JP6455916B2

JP6455916B2 - 粒子の分離方法

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Publication number: JP6455916B2
Application number: JP2014192208A
Authority: JP
Inventors: 田口　耕造; 耕造田口; 京平西本
Original assignee: Ritsumeikan Trust
Current assignee: Ritsumeikan Trust
Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2014-09-22
Publication date: 2019-01-23
Anticipated expiration: 2034-09-22
Also published as: JP2016059906A

Description

本発明は、誘電泳動によって細胞や細菌等の特定の粒子を他の粒子から分離する方法及び装置、並びにプロトプラストの捕捉方法に関する。

従来、溶液中に存在する細胞や細菌等の粒子を操作し、選択的に特定の粒子を分離・抽出する技術として誘電泳動を用いたものが知られている。誘電泳動とは、不均一交流電界中において電界により分極した粒子が、電界の勾配によって強電界側又は弱電界側に泳動する現象である。誘電泳動は、粒子自体が有している電荷に依存せず、印加する電圧や周波数の大きさ等に依存して泳動する。

下記の特許文献１には、４極の電極間に電界を発生させることにより、４極の電極の中心位置に負の誘電泳動によって粒子を集め、又は正の誘電泳動によって各電極に粒子を引きつける技術が開示されている。また、特許文献１には、櫛形に形成された２極の電極を組合せ、両電極間に電界を発生させる技術も開示されている。

特表２００６−５１００２０号公報

特許文献１には、負の誘電泳動によって４極の電極の中心位置に粒子を集めること、又は正の誘電泳動によって各電極に粒子を引きつけることが開示されているが、粒子を種類に応じて分離するための具体的手法については特に示されていない。
また、特許文献１記載の４極の電極や櫛形の電極はそれぞれ特殊な形状となっているため、より簡単な構造の電極を用いて粒子を分離することが望まれる。

他方、生化学分野等においては、細胞壁を取り除いたプロトプラストを用いて細胞を融合させる処理が行われることがあるが、従来は、細胞壁を有する通常の細胞とプロトプラストとが十分に分離されずに混合された状態で処理が行われていた。そのため、融合の確実性が低下する可能性があった。したがって、このようなプロトプラストの処理のために、プロトプラストを他の細胞から分離することが望まれる。

本発明は、複数種類の粒子を分離することができる新たな方法及び装置を提供することを主目的とする。

本発明に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動により分離する方法であって、
所定の中心位置の周りに配設される少なくとも４極の電極に第１の周波数の交流電圧を印加することにより、前記複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。

本発明に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか又は前記電極と非接触の状態で捕捉させ、その他の粒子を、前記電極と非接触の状態で浮遊若しくは捕捉させるか、又は前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。

本発明に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動により分離する方法であって、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させ、その他の粒子を前記電極と非接触の状態で浮遊又は捕捉させる分離工程を含むものである。

本発明に係る粒子の分離装置は、
粒子を含む溶液を収容するための収容部と、
前記収容部内に配置され、所定の中心位置の周りに間隔をあけて配設される少なくとも４極の電極と、
前記電極に交流電圧を印加することによって隣接する電極間に電界を生じさせる電源部とを備え、
前記電源部は、誘電泳動により、複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる周波数の交流電圧を印加するものである。

本発明に係るプロトプラストの捕捉方法は、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することによって、誘電泳動により、溶液中に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか、又は前記電極と非接触の状態で捕捉させるものである。

本発明によれば、好適に複数種類の粒子を分離することができる。

第１実施形態に係る粒子の分離装置の構成図である。分離チップの斜視図である。分離チップの平面図である。分離チップの断面図である。電極の説明図である。電極の一部を拡大して示す画像である。電極の製造方法を示す説明図である。第２実施形態に係る粒子の分離装置の構成図である。分離チップの斜視図である。実施例１における誘電泳動による粒子（ハイプレシカ球）の挙動を示す画像である。実施例１における誘電泳動による粒子（ハイプレシカ球）の挙動を示す画像である。実施例１における誘電泳動による粒子（酵母菌）の挙動を示す画像である。実施例２における粒子のトラップ力を示すグラフである。実施例３における粒子の培養の様子を示す画像である。実施例４における生細胞と死細胞の着色の様子を示す画像である。実施例４における誘電泳動による生細胞と死細胞の分離の様子を示す画像である。実施例５における誘電泳動による死細胞のトラップ力を示す表である。実施例５における誘電泳動による死細胞のトラップ力を示すグラフである。実施例５における誘電泳動による生細胞と死細胞との分離の過程を示す画像である。実施例６における誘電泳動によるプロトプラストの挙動を示す画像である。

