CN115461607A - 计数方法以及计数装置 - Google Patents

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Abstract

一种计数方法，包括：凝集步骤(S110)，使第1方向的介电电泳力起作用来使试样(10)中的粒子(15)凝集；扩散步骤(S120)，使与第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力起作用来使所凝集了的粒子(15)扩散；拍摄步骤(S130)，拍摄包含所扩散了的粒子(15)的扩散图像；以及计数步骤(140)，基于所拍摄到的扩散图像来决定粒子(15)的数量。

Description

计数方法以及计数装置
技术领域
本公开涉及用于对试样中所包含的粒子进行计数的计数方法以及计数装置。
背景技术
以往以来，已知一种计数方法，通过介电电泳(介电泳)捕集试样液中的电介质粒子，对拍摄捕集到该电介质粒子的部位而得到的图像进行解析，由此，对试样液中所包含的电介质粒子进行计数(参照专利文献1)。
现有技术文献
专利文献1:日本特开2017－70281号公报
发明内容
然而，在专利文献1所公开的计数方法中，有时在试样中存在大量的电介质粒子的情况下会产生假阴性而无法进行准确的计数。
于是，本公开提供能够减少假阴性的产生、更准确地进行粒子的计数的计数方法等。
本公开的一个技术方案涉及的计数方法包括：凝集步骤，使第1方向的介电电泳力起作用来使试样中的粒子凝集；扩散步骤，使与所述第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力起作用来使所凝集了的所述粒子扩散；拍摄步骤，拍摄包含所述扩散了的粒子的扩散图像；以及计数步骤，基于所述扩散图像来决定所述粒子的数量。
本公开的一个技术方案涉及的计数装置具备：容纳部，其容纳包含粒子的试样；电场梯度产生部，其对容纳于所述容纳部的所述试样产生电场梯度；控制部，其通过对所述电场梯度产生部进行控制，从而通过所产生的所述电场梯度，使第1方向的介电电泳力作用于所述粒子来使所述粒子凝集，使与所述第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力作用于所凝集了的所述粒子而使所凝集了的所述粒子扩散；拍摄部，其拍摄包含所扩散了的所述粒子的扩散图像；以及计数部，其基于所拍摄到的所述扩散图像来决定所述粒子的数量。
此外，这些总括性的或者具体性的技术方案既可以由系统、装置、集成电路、计算机程序或者计算机能够读取的CD－ROM等的记录介质来实现，也可以由方法、装置、系统、方法、集成电路、计算机程序以及记录介质的任意组合来实现。计算机能够读取的记录介质例如包括CD－ROM(Compact Disc－Read Only Memory，光盘只读存储器)等的非易失性的记录介质。
根据本公开的计数方法等，能够进行更准确的粒子的计数。
附图说明
图1是表示实施方式涉及的计数装置的概略构成的立体图。
图2是表示实施方式涉及的计数装置的概略构成的剖视图。
图3是表示实施方式涉及的电极组的结构的俯视图。
图4是对实施方式涉及的粒子的凝集和扩散进行说明的图。
图5是对实施方式涉及的介电电泳力的变化进行说明的第1图。
图6是对实施方式涉及的介电电泳力的变化进行说明的第2图。
图7是表示实施方式涉及的计数方法的流程图。
图8是表示实施方式的变形例涉及的计数方法的流程图。
图9是表示实施方式的变形例涉及的凝集图像和扩散图像的图。
图10是表示实施方式的变形例涉及的追踪步骤的图。
图11是表示实施方式的变形例涉及的复合体的形成过程的图。
图12是实施方式的变形例涉及的包括第1电极组和第2电极组的电路图。
具体实施方式
(得到公开的过程)
作为用于对试样中(以下也称为试样液中)所包含的粒子进行计数的计数方法，已知利用了介电电泳的技术。例如，专利文献1公开了通过介电电泳对作为计数对象的粒子的电介质粒子进行计数的计数方法。具体而言，在专利文献1中，通过介电电泳在多个缝隙区域的各个缝隙区域捕集电介质粒子，对多个缝隙区域中的因电介质粒子而饱和了的缝隙区域的数量进行计数，由此，对试样液中所包含的电介质粒子进行计数。
一般而言，介电电泳是如上述那样使得在预定部位捕集电介质粒子(换言之使之凝集)的技术，能够使电介质粒子向该预定部位进行移动。因此，在试样中存在大量的电介质粒子的情况下，大量的电介质粒子凝集于预定部位而以三维的方式集聚。也即是，在由拍摄装置等从一个方向拍摄到的图像中，难以对伴随着集聚的电介质粒子彼此的重合进行识别，只能够计数出比实际所包含的数量少的数量，会产生所谓的假阴性。
根据这样的背景，在如上述专利文献1等中所知那样的现有的计数方法中，难以进行电介质粒子的准确计数。
于是，在本公开涉及的计数方法等中，通过使第2介电电泳(也即是第2方向的介电电泳力)作用于通过第1介电电泳(也即是第1方向的介电电泳力)的作用而凝集了的粒子，从而使基于第1方向的介电电泳的凝集进行扩散。由此，根据本公开涉及的计数方法等，能够在粒子彼此的重合的影响降低了的状态下进行粒子的计数，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能更准确地对粒子进行计数。
(公开的概要)
本公开的一个技术方案涉及的计数方法包括：凝集步骤，使第1方向的介电电泳力起作用来使试样中的粒子凝集；扩散步骤，使与第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力起作用来使凝集了的粒子扩散；拍摄步骤，拍摄包含扩散了的粒子的扩散图像；以及计数步骤，基于所拍摄到的扩散图像来决定粒子的数量。
