WO2021220692A1 - 計数方法及び計数装置 - Google Patents

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WO2021220692A1
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dielectrophoretic force
counting
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類 平岡
聡 有本
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パナソニックＩｐマネジメント株式会社
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    • G01N2015/1486—Counting the particles

Definitions

  • the present disclosure relates to a counting method and a counting device for counting particles contained in a sample.
  • dielectric particles in a sample solution are collected by dielectrophoresis, and the dielectric particles contained in the sample solution are counted by analyzing an image obtained by capturing an image of the area where the dielectric particles are collected.
  • a counting method is known (see Patent Document 1).
  • the present disclosure provides a counting method and the like that can reduce the occurrence of false negatives and count particles more accurately.
  • the counting method includes a coagulation step in which particles in a sample are aggregated by applying a dielectrophoretic force in the first direction, and a dielectrophoretic force in a second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
  • a diffusion step in which a dielectrophoretic force is applied to diffuse the aggregated particles, an imaging step in which a diffusion image containing the diffused particles is imaged, and a counting step in which the number of the particles is determined based on the diffusion image. And, including.
  • the counting device includes an accommodating portion for accommodating a sample containing particles, an electric field gradient generating portion for generating an electric field gradient with respect to the sample accommodated in the accommodating portion, and the electric field gradient generating unit.
  • the generated electric field gradient causes the particles to act on the dielectrophoretic force in the first direction to aggregate the particles, which is different from the dielectrophoretic force in the first direction on the aggregated particles.
  • a control unit that diffuses the aggregated particles by applying a dielectrophoretic force in the second direction, an imaging unit that captures a diffused image containing the diffused particles, and the image based on the captured diffused image.
  • a counting unit for determining the number of particles is provided.
  • a recording medium such as a system, an apparatus, an integrated circuit, a computer program or a computer-readable CD-ROM, and the method, the apparatus, the system, the method, the integration. It may be realized by any combination of a circuit, a computer program and a recording medium.
  • Computer-readable recording media include non-volatile recording media such as CD-ROMs (Compact Disc-Read Only Memory).
  • FIG. 1 is a perspective view showing a schematic configuration of a counting device according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing a schematic configuration of the counting device according to the embodiment.
  • FIG. 3 is a plan view showing the configuration of the electrode set according to the embodiment.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating aggregation and diffusion of particles according to the embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to an embodiment.
  • FIG. 6 is a second diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to the embodiment.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a counting method according to the embodiment.
  • FIG. 8 is a flowchart showing a counting method according to a modified example of the embodiment.
  • FIG. 9 is a diagram showing an aggregated image and a diffused image according to a modified example of the embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram showing tracking steps according to a modified example of the embodiment.
  • FIG. 11 is a diagram showing a complex formation process according to a modified example of the embodiment.
  • FIG. 12 is a circuit diagram including a first electrode set and a second electrode set according to a modified example of the embodiment.
  • Patent Document 1 discloses a counting method for counting dielectric particles, which are particles to be counted, by dielectrophoresis. Specifically, in Patent Document 1, dielectric particles are collected in each of a plurality of slit regions by dielectrophoresis, and the number of slit regions saturated with the dielectric particles among the plurality of slit regions is counted. , The dielectric particles contained in the sample liquid are counted.
  • dielectrophoresis is a technique for collecting (in other words, agglutinating) dielectric particles at a predetermined location as described above, and the dielectric particles can be moved toward the predetermined location. Therefore, when a large number of dielectric particles are present in the sample, the large number of dielectric particles are aggregated at a predetermined location and accumulated three-dimensionally. That is, in an image captured by an imaging device or the like from one direction, it is difficult to identify the overlap of dielectric particles due to accumulation, and only a smaller number than the actual number can be counted, so-called false negatives. It will occur.
  • the particles aggregated by the action of the first dielectrophoresis that is, the dielectrophoresis force in the first direction
  • the second dielectrophoresis that is, the dielectrophoresis force in the second direction
  • the aggregation by dielectrophoresis in the first direction is diffused.
  • the particles can be counted in a state where the influence of the overlapping of the particles is reduced, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and the particles are more accurately counted. Can be counted.
  • the counting method includes a coagulation step in which particles in a sample are aggregated by applying a dielectrophoretic force in the first direction, and a dielectrophoretic force in a second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
  • a diffusion step in which a force is applied to diffuse the agglomerated particles
  • an imaging step in which a diffused image containing the diffused particles is imaged
  • a counting step in which the number of particles is determined based on the captured diffused image, and a counting step. including.
  • the particles aggregated by the dielectrophoretic force in the first direction are diffused by the different dielectrophoretic forces in the second direction. That is, by overlapping the particles due to agglutination, it is possible to suppress the occurrence of false negatives such as two particles appearing to be one. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
  • an AC voltage of the first frequency is applied between the electrode sets that generate an electric field gradient for applying a dielectrophoretic force
  • a third frequency different from the first frequency is applied between the electrode sets.
  • a two-frequency AC voltage may be applied.
  • the direction of the dielectrophoretic force can be adjusted by the frequency of the AC voltage applied between the electrode sets. In this way, the direction of the dielectrophoretic force can be changed by adjusting the frequency, and the agglomerated particles can be diffused. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
  • an AC voltage of the first frequency is applied between the first electrode sets that generate an electric field gradient for applying a dielectrophoretic force
  • a first electrode set different from the first electrode set is applied.
  • An AC voltage having a second frequency different from the first frequency may be applied between the two electrode sets.
  • the direction of the dielectrophoretic force can be adjusted by the frequency of the AC voltage applied to each of the first electrode set and the second electrode set. In this way, the direction of the dielectrophoretic force can be changed by adjusting the frequency applied to the two electrode sets, and the particles can be aggregated and diffused. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
  • a dielectrophoretic force in the second direction which is larger than the dielectrophoretic force in the first direction in the agglutination step, may be applied.
  • a larger dielectrophoretic force can be applied in the diffusion step than in the aggregation step, and the aggregated particles can be diffused more reliably. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
  • a positive dielectrophoretic force or a negative dielectrophoretic force acts on the particles
  • the particles have a positive dielectrophoretic force and a negative dielectrophoretic force.
  • the other of the dielectrophoretic forces of may be acted upon.
  • an AC voltage is applied in the environment of the first conductivity between the electrode sets that generate the electric field gradient for applying the dielectricing force, and in the diffusion step, what is the first conductivity? AC voltage may be applied in environments with different second conductivity.
  • the direction of the dielectrophoretic force can be adjusted by the conductivity in the environment around the particles. In this way, the direction of the dielectrophoretic force can be changed by adjusting the conductivity, and the agglomerated particles can be diffused. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
  • the particles when an AC voltage is applied in an environment of first conductivity, either a positive dielectrophoretic force or a negative dielectrophoretic force acts on the particles, and when an AC voltage is applied in an environment of second conductivity.
  • the particle may be subjected to either a positive dielectrophoretic force or a negative dielectrophoretic force.
  • the pre-imaging step of capturing the aggregated image containing the aggregated particles, and the particles included in the aggregated image based on the captured aggregated image and the diffused image may include a tracking step to track the image.
  • particles can be counted based on the aggregated image and the diffused image before and after the particles are diffused. For example, when particles that follow different orbits accidentally overlap each other in the process of diffusion, the particles can be individually counted based on the different orbits. Therefore, in the counting method of the present disclosure, the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced, and particles can be counted more accurately.
  • the particles diffused in the diffusion step are aggregated in the first position in the aggregation step or the particles aggregated in the second position different from the first position. May be good.
  • particles aggregated at each of the first position and the second position can be individually counted for each position.
  • the first position and the second position are the positions where the particles are aggregated by the positive dielectrophoresis and the negative dielectrophoresis
  • the particles aggregated by the action of these different dielectrophoresis are simultaneously and accurately.
  • the counting method of the present disclosure the occurrence of false negatives due to agglutination is reduced at each of the plurality of positions, and particles can be counted more accurately at the same time.
  • the particles containing the substance to be detected may be selectively counted from the particles based on the aggregated image and the diffused image.
  • specific particles can be selectively counted from a sample containing a plurality of types of particles.
  • the counting device controls an accommodating portion for accommodating a sample containing particles, an electric field gradient generating portion for generating an electric field gradient with respect to the sample accommodated in the accommodating portion, and an electric field gradient generating unit.
  • the generated electric field gradient causes the particles to be subjected to the dielectrophoretic force in the first direction to aggregate the particles, and the aggregated particles are subjected to the dielectrophoretic force in the second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
  • It includes a control unit that acts to diffuse the agglomerated particles, an imaging unit that captures a diffused image containing the diffused particles, and a counting unit that determines the number of particles based on the captured diffused image. ..
  • a recording medium such as a system, an apparatus, an integrated circuit, a computer program, or a computer-readable CD-ROM, and the system, a method, an integrated circuit, or a computer. It may be realized by any combination of a program and a recording medium.
  • counting particles means finding particles in a sample based on the determination of one or more particles or zero particles and confirming the existence of the particles, as well as the amount of particles (for example, number or number). Concentration, etc.) or its range is included.
  • counting the substances to be detected means finding the substances to be detected in the sample based on the determination of whether the number of substances to be detected is 1 or more or 0, and confirming the presence of the substances to be detected. Includes measuring the amount of substance (eg, number or concentration, etc.) or its range.
  • the particles to be counted may be all the particles contained in the sample, or may be a part of a plurality of particles contained in the sample.
  • Diffusing particles by the dielectricing force in the second direction simply means that the particles are diffused in the radial second direction from the position where the particles are aggregated by the dielectricing force in the first direction, and the dielectricing force in the first direction. It is a concept that includes aggregating particles at a position different from the position where the particles are aggregated by force and diffusing them from the original position.
  • the particles are aggregated by dielectrophoresis (DEP) in the liquid, and the aggregated particles are further diffused to suppress the overlap of the particles due to the aggregation and count the particles. ..
  • DEP dielectrophoresis
  • Dielectrophoresis is a phenomenon in which a force acts on dielectric particles exposed to a non-uniform electric field (hereinafter, also referred to as an electric field gradient). This force does not require the particles to be charged.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a schematic configuration of a counting device according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing a schematic configuration of the counting device according to the embodiment.
  • the housing unit 110 is shown in an approximate shape so that the inside of the housing unit 110 can be seen by passing through a portion other than the first substrate 111.
  • FIG. 1 is used to explain the relationship with other components centering on the accommodating portion 110, and limits the arrangement position, arrangement direction, posture, etc. of each component when the counting device 100 is used. It's not something to do.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the accommodating portion 110 shown in FIG. 1 cut along a direction parallel to the paper surface. The thickness of a part of the accommodating portion 110 shown in FIG. 2 is shown in FIG. It has been omitted.