［本発明の実施形態の要旨］
最初に本発明の実施形態の要旨を列記して説明する。なお、以下に記載する実施形態の少なくとも一部を任意に組み合わせてもよい。
（１）本発明の実施形態に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
所定の中心位置の周りに配設される少なくとも４極の電極に第１の周波数の交流電圧を印加することにより、前記複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。

このような方法により、誘電泳動を用いて複数種類の粒子を種類に応じて分離することができる。

（２）上記の分離方法において、前記分離工程の前に、前記第１の周波数とは異なる第２の周波数の交流電圧を前記電極に印加することによって、複数種類の粒子を前記中心位置に捕捉させる工程を含んでいてもよい。
この構成によれば、複数種類の粒子を分離する前に一旦複数種類の粒子を前記中心位置に集め、その後、少なくとも１つの種類の粒子を電極に捕捉させることになる。したがって、電極間の中心位置の周辺で粒子を分離することが可能となり、分離後の粒子の取り扱いを容易にすることができる。

（３）上記の分離方法において、前記分離工程後に、前記中心位置に捕捉させた粒子を取り除く除去工程をさらに含んでいてもよい。
この構成によれば、電極に捕捉された粒子のみの処理を行いやすくすることができる。

（４）前記除去工程は、流体の流れによって前記中心位置に捕捉させた粒子を取り除くものであってもよい。
粒子が電極に捕捉される場合と前記中心位置に捕捉される場合とでは、捕捉力に差があり、前者の方が後者よりも捕捉力が強くなる。したがって、後者の捕捉力よりも強い力で流体を流すことによって、電極に捕捉された粒子を残したまま、前記中心位置に捕捉された粒子を取り除くことが可能となる。

（５）上記の分離方法において、前記除去工程後に、前記第１の周波数とは異なる第３の周波数の交流電圧を前記電極に印加することによって、前記電極に捕捉させていた粒子を、前記中心位置に捕捉させる工程をさらに含んでいてもよい。
このような構成によって、電極に捕捉させた粒子を、電極とは非接触の状態で集めることができる。そのため、当該粒子の一部を抽出したりする処理を容易に行うことができる。なお、第３の周波数と、前述の第２の周波数とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。

（６）上記の分離方法において、前記複数種類の粒子が、プロトプラストと、その他の細胞とを含んでいてもよい。
このような構成によって、プロトプロストとその他の細胞とを好適に分離することができる。したがって、プロトプロストのみを用いて融合等の処理を確実に行うことができる。

（７）上記の分離方法において、前記複数種類の粒子は、生細胞と死細胞とを含んでいてもよい。
このような構成によって、生細胞と死細胞とを好適に分離することができる。

（８）他の実施形態に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか又は前記電極と非接触の状態で捕捉させ、その他の粒子を、前記電極と非接触の状態で浮遊若しくは捕捉させるか又は前記電極に捕捉させる分離工程を含むものである。
このような構成によって、プロトプロストとその他の粒子とを好適に分離することができる。したがって、プロトプロストのみを用いて融合等の処理を確実に行うことができる。

（９）他の実施形態に係る粒子の分離方法は、
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
第１の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させ、その他の粒子を前記電極と非接触の状態で浮遊又は捕捉させる分離工程を含むものである。
このような構成によって、プロトプロストとその他の粒子とを好適に分離することができる。したがって、プロトプロストのみを用いて融合等の処理を確実に行うことができる。

（１０）本発明の実施形態に係る粒子の分離装置は、
粒子を含む溶液を収容するための収容部と、
前記収容部内に配置され、所定の中心位置の周りに間隔をあけて配設される少なくとも４極の電極と、
前記電極に交流電圧を印加することによって隣接する電極間に電界を生じさせる電源部とを備え、
前記電源部は、誘電泳動により、複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる周波数の交流電圧を印加するものである。

