛細管現象による流れが生じている。従って、時間の経過とともに点着部に存在する粒子は電極が存在している反応部へ導入されている。その結果、電圧印加前に反応部に存在していた粒子と点着口から反応部へ新たに導入された粒子ではＰＣ反応時間が異なってしまう。つまり、点着口から新たに導入された粒子はＰＣ反応時間が短くなる。これは、パールチェーン化によりそれぞれの粒子を接近させ、免疫凝集反応を起こさせる時間が短いことを示すものであり、免疫凝集反応時間を十分に確保できていない領域が存在することを意味する。このようにＰＣ反応時間が異なる粒子を除外することなく、凝集度を算出していては正確なバイオアッセイが実現できない可能性があった。

上記課題に対し、前記測定チップの反応部の出口付近画像を取得することにより、ＰＣ反応時間が短くなる領域の粒子を排除することができ、上記問題を回避することができると思われる。しかし、免疫アッセイとして精度を確保する必要性からは、凝集度算出対象となる粒子数を可能な限り多くする必要があり、複数枚の画像取得が必要となる。このように複数枚の画像を必要とする場合、空気孔付近の画像だけでなく点着口付近の画像が必要となる。そうすると、測定チップの点着口付近の粒子の画像を取得する可能性があり、その結果、ＰＣ反応時間が異なる粒子を解析する可能性が高くなる。また、前記測定チップや試料液の成分によっては、毛細管現象による流れの速さも変動することもある。その速さが速くなれば、ＰＣ反応時間が異なる粒子の凝集度を解析する可能性はさらに高くなる。また、反応部の領域を大きくすることで本課題の影響を少なくすることは可能であるが、測定に必要な液体試料量が増加する。その結果、試薬が多く必要となり、高コスト化につながる。

本発明の目的は、従来よりも正確なバイオアッセイを提供することである。

本発明の試料液中に含まれる測定対象物を測定するバイオアッセイは、試料液に、前記測定対象物と特異的に結合する生物学的特異的結合物質（抗体）を担持している担体粒子（例えばラテックス）含有試薬を混合して、試薬混合試料液を準備する第１工程と、一対の電極間領域の反応部に、前記試薬混合試料液を導入する第２工程と、前記一対の電極に交流電圧を印加し、前記試薬混合試料液中の前記担体粒子を集合させて生物学的特異結合反応を起こさせる第３工程と、前記交流電圧の印加を停止する第４工程と、前記反応部の画像情報から粒子密度を検出する第５工程と、前記反応部を複数の領域に分割し、前記複数の領域のそれぞれの前記粒子密度がしきい値以上である領域のみを解析領域として決定する第６工程と、前記解析領域における前記担体粒子の凝集度を検出する第７工程と、を含む。前記反応部を複数の領域に分割し、前記複数の領域のそれぞれの前記粒子密度がしきい値以上である領域のみを解析領域として決定するので、パールチェーン化の作用を受ける時間が短くなる領域の粒子については凝集度解析から排除することができる。

本発明の試料液中に含まれる測定対象物を測定するバイオアッセイは、試料液に、前記測定対象物と特異的に結合する生物学的特異的結合物質を担持している担体粒子含有試薬を混合して、試薬混合試料液を準備する第１工程と、一対の電極間領域の反応部に、前記試薬混合試料液を導入する第２工程と、前記一対の電極に交流電圧を印加し、前記試薬混合試料液中の前記担体粒子を集合させて生物学的特異結合反応を起こさせる第３工程と、
前記交流電圧の印加を停止する第４工程と、前記反応部の画像情報から粒子密度を検出する第５工程と、前記反応部を複数の領域に分割し、前記複数の領域のうち前記粒子密度がしきい値未満である少なくとも１つの領域を検出し、前記少なくとも１つの領域よりも前記反応部の点着口に近い領域の全てを除外して、解析領域として決定する第６工程と、前記解析領域における前記担体粒子の凝集度を検出する第７工程と、を含む。前記反応部を複数の領域に分割し、前記複数の領域のうち前記粒子密度がしきい値未満である少なくとも１つの領域を検出し、前記少なくとも１つの領域よりも前記反応部の点着口に近い領域の全てを除外して、解析領域として決定するので、パールチェーン化の作用を受ける時間が短くなる領域の粒子については凝集度解析から排除することができる。

前記反応部の点着口付近に、不均一電場が生じるような電極が配置されることが好ましい。

本発明のバイオアッセイにより、パールチェーン化の作用を受ける時間が短くなる領域の粒子については凝集度解析から排除することができる。そのため、パールチェーン化の作用を受ける時間が同程度の粒子だけを対象とし凝集度解析を行うことができる。よって、正確なアッセイが実現できる。また、測定ごとに粒子の流れの速さが変わった場合でも、本発明のバイオアッセイを用いれば、パールチェーン化の作用を受ける時間が同程度の粒子だけを解析対象とすることができる。よって、流れのような変動要因の影響を受けることなく正確なアッセイができる。さらに、本発明のバイオアッセイを用いることで、反応部の領域を大きくすることなく正確なアッセイができることから、高価な試薬の使用量が少なくなり低コストに繋がる。