在这样的计数方法中，使通过第1方向的介电电泳力凝集了的粒子通过不同的第2方向的介电电泳力进行扩散。也即是，能够抑制粒子彼此因凝集而重合、因此两个粒子视为一个等的假阴性的产生。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够更准确地对粒子进行计数。
例如也可以为：在凝集步骤中，在产生用于使介电电泳力起作用的电场梯度的电极组之间施加第1频率的交流电压，在扩散步骤中，在电极组之间施加与第1频率不同的第2频率的交流电压。
由此，在本公开的计数方法中，能够通过施加于电极组之间的交流电压的频率来对介电电泳力的方向进行调整。这样，能够通过频率的调整来使介电电泳力的方向变化，使所凝集了的粒子扩散。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够更准确地对粒子进行计数。
例如也可以为：在凝集步骤中，在产生用于使介电电泳力起作用的电场梯度的第1电极组之间施加第1频率的交流电压，在扩散步骤中，在与第1电极组不同的第2电极组之间施加与第1频率不同的第2频率的交流电压。
由此，在本公开的计数方法中，能够通过施加于第1电极组和第2电极组各自的交流电压的频率来对介电电泳力的方向进行调整。这样，能够通过施加于两个电极组的频率的调整来使介电电泳力的方向变化，使粒子凝集以及扩散。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够更准确地对粒子进行计数。
例如也可以为：在扩散步骤中，使比凝集步骤中的第1方向的介电电泳力大的第2方向的介电电泳力起作用。
由此，在本公开的计数方法中，能够与凝集步骤相比、在扩散步骤中使更大的介电电泳力起作用，能够更切实地使所凝集了的粒子进行扩散。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够更准确地对粒子进行计数。
例如也可以为：在第1频率的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的一方作用于粒子，在第2频率的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的另一方作用于粒子。
由此，能够通过施加于电极组之间的交流电压的频率来对正的介电电泳力和负的介电电泳力中的哪个起作用进行调整。这样，能够通过频率的调整来使介电电泳力的方向变化，使所凝集了的粒子进行扩散。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够更准确地对粒子进行计数。
例如也可以为：在产生用于使介电电泳力起作用的电场梯度的电极组之间，在凝集步骤中，在第1电导率的环境中施加交流电压，在扩散步骤中，在与第1电导率不同的第2电导率的环境中施加交流电压。
由此，在本公开的计数方法中，能够通过粒子周围的环境中的电导率来对介电电泳力的方向进行调整。这样，能够通过电导率的调整来使介电电泳力的方向变化，使所凝集了的粒子扩散。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够更准确地对粒子进行计数。
例如也可以为：在第1电导率的环境中的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的一方作用于粒子，在第2电导率的环境中的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的另一方作用于粒子。
由此，能够通过粒子周围的环境中的电导率来对正的介电电泳力和负的介电电泳力中的哪个起作用进行调整。这样，能够通过电导率的调整来使介电电泳力的方向变化，使所凝集了的粒子扩散。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能更准确地对粒子进行计数。
例如也可以还包括：前拍摄步骤，在凝集步骤以后且扩散步骤之前，拍摄包含所凝集了的粒子的凝集图像；和追踪步骤，基于所拍摄到的凝集图像和扩散图像，对凝集图像所包含的粒子进行追踪。
由此，在本公开的计数方法中，能基于粒子扩散前后的凝集图像和扩散图像来进行粒子的计数。例如在扩散的过程中行进在不同的轨迹上的粒子彼此偶发地重合的情况下，能够基于不同的轨迹来单独地对粒子彼此进行计数。由此，在本公开的计数方法中，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够更准确地对粒子进行计数。
例如在追踪步骤中，也可以确定在扩散步骤中进行了扩散的粒子是在凝集步骤中凝集于了第1位置的粒子和凝集于了与第1位置不同的第2位置的粒子中的哪种粒子。
由此，在本公开的计数方法中，能够按位置来单独地对分别凝集于了第1位置和第2位置的粒子进行计数。例如在第1位置和第2位置为通过正的介电电泳和负的介电电泳各自所凝集的位置的情况下，能够同时且准确地对因这些不同的介电电泳的作用而凝集了的粒子进行计数。由此，在本公开的计数方法中，关于多个位置的各个位置，能减少伴随着凝集的假阴性的产生，能够同时且更准确地对粒子进行计数。
例如在计数步骤中，也可以基于凝集图像和扩散图像，选择性地对粒子中的、包含作为预定的检测对象的被检测物质的粒子进行计数。
由此，能够从包含多种粒子的试样选择性地对特定粒子进行计数。