  • the counting device 100 includes an accommodating unit 110, a power supply 120, a light source 130, an image sensor 140, and a counting unit 150.
  • the accommodating portion 110 is a container for accommodating the sample 10 containing the particles 15, and has a space 1121 inside.
  • Sample 10 is housed in the space 1121.
  • the sample 10 housed in the space 1121 is subjected to dielectrophoresis in the space 1121, and when the sample 10 contains the particles 15, the particles 15 are moved by the action of the dielectrophoresis.
  • the space 1121 provided in the accommodating portion 110 forms a field for dielectrophoresis in the counting device 100.
  • the particle 15 is a grain-shaped substance exhibiting dielectric property as described above, and is a single material substance such as polystyrene beads and glass beads, as well as a composite substance in which a functional substance is added to these beads.
  • living cells and the like that can be macroscopically regarded as dielectric particles.
  • the particles 15 are appropriately determined according to the use of the counting device 100, and various conditions for dielectrophoresis are set according to the physical properties of the particles 15. In the following description, it is assumed that the particles 15 are polystyrene beads, but as described above, the composition and size of the particles 15 are not particularly limited.
  • the counting device 100 can be applied to various particles 15 as counting targets.
  • the accommodating portion 110 includes a first substrate 111, a spacer 112, and a second substrate 113.
  • the first substrate 111 is, for example, a sheet made of glass or resin.
  • the first substrate 111 has an upper surface that defines the bottom of the space 1121, and an electrode set 1111 to which an AC voltage is applied from the power supply 120 is formed on the upper surface.
  • the electrode set 1111 is formed in contact with the space 1121 so that the sample 10 and the electrode set 1111 are in electrical contact when the sample 10 is housed in the space 1121.
  • the electrode set 1111 includes a first electrode 1112 and a second electrode 1113.
  • the AC voltage applied from the power source to the electrode set 1111 allows the electrode set 1111 to generate (generate or form) a non-uniform electric field (electric field gradient) on the first substrate 111.
  • the electrode set 1111 is an example of the electric field gradient generating portion. The details of the electrode set 1111 will be described later with reference to FIG.
  • the spacer 112 is arranged on the first substrate 111.
  • the spacer 112 is formed with a through hole corresponding to the shape of the space 1121.
  • the space 1121 is formed by through holes sandwiched between the first substrate 111 and the second substrate 113. That is, the spacer 112 is an outer wall that surrounds the through hole and has an inner surface that defines the space 1121.
  • the spacer 112 is made of, for example, a material such as a resin having high adhesion to the first substrate 111 and the second substrate 113.
  • the second substrate 113 is, for example, a transparent sheet made of glass or resin, and is arranged on the spacer 112.
  • a polycarbonate substrate can be used as the second substrate 113.
  • the second substrate 113 is formed with a supply hole 1131 and a discharge hole 1132 connected to the space 1121.
  • the sample 10 is supplied to the space 1121 through the supply hole 1131 and discharged from the space 1121 through the discharge hole 1132.
  • the accommodating portion 110 may be configured without the second substrate 113. That is, the second substrate 113 is not an essential component.
  • the space 1121 for forming the accommodating portion 110 as a container is formed by the first substrate 111 and the spacer 112 that define the bottom and the inner side surface, respectively.
  • the power supply 120 is an AC power supply, and an AC voltage is applied to the electrode set 1111 of the first substrate 111.
  • the power supply 120 may be any power supply as long as it can supply an AC voltage, and is not limited to the specific power supply as described above.
  • the AC voltage may be supplied from an external power source, in which case the power source 120 may not be included in the counting device 100.
  • the internal configuration of the power supply 120 will be omitted and shown in a simplified manner.
  • the light source 130 irradiates the sample 10 in the space 1121 with the irradiation light 131.
  • the irradiation light 131 irradiates the particles 15 in the sample 10 via the second substrate 113.
  • Detection light 132 corresponding to the irradiation light 131 is generated from the particles 15, and the particles 15 are detected by detecting the detection light 132.
  • the irradiation light 131 may be irradiated with excitation light that excites a specific fluorescent substance.
  • the fluorescent substance is dispersed in the polystyrene forming the particles 15, fluorescence is generated according to the irradiated excitation light, and the presence of the fluorescent substance, that is, the presence of the particles 15 is detected by detecting the fluorescence. Can be done.
  • the light source 130 a known technique can be used without particular limitation.
  • a laser such as a semiconductor laser or a gas laser can be used as the light source 130.
  • a wavelength having a small interaction with the substance constituting the particles 15 for example, 400 nm to 2000 nm
  • a wavelength that can be used by a semiconductor laser for example, 600 nm to 850 nm
  • a semiconductor laser for example, 600 nm to 850 nm
  • the light source 130 does not have to be included in the counting device 100.
  • the particles 15 when the particles 15 are large, the particles 15 do not have to contain a fluorescent substance.
  • the particles 15 since the particles 15 do not have to be irradiated with the excitation light, the external light emitted from the sun, a fluorescent lamp, or the like can be used as the irradiation light 131, and the counting device 100 can be realized without providing the light source 130.
  • the image sensor 140 is a CMOS image sensor, a CCD image sensor, or the like built in the camera 141, and generates an image including the particles 15 by detecting the detection light 132 generated from the particles 15.
  • the image pickup element 140 is arranged horizontally on the plate surface of the first substrate 111, and images a portion corresponding to the electrode set 1111 via an optical element (not shown) such as a lens included in the camera 141. If the particles 15 are present at the location, the detection light 132 generated by the irradiation light 131 is incident on the image sensor 140, and the particles 15 are detected.
  • the counting unit 150 acquires an image output by the image pickup device 140, and determines the number of particles 15 contained in the sample 10 based on the image. For example, the counting unit 150 detects bright spots having different brightness values by comparing the acquired image with the control image using a control image that does not include the particles 15 captured in advance. Specifically, when light emission is detected as the detection light 132, a point having a high luminance value in the acquired image is set as a bright point, and when transmitted light and scattered light are detected as the detection light 132, the control is used. A point having a low brightness value in the acquired image with respect to the image may be detected as a bright point. In this way, the counting result of the particles 15 in the sample 10 can be obtained.
  • the counting unit 150 is realized by executing the program for image analysis by using, for example, a circuit such as a processor and a storage device such as a memory, but it may be realized by a dedicated circuit.
  • FIG. 3 is a plan view showing the configuration of the electrode set according to the embodiment.
  • FIG. 3 shows the configuration of the electrode set 1111 when viewed in a plan view from the image sensor 140 side. Note that FIG. 3 shows a schematic configuration diagram showing a part of the electrode set 1111 for simplification.
  • the electrode set 1111 has a first electrode 1112 and a second electrode 1113. Each of the first electrode 1112 and the second electrode 1113 is electrically connected to the power supply 120.
  • the first electrode 1112 projects from the first base portion 1112a extending in the first direction (left-right direction on the paper surface in FIG. 3) and in the second direction (vertical direction on the paper surface in FIG. 3) intersecting the first direction. It has two first convex portions 1112b and. A first concave portion 1112c is formed between the two first convex portions 1112b.
  • the length of each of the two first convex portions 1112b and the first concave portion 1112c in the first direction and the length in the second direction are, for example, about 5 micrometers.
  • the sizes of the two first convex portions 1112b and the first concave portion 1112c are not limited to this.
  • the shape and size of the second electrode 1113 are substantially the same as the shape and size of the first electrode 1112. That is, the second electrode 1113 also extends from the second base portion 1113a extending in the first direction (left-right direction on the paper surface in FIG. 3) and from the second base portion 1113a in the second direction (vertical direction on the paper surface in FIG. 3) intersecting the first direction. It includes two protruding second convex portions 1113b. A second concave portion 1113c is formed between the two second convex portions 1113b. The two second convex portions 1113b are arranged so as to face the two first convex portions 1112b of the first electrode 1112.
  • the first electrode 1112 has a first convex portion 1112b that intersects in the first direction and projects from the first base portion 1112a in a direction that is convex toward the second electrode 1113.
  • the second electrode 1113 has a second convex portion 1113b that intersects in the first direction and projects from the second base portion 1113a in a direction that is convex toward the first electrode 1112.
  • the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b are formed so that the distance between the first electrode 1112 and the second electrode 1113 differs depending on the position in the first direction. Due to the different distances between the first electrode 1112 and the second electrode 1113, when an AC voltage is applied to the electrode set 1111, an electric field gradient having different electric field strengths depending on the position, that is, a non-uniform electric field is formed. NS. That is, the electrode set 1111 may be formed with at least one portion having a different distance between the electrodes.
  • the electrode set 1111 may have a configuration in which a convex portion is formed on one of the first electrode 1112 and the second electrode 1113, and the convex portion is not formed on the other of the first electrode 1112 and the second electrode 1113. Since the above can be achieved if there is at least one convex portion, the electrode set 1111 can be realized by the first electrode 1112 or the second electrode 1113 having at least one convex portion.
  • the position of the electrode set 1111 is not limited to the first substrate 111.
  • the electrode set 1111 may be arranged in the vicinity of the space 1121 without contacting the sample 10.
  • the vicinity of the space 1121 means a range in which an electric field gradient can be formed in the sample 10 by the AC voltage applied to the electrode set 1111.
  • an electric field gradient is formed, and when the particles 15 in the sample 10 are exposed to the electric field, the particles 15 are aggregated at a predetermined location by dielectrophoresis.
  • dielectrophoresis when an electric field gradient is formed, the predetermined location where the particles 15 are aggregated differs depending on whether the particles 15 are subjected to positive dielectrophoresis or negative dielectrophoresis.
  • the particles 15 move to a region where the electric field strength is high and are aggregated.
  • the region where the electric field strength is high is a region including the position where the distance between the first electrode 1112 and the second electrode 1113 is the shortest by the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b. It is the first electric field region A shown.
  • negative dielectrophoresis is applied to the particles 15, the particles 15 move to a region where the electric field strength is low and are aggregated.
  • the region where the electric field strength is low is a region including a position where the distance between the first electrode 1112 and the second electrode 1113 by the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b is the longest. More specifically, the region where the electric field strength is low is the region between the first recess 1112c and the second recess 1113c, and in particular, the electric field strength becomes lower as the distance from the first electric field region A increases. That is, in the figure, for example, the particles 15 subjected to negative dielectrophoresis are aggregated in the second electric field region B shown by the broken line circle.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating aggregation and diffusion of particles according to the embodiment.
  • FIG. 4A is a diagram showing particles 15 aggregated by the first dielectrophoresis.
  • FIG. 4B is a diagram showing particles 15 diffused by the second dielectrophoresis (in other words, aggregated by the dielectrophoretic force in the second direction).
  • images of the first electrode 1112 and the second electrode 1113 viewed from the same direction as in FIG. 3 are shown, and particles 15 are shown as black dots in the figure.