実施の形態１の測定システムのブロック図 実施の形態１の測定チップの平面図 実施の形態１の測定チップの断面図 実施の形態１に示した方法を説明するためのフローチャート （a）から（d）は点着口付近の反応部中の担体粒子挙動を示す図 反応部の平面図 実施の形態１の工程６のフローチャート 実施の形態２の工程６のフローチャート 実施の形態３の工程６のフローチャート 実施の形態４の測定チップの平面図 実施の形態４の測定チップの斜視図 （a）から（d）は点着口付近の反応部中の担体粒子挙動を示す図 実施例１の測定システム図 実施例１の撮影画像と規定領域を示したイメージ図 従来例の生物学的特異的反応チップの断面図 従来例の生物学的特異的反応物質の存在を検出又は測定するシステムのブロック図 従来例の電圧印加時の生物学的特異的反応チップ電極部分の拡大図 従来例の電圧停止時の生物学的特異的反応チップ電極部分の拡大図 各画像の規定領域の粒子個数の表を示す図 Ｎｏ８、９、１０をのぞいた画像で平均凝集度を計算した結果の表を示す図 各画像の凝集度の表を示す図

（実施の形態１）
本発明で用いられる試料液とは、塩を所定の濃度で含む電解質溶液、あるいは、生体内試料である、血液・血漿・尿などである。試薬液とは、抗体などの生物学的特異的反応物質が担持された微粒子と生物学的反応が必要な物質を含んだ液体である。反応液とは、前記試料液と試薬液を混合した液体のことである。実施の形態１の生物学的特異的反応物質の測定方法について以下に説明する。

１．本発明の測定チップおよび装置
図１には、本発明の測定システムのブロック図が示される。分析装置は電圧を印加する電圧印加部１と、担体粒子群の凝集または分散割合を取得する検出部２と、電圧印加部１と検出部２を制御し、さらに検出部２から得られた結果を数値解析する解析制御部３を備えている。また、測定チップ４が挿入できるコネクタ６も備えている。図２は測定チップの平面図であり、図３は、図２のＡ−Ａ’線での部分断面図である。測定チップは、上基板７と、下基板８と、中空形状であり、１対の対向電極９Ａ、Ｂを含む反応部１０と、試料を点着する点着口１１と、反応部１０の気体を前記試料の流入によって排出する空気孔１２を有している。

検出部２は、測定チップの反応部１０内に配置される担体粒子１４の挙動、すなわち、担体粒子が２個以上で凝集しているかまたは凝集せずに単独で存在しているか検出できる。例えば、検出部２は画像撮像手段であってもよく、測定チップ４の上基板７または下基板８に透明性を付与すれば、検出部２によって反応部１０内の様子を容易に撮像することができる。なお、撮像は動画であっても、静止画であってもよい。また、検出部２は測定チップの反応部１０内を観察するために上下左右に移動できる。

制御解析部３は、分析装置による測定の制御とともに、検出部２で検出された結果を処理することができる。また、電圧印加部１や検出部２を動作の制御を行うことができる。
測定チップ４は中空の反応部１０が形成されておればよく、例えば、凹部をもつ上基板７と、下基板８からなり、それらが挟まれてもよいし、または、上基板７と、下面基板８と、中間基板からなり、それらを重ねあわせてもよい。いずれにしても、測定チップ４の反応部１０は、その頂面を上基板７、底面を下基板８としている。なお、反応部１０では担体粒子を検出できれば、特に構造に制限されることはない。

上基板７と下基板８の材料は、絶縁材料で構成されている。絶縁材料の例としては、有機材料またはガラスなどの無機絶縁材料から選ばれる。有機材料の例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどが含まれる。無機絶縁材料の例には、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などが含まれる。ガラスは、アルカリガラス、アルカリソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラスなどである。

測定チップ４の反応部１０には、担体粒子１４が提供される。反応部１０では、担体粒子１４をパールチェーン状に配列させるため、対向電極を含んでいる。なお、画像撮像手段のように光学的に担体粒子の挙動を検出する場合は、上基板７および下基板８の一部は透明性を有することが必要である。反応部１０の深さは、直径数μｍの大きさを持つ担体粒子１４を反応部１０に投入することができ、かつ、担体粒子１４を検出できれば特に限定されるものではない。例えば、検出が画像撮像手段であれば、５μｍ以上１０μｍ以下であることが望ましい。かかる深さは、担体粒子１４を一層に配置させることができるためである。

反応部１０の幅および長さは、電極９Ａ、Ｂを内部に配置、すなわち、電極９Ａ、Ｂと反応液が接触し、かつ、必要な量の反応液が注入できる溶液を持てば任意である。例えば、反応部１０の幅は０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であり、好適には０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下であり、代表的には０．７ｍｍである。反応部１０の長さは、約５ｍｍである。反応部１０の内部表面は、親水性であっても、疎水性であってもよい。また、いずれの表面の一部または全部を、親水性または疎水性にしてもよい。また、粒子の吸着を抑制する表面処理が施されていてもよい。点着口１１の形状は、反応液を挿入でき、反応部１０に担体粒子１４を含む反応液を導入できれば特に制限されるものではない。空気孔１２は反応部１０の気体を試料の流入によって排出する場所に配置されておればよく、反応部１０の気体を排出すれば、大きさは特に制限されることはない。

（測定チップの作製方法）
測定チップ４の作製方法は、特に限定されない。例えば、測定チップ４は、以下の工程で作製される。

（工程１）上基板７に反応部１０の形状に応じた凹部と、必要に応じて反応液を注入するための点着口１１および空気孔１２等を形成する。工程１の、凹部、点着口１１、空気孔１２は当業者に公知の技術で形成される。一例を示すと、切削技術やレーザーによる除去技術、あるいはインプリント技術やフォトリソグラフィーなどが選択される。なお、反応部１０は直方体に限定されることなく、例えば、円柱であってもよい。また、点着口１１と空気孔１２をつなぐ形状であればよい。