本公开的一个技术方案涉及的计数装置具备：容纳部，其容纳包含粒子的试样；电场梯度产生部，其对容纳于容纳部的试样产生电场梯度；控制部，其通过对电场梯度产生部进行控制，从而通过所产生的电场梯度，使第1方向的介电电泳力作用于粒子而使粒子凝集，使与第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力作用于凝集了的粒子而使凝集了的粒子扩散；拍摄部，其拍摄包含扩散了的粒子的扩散图像；以及计数部，其基于所拍摄到的扩散图像来决定粒子的数量。
由此，实现能获得与上述的计数方法同样的效果的计数装置。
此外，这些总括性的或者具体性的技术方案既可以由系统、装置、集成电路、计算机程序或者计算机能够读取的CD－ROM等的记录介质来实现，也可以由系统、方法、集成电路、计算机程序以及记录介质的任意组合来实现。
以下，参照附图对实施方式进行具体的说明。
此外，以下说明的实施方式均是表示总括性的或者具体的例。以下的实施方式中所示的数值、形状、材料、构成要素、构成要素的配置位置以及连接方式、步骤、步骤的顺序等是一个例子，不是意在限定要求保护的范围。各图并不一定是严密地进行图示的。在各图中，对于实质上相同的结构赋予相同的标号，有时省略或者简化重复的说明。
以下，平行和垂直等的表示要素间的关系性的术语、矩形形状等的表示要素的形状的术语以及数值范围并不是仅表示严格的含义，而是意味着也包括实质上同等的范围、例如百分之几左右的差异。
以下，所谓对粒子进行计数，除了基于是1个以上、还是0个的判定来发现试样中的粒子而确认粒子的存在之外，还包括测定粒子的量(例如数量或者浓度等)或者其范围。同样地，所谓对被检测物质进行计数，除了基于是1个以上、还是0个的判定来发现试样中的被检测物质而确认被检测物质的存在之外，还包括测定被检测物质的量(例如数量或者浓度等)或者其范围。成为计数的对象的粒子既可以是试样中所包含的全部粒子，也可以是试样中所包含的多个粒子中的一部分。
所谓通过第2方向的介电电泳力而粒子扩散是以下概念，包括：只是使得从通过第1方向的介电电泳力而粒子所凝集了的位置起在放射状的第2方向上扩散；和使粒子凝集于与通过第1方向的介电电泳力而粒子所凝集了的位置不同的位置来使得从原来的位置进行扩散。
(实施方式)
在本实施方式中，在液体中，粒子通过介电电泳(DEP：Dielectrophoresis)而凝集，进一步使所凝集了的粒子进行扩散，由此，对伴随着凝集的粒子彼此的重合进行抑制来进行该粒子的计数。
介电电泳是指力作用于暴露在了不均匀的电场(以下也称为电场梯度)中的电介质粒子的现象。该力不要求粒子带电。
以下，参照附图对实现使用了介电电泳的被检测物质粒子的计数的计数装置和计数方法的实施方式进行具体的说明。
[计数装置的构成]
首先，参照图1和图2对计数装置的构成进行说明。图1是表示实施方式涉及的计数装置的概略构成的立体图。图2是表示实施方式涉及的计数装置的概略构成的剖视图。在图1中，对于容纳部110，特别地示出了通过透过除了第1基板111之外的部分而容纳部110的内部可见那样的概况。图1被用于以容纳部110为中心来对与其他构成要素的关系性进行说明，并不限定使用计数装置100时的各个构成要素的配置位置、配置方向、姿势等。图2是沿着与纸面平行的方向将图1所示的容纳部110剖截而得到的剖视图，此外，在图1中省略了图2所示的容纳部110的一部分结构的厚度的图示。
如图1和图2所示，计数装置100具备容纳部110、电源120、光源130、拍摄元件140以及计数部150。
容纳部110是容纳包含粒子15的试样10的容器，在内部具有空间1121。试样10被容纳于该空间1121。在空间1121内，介电电泳作用于空间1121所容纳的试样10，在试样10中包含了粒子15的情况下，粒子15因介电电泳的作用而移动。这样，设置在容纳部110内的空间1121形成计数装置100中的介电电泳的场。
在此，粒子15是指如上所述呈现介电性的粒形的物质，除了聚苯乙烯珠和玻璃珠等的单原料物质之外，为对这些珠附加了功能性物质的复合物质以及在宏观上可以视为电介质粒子的活细胞等。对于粒子15，根据计数装置100的用途来适当地进行决定，根据粒子15的物性等来设定介电电泳时的各条件。在以下的说明中，设为粒子15是聚苯乙烯珠来进行说明，但如上述的那样，不特别地关于粒子15的结构和尺寸进行限定。可以将各种各样的粒子15作为计数对象来应用计数装置100。
在此，对容纳部110的内部结构进行说明。如图2所示，容纳部110具备第1基板111、间隔物112以及第2基板113。
第1基板111例如为玻璃或者树脂制的片。第1基板111具有对空间1121的底进行规定的上表面，在该上表面形成有被从电源120施加交流电压的电极组1111。电极组1111与空间1121相接地形成，以使得在空间1121中容纳了试样10时，试样10与电极组1111电接触。
具体而言，电极组1111包括第1电极1112和第2电极1113。通过从电源对于电极组1111所施加的交流电压，电极组1111能够在第1基板111上生成(产生或者形成)不均匀的电场(电场梯度)。这样，电极组1111是电场梯度产生部的一个例子。此外，关于电极组1111的详细情况，将使用图3来在后面进行描述。
间隔物112配置在第1基板111上。在间隔物112形成有与空间1121的形状对应的贯通孔。空间1121通过由第1基板111和第2基板113夹着的贯通孔来形成。也即是，间隔物112为将贯通孔包围的外壁，具有对空间1121进行规定的内侧面。间隔物112例如由与第1基板111以及第2基板113的紧贴性高的树脂等的材料来形成。
第2基板113例如为玻璃或者树脂制的透明片，被配置在间隔物112上。例如，作为第2基板113，可以使用聚碳酸酯基板。在第2基板113形成有与空间1121相连的供给孔1131和排出孔1132。试样10经由供给孔1131而被供给至空间1121，经由排出孔1132而被从空间1121排出。此外，也可以不具备第2基板113而构成容纳部110。也即是，第2基板113不是必需的构成要素。在该情况下，用于容纳部110作为容器来成立的空间1121仅由分别规定底和内侧面的第1基板111和间隔物112来形成。