このような装置により、誘電泳動を用いて複数種類の粒子を種類に応じて分離することができる。

（１１）上記分離装置は、四角形状に形成された４極の電極を備え、４極の電極が縦横に２極づつ配列され、各電極の１つの角部が前記中心位置に集中して配置されていることが好ましい。
このような構成によって、電極を簡単な構造にすることができる。また、４極の電極の中心位置に粒子を捕捉した後、周波数を変えた交流電圧を印加することによって当該粒子を電極に捕捉させる場合に、前記中心位置に集中して配置された各電極の角部付近に粒子を集めて捕捉することができる。

（１２）前記複数の電極は、１つの電極を複数に分割することによって形成されていてもよい。
このような構成によって、電極を簡単に作製することができる。

（１３）前記１つの電極は、その一部が切除されることによって分割されていてもよい。
このような構成によって、電極をより簡単に作製することができる。

（１４）本発明の実施形態に係るプロトプラストの捕捉方法は、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することによって、誘電泳動により、溶液中に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させるか、又は前記電極と非接触の状態で捕捉させるものである。
このような構成によって、プロトプラストの処理等のため、所定の場所にプロトプラストを捕捉することができる。

［本発明の実施形態の詳細］
以下、粒子の分離装置についてのより詳細な実施形態を説明する。
＜第１実施形態＞
図１に示すように、粒子の分離装置１０は、分離チップ（分離部）１１と、供給部１２と、排出部１３と、電源部１４と、撮像部１５と、操作部１６とを備えている。
分離チップ１１は、誘電泳動によって複数種類の粒子を種類に応じて分離するためのものであり、図２及び図３に示すように、基板２１と、基板２１上に設けられた電極２２とを備えている。また、基板２１には、電極２２のほか流路２３、供給ポート（インレットポート）２４、及び排出ポート（アウトレットポート）２５も設けられている。

流路２３は、図４にも示すように、基板２１の上面に設けられた一対の路壁２６の間に形成されている。一対の路壁２６は、シリコーンゴム等により形成され、基板２１の長手方向に沿って延びている。なお、流路２３は、複数種類の粒子を含む溶液が収容される収容部を構成する。

図２及び図３に示すように、流路２３の長さ方向の一端部には供給ポート２４が設けられ、供給ポート２４には流路２３に連通する供給孔２４ａが形成されている。供給ポート２４は、図１に示すように、供給管２７を介して供給部１２に接続されている。
また、図２及び図３に示すように、流路２３の長さ方向の他端部には排出ポート２５が設けられ、排出ポート２５には、流路２３に連通する排出孔２５ａが形成されている。排出ポート２５は、図１に示すように、排出管２８を介して排出部１３に接続されている。

図２及び図３に示すように、基板２１の上面には複数の電極２２が設けられている。この実施形態では、４極（４枚）の電極２２が設けられている。各電極２２は、基板２１の上面に薄膜状に形成され、平面視で四角形状に形成されている。４極の電極２２は、縦に２極、横に２極の四角状の配置で並べられている。また、隣接する電極２２の間には隙間が形成されている。したがって、４極の電極２２は、それぞれ１つの角部が中心の１点（中心位置Ｏ１）に集中して配置されている。

電源部１４は、４極の電極２２に対して交流電圧を印加する。電源部１４は、電極２２に印加する電圧や交流の周波数を調整可能に構成されている。具体的に、電源部１４は、図５に示すように、斜めに対向する２極の電極２２が正極となり、他の斜めに対向する２極の電極２２が負極となるように、交流電圧を印加する。したがって、４極の電極２２は、縦方向及び横方向に正極と負極とが隣り合い、隣り合う電極２２間に電気力線Ｌが生じる、四重極の電極２２を構成している。また、隣り合う電極２２間では、電気力線Ｌ（電場）の勾配が強くなり、４極の電極２２の中心位置Ｏ１では電気力線Ｌ（電場）の勾配が弱くなる。

図１に示すように、供給部１２は、粒子を含む溶液を供給管２７を介して供給するものである。供給部１２には、シリンジポンプを用いることができる。
一方、排出部１３は、分離チップ１１において分離等の処理が行われた後の溶液を排出管２８を介して排出するものである。この排出部１３にも、シリンジポンプを用いることができる。