（工程２）下基板８に電極を形成する。電極の形成方法はスパッタや蒸着に代表される薄膜堆積技術、あるいは印刷技術など当業者に公知の技術を用いて作製される。好適に用いられるのはスパッタであり、これにより電極９Ａ、９Ｂの膜厚を薄くでき、工程３で貼り合せる際の電極段差によるスキマが生じないため望ましい。一例を挙げると、電極９の膜厚は、１ｎｍ〜１０μｍから選ばれ、特にスパッタを用いる時は、５０ｎｍ〜５００ｎｍであり、好適には１００ｎｍが製造時間の観点から好ましい。電極９Ａ、９Ｂの幅は任意であり、通常０．５ｍｍ〜５ｍｍ程度である。さらに、電極９Ａ、９Ｂは電圧印加部と連通するよう、配線や電気的接触を実現する端子を有する。電極９Ａと９Ｂを配置する間隔は、５〜１０００μｍから選ばれる。間隔５μｍ以下では、直径が数μｍである粒子が十分に数珠繋ぎ状に形成するための領域を確保できず、また、間隔１０００μｍ以上では、有効な電界強度が得られない、あるいは、有効な電界強度を得るために、５０Ｖ以上の大きな電圧印加が必要となるため、好ましくない。より望ましくは、１００〜５００μｍであり、好適には上記の観点から５００μｍである。電極材料は、導電性を有する材料であり、かつ、溶液中での交流電圧の印加で溶解・剥離しない特性を有すれば任意であり、通常、金、銀、白金、銅、アルミ、クロム、ニッケル、タングステンやその合金から選ばれる。好適には、下基板８とスパッタ技術によって強固に成膜でき、交流電圧印加に対する膜の安定性から金である。なお、電極９ＡＢが形成される面は、下基板に限定されることはなく、上基板であっても良い。また、電極形状は、対向電極であればよく、粒子がパールチェーン状態に配置されるように電場を形成できるのであれば特に制限されることはない。

（工程３）次に、上基板７と下基板８を貼り合せる。工程３の上基板７と下基板８の貼り合わせは公知の技術を用いればよい。これらの工程を経て、測定チップ４は作製されて使用される。測定チップ４の反応部１０には担体粒子１４が提供される。担体粒子１４は、試料液が注入される前にあらかじめ反応部１０に配置されていてもよいが、試料液とともに反応部１０に供給されてもよい。本発明の担体粒子１４の例には、ラテックス粒子、ベントナイト、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、ゼラチン、リポソームなどが含まれるが、好ましくはラテックス粒子である。凝集反応において一般に用いられているラテックス粒子が使用でき、例えば、ポリスチレン系ラテックス、ポリビニルトルエン系ラテックス、ポリメタクリレート系ラテックスなどが使用できる。ラテックス粒子には、官能基モノマー（−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＯ３等）が共重合して導入されていてもよい。 担体粒子１４の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、０．５〜１００μｍが好ましい。担体粒子６の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、さらに好ましくは１〜１０μｍである。担体粒子濃度が高いほどパールチェーンが形成されやすいので凝集反応が促進される。しかし、担体粒子の濃度が高すぎると、反応部１０で粒子同士の重なりが起こり、正の誤差となる。この観点から担体粒子の濃度は、例えばラテックス粒子の場合、好ましくは０．０１〜１重量％、より好ましくは０．１〜０．５重量％、最も好適には、０．４重量％である。粒子の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、０．５〜１０μｍが好ましい。平均粒径がＯ．５μｍ以下では粒子に十分な誘電泳動力が働かず、パールチェーンが形成されにくく好ましくない。また、平均粒径が１０μｍ以上であると電圧印加を切った後の粒子の分散が起こりにくく、好ましくない。粒子の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、さらに好ましくは１〜５μｍ、最も好適には２〜３μｍである。本発明の好ましい態様としては、被検査物質が抗原及び／又は抗体である該方法が挙げられる。更なる本発明の好ましい態様として、担体粒子が抗体を感作させたラテックス粒子であり、被検査物質が抗原である該方法が挙げられる。ラテックス粒子への抗体の感作は、例えば、従来周知の方法でラテックス粒子に抗体を吸着又は結合させることにより実施することができる。

（測定方法）
本発明の検出または測定方法を以下に概説する。図４に実施の形態１に示す測定方法のフローチャートを示す。図５に点着口１１付近の反応部１０中（図２のＢ領域）の担体粒子の挙動様子を示した。免疫反応は、抗体を吸着させた粒子の凝集度で抗体に特異的に結合する抗原の量を検出する原理に基づく。

まず、測定対象物質を含む試料液と担体粒子１４を含む試薬液を混合する（工程１）。以下、この混合溶液を反応液と呼ぶ。次に、反応液が測定チップ４の点着口１１に投入される（工程２）。工程２により、反応部１０に反応液が充たされ、反応液は電極９Ａ、９Ｂと接する。また、反応部１０では担体粒子１４は溶液中で所定の濃度で分散された状態となる（図５（a））。さらに、反応部１０は微小な空間であるために、毛細管現象による流れが生じており、担体粒子１４もとどまることなく移動している。なお、この状態を作り出すために、担体粒子１４を予め分散した反応液を投入してもよいし、反応部１０に予め担体粒子１４を担持し、測定対象物質を含む試料液を添加してもよい。