电源120为交流电源，对第1基板111的电极组1111施加交流电压。
此外，电源120只要能够供给交流电压，则也可以是任何电源，不限定于如上述描述那样的特定电源。交流电压也可以从外部电源进行供给，在该情况下，电源120也可以不包含于计数装置100。以下，省略电源120的内部结构来简化地进行图示。
光源130对空间1121内的试样10进行照射光131的照射。照射光131经由第2基板113而被照射到试样10中的粒子15。从粒子15产生与照射光131相应的检测光132，通过对该检测光132进行检测，进行粒子15的检测。例如，也可以照射对特定的荧光物质进行激励的激励光来作为照射光131。若在形成粒子15的聚苯乙烯中分散有荧光物质，则会根据所被照射的激励光来产生荧光，通过对该荧光进行检测，能够检测荧光物质的存在、即粒子15的存在。
作为光源130，可以不特别限定地利用公知技术。例如可以使用半导体激光器、气体激光器等的激光器来作为光源130。作为从光源130照射的照射光131的波长，也可以使用与构成粒子15的物质的相互作用小的波长(例如400nm～2000nm)。进一步，作为照射光131的波长，也可以使用半导体激光器能够利用的波长(例如600nm～850nm)。
此外，光源130也可以不包含于计数装置100。例如，在粒子15大的情况下，也可以在粒子15中不包含荧光物质。在该情况下，也可以不对粒子15照射激励光，因此，可以利用从太阳和荧光灯等照射的外部光来作为照射光131，可以不具备光源130而实现计数装置100。
拍摄元件140是内置于相机141的CMOS图像传感器和CCD图像传感器等，通过对从粒子15产生的检测光132进行检测，生成包含粒子15的图像。拍摄元件140以与第1基板111的板面水平的方式配置，经由相机141所包括的透镜等的光学元件(未图示)，对与电极组1111对应的部位进行拍摄。若在该部位存在粒子15，则由照射光131产生的检测光132会入射到拍摄元件140，粒子15被检测出。
计数部150取得由拍摄元件140输出的图像，基于该图像来决定试样10中所包含的粒子15的数量。例如，计数部150使用预先拍摄到的不包含粒子15的对照图像，通过所取得的图像与对照图像的比较，对亮度值不同的亮点进行检测。具体而言，在检测发光来作为检测光132的情况下，将相对于对照图像而言、所取得的图像中的亮度值高的点检测为亮点即可，在检测透射光和散射光来作为检测光132的情况下，将相对于对照图像而言、所取得的图像中的亮度值低的点检测为亮点即可。这样，能够得到试样10中的粒子15的计数结果。
计数部150例如通过使用处理器等的电路和存储器等的存储装置并执行用于上述图像解析的程序来加以实现，但也可以由专用电路来实现。
[电极组的形状和配置]
接着，参照图3对第1基板111上的电极组1111的形状和配置进行说明。图3是表示实施方式涉及的电极组的结构的俯视图。在图3中示出了从拍摄元件140侧进行了俯视的情况下的电极组1111的结构。此外，在图3中，为了简化，示出了表示电极组1111的一部分的概略结构图。
如图3所示，电极组1111具有第1电极1112和第2电极1113。第1电极1112和第2电极1113各自与电源120电连接。
第1电极1112具有在第1方向(图3的纸面左右方向)上延伸的第1基部1112a和在与第1方向交叉的第2方向(图3的纸面上下方向)上从第1基部1112a突出的两个第1凸部1112b。在两个第1凸部1112b之间形成有第1凹部1112c。两个第1凸部1112b和第1凹部1112c各自的第1方向上的长度和第2方向上的长度例如均大约为5微米。此外，两个第1凸部1112b和第1凹部1112c的尺寸不限定于此。
第2电极1113的形状以及尺寸与第1电极1112的形状以及尺寸实质上相同。也即是，第2电极1113也具备在第1方向(图3的纸面左右方向)上延伸的第2基部1113a和在与第1方向交叉的第2方向(图3的纸面上下方向)上从第2基部1113a突出的两个第2凸部1113b。在两个第2凸部1113b之间形成有第2凹部1113c。两个第2凸部1113b与第1电极1112的两个第1凸部1112b相对向地配置。
也即是，第1电极1112具有在与第1方向交叉且朝向第2电极1113变为凸的方向上从第1基部1112a突出的第1凸部1112b。第2电极1113具有在与第1方向交叉且朝向第1电极1112变为凸的方向上从第2基部1113a突出的第2凸部1113b。
第1凸部1112b和第2凸部1113b形成为，使得第1电极1112和第2电极1113之间的距离根据第1方向上的位置而不同。通过第1电极1112和第2电极1113之间的距离不同，在向电极组1111施加了交流电压时，形成电场强度根据位置而不同的电场梯度、即不均匀的电场。也即是，在电极组1111形成有至少一处的电极间距离不同的部位即可。例如，电极组1111也可以为如下结构：在第1电极1112和第2电极1113中的一方形成有凸部，在第1电极1112和第2电极1113中的另一方不形成凸部。即使只存在一个凸部也能够实现上述目的，因此，能够由至少具有一个凸部的第1电极1112或者第2电极1113实现电极组1111。
此外，电极组1111的位置不限定于第1基板111上。电极组1111也可以不与试样10接触而配置在空间1121的附近。在此，空间1121的附近意味着：能够通过施加于电极组1111的交流电压来在试样10内形成电场梯度的范围。