図１に示すように、撮像部１５は、分離チップ１１に存在する粒子を撮像するものであり、光源３１と撮像器３２と光学系３３とを備えている。光学系３３は、レンズ３４及びフィルタ３５を含んでいる。撮像器３２は、ＣＭＯＳ又はＣＣＤ等のイメージセンサを備えたものを用いることができる。光源３１には、ハロゲン光源やＬＥＤ光源を用いることができる。

図１に示すように、操作部１６は、所謂マニピュレーターであり、撮像部１５による撮像箇所を調整するために、分離チップ１１を前後、上下、左右等に移動させる。

（電極の作製方法）
本実施形態の電極２２は以下のように作製することができる。
まず、図７（ａ）に示すように、ガラス製の基板２１上に、開口４２を有するマスク４１を施す。マスク４１にはビニールテープ等の粘着テープを用い、粘着テープをガラス基板２１上に貼り付ける。マスク４１として金属製等の板材を用いてもよい。

次いで、図示しないコーティング装置を用いて、マスク４１の開口４２を通して基板２１の上面に電極材料をコーティングする。具体的には、コーティング装置としてのイオンコーターによって基板２１上に電極材料を蒸着する。電極材料には、金又は銅等を用いることができる。

次に、蒸着によって基板２１に付着した薄膜状の電極２２’の一部を取り除くことによって複数の電極２２に分割する。具体的に、図７（ｂ）に１点鎖線で示すように、１つの電極２２’の縦方向の中心と横方向の中心を線状に切除する。これにより電極２２’には十字状の切れ目が形成され、切れ目によって４枚の電極２２に分割される。図６に、隣接する２つの電極２２と、その間の隙間Ｓを撮影した画像を示す。この例では、隙間Ｓの寸法が約２５μｍとされている。電極２２’の一部を切除するにはカッターナイフを用いることができる。

以上のような作製方法により、複雑なパターンのマスク４１が不要となり、容易に電極２２を形成することができる。また、電極２２の作製のために人体に悪影響のある薬剤を使用しなくてもよい。

以上の構成において、供給部１２から分離チップ１１の流路２３内に粒子を含む溶液を供給し、電源部１４によって分離チップ１１の電極２２に交流電圧を印加すると、その周波数に応じて正の誘電泳動又は負の誘電泳動が生じ、粒子をトラップ（捕捉）することができる。正の誘電泳動が生じると、粒子には電極２２による引力が働き、粒子は電極２２に張り付くことによってトラップされる。他方、負の誘電泳動が生じると、粒子には電極２２からの斥力が働き、４枚の電極２２の角部が集中する箇所（中心位置Ｏ１）において、電極２２に非接触の状態でトラップされる。

したがって、溶液中に周波数による特性の異なる複数種類の粒子が含まれている場合、いずれかの粒子に正の誘電泳動を生じさせ、他の粒子に負の誘電泳動を生じさせることによって両粒子を分離することが可能である。また、いずれかの粒子に正又は負の誘電泳動を生じさせ、他の粒子を溶液中で浮遊させることによっても分離することが可能である。

また、ある特性の粒子を正の誘電泳動により電極２２にトラップし、他の粒子を負の誘電泳動により中心位置Ｏ１にトラップするか又は溶液中に浮遊させた場合、供給部１２から分離チップ１１内に溶液を流入しつつ排出部１３によって分離チップ１１内の溶液を排出することによって、中心位置Ｏ１にトラップした粒子や、溶液中に浮遊した粒子を排出することができる。このような操作によって、電極２２にトラップした特定の粒子のみを分離チップ１１内に残すことが可能である。そして、分離チップ１１内に残った粒子は、培養や融合等の特定の処理を行うために抽出することが可能となる。

周波数による特性の異なる粒子として、生細胞と、死細胞とを挙げることができる。誘電泳動力を用いた細胞の分離は、細胞の大きさ、誘電率や導電率に依存した区別を行うことができる。誘電率は、細胞の各器官によって異なり、生細胞と死細胞との間でも異なる。したがって、生細胞と死細胞とを誘電泳動を用いて分離することが可能となる。生死細胞の分離については、後述する実施例４及び５において説明する。

