CN104974997B - 一种采用平行电场式光电芯片的细胞分离新方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种采用平行电场式光电芯片的细胞分离新方法。平行电场式光电芯片在垂直光斑照射时，通过连接左、右偏置电压源产生光诱导介电泳力。三角光斑阵列形成的光诱导介电泳力可分为正、负介电泳力，此两种力对细胞的作用方向不同。光诱导正、负介电泳力主要取决于细胞的介电常数和外接电信号的频率。因此，本发明借助平行电场式光电芯片的沟道作为待分离细胞的出、入端口。通过调节诱导光斑大小和激励频率数值，根据差异细胞所受的光诱导介电泳力不同而实现细胞的分离。本发明平行电场式光电芯片的细胞分离新方法对生物细胞样品的纯度提取都具有潜在的实用价值和意义。

Description

一种采用平行电场式光电芯片的细胞分离新方法

技术领域

本发明以平行电场式光电芯片为操控平台，依靠投射微米尺度三角阵列光斑和施载激励电压信号，最终产生光诱导介电泳力实现差异性生物细胞分离，属于生物医学研究领域。

背景技术

细胞分离技术由来已久，至今仍被大量国内外学者广泛研究。从动物、或人体组织中提取定量的血液样品用于病理学、临床诊断、克隆和生物细胞探索都是当前实验研究必不可缺的组成部分。然而，细胞的多样性直接反映它们在生命代谢中所发挥的功能不同，比如红细胞与白细胞在正常生命活动中就具有显著的差异。传统方法可以培育待测细胞，或者抽取大量血液用于科学实验。但是培养细胞的周期较长，另外特定细胞的购置也存在诸多困难。因此飞速发展的细胞分离技术，就是从微量溶液中提取更为关注的细胞用于以上所述生命研究。当前的细胞分离方法种类繁多，如：专利CN103305462B提出CD34+和CD91+淋巴细胞的分离，专利CN103571742B提出一种用于细胞筛选的密封腔分离器，专利CN103070718B中的皮肤组织细胞分离机。但是，本发明提出的细胞分离方法却与以上方法存有较大区别，该方法运用当前热门的光诱导介电泳技术，依托新颖的平行电场式光电芯片实现差异性细胞分离与提纯。

光诱导介电泳技术的核心是由微米尺度光斑照射到光敏薄膜，而引发光电芯片内部非均匀电场的产生。当芯片内具有非均匀电场后，将迫使电中性悬浮细胞受电场极化而发生定向移动，该电极化力即为介电泳力。在光电芯片中，光诱导介电泳力控制细胞分离的实验效果显著（Lin, W.-Y., Lin, Y.-H., and Lee, G.-B.: ‘Separation of micro-particles utilizing spatial difference of optically induced dielectrophoreticforces’, Microfluidics and Nanofluidics, 2010, 8, (2), pp. 217-229）。本发明平行电场式光电芯片的结构与Lin, et al.不同，发明的平行电场式光电芯片能够和微流体设备结合用于细胞分离与提纯。本发明对当前微流控芯片模拟药物在人体中的代谢过程，癌细胞扩散分析提供新方法。

发明内容

（一）要解决的技术问题

为了实现平行电场式光电芯片的细胞分离，首先需要解决平行电场式光电芯片的制造。平行电场式光电芯片与传统光电芯片在结构上具有较大区别。在激励电压的链接方法上，传统光电芯片是链接上、下层氧化铟锡玻璃。因此传统光电芯片提供的电场方向一般为垂直电场。但平行电场式光电芯片不需要借助上层氧化铟锡玻璃，仅采用下层基底氧化铟锡玻璃，以至电场方向与基底表面平行。在平行电场式光电芯片内，借助反应离子刻蚀一条微米尺寸沟道，用以实现分离细胞的流入、流出。另外细胞的分离主要借助光诱导介电泳力。在固定频率下，差异细胞受光诱导介电泳力的方向不同，这主要取决于细胞的Clausius-Mossotti因子。值得一提，该因子的取值与外接激励电压的频率有关。分析差异细胞各自的Clausius-Mossotti实部频谱关系，能有助于平行电场式光电芯片在细胞分离中处于正常工作状态。