通过上述电极组1111的结构来形成电场梯度，当试样10中的粒子15暴露于该电场时，粒子15通过介电电泳而凝集于预定部位。在介电电泳中，在形成了电场梯度时，根据是正的介电电泳作用于粒子15、还是负的介电电泳作用于粒子15，粒子15所凝集的预定部位不同。
更具体而言，在正的介电电泳作用于粒子15的情况下，粒子15向电场强度高的区域移动而凝集。电场强度高的区域是包含第1电极1112和第2电极1113之间的距离因第1凸部1112b和第2凸部1113b而成为最短的位置的区域，在图中例如为由虚线圆表示的第1电场区域A。另一方面，在负的介电电泳作用于粒子15的情况下，粒子15向电场强度低的区域移动而凝集。电场强度低的区域为包含第1电极1112和第2电极1113之间的距离因第1凸部1112b和第2凸部1113b而成为最远的位置的区域。更详细而言，电场强度低的区域为第1凹部1112c和第2凹部1113c之间的区域，特别是，距第1电场区域A越远，电场强度越低。也即是，在图中例如被作用了负的介电电泳的粒子15凝集于由虚线圆表示的第2电场区域B。
图4是对实施方式涉及的粒子的凝集和扩散进行说明的图。图4的(a)是表示通过第1介电电泳而凝集了的粒子15的图。图4的(b)是表示通过第2介电电泳而扩散了的(换言之，通过第2方向的介电电泳力而凝集了的)粒子15的图。在图4中示出从与图3相同的方向观察到的第1电极1112和第2电极1113的图像，进一步，在图中，粒子15被作为黑点来进行了表示。此外，图中的第1电极1112在上下两方向上突出有第1凸部1112b。图中的第2电极1113在上下两方向上突出有第1凸部1112b。
如图4的(a)所示，粒子15的大半通过介电电泳而凝集在第1凸部1112b和第2凸部1113b之间。这是由于：通过对粒子15作用了正的介电电泳而粒子15移动并凝集于了电场强度高的区域。在试样10中存在大量的粒子15的情况下，如图所示，当使一个方向的介电电泳起作用时，会引起粒子15彼此重合、无法准确地进行计数。
在本实施方式中，如上所述，使与第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力作用于通过第1方向的介电电泳力而凝集了的粒子15，使所凝集了的粒子15进行扩散。如图4的(b)所示，粒子15通过因第2方向的介电电泳力而从最初的凝集位置进行扩散，从而成为最初的凝集位置处的重合得到了抑制的状态，能够进行更准确的计数。第1方向的介电电泳力和第2方向的介电电泳力，介电电泳力的方向不同。特别是在图4所示的例子中，通过从正的介电电泳力变化为负的介电电泳力，抑制了粒子15彼此的重合。
也即是，变化为方向不同的介电电泳力，包括从正的介电电泳力变化为方向不同的其他正的介电电泳力的情况、从负的介电电泳力变化为方向不同的其他负的介电电泳力的情况以及从正的介电电泳力和负的介电电泳力中的一方逆转为另一方的情况。首先，通过第1方向的介电电泳力，使粒子15凝集于电场强度高或者低的预定的电场区域，通过凝集位置不同的第2方向的介电电泳力使不同的凝集力起作用，使粒子15从预定的电场区域进行扩散。本实施方式的计数装置100能够通过这样的方法来进行粒子15的准确计数。
[从第1方向的介电电泳力向第2方向的介电电泳力的变化]
第1方向的介电电泳力和第2方向的介电电泳力，如上述那样，介电电泳力的方向不同。因此，为了使得从第1方向的介电电泳力向第2方向的介电电泳力进行变化，需要对介电电泳力的方向进行切换。使用图5和图6对这样切换介电电泳力的方向的方法进行说明。
图5是对实施方式涉及的介电电泳力的变化进行说明的第1图。图6是对实施方式涉及的介电电泳力的变化进行说明的第2图。在此，作为切换介电电泳力的方向的方法，特别地对使介电电泳力的正负逆转的方法进行说明。
关于正的介电电泳力和负的介电电泳力中的哪个起作用，与粒子15和形成电场的液体的性质具有相关性，特别地通过克劳修斯-莫索蒂系数的实部(Real-part ofClausius-Mossotti factor，克劳修斯-莫索蒂因子的实部)来进行评价。若克劳修斯-莫索蒂系数的实部为正，则正的介电电泳力作用于粒子15，粒子15向电场强度更高的区域移动。相反地，若克劳修斯-莫索蒂系数的实部为负，则负的介电电泳力作用于粒子15，粒子15向电场强度更低的区域移动。
在图5和图6中示出了：对将克劳修斯-莫索蒂系数的实部作为了纵轴、将施加于电极组1111之间的交流电压的频率作为了横轴的情况下的各自的关系进行表示的曲线图。
如图5所示，例如可知：对于粒子15，在低频率区域的交流电压下，克劳修斯-莫索蒂系数的实部成为正值，在高频率区域的交流电压下，克劳修斯-莫索蒂系数的实部成为负值。因此，为了使介电电泳力的正负逆转，具有例如使施加于电极组1111之间的交流电压的频率变化的方法。
首先，为了使正的介电电泳力作为第1方向的介电电泳力起作用，在电极组1111之间施加克劳修斯-莫索蒂系数的实部成为正值的低频率区域的交流电压。粒子15因正的介电电泳力而凝集于电场强度高的区域。然后，为了使负的介电电泳力作为第2方向的介电电泳力起作用，在电极组1111之间施加克劳修斯-莫索蒂系数的实部成为负值的高频率区域的交流电压。粒子15因负的介电电泳力而向电场强度低的区域扩散。
具体而言，例如在使第1方向的介电电泳力起作用时，在电极组1111之间施加第1频率F1的交流电压来使粒子15凝集。然后，在使第2方向的介电电泳力起作用时，在电极组1111之间施加频率比第1频率F1大的第2频率F2的交流电压，由此使粒子15扩散。第1方向的介电电泳力和第2方向的介电电泳力也可以正和负对调。
为了这样使频率变化，电源120使所施加的交流电压变化。也即是，电源120为控制部的一个例子。控制部也可以是与电源分别地设置的装置，也可以通过对电源120发送控制信号来使从电源120施加的交流电压的频率变化。