  • the first electrode 1112 in the drawing has a first convex portion 1112b protruding in both the upper and lower directions. In the second electrode 1113 in the figure, the first convex portion 1112b protrudes in both the upper and lower directions.
  • the particles 15 are aggregated between the first convex portion 1112b and the second convex portion 1113b by dielectrophoresis. This is because the positive dielectrophoresis acted on the particles 15 and the particles 15 moved to the region where the electric field strength was high and aggregated.
  • the particles 15 may overlap each other and may not be counted accurately.
  • the particles 15 aggregated by the dielectrophoretic force in the first direction are aggregated by applying a dielectrophoretic force in the second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction.
  • the resulting particles 15 are diffused.
  • the particles 15 are diffused from the initial agglutination position by the dielectrophoretic force in the second direction, so that the overlap at the initial agglutination position is suppressed, and more accurate counting can be performed. It can be carried out.
  • the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction have different directions of the dielectrophoretic force.
  • the overlap of the particles 15 is suppressed by changing from the positive dielectrophoretic force to the negative dielectrophoretic force.
  • changing to a dielectrophoretic force with a different direction means that when the dielectrophoretic force changes from a positive dielectrophoretic force to another positive dielectrophoretic force with a different direction, the negative dielectrophoretic force changes to another negative dielectrophoretic force with a different direction.
  • the particles 15 are agglomerated in a predetermined electric field region having a high or low electric field strength by the dielectrophoretic force in the first direction, and different aggregating forces are applied by the dielectrophoretic force in the second direction having different aggregation positions, and the predetermined electric field is applied. Diffuse the particles 15 from the region.
  • the counting device 100 of the present embodiment can accurately count the particles 15 by such a method.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to the embodiment.
  • FIG. 6 is a second diagram illustrating a change in dielectrophoretic force according to the embodiment.
  • a method of switching the direction of the dielectrophoretic force a method of reversing the positive and negative of the dielectrophoretic force will be described.
  • Whether the positive or negative dielectrophoretic force acts has a correlation between the particles 15 and the properties of the liquid in which the electric field is formed, and in particular, the real-part of the Clausius-Mossotti coefficient. Evaluated by Clausius-Mossotti factor). If the real part of the Clausius-Mossotti coefficient is positive, a positive dielectrophoretic force acts on the particle 15 and the particle 15 moves to a region where the electric field strength is higher. On the contrary, if the real part of the Clausius-Mossotti coefficient is negative, a negative dielectrophoretic force acts on the particles 15 and the particles 15 move to a region where the electric field strength is lower.
  • 5 and 6 show graphs showing the relationship between the real part of the Clausius-Mossotti coefficient on the vertical axis and the frequency of the AC voltage applied between the electrode sets 1111 on the horizontal axis. There is.
  • the real part of the Claudius mossotti coefficient becomes a positive value at the AC voltage in the low frequency region
  • the real part of the Claudius mossotti coefficient becomes a positive value at the AC voltage in the high frequency region. It can be seen that the value is negative. Therefore, in order to reverse the positive and negative of the dielectrophoretic force, for example, there is a method of changing the frequency of the AC voltage applied during the electrode set 1111.
  • an AC voltage in a low frequency region where the real part of the Clausius-Mossotti coefficient becomes a positive value is applied between the electrode sets 1111.
  • the particles 15 are aggregated in a region having a high electric field strength by a positive dielectrophoretic force.
  • an AC voltage in a high frequency region in which the real part of the Clausius-Mossotti coefficient becomes a negative value is applied between the electrode sets 1111.
  • the particles 15 are diffused toward a region where the electric field strength is low by a negative dielectrophoretic force.
  • an AC voltage of the first frequency F1 is applied between the electrode sets 1111 to agglomerate the particles 15.
  • the particles 15 are diffused by applying an AC voltage of the second frequency F2 having a frequency higher than that of the first frequency F1 between the electrode sets 1111.
  • the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may be interchanged between positive and negative.
  • the power supply 120 changes the applied AC voltage. That is, the power supply 120 is an example of the control unit.
  • the control unit may be a device provided separately from the power supply, and may change the frequency of the AC voltage applied from the power supply 120 by transmitting a control signal to the power supply 120.
  • An AC voltage of frequency F is applied.
  • the particles 15 are aggregated in a region having a high electric field strength by a positive dielectrophoretic force.
  • an AC voltage having a predetermined frequency F is applied between the electrode sets 1111 in the environment of the second conductivity S2.
  • the particles 15 are diffused toward a region where the electric field strength is low by a negative dielectrophoretic force.
  • an AC voltage of a predetermined frequency F is applied in the environment of the first conductivity S1
  • the dielectrophoretic force in the second direction is applied.
  • An AC voltage of a predetermined frequency F is applied in an environment of a second conductivity S2 smaller than the first conductivity S1.
  • a chelating agent that forms a chelate precipitate is added to the ionic components constituting the solvent of the sample 10.
  • the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may be interchanged between positive and negative.
  • a solution or salt containing ions may be added to the sample 10.
  • the adding device (not shown) for adding the killing agent or the solution or salt containing ions changes the conductivity in the environment around the particles 15. That is, the addition device is an example of the control unit.
  • the control unit may be a device provided separately from the addition device, and by transmitting a control signal to the addition device, a killing agent or a solution or salt containing ions is added from the addition device. You may.
  • the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may include a case where the directions are the same and the positions where the particles 15 are aggregated are different.
  • the agglomerated particles 15 are diffused by changing the dielectrophoretic force in the first direction to the dielectrophoretic force in the second direction in which the direction of the dielectrophoretic force is different.
  • the dielectrophoretic force in the first direction and the dielectrophoretic force in the second direction may have different magnitudes and directions of the dielectrophoretic force.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a counting method according to the embodiment.
  • the particles 15 are aggregated at a predetermined position by applying a positive or negative dielectrophoretic force in the first direction to the sample 10 containing the particles 15 (aggregation step S110). Then, the aggregated particles 15 are diffused by applying a dielectrophoretic force in the second direction different from the dielectrophoretic force in the first direction (diffusion step S120). Specifically, as described above, the dielectrophoretic force in the second direction, which is different in the direction, is applied to the dielectrophoretic force in the first direction applied in the agglutination step S110. By changing the force acting for the aggregation of the particles 15, the aggregation due to the dielectrophoretic force in the first direction changes, and the overlapping of the particles 15 is suppressed.
  • the image sensor 140 receives the detection light 132 and images an image (imaging step S130).
  • the image captured in the imaging step S130 is a diffused image including the diffused particles 15.
  • the counting unit 150 determines the number of particles 15 in the sample 10 by performing image analysis using the diffused image (counting step S140). As described above, it is possible to suppress the occurrence of false negatives due to the overlapping of the particles 15 in the sample 10 and to count the particles 15 more accurately.
  • FIG. 8 is a flowchart showing a counting method according to a modified example of the embodiment.
  • the counting method according to the modified example shown in FIG. 8 is different from the counting method of the above-described embodiment in that the pre-imaging step S115 and the tracking step S135 are performed.
  • the image sensor 140 receives the detection light 132 and receives an image.
  • the image captured in the pre-imaging step S115 is an aggregated image including the aggregated particles 15.
  • FIG. 9 is a diagram showing an aggregated image and a diffused image according to a modified example of the embodiment. As shown in FIG. 9A, in the aggregated image in this modified example, the particles 15 are formed by the first convex portion 1112b of the first electrode 1112 by the action of positive dielectrophoresis as the dielectrophoretic force in the first direction.
  • the particles 15 include the plurality of first convex portions 1112b and the plurality of first convex portions 1113b. It aggregates between the second convex portions 1113b to form a cluster.
  • a first cluster CLa, a second cluster CLb, and a third cluster CLc are formed between the three first convex portions 1112b and the three second convex portions 1113b, respectively.
  • the particles 15 are diffused by the dielectrophoretic force in the second direction, and the diffused image shown in FIG. 9B is imaged (diffusion step S120 and imaging step S130). Further, the counting unit 150 acquires the aggregated image and the diffused image output as described above, and tracks the particles 15 included in the aggregated image based on these (tracking step S135). In the tracking step S135, the particles 15 diffused in the diffusion step S120 are included in the particles 15 contained in the first cluster CLa aggregated in the first position and the particles contained in the second cluster CLb aggregated in the second position in the aggregation step S110. It is possible to specify whether the particles are 15 or the particles 15 contained in the third cluster CLc aggregated at the third position.
  • FIG. 10 is a diagram showing a tracking step according to a modified example of the embodiment.
  • a plan view of the electrode set 1111 viewed from the same viewpoint as in FIG. 3 and an enlarged view of the first cluster CLa on the plan view are shown.
  • images acquired in chronological order from the left to the right of the paper are shown, the left image is an aggregated image, and the center and right images are diffuse images.
  • the first cluster CLa will be described as an example, but the same applies to the second cluster CLb, the third cluster CLc, and other clusters.
  • the counting unit 150 operates as follows in the tracking step S135.
  • the bright spot of the particle 15 or the bright spot of the cluster containing the particle 15 is detected. These bright spots are detected by identifying pixels in which the difference in luminance value with respect to the control image is equal to or greater than the threshold value as described above.
  • the particles 15 may overlap each other, it is not necessary to detect each particle 15 individually.
  • the bright spot of the particle 15 is detected in the diffused image.
  • Particles 15 can be detected substantially individually in the diffused image after diffusion with respect to the aggregated image.
  • the detectability of the particles 15 is improved.
  • the time from the start of diffusion to the acquisition of the diffusion image is set to be excessively long, the particles 15 from different clusters cannot be distinguished from each other, and the particles 15 may not be tracked.
  • the diffusion rate of the particles 15 depends on the properties of the particles 15, an appropriate time from the start of diffusion to the acquisition of a diffused image may be set in advance by a preliminary experiment or the like.
  • the image sensor 140 outputs a moving image in which the image is continuously acquired, and the counting unit 150 extracts a diffused image at the timing when the particles 15 are appropriately diffused, and tracks and counts the particles 15. You may.
  • the counting unit 150 estimates the movement vector of the bright spots of the particles 15 detected in the diffused image by using an algorithm such as pattern matching, and identifies from which cluster each particle 15 is diffused. As a result, the number of particles 15 contained in each cluster can be counted for each cluster. In particular, as shown in the figure, in a situation where a cluster of particles 15a aggregated by negative dielectrophoresis and a cluster of particles 15a aggregated by positive dielectrophoresis coexist in a plurality of clusters, at the same time and respectively. Accurate counting can be performed individually.
  • FIG. 11 is a diagram showing a complex formation process according to a modified example of the embodiment.
  • each of the above particles 15 is a complex particle 13
  • each of the above particles 15a is described as an unbound particle 12 or a contaminant 14.
  • Each of the above particles 15 may be an unbound particle 12 or a contaminant 14, and each of the above particles 15a may be a complex particle 13.