また、周波数による特性の異なる粒子として、細胞壁を有する細胞と、細胞壁を除去したプロトプラストとを挙げることができる。両者は、周波数に応じた誘電率が異なるため、誘電泳動を用いて分離することが可能である。プロトプラストと他の細胞との分離については、後述する実施例６において説明する。

＜第２実施形態＞
図８は、第２実施形態に係る分離装置１０を示す。この分離装置１０は、第１実施形態のような供給部１２及び排出部１３を備えず、光ピンセット部１７を新たに備えている。この光ピンセット部１７は、集光したレーザー光により粒子をその焦点位置の近傍に捕捉し、移動させることができるものである。光ピンセット部１７は、レーザー発振器５１と、ピンセット本体５２と、操作部５３とを備える。レーザー発振器５１によって発生したレーザー光は、ピンセット本体５２から発射され、ピンセット本体５２の先端部で粒子を捕捉する。操作部５３は、所謂マニピュレータであり、ピンセット本体５２を前後、左右、及び上下等に移動させることができる。

本実施形態の分離チップ１１は、供給部１２及び排出部１３を備えていないが、図９に示すように、電極２２上に溶液を収容し、貯留することができるように収容部５４が設けられている。この収容部５４は、シリコーンゴム等によって形成され、電極２２を囲うように配置された四角形状の周壁５５を備えている。したがって、収容部５４内において、粒子の分離を行うことが可能となり、分離された粒子を光ピンセット部１７によって捕捉・抽出することができる。また、収容部５４内において培養や融合等の処理を行うことも可能である。

＜実施例＞
以上のような分離装置１０における作用及び効果を実証するため、特定の粒子を用いた実施例について説明する。
（実施例１）
実施例１は、上述の方法により作製した電極２２の有効性を確認するために、粒子として、ハイプレシカ球（ＵＦＮ２Ｎ、Ｎ３Ｎ宇部日東化成株式会社製）と出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae、BY4741）との２つの試料を用い、それぞれを純水で数十倍に希釈した溶液を分離装置の分離チップに充填し、交流電圧を印加した。ハイプレシカ球は円形で直径１０μｍ、酵母菌は楕円形で５〜８μｍである。そして、交流電圧を印加しているときとしていないとき、又は交流電圧の周波数を変化させたときの粒子の挙動を撮像部によって撮像した。その結果を図１０〜図１２に示す。

図１０（ａ）は、交流電圧を印加していないときのハイプレシカ球（Ｎ２Ｎ）（画像中に符号Ｐで示す）の状態を示し、図１０（ｂ）は、交流電圧を印加しているときの同ハイプレシカ球Ｐの状態を示す。交流電圧を印加していないときは、ハイプレシカ球Ｐは、電極２２上を浮遊している。一方、交流電圧を印加しているとき、ハイプレシカ球Ｐは、負の誘電泳動によって、４極の電極２２間の中心位置Ｏ１にトラップされていることがわかる。

図１１（ａ）は、交流電圧を印加していないときのハイプレシカ球（Ｎ３Ｎ）（画像中に符号Ｐ出示す）の状態を示し、図１１（ｂ）は、交流電圧を印加しているときの同ハイプレシカ球Ｐの状態を示す。交流電圧を印加していないときは、ハイプレシカ球Ｐは、電極２２上を浮遊している。一方、交流電圧を印加しているとき、ハイプレシカ球Ｐは、負の誘電泳動によって、４極の電極２２間の中心位置にトラップされていることがわかる。

図１２（ａ）は、高周波数の交流電圧を印加しているときの酵母菌の状態を示し、図１２（ｂ）は、低周波数の交流電圧を印加しているときの酵母菌の状態を示している。図１２においては、酵母菌を白丸で囲って示している。酵母菌は、高周波数の電圧を印加しているとき、正の誘電泳動により電極に張り付き、トラップされていることがわかる。他方、低周波数の電圧を印加しているとき、酵母菌は、負の誘電泳動により４極の電極２２間の中心位置にトラップされていることがわかる。