如图6所示，为了使介电电泳力的正负逆转，具有例如使粒子15周围的环境中的电导率变化的方法。
首先，为了使正的介电电泳力作为第1方向的介电电泳力来起作用，在第1电导率S1的环境中，在电极组1111之间施加克劳修斯-莫索蒂系数的实部成为正值的预定频率F的交流电压。粒子15因正的介电电泳力而凝集于电场强度高的区域。然后，为了使负的介电电泳力作为第2方向的介电电泳力来起作用，在第2电导率S2的环境中，在电极组1111之间施加预定频率F的交流电压。粒子15因负的介电电泳力而向电场强度低的区域扩散。
具体而言，例如在使第1方向的介电电泳力起作用时，在第1电导率S1的环境中施加预定频率F的交流电压，在使第2方向的介电电泳力起作用时，在比第1电导率S1小的第2电导率S2的环境中施加预定频率F的交流电压。为了这样使电导率变化，要使电导度降低，因此，对构成试样10的溶剂的离子成分添加形成螯合沉淀的螯合剂。第1方向的介电电泳力和第2方向的介电电泳力也可以正和负对调。此时，为了使电导度上升，在试样10中添加包含离子的溶液或者盐即可。
这样，添加螯合剂或者、包含离子的溶液或盐的添加装置(未图示)使粒子15周围的环境中的电导率变化。也即是，添加装置为控制部的一个例子。控制部也可以为与添加装置分别地设置的装置，也可以通过对添加装置发送控制信号来使从添加装置添加螯合剂或者、包含离子的溶液或盐。
在从正的介电电泳力变化为方向不同的其他正的介电电泳力的情况下以及从负的介电电泳力变化为方向不同的其他负的介电电泳力的情况下，也可以例如在只是设置于互不相同的位置的电极组之间对交流电压的施加的接通(on)/断开(off)进行切换。进一步，在该情况下，也可以包括：第1方向的介电电泳力和第2方向的介电电泳力的方向一致、且粒子15所凝集的位置不同的情况。
如以上说明的那样，通过使第1方向的介电电泳力变化为介电电泳力的方向不同的第2方向的介电电泳力，所凝集了的粒子15进行扩散。第1方向的介电电泳力和第2方向的介电电泳力也可以介电电泳力的大小以及方向不同。
[使用了计数装置的计数方法]
参照图7对使用了如上所述那样构成的计数装置100的粒子15的计数方法进行说明。图7是表示实施方式涉及的计数方法的流程图。
首先，通过使正或者负的第1方向的介电电泳力作用于包含粒子15的试样10，粒子15凝集于预定位置(凝集步骤S110)。然后，通过使与第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力起作用，使所凝集了的粒子15扩散(扩散步骤S120)。具体而言，如上述说明的那样，使方向与在凝集步骤S110中起作用了的第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力起作用。通过之前为了粒子15的凝集而起作用了的力变化，由第1方向的介电电泳力实现的凝集发生变化，粒子15彼此的重合得到抑制。
接着，拍摄元件140接受检测光132，对图像进行拍摄(拍摄步骤S130)。此外，在拍摄步骤S130中拍摄的图像是包含扩散了的粒子15的扩散图像。计数部150通过使用该扩散图像来进行图像解析，从而决定试样10中的粒子15的数量(计数步骤S140)。如以上这样，能抑制由试样10中的粒子15彼此的重合导致的假阴性的产生，能够更准确地进行粒子15的计数。
[变形例]
以下，进一步参照图8～图11对本实施方式的变形例进行说明。此外，在以下的说明中，以与上述的实施方式的说明不同的点为中心来进行描述，省略或者简化重复的点。图8是表示实施方式的变形例涉及的计数方法的流程图。与上述实施方式的计数方法相比，图8所示的变形例涉及的计数方法在实施前拍摄步骤S115和追踪步骤S135这一点不同。
具体而言，在凝集步骤S110中试样10中的粒子15凝集了以后且实施扩散步骤S120之前，拍摄元件140接受检测光132，拍摄图像(前拍摄步骤S115)。此外，在前拍摄步骤S115中拍摄的图像是包含所凝集了的粒子15的凝集图像。图9是表示实施方式的变形例涉及的凝集图像和扩散图像的图。如图9的(a)所示，在本变形例的凝集图像中，通过正的介电电泳作为第1方向的介电电泳力来起作用，粒子15凝集在第1电极1112的第1凸部1112b和第2电极1113的第2凸部1113b之间。此时，在第1电极1112和第2电极1113形成有多个第1凸部1112b和第2凸部1113b的情况下，如图中那样，粒子15凝集于多个第1凸部1112b和第2凸部1113b之间的各自而形成群。例如在图中，在3个第1凸部1112b和3个第2凸部1113b之间分别形成了第1群CLa、第2群CLb以及第3群CLc。
通过粒子15这样分群来凝集，与粒子15凝集于一个部位的情况相比，能够使粒子15彼此的重合减少。也即是，能够抑制假阴性的产生，能够进行更准确的粒子的计数。以上的说明在正的介电电泳作为第1方向的介电电泳力来起作用的情况下也是同样的。
在本变形例中，通过第2方向的介电电泳力使粒子15扩散，对图9的(b)所示的扩散图像进行拍摄(扩散步骤S120和拍摄步骤S130)。进一步，计数部150取得如上所述那样所输出的凝集图像和扩散图像，基于这些图像来对凝集图像所包含的粒子15进行追踪(追踪步骤S135)。在追踪步骤S135中，能够确定：在扩散步骤S120中进行了扩散的粒子15是在凝集步骤S110中凝集于了第1位置的第1群CLa所包含的粒子15、凝集于了第2位置的第2群CLb所包含的粒子15以及凝集于了第3位置的第3群CLc所包含的粒子15中的哪种粒子。