  • particles are counted using the counting device 100 for the purpose of counting the substance to be detected 11. That is, among the particles in the sample 10, the particles containing the substance to be detected, which is a predetermined detection target, are selectively counted.
  • the composite particle 13 is a combination of the substance to be detected 11 and the dielectric particles 12a modified with a substance having a property of specifically binding to the substance to be detected 11 (hereinafter, referred to as a specific binding substance 12b). Is. That is, in the complex particle 13, the substance to be detected 11 and the dielectric particle 12a are bonded to each other via the specific binding substance 12b.
  • the dielectric particles 12a have the same structure as the above-mentioned particles 15.
  • the specific binding substance 12b is a substance that can specifically bind to the substance to be detected 11.
  • combinations of the specific binding substance 12b to the substance to be detected 11 include an antibody against an antigen, an enzyme against a substrate or a coenzyme, a receptacle against a hormone, a protein A or protein G against an antibody, avidins against biotin, a carmodulin against calcium, and a sugar.
  • tag-binding substances such as nickel-nitrillotriacetic acid and glutathione for peptide tags such as lectin, 6 ⁇ histidine and glutathione S transferase.
  • the unbound particles 12 are dielectric particles 12a modified with a specific binding substance 12b that does not form the complex particles 13. That is, the unbound particles 12 are dielectric particles 12a modified with a specific binding substance 12b that is not bound to the substance to be detected 11.
  • the unbound particles 12 are also referred to as free (F) components.
  • the dielectric particles 12a contained in the complex particles 13 are also referred to as bind (B) components.
  • the contaminants 14 are particles such as dust mixed in the detection system (here, in the sample 10), and broken pieces of the constituents constituting the counting device 100 and the like.
  • a substance to be detected 11 such as a virus particle, a dielectric particle 12a (unbound particle 12) modified with an anti-virus antibody as a specific binding substance 12b, and a contaminant 14
  • a substance to be detected 11 such as a virus particle, a dielectric particle 12a (unbound particle 12) modified with an anti-virus antibody as a specific binding substance 12b, and a contaminant 14
  • the substance to be detected 11 and the unbound particles 12 form the complex particles 13 as shown in FIG. 11 (b) by diffusion and collision in the liquid.
  • the unbound particles 12 are probably added so that the unbound substance 11 to be detected does not remain. Therefore, as shown in the figure, the unbound particles 12 are in a state of being excessively present.
  • counting is performed so that one of the positive and negative dielectrophoresis acts on the composite particle 13 and the other of the positive and negative dielectrophoresis acts on the unbound particles 12 and the contaminants 14.
  • the composite particles 13 and the other particles form different clusters and are aggregated.
  • the operating conditions are set by the AC voltage applied to the electrode set, the conductivity of the sample 10 in the solvent, and the like.
  • the complex particles 13 correspond to the particles 15, and the other particles correspond to the particles 15a.
  • the operating conditions corresponding to are used.
  • the composite particles 13 and the other particles are aggregated at different positions from each other, and then each is accurately counted by diffusion, so that the particles contained in the sample 10 are included.
  • the substance to be detected 11 which is a predetermined detection target can be selectively and accurately counted.
  • the electrode set on the first substrate is arranged so that the first convex portion and the second convex portion face each other and the first concave portion and the second concave portion face each other.
  • the arrangement of the set is not limited to this.
  • the first convex portion and the second concave portion may face each other, and the first concave portion and the second convex portion may face each other.
  • the electrode set may be configured so as to form an electric field gradient suitable for various counts.
  • the number of electrodes included in the electrode set is not limited to two, and may be three or more.
  • the electrode set shown in FIG. 4 includes a second electrode arranged outside the drawing in both the vertical direction of the paper surface in addition to the first electrode in the drawing as described above.
  • Such an electrode set includes three or more electrodes, and a phase difference is provided in the AC voltage applied to the adjacent electrodes.
  • such an electrode set may be called a Castled electrode.
  • the counting device 100 may further include a second electrode set 1811 in addition to the first electrode set 1111.
  • FIG. 12 is a circuit diagram including a first electrode set and a second electrode set according to a modified example of the embodiment.
  • the first electrode set 1111 includes the first electrode 1112 and the second electrode 1113.
  • the second electrode set 1811 includes a third electrode 1812 and a fourth electrode 1813.
  • the control unit instructs the switch 1901 to connect the voltage source 120 and the first electrode 1112, and instructs the switch 1902 to connect the voltage source 120 and the second electrode 1113, and connects the power supply 120 to the first electrode. Instructs to generate an AC voltage of frequency. As a result, the dielectrophoretic force in the first direction acts on the particles 15 in the agglutination step.