次に、電圧印加部１によって、測定チップ４の電極９Ａ、９Ｂに交流電圧波形を印加する（工程３）。この工程３により、担体粒子１４は反応部１０内で、電界の方向に沿って、数珠つなぎ様（パールチェーンと呼ぶ）に並ぶ。このとき、点着口１１付近は図５（ｂ）のような状態となる。白丸粒子１４は工程２において反応部１０に導入された担体粒子であり、黒丸粒子１５は工程３中に反応部１０に入った担体粒子である。白丸粒子１４は電界の方向に沿ってパールチェーンが形成されている。一方で、図５(b)で示すとおり、点着口１１周辺かつ電極近傍にある領域Ｃは、担体粒子が入らず、疎な領域になる。これは、電極近傍特に点着口に近い電極エッジ部（２隅）の電界強度が高く、負の誘電泳動力が粒子に加わり、粒子が反応部１０内に進行できないためである。

工程３において、電圧印加部１によって印加される交流電圧波形は、方形波、矩形波、正弦波、三角波等を用いることができる。また、電界強度は、パールチェーン１９を形成するため、５〜５０Ｖ／ｍｍ程度を印加することが必要である。また、周波数は１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚであればよい。電圧印加部１によって印加する時間は、大多数の担体粒子１４がパールチェーン化状態になる時間でよいが、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１５〜９０秒、より好ましくは６０秒である。

次に、工程３で印加した電圧を停止する（工程４）。ここで、測定対象物質である抗原がない場合は、電圧印加前と同様に担体粒子は分散した状態となるが、抗原が存在した場合、パールチェーン状態の粒子同士が凝集した状態で維持される（図５（ｃ））。次に、電圧停止後、一定時間後反応部１０中の画像を取得する（工程５）。工程５において、画像の撮影場所は反応部１０内であれば特に制限されることはないが、空気孔１２に近い場所から撮影することが好ましい。図６に反応部１０の平面図とともに画像取得の順番の１例を示した。反応部１０は微小な空間であるため、毛細管現象により流れが生じており、点着口付近の粒子のＰＣ反応時間が、空気孔付近の粒子とは異なる可能性がある。空気孔側から観察することにより、上記の問題を防ぐことが可能となる。なお、担体粒子の画像情報とともに画像の位置情報を取得してもよい。これにより、ＰＣ反応時間が等しい粒子が存在する範囲が特定できる。また、撮影する１つの画像範囲は担体粒子が認識できれば特に問題はなく、反応部１０全体でもよいし、反応部１０の１部を拡大した画像を取得してもよい。反応部１０全体の画像を１度に取得できれば、測定時間が短くなるためより好ましい。一方で、拡大した画像を取得する場合、画像取得範囲として、０．１−１ｍｍ画の領域が好ましく、最適には０．５×０．５ｍｍの領域である。拡大した画像を取得する場合は図６のように複数枚取得することが好ましい。撮影する枚数は多ければ多いほどよいが、解析に時間を要することとなる。例えば２枚以上５０枚以下が望ましく、好適には５から１０枚である。

また、撮影する時間は工程４の後、例えば、１０秒以上１８０秒以下が望ましく、好適には６０秒である。次に、工程５で撮影された画像中の粒子密度を検出し、凝集度を算出する解析領域を決定する（工程６）。解析領域とは、工程７で凝集度を算出するときに使用する領域であり、すべての画像が解析領域となるわけではなく工程６により選別される。

工程６は、工程５で撮影した画像からパールチェーン化の作用を受ける時間（ＰＣ反応時間）が短い粒子を含んだ画像を除くことが目的である。図７に工程６の詳細方法のフローチャート図を示した。まず、工程５により撮影した各画像の１画像あたり粒子数をカウントする（工程６−１Ａ）。具体的には、取得した画像を２値化処理し、粒子群の抽出を行い、粒子群の面積を算出する。総粒子面積を予め規定した１個粒子の面積で割ることで１画像あたりの粒子数が算出できる。なお、一視野あたりの粒子数がわかればよく、上記方法に限定されるものではない。

次に、工程６−１Ａで算出された粒子数と設定値とを比べ、解析に利用するか否かを判断する（工程６−１Ｂ）。工程４で述べたように、電圧を印加したときに反応部１０の中央部の粒子はパールチェーン状態となる。一方で点着口１１付近では一部の粒子は反応部１０に進行できず、粒子密度は疎な状態となっている（図５（ｄ））。各画像あたりの粒子数を比較することで、工程２のときに反応部１０に導入されていた粒子か否かを検出することができ、ＰＣ反応時間の短い粒子を解析から除くことができる。設定値は、工程３以降に導入された粒子かどうかを判別できる値であればよく、例えば、電圧印加前の反応部１０の１画像あたりの粒子数を予め計測し用いてもよいし、予め測定条件にあわせて設定しておいてもよい。そして、工程６−１Ｂにより設定値より粒子数が多いと判断された画像は工程７へ移る（工程６−１D）。一方で、粒子数をカウントした結果、設定値より低い場合は工程２のときに反応部１０に導入されていない粒子とみなし、解析領域より除かれる（工程６−１C）。