图10是表示实施方式的变形例涉及的追踪步骤的图。在图中示出了从与图3相同的视点观察到的电极组1111的俯视图和在该俯视图上放大第1群CLa而得到的放大图。在图中，从纸面左到纸面右示出了按照时间序列取得的图像，左侧的图像为凝集图像，中央和右侧的图像为扩散图像。在此，以第1群CLa为一个例子来进行说明，但关于第2群CLb、第3群CLc以及其他群也是同样的。计数部150在追踪步骤S135中如以下那样进行动作。
首先，在凝集图像中，对粒子15的亮点或者包含粒子15的群的亮点进行检测。这些亮点通过如上所述确定相对于对照图像的亮度值之差成为阈值以上的像素来进行检测。在此，有时粒子15会重合，因此，无法单独地对各个粒子15进行检测也可以。
接着，在扩散图像中对粒子15的亮点进行检测。在相对于凝集图像而言的扩散后的扩散图像中，能够大致单独地检测粒子15。特别是，通过将从扩散开始到取得扩散图像为止的时间设定为足够长，粒子15的检测性提高。但是，当从扩散开始到取得扩散图像为止的时间被设定为过度地长时，有时会无法对来自不同的群的粒子15彼此进行识别，无法进行粒子15的追踪。粒子15的扩散速度依赖于粒子15的性质，因此，也可以通过预备实验等来预先设定从扩散开始到取得扩散图像为止的适当的时间。此外，通过拍摄元件140输出连续地取得了图像而得到的动态图像，计数部150也可以提取粒子15适当地扩散了的定时的扩散图像来进行粒子15的追踪和计数。
计数部150对于在扩散图像中检测到的粒子15的亮点，使用模式匹配等的算法来推定移动矢量，确定各个粒子15是从哪个群进行了扩散的。由此，能够按群来对各群原本所包含了的粒子15的数量进行计数。特别是，如图中所示，在多个群中混合存在通过负的介电电泳凝集了的粒子15a的群和通过正的介电电泳凝集了的粒子15的群的状况下，能同时且分别单独地进行准确的计数。
作为以上说明的变形例涉及的计数方法的应用的一个例子，参照图11来进行说明。图11是表示实施方式的变形例涉及的复合体的形成过程的图。在本例子中，设为上述粒子15各自为复合体粒子13、上述粒子15a各自为未结合粒子12或者夹杂物14，来进行说明。也可以是：上述粒子15各自为未结合粒子12或者夹杂物14，上述粒子15a各自为复合体粒子13。
在本例子中，将被检测物质11的计数作为目的，进行使用了上述计数装置100的粒子的计数。也即是，选择性地对试样10中的粒子中的、包含作为预定的检测对象的被检测物质的粒子进行计数。
复合体粒子13是被检测物质11和由具有与被检测物质11特异性地结合的性质的物质(以下称为特异性结合物质12b)进行了修饰的电介质粒子12a的结合体。也即是，在复合体粒子13中，被检测物质11和电介质粒子12a经由特异性结合物质12b而相结合。电介质粒子12a是与上述粒子15同样的构成。
特异性结合物质12b是指能够与被检测物质11特异性地结合的物质。作为相对于被检测物质11的特异性结合物质12b的组合的例子，可举出相对于抗原的抗体、相对于基质或者辅酶的酶、相对于荷尔蒙的受体、相对于抗体的蛋白质A或者蛋白质G、相对于生物素的抗生物素蛋白类、相对于钙的钙调蛋白、相对于糖的凝集素、相对于6×组氨酸和谷胱甘肽S转移酶等的肽标签的镍－次氮基三乙酸及谷胱甘肽等的标签结合物质等。
此外，未结合粒子12是指未形成复合体粒子13的由特异性结合物质12b进行了修饰的电介质粒子12a。也即是，未结合粒子12是未与被检测物质11结合的由特异性结合物质12b进行了修饰的电介质粒子12a。未结合粒子12也被称为自由(F)成分。另一方面，复合体粒子13所包含的电介质粒子12a也被称为结合(B)成分。
夹杂物14是指混入到了检测系统内(在此为试样10内)的尘埃等的粒子和构成计数装置100的构成物的破损片粒子等。
如图11的(a)所示，例如准备：含有病毒粒子等的被检测物质11、修饰有抗病毒抗体来作为特异性结合物质12b的电介质粒子12a(未结合粒子12)以及夹杂物14的试样10。在试样10中，通过液体中的扩散和碰撞，如图11的(b)所示，被检测物质11和未结合粒子12形成复合体粒子13。此时，添加大量的未结合粒子12，以使得不残留未结合的被检测物质11。因此，如图中所示，成为剩余地存在未结合粒子12的状态。
在此，当计数装置100的动作条件被设定为正的介电电泳和负的介电电泳中的一方作用于复合体粒子13、正的介电电泳和负的介电电泳中的另一方作用于未结合粒子12和夹杂物14时，复合体粒子13和其他粒子形成不同的群而凝集。动作条件由施加于电极组的交流电压和试样10的溶剂中的电导率等来进行设定，例如使用上述的复合体粒子13与上述的粒子15对应、其他粒子与上述的粒子15a对应的动作条件。这样，在本例子中，在使复合体粒子13和其他粒子凝集于了互不相同的位置之后，通过扩散来准确地对各自进行计数，由此，能够选择性地且准确地对试样10所包含的粒子中的作为预定的检测对象的被检测物质11进行计数。
(其他实施方式)
以上，基于实施方式对本公开的一个或多个技术方案涉及的计数装置以及计数方法进行了说明，但本公开并不限定于该实施方式。只要不脱离本公开的宗旨，对本实施方式实施本领域技术人员能够想到的各种变形而得到的方式也可以包含在本公开的一个或者多个技术方案的范围内。
例如在上述实施方式中，将第1基板上的电极组的配置设为了第1凸部和第2凸部相对向、第1凹部和第2凹部相对向的配置，但电极组的配置不限定于此。例如，也可以设为第1凸部和第2凹部相对向、第1凹部和第2凸部相对向的配置。通过电极组的配置和第1电极以及第2电极的形状的设计，也可以将电极组构成为形成与各种计数相适应的电场梯度。
电极组所包括的电极的数量不限定于2个，也可以是3个以上。例如，图4所示出的电极组在如上所述那样图中的第1电极之外，包括在纸面上下方向上的两方配置在了图的外侧的第2电极。这样的电极组包括3个以上的电极，对施加于相邻的电极的交流电压设置有相位差。此外，这样的电极组有时被称为Castellated电极(齿形电极)。