  • the control unit instructs the switch 1901 to connect the voltage source 120 and the third electrode 1812, and instructs the switch 1902 to connect the voltage source 120 and the fourth electrode 1813, and connects the power supply 120 to the second electrode. Instructs to generate an AC voltage of frequency. As a result, the dielectrophoretic force in the second direction acts on the particles 15 in the diffusion step.
  • It can be used as a counting device for counting dielectric particles.

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Abstract

第１方向の誘電泳動力を作用させて、試料（１０）中の粒子（１５）を凝集させる凝集ステップ（Ｓ１１０）と、第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子（１５）を拡散させる拡散ステップ（Ｓ１２０）と、拡散された粒子（１５）を含む拡散画像を撮像する撮像ステップ（Ｓ１３０）と、撮像された拡散画像に基づいて粒子（１５）の数を決定する計数ステップ（１４０）と、を含む計数方法。

Description

計数方法及び計数装置
　本開示は、試料中に含まれる粒子を計数するための計数方法及び計数装置に関する。
　従来、試料液中の誘電体粒子を誘電泳動によって捕集して、当該誘電体粒子が捕集された箇所を撮像した画像を解析することにより、試料液中に含まれる誘電体粒子を計数する計数方法が知られている（特許文献１参照）。
特開２０１７－７０２８１号公報
　しかしながら、特許文献１に開示された計数方法では、試料中に多数の誘電体粒子が存在する場合に偽陰性が生じて正確な計数ができない場合がある。
　そこで、本開示は、偽陰性の発生を低減し、より正確に粒子の計数が可能な計数方法等を提供する。
　本開示の一態様に係る計数方法は、第１方向の誘電泳動力を作用させて、試料中の粒子を凝集させる凝集ステップと、前記第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる拡散ステップと、前記拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像ステップと、前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数ステップと、を含む。
　本開示の一態様に係る計数装置は、粒子を含む試料を収容する収容部と、前記収容部に収容された前記試料に対して電場勾配を発生する電場勾配発生部と、前記電場勾配発生部を制御することで、発生する前記電場勾配により、前記粒子に第１方向の誘電泳動力を作用させて前記粒子を凝集させ、凝集された前記粒子に前記第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる制御部と、拡散された前記粒子を含む拡散画像を撮像する撮像部と、撮像された前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数部と、を備える。
　なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ－ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、方法、装置、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体は、例えばＣＤ－ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｃ－Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）などの不揮発性の記録媒体を含む。
　本開示の計数方法等によれば、より正確な粒子の計数が可能となる。
図１は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す斜視図である。 図２は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す断面図である。 図３は、実施の形態に係る電極セットの構成を示す平面図である。 図４は、実施の形態に係る粒子の凝集及び拡散を説明する図である。 図５は、実施の形態に係る誘電泳動力の変化を説明する第１図である。 図６は、実施の形態に係る誘電泳動力の変化を説明する第２図である。 図７は、実施の形態に係る計数方法を示すフローチャートである。 図８は、実施の形態の変形例に係る計数方法を示すフローチャートである。 図９は、実施の形態の変形例に係る凝集画像及び拡散画像を示す図である。 図１０は、実施の形態の変形例に係る追跡ステップを示す図である。 図１１は、実施の形態の変形例に係る複合体の形成プロセスを示す図である。 図１２は、実施の形態の変形例に係る第１の電極セットと第２の電極セットを含む回路図である。
　（開示に至った経緯）
　試料中（以下、試料液中ともいう）に含まれる粒子を計数するための計数方法として、誘電泳動を利用した技術が知られている。例えば、特許文献１には、計数対象の粒子である誘電体粒子を誘電泳動によって計数する計数方法が開示されている。具体的には、特許文献１では、誘電泳動によって、複数のスリット領域の各々に誘電体粒子を捕集させ、複数のスリット領域のうち誘電体粒子によって飽和したスリット領域の数をカウントすることで、試料液中に含まれる誘電体粒子を計数している。
　一般に、誘電泳動は、上記のように所定の箇所に誘電体粒子を捕集させる（言い換えると、凝集させる）技術であり、当該所定の箇所に向けて誘電体粒子を移動させることができる。したがって、試料中に多数の誘電体粒子が存在する場合、多数の誘電体粒子は、所定の箇所に凝集されて三次元的に集積される。つまり、一方向から撮像装置等によって撮像した画像では、集積に伴う誘電体粒子同士の重なり合いを識別することは困難であり、実際に含まれる数よりも少ない数しか計数できない、いわゆる、偽陰性が生じてしまう。
　このような背景から、上記の特許文献１等で知られるような従来の計数方法では、誘電体粒子の正確な計数が困難であった。
　そこで、本開示に係る計数方法等では、第１の誘電泳動（つまり第１方向の誘電泳動力）の作用によって凝集された粒子に、第２の誘電泳動（つまり第２方向の誘電泳動力）を作用させることで、第１方向の誘電泳動による凝集を拡散させる。これにより、本開示に係る計数方法等によれば、粒子同士の重なり合いの影響が低減した状態で粒子の計数を行うことができ、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　（開示の概要）
　本開示の一態様に係る計数方法は、第１方向の誘電泳動力を作用させて、試料中の粒子を凝集させる凝集ステップと、第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子を拡散させる拡散ステップと、拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像ステップと、撮像された拡散画像に基づいて粒子の数を決定する計数ステップと、を含む。
　このような計数方法では、第１方向の誘電泳動力によって凝集された粒子を、異なる第２方向の誘電泳動力によって拡散させる。つまり、凝集によって粒子同士が重なり合うことで、２つの粒子が１つに見えるなどの偽陰性の発生を抑制できる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間に第１周波数の交流電圧を印加し、拡散ステップでは、電極セットの間に第１周波数とは異なる第２周波数の交流電圧を印加してもよい。
　これによれば、本開示の計数方法では、誘電泳動力の方向を、電極セットの間に印加される交流電圧の周波数によって調整できる。このように、周波数の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する第１の電極セットの間に第１周波数の交流電圧を印加し、拡散ステップでは、第１の電極セットとは異なる第２の電極セットの間に第１周波数とは異なる第２周波数の交流電圧を印加してもよい。
　これによれば、本開示の計数方法では、誘電泳動力の方向を、第１の電極セットおよび第２の電極セットのそれぞれに印加される交流電圧の周波数によって調整できる。このように、２つの電極セットに印加される周波数の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、粒子を凝集および拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、拡散ステップでは、凝集ステップにおける第１方向の誘電泳動力よりも大きい第２方向の誘電泳動力を作用させてもよい。
　これによれば、本開示の計数方法では、凝集ステップよりも拡散ステップにおいてより大きな誘電泳動力を作用させることができ、凝集した粒子をより確実に拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、第１周波数の交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、第２周波数の交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用されてもよい。
　これによれば、正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力のいずれが作用されるかを、電極セットの間に印加される交流電圧の周波数によって調整できる。このように、周波数の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間には、凝集ステップにおいて、第１導電率の環境中で交流電圧が印加され、拡散ステップにおいて、第１導電率とは異なる第２導電率の環境中で交流電圧が印加されてもよい。
　これによれば、本開示の計数方法では、誘電泳動力の方向を、粒子の周囲の環境中における導電率によって調整できる。このように、導電率の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、第１導電率の環境中での交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、第２導電率の環境中での交流電圧の印加では、粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用されてもよい。
　これによれば、正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力のいずれが作用されるかを、粒子の周囲の環境中における導電率によって調整できる。このように、導電率の調整で誘電泳動力の方向を変化させ、凝集された粒子を拡散させることができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、さらに、凝集ステップ以降、かつ、拡散ステップよりも前に、凝集された粒子を含む凝集画像を撮像する前撮像ステップと、撮像された凝集画像及び拡散画像に基づいて凝集画像に含まれる粒子を追跡する追跡ステップと、を含んでもよい。
　これによれば、本開示の計数方法では、粒子が拡散する前後の凝集画像及び拡散画像に基づいて粒子の計数を行える。例えば、拡散の過程で別々の軌道をたどる粒子同士が偶発的に重なり合う場合に、別々の軌道に基づいて粒子同士を個別に計数することができる。よって、本開示の計数方法では、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、追跡ステップでは、拡散ステップにおいて拡散された粒子を、凝集ステップにおいて第１位置に凝集した粒子、又は、第１位置とは異なる第２位置に凝集した粒子のいずれであるかを特定してもよい。
　これによれば、本開示の計数方法では、第１位置及び第２位置のそれぞれに凝集された粒子を位置ごとに個別に計数することができる。例えば、第１位置及び第２位置が正の誘電泳動及び負の誘電泳動のそれぞれによって凝集される位置である場合に、これらの異なる誘電泳動の作用によって凝集された粒子を同時に、かつ、正確に計数することができる。よって、本開示の計数方法では、複数の位置のそれぞれについて、凝集に伴う偽陰性の発生が低減されて、同時に、かつ、より正確に粒子を計数することができる。
　例えば、計数ステップでは、凝集画像及び拡散画像に基づいて、粒子のうち、所定の検出対象である被検出物質を含む粒子を選択的に計数してもよい。
　これによれば、複数種類の粒子を含む試料から、特定の粒子を選択的に計数することができる。