最後に、工程６により判別された各画像での担体粒子１４の凝集度を算出する（工程７）。凝集度は総粒子数に対する２個以上に凝集した粒子の総数で求めればよく、計算式は下記のとおりである。
凝集度＝（２個以上に凝集した粒子数）／（総粒子数）×１００ （％）
具体的には、画像を２値化処理し、粒子群の抽出を行う。次に、抽出された個々の粒子群の輪郭近傍領域の面積を求めることで、２個以上に凝集した粒子群は、担体粒子１個分と区別することができる。以上の処理により、粒子の凝集度を算出する。処理される画像は工程６で除かれたもの以外であれば、特に制限されることはない。

以上説明したように、本実施形態のように、反応部１０を複数の領域１７に分割し、複数の領域１７のそれぞれの粒子密度がしきい値以上である領域のみを解析領域として決定し、解析領域における担体粒子の凝集度を検出するので、パールチェーン化の作用を受ける時間が短い粒子を解析することを抑制でき、従来よりも正確なアッセイが実現できる。

（実施の形態２）
実施の形態２の生物学的特異的反応物質の測定方法について以下に説明する。実施の形態１と測定システムは同じであるが、解析領域を決定する工程６の内容が異なる。
工程1から４は実施の形態１と同様であるため、省略するが、工程４以降について説明する。図８に実施の形態２の工程６のフローチャート図を示した。
まず、工程５で画像を取得し、同時に画像位置情報を取得する。画像位置情報とは、例えば、測定チップの出口側の端部に原点をとって、図６に示すようにＸ，Ｙ軸をとった場合の座標である。

工程５で撮影した各画像の１画像あたり粒子数をカウントする（工程６−２Ａ）。次に、工程６−２Ａで算出された粒子数と設定値を比べる（工程６−２Ｂ）。工程３で電圧を印加したときに点着口１１付近では一部の粒子は反応部１０に進行できなく、粒子数は疎な状態となっている。そのため、各反応部の粒子数を比較することで工程３以降に導入された粒子か否かを確認できる。設定値とは、工程３以降に導入された粒子かどうかを判別できる値であればよく、例えば、電圧印加前の反応部１０の１画像あたりの粒子数を予め計測し用いてもよいし、予め測定条件にあわせて設定しておいてもよい。

工程６−２Ｂで比較した結果、粒子数が設定値より少ない画像があった場合、その画像の位置情報を制御解析部２に記録する（工程６−２Ｃ）。この画像は粒子数が少ないために凝集度の解析には利用されない。工程６−２Ｃ画像位置情報より点着口側に存在する粒子はＰＣ反応化時間が短いことを意味する。そのため、ここで記録した位置情報は、工程３以前に導入された粒子か否かを判別する指標に利用することができる。すなわち、粒子数が設定値より少ない画像より点着口側で撮影された画像は電圧印加中またはそれ以後に導入された粒子といえる。

一方で、粒子数が設定値より多いと判断された場合、工程６−２Ｃで得られた画像位置情報をもとに凝集度の解析に利用する画像を選択する。具体的には、工程６−２Ｃで得られた画像のＹ座標より小さいか否かで選別する（工程６−２Ｄ）。なお、この工程では工程６−２Ｃで得られた画像位置情報より空気孔側に存在していることを確認する方法であれば特に限定されることはない。

例えば、図６で示すような順番で画像を取得した場合について説明する。ここで、７番画像で粒子数が設定値より少なかったとする。その場合、粒子数が設定値より多くとも、8番から１０番の画像の粒子は工程３の前に反応部１０に入っていなかったことになり、これらの画像にある粒子のＰＣ反応化時間は短く、解析より除外する必要がある。そこで、７番画像の位置情報が重要となる。例えば、図６に示した方向をＸ，Ｙ軸とし、1番画像の撮影位置を原点とすれば７番画像よりＹ軸方向に大きな値の画像は工程3の前に粒子が反応部１０に存在しなかったことになる。一方で、画像1〜６、11、１２番はＹ値が7番より小さいことから、解析に利用される画像であり、工程７へ移される。なお、位置情報がわかればよく、画像取得位置だけでなく画像取得時間の情報により判断してもよい。
このように粒子数と画像位置情報を用いることで、ＰＣ反応時間が短い、もしくはＰＣ化していない粒子を解析より除くことができる。特に電圧オフ時は粒子が一定の速度で反応部１０に入ってくるため、粒子数だけの判別では電圧印加前に存在している粒子と電圧オフ後に導入された粒子との区別がつかない可能性がある。しかし、位置情報を合わせることで電圧オフ後に反応部に導入された粒子を解析から除くことができる。

以上説明したように本実施形態によると、反応部１０を複数の領域１７に分割し、複数の領域のうち粒子密度がしきい値未満である少なくとも１つの領域（例えば図６の領域７）を検出し、少なくとも１つの領域よりも反応部の点着口に近い領域の全て（図６の領域７、８，９，１０）を除外して、解析領域を決定し、解析領域における担体粒子の凝集度を検出するので、パールチェーン化の作用を受ける時間が短い粒子を解析することを抑制でき、従来よりも正確なアッセイが実現できる。

（実施の形態３）
実施の形態３の生物学的特異的反応物質の測定方法について以下に説明する。実施の形態１と測定システムは同じだが、工程６の内容が異なる。電圧印加中は電極近傍、とくに電極エッジ部の電界強度が高く、負の誘電泳動力が粒子に加わり、点着口付近の粒子は反応部１０内に進行できない。つまり、電極近傍の粒子密度が疎になる。実施の形態３の工程６では、撮影画像中の規定領域を設けその規定領域中の粒子数を比較することで、ＰＣ反応時間の短い粒子を凝集度の解析から除いている。