（二）技术方案

本发明提出一种采用平行电场式光电芯片的细胞分离新方法。首先需要解决平行电场式光电芯片的制作和加工。选择镀有氧化铟锡的玻璃作为该光电芯片的基底，接着采用等离子体增强化学气相沉淀法镀上1 μm厚度的氢化非晶硅材质。氢化非晶硅具有良好的光敏特性，在非光照条件下，氢化非晶硅作为绝缘体占有较多电势差，使之芯片溶液中的电场相当微弱。但在光照下，光生载流子使氢化非晶硅受光照区域上的局部电导率增加，从而变成良好的导体。

上述方案中，所述镀有氢化非晶硅的氧化铟锡玻璃表面，依靠反应离子和化学湿法刻蚀出一条10 μm深，30 μm宽的微沟槽。一方面，沟槽将氢化非晶硅分割成两子块薄膜，作为虚拟电极的载体。另一方面微沟槽两端可连接微流管道作为细胞进出待分离的通道。

上述方案中，所述的平行电场式光电芯片左、右连接信号发生器，并且左、右空隙的微沟槽通以流动生物细胞。当可编程光源产生的三角阵列照射到左、右氢化非晶硅薄膜，调节信号发生器频率，能产生光诱导介电泳力。其中，光诱导正介电泳力束缚细胞，迫使其运动到电场能量相对较高的位置，即微沟槽边缘。另外的差异细胞则受光诱导负介电泳力，使之保持定向运动。至此，该方法可以实现细胞的分离。

（三）有益效果

本发明的优点在于方法新颖，能简单高效的获取血液样本的特定细胞。由于光诱导介电泳力是一种柔和的作用力，对细胞的束缚不会造成破坏。因此，平行电场式光电芯片能较好集成在微流体装置中。借助其易操作、体积小和分离速度快的优点，它必将胜任于生物医学研究领域。

附图说明

图1 平行电场式光电芯片结构：(a) 平行电场式光电芯片的工作原理；(b) 平行电场式光电芯片的截面示意图。其中1为刻蚀后的氧化铟锡玻璃，2为氢化非晶硅薄膜，3为绝缘胶或双面胶，4为激励电信号，5光学投影仪，6数字微全镜，7细胞，8微沟槽，9投影的三角阵列光斑形状。

图2 细胞分离相关理论分析：(a)红细胞和B细胞Clausius-Mossotti因子实部随频率的变化曲线图；(b)基于有限元软件COMSOL仿真的微沟槽内部电场能量分布图，白色箭头表征电场线指向。

图3 基于分子动力学方法模拟的细胞运动轨迹：(a)红细胞与B细胞初始位置；(b)B细胞受到光诱导正介电泳力的运动轨迹图；(c)红细胞受光诱导负介电泳力的运动轨迹图。

具体实施方式

本发明的细胞分离方法主要依靠平行电场式光电芯片提供的光诱导介电泳力。平行电场式光电芯片的结构如图1所示。平行电场式光电芯片基底1表面镀有氢化非晶硅薄膜2，因此具有较好的光电特性。微沟槽8采用反应离子和化学湿法刻蚀，深度保持在10 μm，并且沟槽宽为30 μm。光源5通过计算机编程可投射出三角阵列光斑，该光斑通过光源缩微装置6，能缩小成微米尺度的三角形光学阵列9。在左、右氢化非晶硅两端加载激励电源4，即可在平行电场式光电芯片中产生固定大小的非均匀电场。需要指出绝缘胶或双面胶3的使用，主要为了封装顶层玻璃防止芯片溶液大量挥发和细胞受到悬浮物污染。传统光电芯片必须具备顶层玻璃，但平行电场式光电芯片在使用上与其存在较大差异。

所述平行电场式光电芯片连接微流装置后，细胞7在微沟槽8中受流体拖力运动。当运动到三角阵列光斑位置，细胞将受到光诱导介电泳力作用而改变运动轨迹。光诱导介电泳力的表达式为F _ODEP =2πr ³ ε _m Re[CM(ω)]▽|E _rms|²，