　本開示の一態様に係る計数装置は、粒子を含む試料を収容する収容部と、収容部に収容された試料に対して電場勾配を発生する電場勾配発生部と、電場勾配発生部を制御することで、発生する電場勾配により、粒子に第１方向の誘電泳動力を作用させて粒子を凝集させ、凝集された粒子に第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子を拡散させる制御部と、拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像部と、撮像された拡散画像に基づいて粒子の数を決定する計数部と、を備える。
　これによれば、上記の計数方法と同様の効果を奏する計数装置が実現される。
　なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、装置、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータで読み取り可能なＣＤ－ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化する場合がある。
　以下において、平行及び垂直などの要素間の関係性を示す用語、及び、矩形状などの要素の形状を示す用語、並びに、数値範囲は、厳格な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば数％程度の差異をも含むことを意味する。
　以下において、粒子を計数するとは、１個以上であるか又は０個であるかの判定に基づき試料中の粒子を見つけ出して粒子の存在を確認することに加えて、粒子の量（例えば数又は濃度等）又はその範囲を測定することを含む。同様に被検出物質を計数するとは、１個以上であるか又は０個であるかの判定に基づき試料中の被検出物質を見つけ出して被検出物質の存在を確認することに加えて、被検出物質の量（例えば数又は濃度等）又はその範囲を測定することを含む。計数の対象となる粒子は、試料中に含まれる全ての粒子であってもよいし、試料中に含まれる複数の粒子のうちの一部であってもよい。
　第２方向の誘電泳動力により粒子が拡散されるとは、単に、第１方向の誘電泳動力によって粒子が凝集された位置から放射状の第２方向に拡散させることと、第１方向の誘電泳動力によって粒子が凝集された位置とは異なる位置に粒子を凝集させて、元の位置から拡散させることとを含む概念である。
　（実施の形態）
　本実施の形態では、液体中で粒子が誘電泳動（ＤＥＰ：Dielectrophoresis）によって凝集され、さらに凝集された粒子を拡散させることで、凝集に伴う粒子同士の重なり合いを抑制して当該粒子の計数を行う。
　誘電泳動とは、不均一な電場（以下、電場勾配ともいう）にさらされた誘電体粒子に力が働く現象である。この力は、粒子の帯電を要求しない。
　以下に、誘電泳動を用いた被検出物質粒子の計数を実現する計数装置及び計数方法の実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　［計数装置の構成］
　まず、計数装置の構成について図１及び図２を参照しながら説明する。図１は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す斜視図である。図２は、実施の形態に係る計数装置の概略構成を示す断面図である。図１では、特に、収容部１１０は、第１基板１１１を除く部分を透過することで、収容部１１０の内部が見えるよう、概形を示している。図１は、収容部１１０を中心にその他の構成要素との関係性を説明するために用いられ、計数装置１００が使用される際の各々の構成要素の配置位置、配置方向、姿勢等を限定するものではない。図２は、図１に示す収容部１１０を紙面と平行な方向に沿って切断した断面図である、なお、図２に示す収容部１１０の一部の構成の厚みは、図１において図示が省略されている。
　図１及び図２に示すように、計数装置１００は、収容部１１０と、電源１２０と、光源１３０と、撮像素子１４０と、計数部１５０とを備える。
　収容部１１０は、粒子１５を含む試料１０を収容する容器であり、空間１１２１を内部に有する。試料１０は、当該空間１１２１に収容される。空間１１２１に収容された試料１０は、空間１１２１内で誘電泳動が作用され、試料１０に粒子１５が含まれていた場合、粒子１５は、誘電泳動の作用によって移動される。このように、収容部１１０内に設けられた空間１１２１は、計数装置１００における誘電泳動の場を成す。
　ここで、粒子１５とは、上記したように誘電性を示す粒形の物質であり、ポリスチレンビーズ及びガラスビーズなどの単素材物質の他、これらのビーズに機能性物質が付加された複合物質、ならびに、巨視的に誘電体粒子とみなすことができる生細胞等である。粒子１５は、計数装置１００の用途に応じて適宜決定され、粒子１５の物性等に応じて、誘電泳動の際の諸条件が設定される。以下の説明では、粒子１５がポリスチレンビーズであるものとして説明するが、上記のように、粒子１５の構成及びサイズに特に限定はない。様々な粒子１５を計数対象として、計数装置１００を適用することができる。
　ここで、収容部１１０の内部構成について説明する。図２に示すように、収容部１１０は、第１基板１１１と、スペーサ１１２と、第２基板１１３と、を備える。
　第１基板１１１は、例えばガラス又は樹脂製のシートである。第１基板１１１は、空間１１２１の底を規定する上面を有し、当該上面には、電源１２０から交流電圧が印加される電極セット１１１１が形成される。空間１１２１に試料１０が収容された際に、試料１０と電極セット１１１１とが電気的に接触するよう、電極セット１１１１は、空間１１２１に接して形成されている。
　電極セット１１１１は、具体的に、第１電極１１１２及び第２電極１１１３を含む。電極セット１１１１に対して電源から印加された交流電圧によって、電極セット１１１１は、第１基板１１１上に不均一な電場（電場勾配）を生成する（発生する又は形成する）ことができる。このように、電極セット１１１１は、電場勾配発生部の一例である。なお、電極セット１１１１の詳細については、図３を用いて後述する。
　スペーサ１１２は、第１基板１１１上に配置される。スペーサ１１２には、空間１１２１の形状に対応する貫通孔が形成されている。空間１１２１は、第１基板１１１及び第２基板１１３に挟まれた貫通孔によって形成される。つまり、スペーサ１１２は、貫通孔を囲む外壁であり、空間１１２１を規定する内側面を有する。スペーサ１１２は、例えば、第１基板１１１及び第２基板１１３との密着性が高い樹脂等の材料で構成される。
　第２基板１１３は、例えばガラス又は樹脂製の透明なシートであり、スペーサ１１２上に配置される。例えば、第２基板１１３としては、ポリカーボネート基板を用いることができる。第２基板１１３には、空間１１２１に繋がる供給孔１１３１及び排出孔１１３２が形成されている。試料１０は、供給孔１１３１を介して空間１１２１に供給され、排出孔１１３２を介して空間１１２１から排出される。なお、第２基板１１３を備えずに収容部１１０を構成してもよい。つまり、第２基板１１３は、必須の構成要素ではない。この場合、収容部１１０が容器として成立するための空間１１２１は、底及び内側面をそれぞれ規定する第１基板１１１及びスペーサ１１２で形成される。
　電源１２０は、交流電源であり、第１基板１１１の電極セット１１１１に交流電圧を印加する。
　なお、電源１２０は、交流電圧を供給できればどのような電源であってもよく、上記に述べたような特定の電源に限定されない。交流電圧は外部電源から供給されてもよく、この場合、電源１２０は、計数装置１００に含まれなくてもよい。以下では、電源１２０の内部構成を省略して簡略化して図示する。
　光源１３０は、空間１１２１内の試料１０に照射光１３１を照射する。照射光１３１は、第２基板１１３を介して試料１０中の粒子１５に照射される。粒子１５からは、照射光１３１に応じた検出光１３２が生じ、当該検出光１３２を検出することで、粒子１５の検出が行われる。例えば、照射光１３１として、特定の蛍光物質を励起する励起光を照射してもよい。粒子１５を形成するポリスチレンに蛍光物質が分散されていれば、照射された励起光に応じて蛍光が生じ、当該蛍光を検出することで、蛍光物質の存在、すなわち粒子１５の存在を検出することができる。
　光源１３０としては、公知の技術を特に限定することなく利用することができる。例えば半導体レーザ、ガスレーザ等のレーザを光源１３０として用いることができる。光源１３０から照射される照射光１３１の波長としては、粒子１５を構成する物質と相互作用が小さい波長（例えば４００ｎｍ～２０００ｎｍ）が用いられてもよい。さらには、照射光１３１の波長としては、半導体レーザが利用できる波長（例えば６００ｎｍ～８５０ｎｍ）が用いられてもよい。
　なお、光源１３０は、計数装置１００に含まれなくてもよい。例えば、粒子１５が大きい場合には、粒子１５に蛍光物質が含まれなくてもよい。この場合、粒子１５に励起光が照射されなくてもよいため、照射光１３１として、太陽及び蛍光灯などから照射される外光が利用でき、光源１３０を備えることなく計数装置１００を実現できる。
　撮像素子１４０は、カメラ１４１に内蔵されたＣＭＯＳイメージセンサ及びＣＣＤイメージセンサ等であり、粒子１５から生じた検出光１３２を検出することで、粒子１５を含む画像を生成する。撮像素子１４０は、第１基板１１１の板面に水平に配置されて、カメラ１４１に含まれるレンズ等の光学素子（不図示）を介して、電極セット１１１１に対応する箇所を撮像する。当該箇所に粒子１５が存在すれば、照射光１３１によって生じた検出光１３２が撮像素子１４０に入射し、粒子１５が検出される。
　計数部１５０は、撮像素子１４０によって出力された画像を取得し、当該画像に基づき、試料１０中に含まれる粒子１５の数を決定する。例えば、計数部１５０は、予め撮像された粒子１５を含まない対照画像を用いて、取得された画像と対照画像との比較により、輝度値の異なる輝点を検出する。具体的に、検出光１３２として発光を検出する場合、対照画像に対して取得された画像中の輝度値の高い点を輝点とし、検出光１３２として透過光及び散乱光を検出する場合、対照画像に対して取得された画像中の輝度値の低い点を輝点として検出すればよい。このようにして、試料１０中の粒子１５の計数結果を得ることができる。
　計数部１５０は、例えば、プロセッサ等の回路とメモリ等の記憶装置とを用いて、上記画像解析のためのプログラムが実行されることで実現されるが、専用の回路によって実現されてもよい。
　［電極セットの形状及び配置］
　次に、第１基板１１１上の電極セット１１１１の形状及び配置について、図３を参照しながら説明する。図３は、実施の形態に係る電極セットの構成を示す平面図である。図３では、撮像素子１４０側から平面視した場合の電極セット１１１１の構成が示されている。なお、図３では、簡略化のため、電極セット１１１１の一部分を示す概略構成図が示されている。
　図３に示すように、電極セット１１１１は、第１電極１１１２と第２電極１１１３とを有する。第１電極１１１２及び第２電極１１１３の各々は、電源１２０と電気的に接続されている。
　第１電極１１１２は、第１方向（図３の紙面左右方向）に延びる第１基部１１１２ａと、第１方向と交差する第２方向（図３の紙面上下方向）に第１基部１１１２ａから突出する２つの第１凸部１１１２ｂと、を有する。２つの第１凸部１１１２ｂの間には、第１凹部１１１２ｃが形成される。２つの第１凸部１１１２ｂ及び第１凹部１１１２ｃの各々の第１方向の長さ及び第２方向の長さは、例えば、いずれも約５マイクロメートルである。なお、２つの第１凸部１１１２ｂ及び第１凹部１１１２ｃのサイズは、これに限定されない。
　第２電極１１１３の形状及びサイズは、第１電極１１１２の形状及びサイズと実質的に同一である。つまり、第２電極１１１３も、第１方向（図３の紙面左右方向）に延びる第２基部１１１３ａと、第１方向と交差する第２方向（図３の紙面上下方向）に第２基部１１１３ａから突出する２つの第２凸部１１１３ｂと、を備える。２つの第２凸部１１１３ｂの間には、第２凹部１１１３ｃが形成される。２つの第２凸部１１１３ｂは、第１電極１１１２の２つの第１凸部１１１２ｂに対向して配置されている。
　つまり、第１電極１１１２は、第１方向に交差し、第２電極１１１３に向けて凸となる方向に第１基部１１１２ａから突出する第１凸部１１１２ｂを有する。第２電極１１１３は、第１方向に交差し、第１電極１１１２に向けて凸となる方向に第２基部１１１３ａから突出する第２凸部１１１３ｂを有する。
　第１凸部１１１２ｂ及び第２凸部１１１３ｂは、第１方向の位置に応じて第１電極１１１２及び第２電極１１１３の間の距離が異なるように形成される。第１電極１１１２及び第２電極１１１３の間の距離が異なることで、電極セット１１１１に交流電圧が印加された際に、位置に応じて電界強度の異なる電場勾配、すなわち不均一な電場が形成される。つまり、電極セット１１１１には、少なくとも１か所の電極間距離が異なる箇所が形成されていればよい。例えば、電極セット１１１１は、第１電極１１１２及び第２電極１１１３の一方に凸部が形成され、第１電極１１１２及び第２電極１１１３の他方に凸部が形成されない構成であってもよい。凸部が１つでも存在すれば上記が達成できるため、少なくとも１つの凸部を有する第１電極１１１２又は第２電極１１１３によって電極セット１１１１が実現できる。
　なお、電極セット１１１１の位置は、第１基板１１１上に限定されない。電極セット１１１１は、試料１０に接触せずに、空間１１２１の近傍に配置されてもよい。ここで、空間１１２１の近傍とは、電極セット１１１１に印加された交流電圧によって試料１０内に電場勾配を形成することができる範囲を意味する。