図９に実施の形態３の工程６のフローチャート図を示した。なお、他の工程は実施の形態１と同様である。まず、工程５で取得された１画像の中の規定領域を抽出する（工程６−３Ａ）。規定領域の範囲は、粒子が疎か否かを判断できる範囲であればよいが、好ましくは１０−５００μｍ角である。好適には１００×５００μｍである。なお、規定領域の形は正方形や長方形、丸型など特に制限されることはない。さらに、１画像中の規定領域の位置は電極に近い部分がより疎になるため、電極近傍部になるように設定することが好ましい。次に、規定領域の粒子数をカウントする（工程６−３Ｂ）。その後、カウントした値と設定値を比較し（工程６−３Ｃ）、工程7に利用すべき画像を判別する（６−２D）。なお、上記の方法に実施の形態２のように位置情報を追加し、工程７へ移す画像を判別してもよい。

以上のように、1画像中の規定領域部分の粒子数をカウントすることにより、より正確に電圧印加後に反応部に入ってきた粒子か否かを判別できる。その結果、パールチェーン化の作用を受ける時間が短い粒子を解析することがなくなり、正確なアッセイが実現できる。

（実施の形態４）
実施の形態４の生物学的特異的反応物質の測定方法について以下に説明する。実施の形態１と測定システムは同じだが、測定チップ構造が異なる。図１０に測定チップの平面図、図１１に測定チップの斜視図を示した。実施の形態１とおおよそ似ているが、電極の構造が異なり、ガイド電極１８Ａ，Ｂを有している。測定チップは、上基板７と、下基板８と、スペーサー１９と、１対の対向電極９Ａ、Ｂを含む反応部１０と、試料を点着する点着口１１と、反応部１０の気体を前記試料の流入によって排出する空気孔１２を有している。さらに、上基板７、下基板８にガイド電極１８Ａ、Ｂを有している。ガイド電極１８Ａ，Ｂはスペーサー１９を介し、対向するように配置されている。

（測定チップの作製方法）
測定チップ４の作製方法は、（工程１）上基板の加工、（工程２）電極形成、（工程３）スペーサーの加工、（工程４）貼りあわせとなる。
（工程１）上基板７に、試料液を注入するための点着口１１および空気孔１２等を形成する。点着口１１、空気孔１２は当業者に公知の技術で形成される。
（工程２）電極形成方法は実施の形態１と同様の方法を用いて形成すればよい。下基板に対向電極９Ａ，Ｂ、ガイド電極１８Ａと、上基板にガイド電極１８Ｂを形成する。対向電極９Ａ，Ｂの形状は実施の形態１と同様であればよい。ガイド電極１８Ａ，Ｂは反応部１０内の点着口１１に近接する位置に配置されればよく、対向電極９Ａ，Ｂと接することなく配置されればよい。ガイド電極１８Ａ，Ｂの長さおよび幅は反応液と接する状態であれば任意であるが、例えば、長さは通常、０．０１〜１ｍｍ程度である。好適には、０．０５ｍｍである。幅は通常、反応部の幅以上あればよく、例えば、０．１〜１０ｍｍ以下である。好適には０．８ｍｍである。さらに、ガイド電極１８Ａ，Ｂは電圧印加部と連通するように配線や電気的接触を実現する端子を有する。ガイド電極１８Ａ，Ｂの間隔はスペーサー１９で規定されることなる。
（工程３）スペーサー１９加工
スペーサー１９は反応部１０の大きさを決めることなる。反応部１０の幅および長さは、電極９Ａ、Ｂおよびガイド電極１８Ａ，Ｂを内部に配置、すなわち、電極９Ａ、Ｂおよびガイド電極１８Ａ，Ｂと反応液が接触し、かつ、必要な量の反応液が注入できる溶液を持てば任意である。スペーサー１９の両面が接着性あるいは粘着性を有する構造を持っていることが望ましい。これにより、スペーサー１９と上基板７あるいは下基板８とを貼り合せる手間が少なくて済み、製造効率が良い。また、スペーサーの部材はガイド電極１８Ａ，Ｂが導通しないような絶縁体である必要がある。例えば、反応部１０の幅は０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であり、好適には０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下であり、代表的には０．７ｍｍである。反応部１０の長さは、約５ｍｍである。加工方法は、当業者に公知の技術で形成される。
（工程４）上記工程１から４で作製された上基板７、下基板８、スペーサー１９を貼り合わせれば、測定チップが作製されて使用される。貼りあわせは公知の技術を用いればよい。実施の形態４に使用する担体粒子１４は実施の形態１と同様である。

（測定方法）
測定方法は実施の形態１とほぼ同様であるが、工程３の電圧印加工程が異なる。工程３において、対向電極９Ａ，Ｂ、ガイド電極１８Ａ，Ｂに電圧を印加する。対向電極９Ａ，Ｂには５〜５０Ｖ／ｍｍ程度を印加することが必要である。また、周波数は１０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚであればよい。印加する時間は、大多数の担体粒子１４がパールチェーン化状態になる時間でよいが、例えば、１０〜１８０秒、好ましくは１５〜９０秒、より好ましくは６０秒である。ガイド電極１８Ａ，Ｂにも対向電極９Ａ，９Ｂと同様の電界強度となるように電圧を印加すればよく、周波数や印加時間も同じでよい。また、印加するタイミングも対向電極９Ａ，Ｂと同様にすればよい。ガイド電極１８Ａ，Ｂに電圧が印加されたとき、点着口１１から導入される担体粒子には負の誘電泳動力が働く。その結果、点着口１１より反応部１０へ担体粒子は入らなくなる。