酵母菌は、４Ｖｐ−ｐの一定電圧を印加した場合、周波数が約３００ｋＨｚで誘電泳動の正負が切り替わった。すなわち、約３００ｋＨｚを超える周波数の交流電圧を印加することにより正の誘電泳動により酵母菌をトラップすることができ、３００ｋＨｚよりも小さい周波数の交流電圧を印加することによって負の誘電泳動によって酵母菌をトラップすることができた。

以上の実施例１により、交流電圧の印加により粒子のトラップが可能であることが実証された。また、交流電圧の周波数を変化させることにより、トラップの形態（誘電泳動の正負）を変更可能であることがわかった。

（実施例２）
上記の実施例１において、負の誘電泳動によって酵母菌をトラップしている状態で、流路２３内に流量を変化させながら溶液を流した。印加する交流電圧の周波数は、１０ｋＨｚ，５０ｋＨｚ，１００ｋＨｚ，１５０ｋＨｚとした。これにより、負の誘電泳動によるトラップ力を定量的に評価した。その結果を図１３に示す。

図１３のグラフには、トラップ力の最大値に相当する溶液の流速がプロットされている。つまり、流速が大きいほどトラップ力が大きいことになる。図１３によれば、印加する交流電圧の周波数が大きくなるほど、トラップ力が減少していることがわかる。したがって、交流電圧の周波数と、負の誘電泳動によるトラップ力との間には密接な関係があることがわかる。

（実施例３）
図９に示す分離チップ１１を用い、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心位置にトラップされた酵母菌をそのまま培養させた。図１４に、時間の経過に伴う酵母菌の培養の様子を示す。観察対象とする酵母菌を白丸で囲って示す。溶液は、培養液（ＹＰＤ）と水とを１対１で混合し、液温を２４℃とした。そして、５００ｋＨｚ、１Ｖｐ−ｐの交流電圧を電極に印加した。隣接する電極２２の隙間は約２５μｍである（図１６，図１９の電極２２も同様）。前述した実施例１においては溶液が純水の場合に誘電泳動の正負が切り替わる周波数が３００ｋＨｚであった。培養液と水との混合溶液の場合、１５００ｋＨｚ前後で誘電泳動の正負が切り替わった。

図１４に示すように、時間の経過によって酵母菌に娘細胞が出芽し、培養が行えることが確認された。培養時間は、基準時間から４０分程度であった（図１４（ｅ）参照）。
なお、図１４には、培養の対象となる酵母菌以外にも、負の誘電泳動により４極の電極２２の中心位置にトラップされた他の酵母菌が示されている。このように他の酵母菌がトラップされるのをできるだけ抑制するため、実施例３では、１Ｖｐ−ｐに下げた交流電圧を印加した。交流電圧が小さい程トラップ力が小さくなるからである。

（実施例４）
実施例１において、酵母菌の生細胞は約３００ｋＨｚで誘電泳動の正負が切り替わることがわかったが、死細胞は、水中下において１０ｋＨｚ〜１５０００ｋＨｚの周波数で終始負の誘電泳動の挙動を行う。実施例４では、このような生死細胞の周波数特性を利用して、生細胞と死細胞とを分離できるかを検証した。

図２又は図９に示す分離チップ１１に、生細胞と死細胞とが混合して含まれる溶液を充填し、電極に交流電圧を印加した。生細胞と死細胞を視覚的に区別するため、メチレンブルーにより染色を行った。生細胞は、デハイドロゲナーゼという脱水素酵素により還元反応が起こり、還元型のロイコメチレンブルーとなり、無色になる。一方、死細胞は、メチレンブルーのまま青色に発色した。図１５には、生細胞中に含まれる、メチレンブルーで染色された死細胞を丸で囲って示している。

図１６（ａ）は、電極２２に周波数１００ｋＨｚのＶｐ−ｐ４Ｖの交流電圧を印加した状態を示す。周波数１００ｋＨｚの場合、生細胞も死細胞も、負の誘電泳動により４極の電極２２の中心位置にトラップされた。
その後、交流電圧の周波数を１０００ｋＨｚにまで徐々に上げると、図１６（ｂ）に示すように、染色された死細胞Ｐ２は、４極の電極２２の中心位置にトラップされたまま残り、生細胞Ｐ１は、その周囲の電極２２の角部付近に貼り付くことによってトラップされた。これにより、生細胞Ｐ１と死細胞Ｐ２とを好適に分離することができた。