此外，也可以组合多个上述说明的用于使得从第1方向的介电电泳力变化为第2方向的介电电泳力的方法，更有效地使所凝集了的粒子进行扩散。
计数装置100也可以在第1电极组1111之外还具备第2电极组1811。图12是实施方式的变形例涉及的包括第1电极组和第2电极组的电路图。
第1电极组1111包括第1电极1112和第2电极1113。第2电极组1811包括第3电极1812和第4电极1813。
在凝集步骤中，控制部对开关1901指示将电压源120与第1电极1112连接、以及对开关1902指示将电压源120与第2电极1113连接，对电源120指示使之产生第1频率的交流电压。由此，在凝集步骤中，第1方向的介电电泳力作用于粒子15。
在扩散步骤中，控制部对开关1901指示将电压源120与第3电极1812连接、以及对开关1902指示将电压源120与第4电极1813连接，对电源120指示使之产生第2频率的交流电压。由此，在扩散步骤中，第2方向的介电电泳力作用于粒子15。
产业上的可利用性
可以作为对电介质粒子进行计数的计数装置来进行利用。
标号说明
10 试样
11 被检测物质
12 未结合粒子
12a 电介质粒子
12b 特异性结合物质
13 复合体粒子
14 夹杂物
15、15a 粒子
100 计数装置
110 容纳部
111 第1基板
112 间隔物
113 第2基板
120 电源
130 光源
131 照射光
132 检测光
140 拍摄元件
141 相机
150 计数部
1111 电极组
1112 第1电极
1112a 第1基部
1112b 第1凸部
1112c 第1凹部
1113 第2电极
1113a 第2基部
1113b 第2凸部
1113c 第2凹部
1121 空间
1131 供给孔
1132 排出孔
CLa 第1群
CLb 第2群
CLc 第3群

Claims (11)

1.一种计数方法，包括：
凝集步骤，使第1方向的介电电泳力起作用来使试样中的粒子凝集；
扩散步骤，使与所述第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力起作用来使所凝集了的所述粒子扩散；
拍摄步骤，拍摄包含所述扩散了的粒子的扩散图像；以及
计数步骤，基于所述扩散图像来决定所述粒子的数量。
2.根据权利要求1所述的计数方法，
在所述凝集步骤中，在产生用于使介电电泳力起作用的电场梯度的电极组之间施加第1频率的交流电压，
在所述扩散步骤中，在所述电极组之间施加与所述第1频率不同的第2频率的交流电压。
3.根据权利要求1所述的计数方法，
在所述凝集步骤中，在产生用于使介电电泳力起作用的电场梯度的第1电极组之间施加第1频率的交流电压，
在所述扩散步骤中，在与所述第1电极组不同的第2电极组之间施加与所述第1频率不同的第2频率的交流电压。
4.根据权利要求3所述的计数方法，
在所述扩散步骤中，使比所述凝集步骤中的第1方向的介电电泳力大的第2方向的介电电泳力起作用。
5.根据权利要求2或者3所述的计数方法，
在所述第1频率的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的一方作用于所述粒子，
在所述第2频率的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的另一方作用于所述粒子。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的计数方法，
在产生用于使介电电泳力起作用的电场梯度的电极组之间，
在所述凝集步骤中，在第1电导率的环境中施加交流电压，
在所述扩散步骤中，在与所述第1电导率不同的第2电导率的环境中施加交流电压。
7.根据权利要求6所述的计数方法，
在所述第1电导率的环境中的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的一方作用于所述粒子，
在所述第2电导率的环境中的交流电压的施加中，正的介电电泳力和负的介电电泳力中的另一方作用于所述粒子。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的计数方法，还包括：
前拍摄步骤，在所述凝集步骤以后且所述扩散步骤之前，拍摄包含所凝集了的所述粒子的凝集图像；和
追踪步骤，基于所拍摄到的所述凝集图像和所述扩散图像，对所述凝集图像所包含的所述粒子进行追踪。
9.根据权利要求8所述的计数方法，
在所述追踪步骤中，确定在所述扩散步骤中进行了扩散的所述粒子是在所述凝集步骤中凝集于了第1位置的所述粒子和凝集于了与所述第1位置不同的第2位置的所述粒子中的哪种粒子。
10.根据权利要求8或者9所述的计数方法，
在所述计数步骤中，基于所述凝集图像和所述扩散图像，选择性地对所述粒子中的、包含作为预定的检测对象的被检测物质的粒子进行计数。
11.一种计数装置，具备：
容纳部，其容纳包含粒子的试样；
电场梯度产生部，其对容纳于所述容纳部的所述试样产生电场梯度；
控制部，其通过对所述电场梯度产生部进行控制，从而通过所产生的所述电场梯度，使第1方向的介电电泳力作用于所述粒子来使所述粒子凝集，使与所述第1方向的介电电泳力不同的第2方向的介电电泳力作用于所凝集了的所述粒子而使所凝集了的所述粒子扩散；
拍摄部，其拍摄包含所扩散了的所述粒子的扩散图像；以及
计数部，其基于所拍摄到的所述扩散图像来决定所述粒子的数量。
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