図１２に担体粒子の挙動の様子を示した。図１２（a）は電圧印加前、(b)は電圧印加中、(c)は電圧オフ直後、(d)は電圧オフ後の粒子挙動の様子である。電圧印加したときは、反応部１０に導入されていた担体粒子はパールチェーン化する。一方で、ガイド電極１９Ａ，Ｂにも同時に電圧が印加され、点着口１１から導入される担体粒子には負の誘電泳動力が働き、粒子が導入されない、疎な領域Ｄができる。（図１２(b)）電圧オフ後、パールチェーン化された粒子が抗原濃度に依存して分散する。（図１２(c)）その後、点着口１１より担体粒子が導入され、ある程度時間がたつと図１２(d)のように点着口１１から新たな担体粒子１５が導入される。

その後の工程は、実施の形態１と同様である。ガイド電極１９Ａ，Ｂがあることにより、点着口付近の電界強度がより大きくなるので、粒子が導入されない領域が大きくなる。そのため、解析領域の規定が容易となる。上記のような方法により、パールチェーン化の作用を受ける時間が短い粒子を解析することがなくなり、その結果、正確なアッセイが実現できる。なお、ガイド電極間には平等電界が印加されているが、これが不平等電界であってもよい。

以下、本発明をより具体的に例示する。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。

（実施例１）
本実施例は、第１の実施形態にかかる実施例である。実施例１として、図２、３に示されるような凹部を設けた上基板７と、下基板８との２枚構造とした測定チップを用いた。測定は図４に示すフローチャート示す方法で行った。測定システムは図１３に示した。

（測定チップの作製）
第一に、下基板８を作製する。下基板８の材質として、清浄に処理されたほうけい酸ガラス（ＳＣＨＯＴＴ社製 Ｄ−２６３）板厚１．１ｍｍを用いた。電極９Ａ，Ｂのパターンに貫通させたステンシルマスク（ステンレス製）を通してスパッタすることで、ガラスと金の密着性を向上させる目的で、クロム５０Åを堆積し、続けて金９５０Åを堆積させた。そして、電極９Ａ、９Ｂと端子５を作製した。電極幅は１ｍｍ、対向電極の間隔は０．５ｍｍ、電極長さ５ｍｍの一対の矩形電極が作製できた。

次に、上基板７を作製する。上基板７は、ほう珪酸ガラス（ＳＣＨＯＴＴ社製 Ｄ−２６３）（板厚０．１ｍｍ）とした。フォトリソグラフィーとウェットエッチングにより凹部を作製した。反応部１０の流路幅は０．７５ｍｍ、長さは１０ｍｍとした。流路の深さは１０μｍとした。そして、上基板７と下基板８を、ＵＶ硬化性接着剤を用いて貼り合せて、測定チップを作製した。

（試薬調整）
本実施例では、抗原―抗体反応に代表される生物学的特異反応を検証した。被検査物質は各種炎症のマーカータンパクとされるＣ反応性タンパク（以下、ＣＲＰと記す。）を用いた。担体粒子は、平均直径２μｍのラテックスビーズ（バングス社）に、抗ＣＲＰモノクローナル抗体（以下、抗ＣＲＰ抗体と記す。）を感作させた。抗ＣＲＰ抗体溶液に２μｍのラテックスビーズを添加し、２時間攪拌後、感作したラテックスを遠心分離し、上清を除去した。その後、牛血清アルブミン溶液（ＢＳＡ）を添加し、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックスを作製した。溶媒の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２０ｍＭグリシン ｐＨ８．６、０．１％ ＢＳＡとした。ＣＲＰ溶液は、上述したバッファでそれぞれ１．５×１０^−９ （Ｍ）の濃度に調整した。

（計測方法）
担体粒子の挙動の観測は、オリンパス社製倒立顕微鏡を用いて、透過光観察した。この構成により、反応部の深さが１０μｍで規定されているので、担体粒子は２層に重なることなく、また、観測している顕微鏡の焦点から外れることもなく、担体粒子の輪郭がはっきりと観測される。担体粒子の凝集度は、以下の式により求めた。測定装置の撮像手段によって撮像された１０画面の平均をとった。
凝集度＝（２個以上に凝集した粒子総数の面積）／（総粒子数の面積）×１００ （％）
（実験：抗原―抗体反応）
まずＣＲＰを含む試料液と粒子を含む試薬液を９０秒間室温で混合し、反応させた。なお、このとき粒子は０．４重量％となるようにした（工程１）。反応後の粒子を含む反応液を点着口１１に１μＬ注入した（工程２）。次に、対向電極９Ａ，Ｂに各交流電圧波形を電圧印加部１（波形発生器：ＨＥＷＬＥＴＴ ＰＡＣＫＥＲＤ社 ３３１２０Ａ）を使って２０Ｖ，１００ｋＨｚを６０秒間印加した（工程３）。電圧は、必要に応じて、波形発生器の次段に電力増幅アンプ（ＮＦ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ社 ４０５５ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｐｏｗｅｒ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）などを接続して増幅する。この工程により、反応部１０内の担体粒子１４は電場の力を受け、パールチェーン化する。次に、電圧印加を停止し（工程４）、停止から６０秒経過した時の画像を１０枚取得した（工程５）。担体粒子の挙動の観測は、オリンパス社製倒立顕微鏡を用いて、透過光観察した。この構成により、反応部の深さが１０μｍで規定されているので、担体粒子は２層に重なることなく、また、観測している顕微鏡の焦点から外れることもなく、担体粒子の輪郭がはっきりと観測される。画像の撮影位置は図６のように空気孔１２側から点着口１１の方向へ反応部１０を撮影した。１画像の撮影範囲は、５００μｍ×５００μｍとした。