　上記電極セット１１１１の構成により、電場勾配が形成され、試料１０中の粒子１５が当該電場にさらされると誘電泳動によって粒子１５は、所定の箇所に凝集される。誘電泳動では、電場勾配が形成された際に、粒子１５に正の誘電泳動が作用されるか、負の誘電泳動が作用されるかによって粒子１５が凝集される所定の箇所が異なる。
　より具体的には、粒子１５に正の誘電泳動が作用される場合、粒子１５は電界強度の高い領域に移動して凝集される。電界強度が高い領域は、第１凸部１１１２ｂ及び第２凸部１１１３ｂによって第１電極１１１２及び第２電極１１１３の間の距離が最も短い位置を含む領域であり、図中では例えば、破線円に示される第１電場領域Ａである。一方で、粒子１５に負の誘電泳動が作用される場合、粒子１５は電界強度の低い領域に移動して凝集される。電界強度が低い領域は、第１凸部１１１２ｂ及び第２凸部１１１３ｂによって第１電極１１１２及び第２電極１１１３の間の距離が最も遠い位置を含む領域である。さらに詳しくは、電界強度が低い領域は、第１凹部１１１２ｃ及び第２凹部１１１３ｃの間の領域であり、特に、第１電場領域Ａから離れるほど電界強度が低くなる。つまり、図中では例えば、破線円に示される第２電場領域Ｂに、負の誘電泳動が作用された粒子１５が凝集される。
　図４は、実施の形態に係る粒子の凝集及び拡散を説明する図である。図４の（ａ）は、第１の誘電泳動によって凝集した粒子１５を示す図である。図４の（ｂ）は、第２の誘電泳動によって拡散（言い換えると、第２方向の誘電泳動力によって凝集）した粒子１５を示す図である。図４では、図３と同じ方向から見た第１電極１１１２及び第２電極１１１３の画像が示されており、さらに図中に黒点として粒子１５が示されている。なお、図中の第１電極１１１２は、上下両方向に第１凸部１１１２ｂが突出している。図中の第２電極１１１３は、上下両方向に第１凸部１１１２ｂが突出している。
　図４の（ａ）に示すように、粒子１５の大半は、誘電泳動によって第１凸部１１１２ｂ及び第２凸部１１１３ｂの間に凝集される。これは、粒子１５に対して、正の誘電泳動が作用したことで、電界強度の高い領域に粒子１５が移動して凝集されたことによる。試料１０中に粒子１５が多数存在する場合、図示するように、一つの方向の誘電泳動を作用させると、粒子１５同士が重なり合い、正確に計数できないことが起こりうる。
　本実施の形態では、上記したように、第１方向の誘電泳動力によって凝集された粒子１５に対して、第１方向の誘電泳動力と異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された粒子１５を拡散させる。図４の（ｂ）に示すように、粒子１５は、第２方向の誘電泳動力によってはじめの凝集位置から拡散することによってはじめの凝集位置における重なり合いが抑制された状態となり、より正確な計数を行うことができる。第１方向の誘電泳動力及び第２方向の誘電泳動力は、誘電泳動力の方向が異なっている。特に図４に示す例では、正の誘電泳動力から負の誘電泳動力に変化することで、粒子１５同士の重なり合いが抑制されている。
　つまり、方向が異なる誘電泳動力に変化するとは、正の誘電泳動力から方向の異なる別の正の誘電泳動力に変化する場合、負の誘電泳動力から方向の異なる別の負の誘電泳動力に変化する場合、及び、正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力の一方から他方に逆転する場合とを含む。はじめに第１方向の誘電泳動力によって、電界強度の高い又は低い所定の電場領域に粒子１５を凝集させ、凝集位置の異なる第２方向の誘電泳動力によって異なる凝集の力を作用させ、所定の電場領域から粒子１５を拡散させる。本実施の形態の計数装置１００は、このような手法により粒子１５の正確な計数を行うことができる。
　［第１方向の誘電泳動力から第２方向の誘電泳動力への変化］
　第１方向の誘電泳動力と第２方向の誘電泳動力とは、上記のように誘電泳動力の方向が異なる。したがって、第１方向の誘電泳動力から第２方向の誘電泳動力へ変化させるためには、誘電泳動力の方向を切り替える必要がある。このように誘電泳動力の方向を切り替える方法について、図５及び図６を用いて説明する。
　図５は、実施の形態に係る誘電泳動力の変化を説明する第１図である。図６は、実施の形態に係る誘電泳動力の変化を説明する第２図である。ここでは特に、誘電泳動力の方向を切り換える方法として、誘電泳動力の正負を逆転させる方法について説明する。
　正の誘電泳動力又は負の誘電泳動力のいずれが作用するかは、粒子１５と、電界が形成される液体の性質に相関があり、特に、クラウジウス・モソッティ係数の実部（Real-part of Clausius-Mossotti factor）によって評価される。クラウジウス・モソッティ係数の実部が正であれば、粒子１５には正の誘電泳動力が作用し、電界強度のより高い領域に粒子１５が移動する。逆に、クラウジウス・モソッティ係数の実部が負であれば、粒子１５には負の誘電泳動力が作用し、電界強度のより低い領域に粒子１５が移動する。
　図５及び図６には、クラウジウス・モソッティ係数の実部を縦軸とし、電極セット１１１１の間に印加される交流電圧の周波数を横軸とした場合の各々の関係を表すグラフが示されている。
　図５に示すように、例えば、粒子１５は、低い周波数領域の交流電圧において、クラウジウス・モソッティ係数の実部が正の値となり、高い周波数領域の交流電圧において、クラウジウス・モソッティ係数の実部が負の値となることがわかる。したがって、誘電泳動力の正負を逆転させるためには、例えば、電極セット１１１１の間に印加される交流電圧の周波数を変化させる方法がある。
　はじめに、第１方向の誘電泳動力として正の誘電泳動力を作用させるため、電極セット１１１１の間にクラウジウス・モソッティ係数の実部を正の値となる低い周波数領域の交流電圧を印加する。粒子１５は、正の誘電泳動力によって電界強度の高い領域に凝集される。その後、第２方向の誘電泳動力として負の誘電泳動力を作用させるため、電極セット１１１１の間にクラウジウス・モソッティ係数の実部が負の値となる高い周波数領域の交流電圧を印加する。粒子１５は、負の誘電泳動力によって電界強度の低い領域に向けて拡散される。
　具体的に、例えば、第１方向の誘電泳動力を作用させる際に、電極セット１１１１の間に、第１周波数Ｆ１の交流電圧を印加して粒子１５を凝集させる。その後、第２方向の誘電泳動力を作用させる際に、電極セット１１１１の間に第１周波数Ｆ１よりも周波数が大きい第２周波数Ｆ２の交流電圧を印加することで粒子１５を拡散させる。第１方向の誘電泳動力と第２方向の誘電泳動力とは、正と負が入れ替わってもよい。
　このように周波数を変化させるために、電源１２０は、印加する交流電圧を変化させる。つまり、電源１２０は、制御部の一例である。制御部は、電源とは別に設けられた装置であってもよく、電源１２０に対して制御信号を送信することで、電源１２０から印加される交流電圧の周波数を変化させてもよい。
　図６に示すように、誘電泳動力の正負を逆転させるためには、例えば、粒子１５の周囲の環境における導電率を変化させる方法がある。
　はじめに、第１方向の誘電泳動力として正の誘電泳動力を作用させるため、第１導電率Ｓ１の環境中において、電極セット１１１１の間にクラウジウス・モソッティ係数の実部を正の値となる所定周波数Ｆの交流電圧を印加する。粒子１５は、正の誘電泳動力によって電界強度の高い領域に凝集される。その後、第２方向の誘電泳動力として負の誘電泳動力を作用させるため、第２導電率Ｓ２の環境中において、電極セット１１１１の間に所定周波数Ｆの交流電圧を印加する。粒子１５は、負の誘電泳動力によって電界強度の低い領域に向けて拡散される。
　具体的に、例えば、第１方向の誘電泳動力を作用させる際に、第１導電率Ｓ１の環境中で所定周波数Ｆの交流電圧が印加され、第２方向の誘電泳動力を作用させる際に、第１導電率Ｓ１よりも小さい第２導電率Ｓ２の環境中で所定周波数Ｆの交流電圧が印加される。このように導電率を変化させるために、電導度を低下させるため、試料１０の溶媒を構成するイオン成分に対して、キレート沈殿を形成するキレーティング剤が添加される。第１方向の誘電泳動力と第２方向の誘電泳動力とは、正と負が入れ替わってもよい。このとき、電導度を上昇するため、試料１０中にイオンを含む溶液又は塩が添加されればよい。
　このように、キレーティング剤、又は、イオンを含む溶液もしくは塩を添加する添加装置（不図示）は、粒子１５の周囲の環境における導電率を変化させる。つまり、添加装置は、制御部の一例である。制御部は、添加装置とは別に設けられた装置であってもよく、添加装置に対して制御信号を送信することで、添加装置からキレーティング剤、又は、イオンを含む溶液もしくは塩を添加させてもよい。
　正の誘電泳動力から方向の異なる別の正の誘電泳動力に変化する場合、及び、負の誘電泳動力から方向の異なる別の負の誘電泳動力に変化する場合には、例えば、単に互いに異なる位置に設けられた電極セット間で、交流電圧の印加のオン／オフを切り替えてもよい。さらに、この場合、第１方向の誘電泳動力と第２方向の誘電泳動力とは、方向が一致し、かつ、粒子１５が凝集される位置が異なる場合が含まれてもよい。
　以上に説明したように、第１方向の誘電泳動力に対して、誘電泳動力の方向が異なる第２方向の誘電泳動力に変化させることで、凝集された粒子１５が拡散される。第１方向の誘電泳動力と、第２方向の誘電泳動力とは、誘電泳動力の大きさ及び方向が異なっていてもよい。
　［計数装置を用いた計数方法］
　以上のように構成された計数装置１００を用いた粒子１５の計数方法について、図７を参照しながら説明する。図７は、実施の形態に係る計数方法を示すフローチャートである。
　まず、粒子１５を含む試料１０に対して、正又は負の第１方向の誘電泳動力を作用させることで、所定の位置に粒子１５が凝集される（凝集ステップＳ１１０）。その後、第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させることで、凝集された粒子１５を拡散させる（拡散ステップＳ１２０）。具体的には、上記に説明したように、凝集ステップＳ１１０において作用された第１方向の誘電泳動力に対して、方向が異なる第２方向の誘電泳動力を作用させる。粒子１５の凝集のために作用していた力が変化することにより、第１方向の誘電泳動力による凝集が変化し、粒子１５同士の重なり合いが抑制される。
　次に、撮像素子１４０は、検出光１３２を受光して、画像を撮像する（撮像ステップＳ１３０）。なお、撮像ステップＳ１３０において撮像される画像は、拡散された粒子１５を含む拡散画像である。計数部１５０は、当該拡散画像を用いて、画像解析することにより試料１０中の粒子１５の数を決定する（計数ステップＳ１４０）。以上のようにして、試料１０中の粒子１５同士の重なり合いによる偽陰性の発生を抑制して、より正確に粒子１５の計数を行うことができる。
　［変形例］
　以下さらに、本実施の形態の変形例について、図８～図１１を参照して説明する。なお、以下の説明では、上記した実施の形態の説明と異なる点を中心に述べ、重複する点を省略又は簡略化する。図８は、実施の形態の変形例に係る計数方法を示すフローチャートである。図８に示す変形例に係る計数方法は、上記実施の形態の計数方法に比べ、前撮像ステップＳ１１５及び追跡ステップＳ１３５を実施する点で異なっている。
　具体的には、凝集ステップＳ１１０において、試料１０中の粒子１５が凝集された以降、かつ、拡散ステップＳ１２０が実施されるよりも前に、撮像素子１４０は、検出光１３２を受光して、画像を撮像する（前撮像ステップＳ１１５）。なお、前撮像ステップＳ１１５において撮像される画像は、凝集された粒子１５を含む凝集画像である。図９は、実施の形態の変形例に係る凝集画像及び拡散画像を示す図である。図９の（ａ）に示すように、本変形例における凝集画像では、第１方向の誘電泳動力として正の誘電泳動が作用されることによって粒子１５が第１電極１１１２の第１凸部１１１２ｂ及び第２電極１１１３の第２凸部１１１３ｂの間に凝集されている。このとき、第１電極１１１２及び第２電極１１１３が第１凸部１１１２ｂ及び第２凸部１１１３ｂを複数形成している場合、図中のように、粒子１５は、複数の第１凸部１１１２ｂ及び第２凸部１１１３ｂの間のそれぞれに凝集してクラスタを形成する。例えば、図中では３つの第１凸部１１１２ｂ及び３つの第２凸部１１１３ｂの間に、第１クラスタＣＬａ、第２クラスタＣＬｂ、及び、第３クラスタＣＬｃをそれぞれ形成している。
　このようにクラスタに分かれて粒子１５が凝集されることで、１箇所に粒子１５が凝集される場合に比べて粒子１５同士の重なり合いを低減させることができる。つまり、偽陰性の発生を抑制し、より正確な粒子の計数を行うことができる。以上の説明は、第１方向の誘電泳動力として正の誘電泳動が作用される場合も同様である。
　本変形例では、第２方向の誘電泳動力によって粒子１５を拡散させ、図９の（ｂ）に示す拡散画像を撮像する（拡散ステップＳ１２０及び撮像ステップＳ１３０）。さらに、計数部１５０は、以上のようにして出力された凝集画像及び拡散画像を取得し、これらに基づいて凝集画像に含まれる粒子１５を追跡する（追跡ステップＳ１３５）。追跡ステップＳ１３５では、拡散ステップＳ１２０において拡散された粒子１５を、凝集ステップＳ１１０において第１位置に凝集した第１クラスタＣＬａに含まれる粒子１５、第２位置に凝集した第２クラスタＣＬｂに含まれる粒子１５、又は、第３位置に凝集した第３クラスタＣＬｃに含まれる粒子１５のいずれであるかを特定する事ができる。