なお、実施例４においては、最初に生細胞及び死細胞を負の誘電泳動により４極の電極２２の中心位置にトラップし、その後周波数を上げることによって、生細胞を電極２２の角部付近にトラップした。そのため、生細胞も死細胞も広範囲に分散することなく、比較的狭い範囲に集めた状態で分離することができた。そのため、前述した光ピンセット部１７等を用いて、特定の細胞を抽出する作業を容易に行うことが可能となる。

（実施例５）
前述の実施例４により、生細胞と死細胞とを分離可能であることが実証された。実施例５では、生細胞と死細胞とを分離するだけでなく、分離した死細胞を除去し、生細胞のみを分離チップ１１に残す操作を行った。死細胞を除去するには溶液を流す力を利用した。

生細胞と死細胞との分離には、生細胞を正の誘電泳動によりトラップし、死細胞を負の誘電泳動によりトラップするので、この状態で死細胞のみを取り除くには、死細胞のトラップ力を超えるが、生細胞のトラップ力を超えない流速で溶液を流す必要がある。したがって、死細胞のトラップ力を超える溶液の流速を測定した。具体的には、周波数を１００ｋＨｚ（０．１ＭＨｚ），５００ｋＨｚ（０．５ＭＨｚ）、１０００ｋＨｚ（１ＭＨｚ）とした場合の、死細胞をトラップすることができる最大の流速を３回ずつ測定した。その結果を図１７の表と図１８のグラフに示す。

この結果から、周波数が小さいほど死細胞を流すことができる溶液の流速が低くなり、死細胞のトラップ力が小さくなるといえる。
一方、生細胞に対して同様の実験を行ったところ、例えば周波数５００ｋＨｚでは流速１００００μＬ／ｍｉｎであっても生細胞はトラップされたままであった。したがって、正の誘電泳動と負の誘電泳動とでは、約１０倍のトラップ力の差があることがわかった。

実施例５では、生細胞と死細胞とを分離した後、このトラップ力の差を利用して、死細胞のみを取り除き生細胞のみを残す処理を行った。図１９にその過程を示す。なお、図１９においては、生細胞を白丸で囲って示し、死細胞を黒丸で囲って示している。
図１９（ａ）は、電源部１４によって周波数１００ｋＨｚ、４Ｖｐ−ｐの交流電圧を印加した状態を示す。この場合、生細胞も死細胞も、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心にトラップされた。

図１９（ｂ）は、徐々に周波数を上げていき、１０００ｋＨｚになったときの状態を示す。このとき、生細胞は正の誘電泳動によって電極２２に貼り付いた。一方、死細胞は、負の誘電泳動によって４極の電極２２間の中心位置にトラップされたままとなった。
図１９（ｃ）は、分離チップ１１の流路２３に溶液を流した状態を示す。溶液の流速は、正の誘電泳動によるトラップ力を超えず、負の誘電泳動によるトラップ力を超える流速である。これにより死細胞は流されて排出され、電極２２には生細胞がトラップされたまま残った。

図１９（ｄ）は、周波数１００ｋＨｚに下げた状態を示す。生細胞は、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心位置にトラップされた。つまり、電極２２に非接触の状態で、生細胞のみを取得することができた。
以上の手順により、メチレンブルー等の試薬を用いることなく生細胞のみを識別し、分離・取得を行うことができるので、生細胞を培養したり融合させたりする処理を好適に行うことができる。また、第２実施形態で示した光ピンセット部１７を用いて特定の生細胞のみを抽出し、培養や融合させる操作も容易に行うことができる。

（実施例６）
実施例６では、誘電泳動によるプロトプラストの挙動について検証した。細胞から細胞壁を取り除いたプロトプラストをソルビトール液中に分散させた溶液を、分離チップに供給し、電極に交流電圧を印加した。その結果を図２０に示す。図２０において隣接する電極２２の隙間は約５０μｍである。