式中：r为细胞半径，

ε _m 为溶液介电常数，

E _rms为电场强度的均方根值，

CM则代表与激励电信号频率ω有关的函数，即Clausius-Mossotti (CM)因子。

当CM>0时，细胞承受光诱导正介电泳力，该力驱使细胞运动到电场强度较大位置。反之，细胞承受光诱导负介电泳力，运动至平行电场式光电芯片电场能量较弱的区域。因此根据差异细胞在相同激励频率电信号下，其所受的光诱导介电泳力不同，从而实现细胞的分离。细胞的CM因子表达式为，式中和分别为细胞和溶液的复介电常数，，，。

然而，细胞是一种多层介质壳包裹组成的球体，一般分为细胞膜、细胞质、细胞核。因此细胞复介电常数的求解与聚苯乙烯均质颗粒不同。细胞复介电常数解析式为，

式中：为细胞膜的复电容值，，C _mem 是细胞膜的电容率，R _mem 则是细胞膜的电阻率，是细胞质的复介电常数，与细胞质的介电常数ε _int 和σ _int 有关。

以红细胞和B细胞为例，它们的CM因子实部曲线如图2(a)所示。红细胞的CM实部曲线相比B细胞延后。在53 kHz ~ 93 kHz频率之间，红细胞受到光诱导负介电泳力，B细胞则受光诱导正介电泳力。相关曲线涉及红细胞，B细胞的电物理量如下表所示，涉及的ε₀是真空真空介电常数。

	红细胞	B细胞
			ε int	50ε 0	154ε 0
σ int	0.53 S/m	0.73 S/m
			C mem	0.01 F/m2	0.0126 F/m2
R mem	1 μS/m	0.8 μS/m
			r	2.4 μm	3.29 μm

平行电场式光电芯片的微观力主要有光诱导电渗透流力，浮力，重力，布朗运动力等。电渗透流力在频率大于1 kHz后将会衰减严重。细胞与培养溶液的密度也差别不大，布朗运动力对微米粒子的影响较小，所以上述力暂且忽略不计。在此考虑细胞所受的流体拖力，其表达式为F _Drag =6πηv-u，

式中：u为溶液流速，

v为细胞运动速度，

η为溶液的粘滞系数。

根据COMSOL有限元软件模拟电场分布，如图2(b)所示。三角阵列光斑的顶角为40°，三角光斑高为15 μm，光斑间距为9 μm。图2(b)指出|E _rms |²能量主要集中在三角形顶角位置。之后根据分子动力学仿真分析B细胞和红细胞在18 V偏置电压、70 kHz频率的运动轨迹，并且微沟槽的溶液流速为168 μm/s，仿真结果如图3所示。图3(b)虚线指出B细胞受光诱导正介电泳力束缚于三角阵列顶角位置，而图3(c)则反映红细胞受光诱导负介电泳力运动仍旧保持原始的直线运动。分析结果指出，靠近微沟槽边缘的红细胞受光诱导负介电泳力排斥有向微沟槽中心移动的趋势。也通过以红细胞和B细胞为例的仿真分析，证实平行电场式光电芯片分离细胞方法的可行性。

Claims (3)

1.一种采用平行电场式光电芯片的细胞分离新方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：制备平行电场式光电芯片；

采用等离子体增强化学气相沉淀工艺在氧化铟锡玻璃表面镀上1μm厚度的氢化非晶硅薄膜；然后在氢化非晶硅薄膜表面，采用反应离子和化学湿法刻蚀工艺刻蚀深度为10μm，宽度为30μm的微沟槽，获得平行电场式光电芯片；

步骤二：搭建平行电场式光电芯片的细胞分离平台；

在平行电场式光电芯片左、右连接信号发生器；通过可编程光源产生的三角阵列光斑照射到微沟槽左、右两侧氢化非晶硅薄膜上；微沟槽内通过流动的生物细胞；

步骤三：调节信号发生器频率，通过产生的光诱导介电泳力，实现细胞的分离。

2.根据权利要求1所述的一种采用平行电场式光电芯片的细胞分离新方法，其特征在于，步骤二中产生三角阵列光斑通过数字微全镜，产生的三角光斑顶角为40°，高为15μm，间距为9μm。

3.根据权利要求1或2所述的一种采用平行电场式光电芯片的细胞分离新方法，其特征在于，步骤二中流入微沟槽内的细胞流动速度为168μm/s。