　図１０は、実施の形態の変形例に係る追跡ステップを示す図である。図中では、図３と同じ視点から見た電極セット１１１１の平面図と、当該平面図上で第１クラスタＣＬａを拡大した拡大図とを示している。図中では、紙面左から右にかけて時系列に沿って取得された画像を示しており、左側の画像が凝集画像であり、中央及び右側の画像が拡散画像である。ここでは、第１クラスタＣＬａを一例として説明するが第２クラスタＣＬｂ、第３クラスタＣＬｃ、及びその他のクラスタについても同様である。計数部１５０は、追跡ステップＳ１３５において、以下のように動作する。
　はじめに、凝集画像において、粒子１５の輝点又は粒子１５が含まれるクラスタの輝点を検出する。これらの輝点は、上記したように対照画像に対する輝度値の差が閾値以上となる画素を特定することで検出される。ここでは、粒子１５が重なり合っている場合があるため、各々の粒子１５を個別に検出できなくてもよい。
　次いで、拡散画像において、粒子１５の輝点を検出する。凝集画像に対して拡散後の拡散画像においては、粒子１５を略個別に検出することができる。特に、拡散開始から拡散画像が取得されるまでの時間を十分長く設定することで、粒子１５の検出性が向上される。ただし、拡散開始から拡散画像が取得されるまでの時間が過剰に長く設定されると、異なるクラスタからの粒子１５同士を識別できず粒子１５の追跡が不可能になる場合がある。粒子１５の拡散の速度は、粒子１５の性質に依存するため、拡散開始から拡散画像が取得されるまでの適切な時間を予備実験等によりあらかじめ設定してもよい。なお、撮像素子１４０が、連続的に画像を取得した動画像を出力することで、計数部１５０は、粒子１５が適切に拡散したタイミングの拡散画像を抽出して粒子１５の追跡及び計数を行ってもよい。
　計数部１５０は、拡散画像において検出された粒子１５の輝点をパターンマッチング等のアルゴリズムを用いて、移動ベクトルを推定し、各々の粒子１５がどのクラスタから拡散されたかを特定する。これにより、各クラスタに含まれていた粒子１５の数をクラスタごとに計数することができる。特に、図中に示すように、複数のクラスタに負の誘電泳動によって凝集された粒子１５ａのクラスタと、正の誘電泳動によって凝集された粒子１５クラスタとが混在している状況で、同時かつそれぞれ個別に正確な計数が行える。
　以上に説明した変形例に係る計数方法の応用の一例として、図１１を参照して説明する。図１１は、実施の形態の変形例に係る複合体の形成プロセスを示す図である。本例では、上記の粒子１５のそれぞれは複合体粒子１３であり、上記の粒子１５ａのそれぞれは未結合粒子１２または夾雑物１４として説明する。上記の粒子１５のそれぞれは未結合粒子１２または夾雑物１４であり、上記の粒子１５ａのそれぞれは複合体粒子１３であってもよい。
　本例では、被検出物質１１の計数を目的として上記計数装置１００を用いた粒子の計数を行う。つまり、試料１０中の粒子のうち、所定の検出対象である被検出物質を含む粒子を選択的に計数する。
　複合体粒子１３とは、被検出物質１１と、被検出物質１１に特異的に結合する性質を有する物質（以下、特異的結合物質１２ｂと呼ぶ）で修飾された誘電体粒子１２ａとの結合体である。つまり、複合体粒子１３では、特異的結合物質１２ｂを介して、被検出物質１１と誘電体粒子１２ａとが結合されている。誘電体粒子１２ａは、上記の粒子１５と同様の構成である。
　特異的結合物質１２ｂとは、被検出物質１１と特異的に結合可能な物質である。被検出物質１１に対する特異的結合物質１２ｂの組み合わせの例としては、抗原に対する抗体、基質又は補酵素に対する酵素、ホルモンに対するレセプタ、抗体に対するプロテインＡ又はプロテインＧ、ビオチンに対するアビジン類、カルシウムに対するカルモジュリン、糖に対するレクチン、６×ヒスチジン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼなどのペプチドタグに対するニッケル－ニトリロ三酢酸及びグルタチオンなどのタグ結合物質等が挙げられる。
　なお、未結合粒子１２とは、複合体粒子１３を形成していない特異的結合物質１２ｂで修飾された誘電体粒子１２ａである。つまり、未結合粒子１２は、被検出物質１１に結合していない特異的結合物質１２ｂで修飾された誘電体粒子１２ａである。未結合粒子１２は、フリー（Ｆ）成分とも呼ばれる。一方、複合体粒子１３に含まれる誘電体粒子１２ａは、バインド（Ｂ）成分とも呼ばれる。
　夾雑物１４とは、検出系内（ここでは試料１０内）に混入された塵埃等の粒子、及び計数装置１００を構成する構成物の破損片粒子等である。
　図１１の（ａ）に示すように、例えばウイルス粒子などの被検出物質１１と、特異的結合物質１２ｂとして抗ウイルス抗体が修飾された誘電体粒子１２ａ（未結合粒子１２）と、夾雑物１４とが含まれた試料１０中を準備する。試料１０中では液体中での拡散及び衝突によって、図１１の（ｂ）に示すように、被検出物質１１と未結合粒子１２とが複合体粒子１３を形成する。このとき、未結合の被検出物質１１が残留しないよう、未結合粒子１２を多分に添加しておく。このため、図中に示すように、未結合粒子１２が余剰に存在する状態となる。
　ここで、複合体粒子１３に正の誘電泳動及び負の誘電泳動の一方が作用し、未結合粒子１２及び夾雑物１４に正の誘電泳動及び負の誘電泳動の他方が作用するように、計数装置１００の動作条件が設定されると、複合体粒子１３とその他の粒子とが異なるクラスタを形成して凝集される。動作条件は、電極セットに印加される交流電圧及び試料１０の溶媒における導電率等によって設定され、例えば、上記の複合体粒子１３が上記の粒子１５に対応し、その他の粒子が上記の粒子１５ａに対応する動作条件が用いられる。このようにして、本例では、複合体粒子１３と、その他の粒子とを、互いに異なる位置に凝集させた後、拡散によって各々を正確に計数することで、試料１０に含まれる粒子のうちの所定の検出対象である被検出物質１１を選択的かつ正確に計数することができる。
　（その他の実施の形態）
　以上、本開示の１つまたは複数の態様に係る計数装置及び計数方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものも、本開示の１つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
　例えば、上記実施の形態において、第１基板上の電極セットの配置を、第１凸部と第２凸部とが対向し、第１凹部と第２凹部とが対向する配置としたが、電極セットの配置はこれに限定されない。例えば、第１凸部と第２凹部とが対向し、第１凹部と第２凸部とが対向する配置としてもよい。電極セットの配置、ならびに、第１電極及び第２電極の形状の設計により、各種の計数に適した電場勾配を形成するように電極セットを構成してもよい。
　電極セットに含まれる電極の数は、２つに限定されず、３つ以上であってもよい。例えば、図４に示した電極セットは、上記したように図中の第１電極の他に、紙面上下方向の両方において図の外側に配置された第２電極を含む。このような電極セットは、３つ以上の電極を含み、隣り合う電極に印加される交流電圧に位相差が設けられている。なお、このような電極セットは、Ｃａｓｔｅｌｌａｔｅｄ電極と呼ばれる場合がある。
　なお、上記に説明した第１方向の誘電泳動力から第２方向の誘電泳動力に変化させるための方法を複数組み合わせて、より効果的に凝集された粒子を拡散させてもよい。
　計数装置１００は、第１の電極セット１１１１に加えて、さらに、第２の電極セット１８１１を備えてもよい。図１２は、実施の形態の変形例に係る第１の電極セットと第２の電極セットを含む回路図である。
　第１電極セット１１１１は第１電極１１１２と第２電極１１１３を含む。第２電極セット１８１１は第３電極１８１２と第４電極１８１３を含む。
　凝集ステップで、制御部は、スイッチ１９０１に電圧源１２０と第１電極１１１２を接続すること、及び、スイッチ１９０２に電圧源１２０と第２電極１１１３を接続することを指示し、電源１２０に第１周波数の交流電圧を発生せることを指示する。これにより、凝集ステップで、粒子１５に第１方向の誘電泳動力が作用する。
　拡散ステップで、制御部は、スイッチ１９０１に電圧源１２０と第３電極１８１２を接続すること、及び、スイッチ１９０２に電圧源１２０と第４電極１８１３を接続することを指示し、電源１２０に第２周波数の交流電圧を発生せることを指示する。これにより、拡散ステップで、粒子１５に第２方向の誘電泳動力が作用する。
　誘電体粒子を計数する計数装置として利用することができる。
　　１０　試料
　　１１　被検出物質
　　１２　未結合粒子
　　１２ａ　誘電体粒子
　　１２ｂ　特異的結合物質
　　１３　複合体粒子
　　１４　夾雑物
　　１５、１５ａ　粒子
　　１００　計数装置
　　１１０　収容部
　　１１１　第１基板
　　１１２　スペーサ
　　１１３　第２基板
　　１２０　電源
　　１３０　光源
　　１３１　照射光
　　１３２　検出光
　　１４０　撮像素子
　　１４１　カメラ
　　１５０　計数部
　１１１１　電極セット
　１１１２　第１電極
　１１１２ａ　第１基部
　１１１２ｂ　第１凸部
　１１１２ｃ　第１凹部
　１１１３　第２電極
　１１１３ａ　第２基部
　１１１３ｂ　第２凸部
　１１１３ｃ　第２凹部
　１１２１　空間
　１１３１　供給孔
　１１３２　排出孔
　　ＣＬａ　第１クラスタ
　　ＣＬｂ　第２クラスタ
　　ＣＬｃ　第３クラスタ

Claims (11)

  1. 　第１方向の誘電泳動力を作用させて、試料中の粒子を凝集させる凝集ステップと、
    　前記第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる拡散ステップと、
    　前記拡散された粒子を含む拡散画像を撮像する撮像ステップと、
    　前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数ステップと、を含む
    　計数方法。
  2. 　前記凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間に第１周波数の交流電圧を印加し、
    　前記拡散ステップでは、前記電極セットの間に前記第１周波数とは異なる第２周波数の交流電圧を印加する
    　請求項１に記載の計数方法。
  3. 　前記凝集ステップでは、誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する第１の電極セットの間に第１周波数の交流電圧を印加し、
    　前記拡散ステップでは、前記第１の電極セットとは異なる第２の電極セットの間に前記第１周波数とは異なる第２周波数の交流電圧を印加する
    　請求項１に記載の計数方法。
  4. 　前記拡散ステップでは、前記凝集ステップにおける第１方向の誘電泳動力よりも大きい第２方向の誘電泳動力を作用させる
    　請求項３に記載の計数方法。
  5. 　前記第１周波数の交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、
    　前記第２周波数の交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用される
    　請求項２または３に記載の計数方法。
  6. 　誘電泳動力を作用させるための電場勾配を発生する電極セットの間には、
    　前記凝集ステップにおいて、第１導電率の環境中で交流電圧が印加され、
    　前記拡散ステップにおいて、前記第１導電率とは異なる第２導電率の環境中で交流電圧が印加される
    　請求項１～５のいずれか一項に記載の計数方法。
  7. 　前記第１導電率の環境中での交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の一方が作用され、
    　前記第２導電率の環境中での交流電圧の印加では、前記粒子に正の誘電泳動力及び負の誘電泳動力の他方が作用される
    　請求項６に記載の計数方法。
  8. 　さらに、
    　前記凝集ステップ以降、かつ、前記拡散ステップよりも前に、凝集された前記粒子を含む凝集画像を撮像する前撮像ステップと、
    　撮像された前記凝集画像及び前記拡散画像に基づいて前記凝集画像に含まれる前記粒子を追跡する追跡ステップと、を含む
    　請求項１～７のいずれか一項に記載の計数方法。
  9. 前記追跡ステップでは、前記拡散ステップにおいて拡散された前記粒子を、前記凝集ステップにおいて第１位置に凝集した前記粒子、又は、前記第１位置とは異なる第２位置に凝集した前記粒子のいずれであるかを特定する
    　請求項８に記載の計数方法。
  10. 　前記計数ステップでは、前記凝集画像及び前記拡散画像に基づいて、前記粒子のうち、所定の検出対象である被検出物質を含む粒子を選択的に計数する
    　請求項８又は９に記載の計数方法。
  11. 　粒子を含む試料を収容する収容部と、
    　前記収容部に収容された前記試料に対して電場勾配を発生する電場勾配発生部と、
    　前記電場勾配発生部を制御することで、発生する前記電場勾配により、前記粒子に第１方向の誘電泳動力を作用させて前記粒子を凝集させ、凝集された前記粒子に前記第１方向の誘電泳動力とは異なる第２方向の誘電泳動力を作用させて、凝集された前記粒子を拡散させる制御部と、
    　拡散された前記粒子を含む拡散画像を撮像する撮像部と、
    　撮像された前記拡散画像に基づいて前記粒子の数を決定する計数部と、を備える
    　計数装置。
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