次に、工程５で取得した画像の左端から１００μｍの範囲を規定し、粒子をカウントした（工程６）。このカウント数が他画像と比較して少ない場合は工程３時に反応部１０へ粒子が導入されていないことがわかる。最後に、以下の式を用いて各画像の凝集度を求めた。
凝集度＝２個以上の粒子面積 ／総粒子面積 ×１００ （％）
その後、各画像の凝集度を平均し、１測定の凝集度とした。

（工程５の結果）
各画像の規定領域（１００μｍ×５００μｍ）の粒子個数を図１９の表に示した。
Ｎｏ８、９以外画像の粒子数はおおよそ９０個である。しかし、Ｎｏ．８は３０個と大きくことなることがわかる。これは、電圧を印加したときに粒子が反応部１０に進行できなかったためであり、その結果、電極近傍部は粒子密度が疎な状態となっている。また、Ｎｏ９、１０は９０個程度存在しているがこれはＮｏ６よりも点着口１１側の粒子である。すなわち、工程３で電圧を印加したときに、反応部１１に存在していなかったことがわかる。

以上より、Ｎｏ８、９、１０の画像は工程７の解析より除外することとした。Ｎｏ８、９、１０をのぞいた画像で平均凝集度を計算した結果を図２０の表に示す。比較として、全画像での凝集度を計算した結果を併せて示している。また、図２１の表に各画像の凝集度を示した。抗原であるＣＲＰが存在しない場合、実施例と比較例の結果は異ならないことがわかる。これは、抗原がないため、パールチェーン化を受ける時間が異なっても粒子の凝集または分散に影響を与えないためである。一方で、抗原存在下では、パールチェーン化された粒子は維持された状態となる。その結果、電圧を印加したときに粒子が反応部１０に存在していなかったＮｏ９の画像の凝集度は他と比べて大きく低下していることがわかる。その結果、比較例は実施例に比べて平均凝集度は４％も低下している。以上のことから、本発明により、パールチェーン化の作用を受ける時間が短い粒子を除くことができ、正確なバイオアッセイが提供できる。

以上のように本発明は、正確なバイオアッセイが提供できるので、臨床検査分野で有用である。

１ 電圧印加部
２ 検出部
３ 解析制御部
４ 測定チップ
５ 端子
６ コネクタ
７ 上基板
８ 下基板
９Ａ，Ｂ 電極
１０ 反応部
１１ 点着口
１２ 空気孔
１３ 担体粒子
１４ 担体粒子
１５ 担体粒子
１６ 液滴
１７ １枚の取得画像
１８Ａ ガイド電極
１８Ｂ ガイド電極
１９ スペーサー
２０ 撮影部
２１ 規定領域
２２ スライドガラス
２３ ラテックス粒子
２４ 流路
２５ パールチェーン
２６ 交流電源発生装置
２７ 顕微鏡
２８ ＣＣＤカメラ
２９ 画像処理ボード
３０ パーソナルコンピュータ
３１ オシロスコープ

Claims (4)

1. 試料液中に含まれる測定対象物を測定するバイオアッセイであって、
   前記試料液に、前記測定対象物と特異的に結合する生物学的特異的結合物質を担持している担体粒子含有試薬を混合して、試薬混合試料液を準備する第１工程と、
   一対の電極間領域の反応部に、前記試薬混合試料液を導入する第２工程と、
   前記一対の電極に交流電圧を印加し、前記試薬混合試料液中の前記担体粒子を集合させて生物学的特異結合反応を起こさせる第３工程と、
   前記交流電圧の印加を停止する第４工程と、
   前記反応部の画像情報から粒子密度を検出する第５工程と、
   前記反応部を複数の領域に分割し、前記複数の領域のそれぞれの前記粒子密度がしきい値以上である領域のみを解析領域として決定する第６工程と、
   前記解析領域における前記担体粒子の凝集度を検出する第７工程と、
   を含む、バイオアッセイ。
2. 試料液中に含まれる測定対象物を測定するバイオアッセイであって、
   前記試料液に、前記測定対象物と特異的に結合する生物学的特異的結合物質を担持している担体粒子含有試薬を混合して、試薬混合試料液を準備する第１工程と、
   一対の電極間領域の反応部に、前記試薬混合試料液を導入する第２工程と、
   前記一対の電極に交流電圧を印加し、前記試薬混合試料液中の前記担体粒子を集合させて生物学的特異結合反応を起こさせる第３工程と、
   前記交流電圧の印加を停止する第４工程と、
   前記反応部の画像情報から粒子密度を検出する第５工程と、
   前記反応部を複数の領域に分割し、前記複数の領域のうち前記粒子密度がしきい値未満である少なくとも１つの領域を検出し、前記少なくとも１つの領域よりも前記反応部の点着口に近い領域の全てを除外して、解析領域として決定する第６工程と、
   前記解析領域における前記担体粒子の凝集度を検出する第７工程と、
   を含む、バイオアッセイ。
3. 前記反応部の点着口付近に、不均一電場が生じるような電極が配置される、請求項１または２に記載のバイオアッセイ。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のバイオアッセイに用いる測定装置。