周波数１０ｋＨｚ、４Ｖｐ−ｐの交流電圧を電極２２に印加したとき、図２０（ａ）に示すように、プロトプラストは、負の誘電泳動によって４極の電極２２の中心位置に捕捉された。
その後、周波数１２０ｋＨｚ、４Ｖｐ−ｐの交流電圧を電極２２に印加すると、図２０（ｂ）に示すように、プロトプラストは、正の誘電泳動によって各電極２２の角部近傍に貼り付くことによって捕捉された。

したがって、プロトプラストについても印加する交流電圧の周波数に応じて正の誘電泳動又は負の誘電泳動により捕捉可能であることがわかった。また、プロトプラスト以外の他の細胞（例えば、上記実施例４及び５で示した生細胞や死細胞等）とは、捕捉特性が異なることが確認された。そのため、上記実施例５と略同様に、プロトプラストと他の細胞とが含まれる溶液からプロトプラストのみを分離して取得することが可能である。例えば、次のような手順（１）〜（３）でプロトプラストを取得することができる。

（１）まず、電極２２に１２０ｋＨｚの交流電圧を電極２２に印加することでプロトプラストのみを電極２２に捕捉させ、その他の細胞は、電極２２間の中心位置に捕捉させるか、溶液中に浮遊させる。
（２）その後、シリンジポンプ等を用いて溶液を流し、プロトプラスト以外の他の細胞を排出する。
（３）電極２２に印加する交流電圧を１０ｋＨｚに変更することでプロトプラストのみを電極２２間の中心位置に捕捉する。

また、電極２２に印加する周波数を調整することによって、生細胞と死細胞とプロトプラストとが含まれる溶液において、プロトプラストと、生細胞及び死細胞とを分離する操作だけでなく、プロトプラスト及び生細胞と、死細胞とを分離し、その後、プロトプラストと生細胞とを分離するような操作も可能となる。

本発明は、上記の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲内において変更することができる。
上記実施形態では、４極の電極を用いたが、それ以上の多極の電極を用いることが可能である。また、プロトプラストと他の細胞とを分離する方法及び装置には、２極の電極を用いてもよい。

粒子の分離等のために電極に印加した交流電圧や周波数の具体的数値はあくまで一例であり、分離の対象となる粒子の特性や溶液の種類等に応じて適宜変更されるものである。

１０：分離装置
１１：分離チップ（分離部）
１４：電源部
２２：電極
５４：収容部
Ｏ１：中心位置

Claims

溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動により分離する方法であって、
所定の中心位置の周りに配設される少なくとも４極の電極に第１の周波数の交流電圧を印加することにより、前記複数種類の粒子のうち少なくとも１つの種類の粒子を前記中心位置に捕捉させ、他の少なくとも１つの種類の粒子を前記電極に捕捉させる分離工程と、
前記分離工程後に、前記中心位置に捕捉させた粒子を取り除く除去工程と、
前記除去工程後に、前記第１の周波数とは異なる第３の周波数の交流電圧を前記電極に印加することによって、前記電極に捕捉させていた粒子を、前記中心位置に捕捉させる工程と、
を含む、粒子の分離方法。
前記分離工程の前に、前記第１の周波数とは異なる第２の周波数の交流電圧を前記電極に印加することによって、複数種類の粒子を前記中心位置に捕捉させる工程を含む、請求項１に記載の粒子の分離方法。
前記除去工程は、流体の流れによって前記中心位置に捕捉させた粒子を取り除く、請求項１又は２に記載の粒子の分離方法。
前記複数種類の粒子が、プロトプラストと、その他の細胞とを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子の分離方法。
前記複数種類の粒子が、生細胞と死細胞とを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子の分離方法。
溶液中に含まれる複数種類の粒子を誘電泳動によって分離する方法であって、
所定の周波数の交流電圧を電極に印加することにより、前記溶液に含まれるプロトプラストを前記電極に捕捉させ、その他の粒子を前記電極と非接触の状態で浮遊又は捕捉させる分離工程と、
前記分離工程後に、前記その他の粒子を取り除く除去工程と、
前記除去工程後に、前記所定の周波数とは異なる周波数の交流電圧を前記電極に印加することによって、前記電極に捕捉させていた前記プロトプラストを、前記電極と非接触の状態で捕捉させる工程と、
を含む、粒子の分離方法。